一種樣品中鐮刀菌的快速分離檢測(cè)方法及所用培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種樣品中鐮刀菌的快速分離檢測(cè)方法及所用培養(yǎng)基，將樣品涂布于分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分離培養(yǎng)基成分中不含任何氮源，按質(zhì)量百分比含：0.4％?1％碳源、1.5?2％瓊脂粉，0.15?0.3％K2HPO4，0.1?0.3％MgSO4，0.1?0.3％CaCl2，0.3?0.5％CaCO3，pH 6.5?7；該培養(yǎng)基中還含有能抑制細(xì)菌而不抑制真菌的抗生素；碳源為蔗糖、葡萄糖、D?半乳糖、阿拉伯糖和甘露醇中的一種或幾種；培養(yǎng)好后從單菌落上挑取白色半透明氣生菌絲，顯微觀察根據(jù)細(xì)胞形態(tài)特征判斷是否為鐮刀菌。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)對(duì)各類樣品中的鐮刀菌的檢測(cè)，避免其他真菌污染，使得檢測(cè)靈敏度更高、周期更短。
【專利說(shuō)明】
-種樣品中編刀菌的快速分離檢測(cè)方法及所用培養(yǎng)基
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種菌種分離技術(shù)，具體設(shè)及一種樣品中鑲刀菌的快速分離檢測(cè)方法 及所用培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 鑲刀菌屬類真菌可W導(dǎo)致嚴(yán)重的農(nóng)作物病害，如小麥赤霉病、鑲刀菌根腐病和玉 米穗腐病等。該屬真菌產(chǎn)生的鑲刀菌毒素是一類次生代謝物能使人嘔吐、腹瀉、誘發(fā)大骨節(jié) 病甚至癌癥等嚴(yán)重健康問(wèn)題。因此鑲刀菌檢測(cè)技術(shù)在海關(guān)檢疫、田間病害防控檢測(cè)中具有 重要作用;而與鑲刀菌緊密關(guān)聯(lián)的鑲刀菌毒素檢測(cè)是糧食和食品安全中的一個(gè)重要檢測(cè)項(xiàng) 目。
[0003] 針對(duì)鑲刀菌毒素含量的檢測(cè)技術(shù)只能反映樣品中的毒素濃度，無(wú)法檢測(cè)樣品中是 否存在鑲刀菌活體菌;該方法無(wú)法預(yù)測(cè)糧食儲(chǔ)藏過(guò)程中毒素是否會(huì)持續(xù)積累的風(fēng)險(xiǎn)。因此， 在糧食儲(chǔ)藏前進(jìn)行鑲刀菌含量檢測(cè)將是防控糧食儲(chǔ)藏過(guò)程中鑲刀菌毒素積累的關(guān)鍵。
[0004] 目前在田間病害或海關(guān)檢疫中對(duì)鑲刀菌的檢測(cè)方法主要有4類：
[0005] ①基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的檢測(cè)技術(shù)
[0006] 運(yùn)類檢測(cè)技術(shù)一般針對(duì)某一個(gè)或幾個(gè)鑲刀菌種的基因組中的某一片段設(shè)計(jì)一對(duì) 或多個(gè)特異引物，通過(guò)一次或多次PCR擴(kuò)增得到目的片段，并對(duì)擴(kuò)增的片段進(jìn)行帶型分析或 測(cè)序來(lái)判斷菌體的種屬。該檢測(cè)技術(shù)靈敏度仍較低(檢測(cè)下限是含鑲刀菌500個(gè)細(xì)胞/g的樣 品）、帶型分析假陽(yáng)性高、無(wú)法區(qū)分活體和死體菌，檢測(cè)范圍不夠廣譜。
[0007] ②基于抗體的檢測(cè)技術(shù)
[000引此類技術(shù)在獲得某個(gè)特定鑲刀菌株的特異抗體后，用該抗體連接一些有特殊顯色 反應(yīng)的酶蛋白，通過(guò)顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品中是否含有該特定鑲刀菌株。該檢測(cè)技術(shù)研發(fā)和 使用成本高，檢測(cè)范圍也很窄。
[0009] ③基于巧光染色的鑲刀菌抱子活體檢測(cè)技術(shù)
[0010] 此類巧光染色技術(shù)一般是對(duì)已經(jīng)是純化的菌株進(jìn)行活體判斷。活體菌和死亡菌可 W染上不同的巧光顏色，W此來(lái)判斷菌體是否是活體。該檢測(cè)技術(shù)沒(méi)有針對(duì)性，無(wú)法直接用 于檢測(cè)糧食中的鑲刀菌污染。
