一種簡(jiǎn)單快捷的酸性磷酸酶活性測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種簡(jiǎn)單快捷的酸性磷酸酶活性測(cè)定方法，具體步驟如下：步驟一，取得一條鏈的3`端磷酸化的雙鏈DNA；步驟二，以該雙鏈DNA為底物在酸性磷酸酶存在下在反應(yīng)體系中反應(yīng)，將反應(yīng)獲得的具有3`端去磷酸化的雙鏈DNA的反應(yīng)物在足量的核酸外切酶存在下反應(yīng)；步驟三，反應(yīng)完成后，測(cè)定反應(yīng)體系中單鏈DNA和雙鏈DNA的相對(duì)量，并由該檢測(cè)結(jié)果推導(dǎo)出酸性磷酸酶的活性程度。本發(fā)明公布了一種簡(jiǎn)單快捷的酸性磷酸酶活性測(cè)定方法，該方法比現(xiàn)有技術(shù)操作步驟更簡(jiǎn)單、方便和快捷，可實(shí)現(xiàn)高通量和自動(dòng)化的活性測(cè)定，并且靈敏度高，可檢測(cè)到15mU的酸性磷酸酶，使用效果好。
【專利說明】
-種簡(jiǎn)單快捷的酸性磯酸酶活性測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生化技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種簡(jiǎn)單快捷的酸性憐酸酶活性測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 酸性憐酸酶是一類水解酶，可在核巧酸、蛋白質(zhì)等分子上去除憐酸基團(tuán)，使目標(biāo)分 子去憐酸化，在酸性環(huán)境下最為有效，故得名酸性憐酸酶。酸性憐酸酶是基因工程技術(shù)W及 分子生物學(xué)研究中很重要的一類工具酶。非特異性催化DNA和RNAr 5'和3'末端憐酸單醋去 憐酸化，但不降解憐酸二醋和Ξ醋鍵。在分子生物學(xué)研究中可W用來去除DNA和RNA的憐酸 化末端，W便后續(xù)的克隆和標(biāo)記?？寺∵^程中線性DNA分子去憐酸化后可W防止自連。該酶 作用于3'末端，無論其為凸端，平端或凹端。酸性憐酸酶還可W降解PCR反應(yīng)中多余的 dNTPs，此PCR產(chǎn)物可直接用于DNA測(cè)序和SNP分析。
[0003] 標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)活方法采用對(duì)硝基苯憐酸鋼(pNPP)法，其反應(yīng)方程式如下： pNPP (無色）+也 0------ACP--〉pNP (黃色）+HPO42- 通過分光光度法測(cè)定產(chǎn)物pNP的含量，進(jìn)而計(jì)算出酸性憐酸酶的活性。運(yùn)種基于顯色的 方法步驟較多，反應(yīng)時(shí)間要求控制精確，難W實(shí)現(xiàn)高通量和自動(dòng)化，運(yùn)就為使用者帶來了不 便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單快捷的酸性憐酸酶活性測(cè)定方法，W解決上述背 景技術(shù)中提出的問題。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案： 一種簡(jiǎn)單快捷的酸性憐酸酶活性測(cè)定方法，具體步驟如下： 步驟一，取得一條鏈的3'端憐酸化的雙鏈DNA; 步驟二，W該雙鏈DNA為底物在酸性憐酸酶存在下在反應(yīng)體系中反應(yīng)，將反應(yīng)獲得的具 有3'端去憐酸化的雙鏈DNA的反應(yīng)物在足量的核酸外切酶存在下反應(yīng)； 步驟S，反應(yīng)完成后，ii定反應(yīng)體系中單鏈DNA和雙鏈DNA的相對(duì)量，并由該檢測(cè)結(jié)果推 導(dǎo)出酸性憐酸酶的活性程度。
[0006] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:雙鏈DNA或單鏈DNA的相對(duì)量是用巧光染料標(biāo)記，通過 巧光法測(cè)得的，并且雙鏈DNA或單鏈DNA的相對(duì)量用巧光豐度表示。
[0007] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:巧光染料采用單雙鏈DNA差異性巧光染料。
[000引作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:染料采用goldview染料。
[0009] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:雙鏈DNA模板是W娃魚精DNA為底物在正向引物和反向 引物的存在下通過PCR擴(kuò)增得到的線性雙鏈DNA，其中所用的引物的兩者的3'端具有憐酸化 基團(tuán)。
[0010] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：正向引物采用5 --aagtaccgtaggccagtcatgca-3-，反向 引-邑tac邑cca邑tea邑eta邑C邑ata邑C-3'。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明公布了一種簡(jiǎn)單快捷的酸性憐酸 酶活性測(cè)定方法，該方法比現(xiàn)有技術(shù)操作步驟更簡(jiǎn)單、方便和快捷，可實(shí)現(xiàn)高通量和自動(dòng)化 的活性測(cè)定，并且靈敏度高，可檢測(cè)到15mU的酸性憐酸酶，使用效果好。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本專利的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