[0011] ④基于鑲刀菌分離的檢測(cè)方法
[001^ 利用真菌常用培養(yǎng)基PDA或加有五氯硝基苯(PCNB)的PPA培養(yǎng)基，從各類樣品中分 離鑲刀菌。經(jīng)過(guò)多步驟連續(xù)分離后獲得純的菌株，再通過(guò)分子鑒定等手段進(jìn)行菌株鑒定。
[0013]運(yùn)種檢測(cè)方法一般是針對(duì)具有明顯鑲刀菌病的材料。例如盧維宏等人從玉米穗腐 病樣品中用PDA培養(yǎng)基多次分離的方法獲得純菌株，再通過(guò)分子鑒定證明分離得到層出鑲 刀菌化sarium prolifera化m(盧維宏，黃思良，陶愛(ài)麗，等.玉米穗腐病樣品中層出鑲刀菌 的分離與鑒定[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2011,38(03) :233-239)。黎永堅(jiān)等人從患有香蕉枯萎病 (鑲刀菌病害）的田中取根際±壤，用具有一定選擇作用的PPA培養(yǎng)基經(jīng)多輪分離后篩選得 到純菌落，再用分子鑒定方法證明分離得到的是鑲刀菌(黎永堅(jiān)，陳遠(yuǎn)鳳，喻國(guó)輝，等.粉蕉 種植±鑲刀菌分離與鑒定[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，41 (16): 74-80)。
[0014] 由于PDA是廣泛性的培養(yǎng)基，各類真菌均能在其上面快速生長(zhǎng)，因此分離純化工作 量很大，難W篩選得到目的鑲刀菌。
[0015] PPA培養(yǎng)基加入了PCNB后具有一定的篩選作用，可W減少立枯菌和炭痘菌等一些 真菌的污染，但是篩選分離的難度和工作量依然很大，需要不斷循環(huán)分離篩選。例如汪建飛 第一步用PPA培養(yǎng)基從有鑲刀菌病的牆菊連作±壤中分離菌株，然后"在培養(yǎng)基上挑取生長(zhǎng) 5d的菌落，接種到馬鈴馨培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)3d，再挑取菌落接種到馬鈴馨培養(yǎng)基上，如此循 環(huán)，直到得到純化的菌種"（汪建飛，周毅，高祥，等.牆菊連作±壤中尖抱鑲刀菌的分離、鑒 定及變化特征[J].生物學(xué)雜志，2011，28 (06): 46-48)。
[0016] 由于此類檢測(cè)方法一般針對(duì)含鑲刀菌數(shù)量較多的帶有鑲刀菌病癥的樣品，并且需 要多次的分離才能獲得鑲刀菌株；因此不適合用于無(wú)鑲刀菌病癥、菌體含量較少的樣品的 快速檢測(cè)。
[0017] 綜上，基于鑲刀菌分離的檢測(cè)方法，缺點(diǎn)在于:a、目前此類分離方法中使用的培養(yǎng) 基如PDA或PPA等，導(dǎo)致其他真菌的污染率高，需要多次循環(huán)分離才能獲得純菌株;分離難度 大。b、由于a運(yùn)樣的分離特點(diǎn)，該方法分離周期過(guò)長(zhǎng)，一個(gè)分離循環(huán)時(shí)間5天左右，兩個(gè)W上 的分離循環(huán)需要10天W上的工作時(shí)間，不適用于快速檢測(cè)。C、由于a運(yùn)樣的分離特點(diǎn)，分離 工作量大，需要耗費(fèi)較大的人力物力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 本發(fā)明的目的是提供一種樣品中鑲刀菌的快速分離檢測(cè)方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)各類樣品 中的鑲刀菌的檢測(cè)，避免其他真菌污染，使得檢測(cè)靈敏度更高、周期更短。
[0019] 本發(fā)明人在相關(guān)研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn):鑲刀菌是一類具有固氮作用的真菌，具有不需 要任何氮源、只要有合適的碳源和無(wú)機(jī)鹽就能正常生長(zhǎng)的生理特性;至今還沒(méi)有任何關(guān)于 鑲刀菌可W固氮的報(bào)道。而現(xiàn)有技術(shù)中基于鑲刀菌分離的檢測(cè)方法使用的培養(yǎng)基如PDA或 PPA等都含有豐富的氮源，因此會(huì)導(dǎo)致其他真菌的污染率高。
[0020] 本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種樣品中鑲刀菌的快速分離檢測(cè)方法，包括：
[0021] 將樣品涂布于分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述分離培養(yǎng)基成分中不含任何氮源，按質(zhì)量 百分比含:〇.4%-1% 碳源、1.5-2% 瓊脂粉，0.15-0.3%K2HP04,0.1-0.3%MgS04,0.1-0.3% CaCb，0.3-0.5%化C〇3，抑6.5-7;該培養(yǎng)基中還含有能抑制細(xì)菌而不抑制真菌的抗生素； 所述碳源為薦糖、葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖和甘露醇中的一種或幾種；
[0022] 培養(yǎng)好后從單菌落上挑取白色半透明氣生菌絲，顯微觀察根據(jù)細(xì)胞形態(tài)特征判斷 是否為鑲刀菌。
[0023] 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述樣品取自玉米種、玉米須或巧白。
[0024] 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述能抑制細(xì)菌而不抑制真菌的抗生素為鏈霉素和/ 或頭抱霉素。
[0025] 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，平皿中的分離培養(yǎng)基厚度不小于4毫米;平皿不需密 封，保持透氣。
[0026] 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)是置于恒溫培養(yǎng)箱中，28~3(TC培養(yǎng)2~3天。
[0027] 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，在載玻片上滴上含有15-30%甘油的水滴，將挑取的白 色半透明氣生菌絲分散于水滴中，用顯微鏡觀察，憑經(jīng)驗(yàn)或軟件判定是否鑲刀菌。
[0028] 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，通過(guò)真菌分子鑒定方法進(jìn)一步確定鑲刀菌的種屬。具 體來(lái)說(shuō)，挑取白色半透明氣生菌絲接種于真菌液體培養(yǎng)基進(jìn)一步培養(yǎng)后，進(jìn)行口 S序列擴(kuò)增 測(cè)序。
[0029] 本發(fā)明提供的一種用于樣品中鑲刀菌的快速分離檢測(cè)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分中不 含任何氮源，按質(zhì)量百分比含：0.4%-1%碳源、1.5-2%瓊脂粉，0.15-0.3%1(2冊(cè)04,0.1- 0.3%MgS04,0.1-0.3%CaCl2,0.3-0.5%CaC03，pH 6.5-7;所述碳源為薦糖、葡萄糖、0-半乳 糖、阿拉伯糖和甘露醇中的一種或幾種。
[0030] 本發(fā)明方法可適用于檢測(cè)無(wú)鑲刀菌病癥、菌體含量較少的樣品中的鑲刀菌，不一 定是具有明顯鑲刀菌病的材料;檢測(cè)靈敏度高。
[0031] 經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)，采用本發(fā)明方法分離檢測(cè)樣品中含有鑲刀菌的準(zhǔn)確率可達(dá)到 100%;檢測(cè)下限達(dá)到10個(gè)活細(xì)胞/g甚至更低;2-3天可即可完成分離檢測(cè)。
[0032] 相比①于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的檢測(cè)技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:檢測(cè)靈敏度顯著 提高;檢測(cè)周期時(shí)間較為理想，除簡(jiǎn)單制片觀察外培養(yǎng)期間無(wú)需其他的工作量，更為經(jīng)濟(jì)實(shí) 用。
[0033] 相比②基于抗體的檢測(cè)技術(shù)，本發(fā)明可提高鑲刀菌的檢測(cè)靈敏度、減少檢測(cè)成本。
[0034] 相比④基于鑲刀菌分離的檢測(cè)方法，本發(fā)明除了④所具有的經(jīng)濟(jì)性之外，可顯著 減少其他真菌污染，篩選檢測(cè)周期大大縮短，顯著提高了工作效率。