[oou]實(shí)施例1 一種簡(jiǎn)單快捷的酸性憐酸酶活性測(cè)定方法，具體步驟如下： 步驟一，采用娃魚精DNA為底物，采用5 - -aag1:accgtaggccagtcatgca-3 -為正向引物，采 用5 --g1:acgccagtcagctagcgatagc-3 -為反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，所用PCR反應(yīng)組分和體 積如表1所示。
[QQ14] 表1 PCR反應(yīng)的組分和體積_
PCR的反應(yīng)過程見表2 表2 PCR的反應(yīng)過程
步驟二，W該雙鏈DNA為底物在酸性憐酸酶存在下在37° C反應(yīng)半小時(shí)然后維持在4° C， 將反應(yīng)獲得的具有3'端去憐酸化的雙鏈DNA的反應(yīng)物在足量的核酸外切酶存在下在37° C反 應(yīng)半小時(shí)然后維持在4° C。
[0015] 酸性憐酸酶的組分和體積見表3,核酸外切酶的組分和體積見表4。
[0016] 表3酸性憐酸酶的組分和體積

步驟Ξ，反應(yīng)完成后，向反應(yīng)產(chǎn)物中加入化1 goldview染料；用巧光酶標(biāo)儀檢測(cè)，激發(fā) 波長(zhǎng)為430nm,發(fā)射波長(zhǎng)為470nm，檢測(cè)結(jié)果見表5 表5檢測(cè)結(jié)果
酸性憐酸酶可W將憐酸化的雙鏈DNA轉(zhuǎn)化為非憐酸化的雙鏈DNA.核酸外切酶可W特異~ 性地將憐酸化雙鏈DNA降解為單鏈DNA，而不降解非憐酸化的雙鏈DNA。goldview染料結(jié)合 雙鏈DNA在紫外激發(fā)下產(chǎn)生綠色巧光，單鏈DNA結(jié)合染料顯現(xiàn)紅色巧光。酸性憐酸酶的活性 一定范圍內(nèi)同去憐酸化雙鏈DNA的量成正比，因此其活性就可W用goldview綠色巧光強(qiáng)度 來進(jìn)行測(cè)定。
[0017] 表5的結(jié)果表明，憐酸化的雙鏈DNA可被酸性憐酸酶去憐酸，且去憐酸程度呈現(xiàn)劑 量相關(guān)性，因此可W用巧光強(qiáng)度來表征酸性憐酸酶活性。
[0018] 上面對(duì)本專利的較佳實(shí)施方式作了詳細(xì)說明，但是本專利并不限于上述實(shí)施方 式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識(shí)范圍內(nèi)，還可W在不脫離本專利宗旨的前提下 做出各種變化。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種簡(jiǎn)單快捷的酸性磷酸酶活性測(cè)定方法，其特征在于，具體步驟如下： 步驟一，取得一條鏈的3'端磷酸化的雙鏈DNA; 步驟二，以該雙鏈DNA為底物在酸性磷酸酶存在下在反應(yīng)體系中反應(yīng)，將反應(yīng)獲得的具 有3'端去磷酸化的雙鏈DNA的反應(yīng)物在足量的核酸外切酶存在下反應(yīng)； 步驟三，反應(yīng)完成后，測(cè)定反應(yīng)體系中單鏈DNA和雙鏈DNA的相對(duì)量，并由該檢測(cè)結(jié)果推 導(dǎo)出酸性磷酸酶的活性程度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的簡(jiǎn)單快捷的酸性磷酸酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所述雙鏈 DNA或單鏈DNA的相對(duì)量是用熒光染料標(biāo)記，通過熒光法測(cè)得的，并且雙鏈DNA或單鏈DNA的 相對(duì)量用焚光豐度表不。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的簡(jiǎn)單快捷的酸性磷酸酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所述熒光 染料采用單雙鏈DNA差異性熒光染料。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的簡(jiǎn)單快捷的酸性磷酸酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所述染料 采用goldview染料。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的簡(jiǎn)單快捷的酸性磷酸酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所述雙鏈 DNA模板是以鮭魚精DNA為底物在正向引物和反向引物的存在下通過PCR擴(kuò)增得到的線性雙 鏈DNA，其中所用的引物的兩者的3'端具有磷酸化基團(tuán)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的簡(jiǎn)單快捷的酸性磷酸酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所述正向 引 物采用 5'-aagtaccgtaggccagtcatgca-3'，反向弓| 物采用 5'-gtacgccagtcagctagcgatagc-3 〇
【文檔編號(hào)】C12Q1/44GK106011223SQ201610596613
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月27日
【發(fā)明人】張存清, 江長(zhǎng)青
【申請(qǐng)人】上海畢傲圖生物科技有限公司