[0035] 綜上，本發(fā)明方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)各類樣品中的鑲刀菌進(jìn)行經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便和快速分離檢測(cè) 的目的。該方法更廣譜、檢測(cè)靈敏度更高、周期更短、成本更低?？娠@著提高鑲刀菌的檢測(cè)效 率。本發(fā)明可應(yīng)用于海關(guān)檢疫中的鑲刀菌檢疫、種子鑲刀菌檢測(cè)和糧食鑲刀菌檢測(cè)等。
【附圖說(shuō)明】
[0036] 圖1為實(shí)施例一中玉米種懦2000的分離情況對(duì)比；
[0037] 圖2為實(shí)施例一中玉米須的分離情況對(duì)比；
[0038] 圖3為實(shí)施例一中顯微鏡觀察到的疑似鑲刀菌；
[0039] 圖4 PCR檢測(cè)對(duì)比試驗(yàn)中樣品DNA及EFl-a基因 PCR凝膠電泳。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 本發(fā)明一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，樣品中鑲刀菌的快速分離檢測(cè)方法包括下述的步 驟：
[0041] 1)樣品處理
[0042] 樣品取樣無(wú)限制，可取材于無(wú)鑲刀菌病癥、菌體含量較少的樣品，例如取材于玉米 種、玉米須、巧白等。
[0043] 液體樣品可直接用于涂皿；固體樣品則取0.5-lg，加適量無(wú)菌水，在無(wú)菌條件下研 磨后取液汁涂皿。
[0044] 2)分離培養(yǎng)基的準(zhǔn)備
[0045] 分離培養(yǎng)基：按質(zhì)量百分比計(jì)含0.4 % -1 %碳源、1.5-2 %瓊脂粉，0.15-0.3 % K2HPO4，0.1-0.3 %MgS〇4，0.1-0.3 % CaCl2，0.3-0.5 % CaC〇3，抑 6.5-7，不含任何氮源。所述 碳源為薦糖、葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖和甘露醇中的一種或幾種。
[0046] 配置的培養(yǎng)基裝瓶密封后經(jīng)高溫高壓滅菌處理。滅菌好的培養(yǎng)基可立即使用或放 置待用。培養(yǎng)基倒皿前加入適當(dāng)濃度的抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的一種或多種抗生素，優(yōu)選培養(yǎng)基中 每種抗生素濃度為100微克/毫升左右。平皿中倒入的培養(yǎng)基厚度不小于4mm。
[0047] 3)涂皿培養(yǎng)
[004引取樣品液體50-200微升于涂布于上述分離培養(yǎng)基平皿中，不要封口 W保持透氣。 隨后將平皿倒扣置于恒溫培養(yǎng)箱中，28~30°C培養(yǎng)2~3天。
[0049] 4)挑取白色半透明氣生菌絲顯微觀察
[0050] 在培養(yǎng)好的平皿中雜菌非常稀少。在載玻片上滴上一滴含有15-30%甘油的水滴； 用無(wú)菌、尖細(xì)的器具從平皿中單菌落上挑取白色半透明氣生菌絲(在本發(fā)明培養(yǎng)基上有此 特征的菌絲一般即為鑲刀菌），分散于載片水滴上即可用于顯微觀察檢測(cè)?？蒞憑實(shí)驗(yàn)人員 的鑲刀菌形態(tài)區(qū)分經(jīng)驗(yàn)來(lái)判斷是否鑲刀菌，或者利用"鑲刀菌顯微圖像處理與識(shí)別系統(tǒng)" (王國(guó)斌.鑲刀菌顯微圖像處理與識(shí)別系統(tǒng)開(kāi)發(fā)[D].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010;郭靈，趙艷，劉永 福，等.鑲刀菌圖像識(shí)別系統(tǒng)的研究與開(kāi)發(fā)[J].農(nóng)機(jī)化研究，2011,33(07) :122-124.)等軟 件進(jìn)行鑲刀菌的判斷。至此，樣品中的鑲刀菌快速分離檢測(cè)工作已完成。
[0051] 顯微鏡觀察的人工經(jīng)驗(yàn)或軟件判斷方法都是可靠的判斷方式;但也可最終通過(guò)真 菌分子鑒定方法、比如口S、18S和28S DNA序列測(cè)序等進(jìn)一步確定。
[0052] 5)若用上述分離到的鑲刀菌用于其他研究工作
[0053] 只需要挑取單菌落上的白色半透明氣生菌絲接種于常用真菌液體培養(yǎng)基進(jìn)一步 培養(yǎng)即可。
[0054] 該步驟可W采用常用的真菌液體培養(yǎng)基，或者用上述的液體分離培養(yǎng)基（即不加 瓊脂，其他組分及配比與步驟2相同）。
[0化日]6)菌株鑒定
[0056] 為了證明上述第4)步分離得到的是否是鑲刀菌，挑取菌絲經(jīng)第5)步培養(yǎng)提取DNA 后，進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增測(cè)序。所用真菌ITS序列引物為ITS1和ITS4(ITS 1:5'-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG-3'，ITS 4:5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3'）。
[0057] 實(shí)施例一鑲刀菌分離檢測(cè)優(yōu)選實(shí)驗(yàn)
[0058] 配置幾種固體培養(yǎng)基，高壓高溫滅菌后備用。幾種培養(yǎng)基成分含量分別為：
[0化9]① PPA:D-半乳糖 1%、蛋白腺0.5%、Κ出P〇4 0.1%，MgS〇4 0.05%、瓊脂粉2%，pH值 6.8;倒平皿時(shí)加入五氯硝基苯(PCNB)使其終濃度為150微克/毫升，加入鏈霉素和頭抱霉素 終濃度各為100毫克/毫升。
[0060]②PDA: 200g去皮馬鈴馨煮水過(guò)濾汁約800ml，加20g葡萄糖、20瓊脂粉，自然抑值， 加純水定容至化;倒平皿時(shí)加入鏈霉素和頭抱霉素終濃度各為100毫克/毫升。
[006。 ③本發(fā)明的分離培養(yǎng)基：1 %薦糖、1.7 %瓊脂粉，0.2 % K2HPO4，0.25 %MgS04， 0.25 %化CI2，0.4 %化CO3，抑值7.0;倒平皿時(shí)加入鏈霉素和頭抱霉素終濃度各為100毫克/ 毫升。
[0062]研鉢經(jīng)11(TC烘烤2小時(shí)，冷卻到室溫后，加入3ml無(wú)菌水使樣品研磨后有足夠的液 體;分別稱取約〇.5g玉米種"懦2000"(買自市場(chǎng))和0.5玉米須(來(lái)自長(zhǎng)沙田間），分別放入研 鉢中搗碎、攬拌均勻。各吸取200微升水液分別涂布于上述①-③Ξ種培養(yǎng)基中，蓋上平皿蓋 子后不封口，倒扣平皿放置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。
[0063] 挑取氣生菌絲，分散于含15%甘油水滴中，在顯微鏡下鏡檢。
[0064] 結(jié)果1玉米種"懦2000"的分離情況如圖1:PDA培養(yǎng)基中很快被其他霉菌長(zhǎng)滿，幾 乎覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿，少數(shù)幾個(gè)單獨(dú)的菌落經(jīng)顯微鏡觀察，無(wú)鑲刀菌特征的菌落。PPA培養(yǎng)基 中有16個(gè)絲狀真菌菌落，經(jīng)顯微鏡鏡檢有1個(gè)疑似鑲刀菌菌落。在本發(fā)明的"分離"培養(yǎng)基 中，只有3個(gè)長(zhǎng)有稀疏白色半透明氣生菌絲的菌落（由于背景是白色培養(yǎng)基，圖上看不出菌 落，但實(shí)樣中可肉眼看到）；經(jīng)顯微鏡檢查3個(gè)均為疑似鑲刀菌。
[0065] 結(jié)果2玉米須的分離情況如圖2:PDA培養(yǎng)皿中被大量真菌長(zhǎng)滿覆蓋，無(wú)法挑出單 菌落;嘗試挑取10個(gè)不同菌落的菌絲，經(jīng)顯微鏡觀察均無(wú)疑似鑲刀菌。在PPA培養(yǎng)皿中有大 量真菌單菌落，其中絲狀真菌菌落有69個(gè)，經(jīng)顯微鏡觀察，有2個(gè)疑似鑲刀菌菌落。在本發(fā)明 的"分離"培養(yǎng)基中，有5個(gè)有稀疏白色半透明氣生菌絲的菌落（由于背景是白色培養(yǎng)基，圖 上看不出稀疏白色半透明氣生菌絲的菌落），經(jīng)顯微鏡觀察均為疑似鑲刀菌。
[0066] 對(duì)玉米種"懦2000"和玉米須的分離統(tǒng)計(jì)情況如表1，從"成功率"上看，本發(fā)明在分 離檢測(cè)上成功率顯著提高，在我們的多次實(shí)驗(yàn)中成功率達(dá)100%。從篩選過(guò)程看，常用的PDA 真菌培養(yǎng)基各種真菌污染非常嚴(yán)重，難W分離出鑲刀菌;而PPA雖然有部分篩選作用，但在 對(duì)不同材料篩的篩選過(guò)程中仍存在較嚴(yán)重的雜菌污染，分離效率仍較低;從結(jié)果看，與現(xiàn)有 技術(shù)相比，本發(fā)明可極大程度的抑制其他真菌類雜菌，快速分離檢測(cè)到鑲刀菌。
[0067] 表1兩種材料在不同培養(yǎng)基中分離鑲刀菌的情況 [006引
[0069] 表注:成功率=鑲刀菌菌落數(shù)/絲狀真菌菌落數(shù)X 100%。
[0070] 從玉米種"懦2000"分離到的絲狀真菌中的疑似鑲刀菌如圖3曰。經(jīng)分離培養(yǎng)基的液 體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后提取DNA，用真菌ITSUIT^引物（ITS 1:5'-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG-3'，ITS 4:5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI 上Blastn比對(duì)，與F'usa;riumve;rticillioides的相似性為99%，證明分離到的該菌就是鑲 刀困。
[0071] 測(cè)序獲得的序列為
[0072] >ITS Fusarium verticillioides

[0074] 從玉米須中分離到的絲狀真菌中的疑似鑲刀菌如圖3b。經(jīng)真菌ITS1、IT^引物進(jìn) 行擴(kuò)增后在NCBI上Blastn比對(duì)，結(jié)果與F'usarium proliferatum strain H10的相似性為 100%，證明分離到也是鑲刀菌。
[0075] 測(cè)序獲得的序列為
[007引 WPCR檢測(cè)技術(shù)作為對(duì)比實(shí)驗(yàn)
[0079] 為驗(yàn)證PCR的檢測(cè)方法是否適用于玉米種"懦2000"和玉米須中的鑲刀菌檢測(cè)。分 別提取"懦2000"、玉米須（與W上"實(shí)施例一"的實(shí)驗(yàn)為同一批取樣）和純化后化sarium vertici 11 ioides和F'usarium proliferatum的樣品總DNA。根據(jù)鑲刀菌EFl-a基因 (Translation Elongation Factor 1-al地a gene)同源序列設(shè)計(jì)的一對(duì)引物EFl-aF:5 ATGGGTAAGGAGGACAAGACTCAC-3'和邸 1-aR: 5'-GAGCGACAACATACCAATGACGG-3'，對(duì)樣品DNA進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖4。
[0080] 圖4中4個(gè)樣品的基因組DNA均已提取成功，但用該DNA作為PCR模板進(jìn)行EFl-a基因 片段擴(kuò)增時(shí)，只有F. vei·tiCi 11 i0ideS和F. pro 1 if eratum樣品的DNA模板能擴(kuò)增出目的帶， 而玉米種懦2000和玉米須樣品無(wú)法擴(kuò)增出目的帶。因此，對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明：在目的 細(xì)胞(鑲刀菌)含量較少的樣品中，通過(guò)基于PCR技術(shù)的檢測(cè)方法并不足夠靈敏，無(wú)法檢測(cè)出 樣品中含有的少量鑲刀菌;而本發(fā)明的方法可W分離檢測(cè)出含量很低的鑲刀菌。
[0081] 實(shí)施例二分離檢測(cè)巧白中的鑲刀菌
[0082] 該實(shí)施例與實(shí)施例一不同的地方是:從菜市場(chǎng)上購(gòu)買的巧白作為材料；只配制分 離培養(yǎng)基的固體和液體兩種培養(yǎng)基，成分含量為:0.5%甘露醇、2%瓊脂粉(液體培養(yǎng)基不 加瓊脂粉），0.3%K2HP04，0.1 %MgS〇4，0.1 %CaCl2，0.5%CaC〇3，pH值6.5。
[0083] 培養(yǎng)出來(lái)的白色半透明菌絲經(jīng)顯微鏡觀察初步判斷為鑲刀菌。經(jīng)分離液體培養(yǎng)基 進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)提取DNA后用真菌ITS1和ITS4引物擴(kuò)增測(cè)序；測(cè)序的序列在NCBI上進(jìn)行 Blastn比對(duì)，結(jié)果與F'usarium chlamydosporum strain NZD-mfll2有100%的相似性。至今 尚無(wú)報(bào)道在巧白中分離或檢測(cè)到鑲刀菌的相關(guān)報(bào)道，本實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明能廣泛的應(yīng)用到 各種樣品中鑲刀菌的分離鑒定！

[0086]從上述實(shí)施例中可W看出，本發(fā)明可W高靈敏、低成本的快速分離檢測(cè)各種樣品 中的鑲刀菌。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種樣品中鐮刀菌的快速分離檢測(cè)方法，其特征在于包括： 將樣品涂布于分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述分離培養(yǎng)基成分中不含任何氮源，按質(zhì)量百分 比含：0.4%-1%碳源、1.5-2%瓊脂粉，0· 15-〇·3%Κ2ΗΡ〇4,0· l-〇.3%MgS〇4,0.1-0.3% CaCl2，0.3-0.5%Ca⑶3，pH 6.5-7;該培養(yǎng)基中還含有能抑制細(xì)菌而不抑制真菌的抗生素； 所述碳源為蔗糖、葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖和甘露醇中的一種或幾種； 培養(yǎng)好后從單菌落上挑取白色半透明氣生菌絲，顯微觀察根據(jù)細(xì)胞形態(tài)特征判斷是否 為鐮刀菌。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樣品中鐮刀菌的快速分離檢測(cè)方法，其特征在于所述樣品取 自玉米種、玉米須或菱白。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的樣品中鐮刀菌的快速分離檢測(cè)方法，其特征在于所述能抑 制細(xì)菌而不抑制真菌的抗生素為鏈霉素和/或頭孢霉素。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的樣品中鐮刀菌的快速分離檢測(cè)方法，其特征在于平皿中的 分離培養(yǎng)基厚度不小于4毫米;平皿不需密封，保持透氣。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的樣品中鐮刀菌的快速分離檢測(cè)方法，其特征在于所述培養(yǎng) 是置于恒溫培養(yǎng)箱中，28~30 °C培養(yǎng)2~3天。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樣品中鐮刀菌的快速分離檢測(cè)方法，其特征在于在載玻片上 滴上含有15-30%甘油的水滴，將挑取的白色半透明氣生菌絲分散于水滴中，用顯微鏡觀 察，憑經(jīng)驗(yàn)或軟件判定是否鐮刀菌。7. 根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的樣品中鐮刀菌的快速分離檢測(cè)方法，其特征在于通過(guò)真菌 分子鑒定方法進(jìn)一步確定鐮刀菌的種屬。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的樣品中鐮刀菌的快速分離檢測(cè)方法，其特征在于挑取白色半 透明氣生菌絲接種于真菌液體培養(yǎng)基進(jìn)一步培養(yǎng)后，進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增測(cè)序。9. 一種用于樣品中鐮刀菌的快速分離檢測(cè)的培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基成分中不含任 何氮源，按質(zhì)量百分比含:〇.4%-1%碳源、1.5-2%瓊脂粉，0.15-0.3%1( 2冊(cè)04,0.1-0.3% MgSCU，0.1-0.3 % CaCh，0.3-0.5 % CaC〇3，pH 6.5-7;所述碳源為鹿糖、葡萄糖、D-半乳糖、阿 拉伯糖和甘露醇中的一種或幾種。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK106011220SQ201610618080
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月29日
【發(fā)明人】李智敏, 嚴(yán)準(zhǔn), 嚴(yán)理, 高春生, 余永廷, 曾糧斌, 陳佳, 程毅, 孫向平, 薛召東
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所