專利名稱：一種簡單快速適用于細(xì)菌pcr檢測樣品的前處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)細(xì)菌的PCR檢測，尤其適用于PCR檢測的前處理，其方法既簡便又快速。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR方法被用于臨床檢測與傳統(tǒng)的微生物形態(tài)學(xué)、生化反應(yīng)和血清學(xué)方法的鑒定相比，其方法簡單快速、特異、敏感，在合適的條件下，往往幾個(gè)菌就能被檢測出來。但在實(shí)際應(yīng)用中由于臨床樣品中含有大量抑制PCR反應(yīng)的復(fù)雜成分，限制了其方法普遍應(yīng)用。一般的檢測程序通常大多是首先采用感染樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)，然后劃板分離得到純化菌再培養(yǎng)后進(jìn)行初步鑒定，其中包括形態(tài)學(xué)比如菌落形態(tài)、染色等鑒定，有時(shí)還需要生化和血清學(xué)鑒定相配合，步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，從而大大限制了后續(xù)的PCR檢測的實(shí)際應(yīng)用。目前也有研究報(bào)道，有途徑拓展PCR的應(yīng)用問題。例如中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院許文濤等在2009年17 (4)的《農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)》發(fā)表的題為《稻種PCR抑制因子的3種去除方法》論文中披露了 3種去除這些抑制物質(zhì)的方法，即DNA樣品稀釋法， 硅膜純化基因組法和低熔點(diǎn)瓊脂糖純化法；其中DNA樣品稀釋法去除抑制因子最簡便快捷等。另外還有北京軍事醫(yī)學(xué)院疾病預(yù)防控制所傳染病控制中心趙紅慶等在2007年18(5) 《生物技術(shù)通訊》發(fā)表的題為《多重PCR技術(shù)在病原檢測中的應(yīng)用》綜述了多重PCR在細(xì)菌病原體的檢測，病毒病原體的檢測，支原體衣原體及寄生蟲的檢測，微生物耐藥性檢測等方面的應(yīng)用。又如在樣本檢測中，采用試劑盒能夠從糞便標(biāo)本中提取DNA并有效去除抑制物， 如天根公司的QIAamp DNA Stool Mini Kit，該試劑盒使用硅膠膜技術(shù)，可以從新鮮或冷凍人糞便及其他帶有高濃度PCR抑制物的樣品中純化DNA。但畢竟需要購買試劑盒，使成本大大增加，從而也限制了 PCR檢測的實(shí)際應(yīng)用。尤其外對(duì)糞便樣本的處理方法較多，有浮力密度離心過濾法、兩步過濾法、核酸吸附矩陣法、金屬氫氧化物吸附法、酚抽提法等，都是相對(duì)比較繁瑣的處理方法。另山東省農(nóng)科院奶牛研究中心馬廣強(qiáng)等人在2006年22期0)153 頁《中國人獸共患病雜志》發(fā)表的“直接從糞便中檢測致牛犢腹瀉產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的雙重 PCR方法的建立與應(yīng)用》披露依據(jù)腸毒素大腸桿菌產(chǎn)生的毒素基因序列，設(shè)計(jì)了兩種引物， 建立多重PCR方法。本發(fā)明與此對(duì)照，目的都是去除抑制物，但是盲菌培養(yǎng)與針對(duì)引物的擴(kuò)菌培養(yǎng)有獨(dú)到之處。簡單快速的前處理方法，可有效的去除標(biāo)本中的PCR抑制物，消除臨床標(biāo)本對(duì)PCR反應(yīng)的抑制作用，避免假陰性結(jié)果出現(xiàn)。將為拓展PCR檢測的應(yīng)用，產(chǎn)生了極強(qiáng)的實(shí)用效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供適用于PCR檢測的樣品的前處理方法，即簡單又易行，能使PCR檢測方法在臨床樣品的應(yīng)用中既簡便又快速，拓展其方法的實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種簡單快速適用于細(xì)菌PCR檢測樣品的前處理方法，在無菌操作下取需量的病變組織、分泌物或糞便的臨床樣本，接種于增菌培養(yǎng)液中，在 37°C下恒溫培養(yǎng)12-16小時(shí)；無菌條件下取需量的培養(yǎng)液，再次接種于同種增菌液中，振蕩培養(yǎng)4-6小時(shí)；取l-2ml菌液離心，轉(zhuǎn)速為5000轉(zhuǎn)/min，5-6分鐘得到菌體沉淀；用雙蒸水洗滌菌體2-3遍后，加入IOOul無菌雙蒸水懸浮，在100°C下煮沸約10-12分鐘，離心，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/min，3-4分鐘得上清液，即為菌粗制DNA，再進(jìn)行后續(xù)的PCR分型檢測即可。所述的PCR檢測的前處理方法，實(shí)驗(yàn)檢測中作為陽性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)(或參考)菌株均購自中國菌種保藏中心。所述的PCR檢測的前處理方法，選用的實(shí)驗(yàn)材料均為市售產(chǎn)品。本發(fā)明構(gòu)思的樣本的前處理方法關(guān)鍵是使待檢細(xì)菌模板拷貝數(shù)進(jìn)一步增加的同時(shí)去除了臨床樣本增菌培養(yǎng)時(shí)帶入的影響后續(xù)PCR反應(yīng)的抑制成分。但由于樣品中PCR抑制物的存在，必須摸索DNA濃度在相對(duì)的稀釋度內(nèi)方能檢測的條件，避免樣本中抑制物干擾的不確定性及假陰性的結(jié)果產(chǎn)生。本方法通過無菌操作取少許臨床樣本在增菌培養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)細(xì)菌，達(dá)到增菌的目的，然后取少許培養(yǎng)后的增菌液進(jìn)行再一次接種以重復(fù)培養(yǎng)，達(dá)到富集細(xì)菌同時(shí)去除樣本中其他成分的目的。最后按常規(guī)操作收集菌體，進(jìn)行后續(xù)的PCR檢測，結(jié)果表明，得到的菌體DNA足以達(dá)到PCR擴(kuò)增要求，即獲得擴(kuò)增結(jié)果，從而達(dá)到檢測的目的。本發(fā)明將該方法直接應(yīng)用臨床標(biāo)本，包括組織、血液、分泌物及其糞便標(biāo)本等，其中糞便標(biāo)本中含有能夠抑制PCR擴(kuò)增的多種成分，是臨床標(biāo)本中最難提取核酸及擴(kuò)增的標(biāo)本。對(duì)于糞便樣本來說，如何去除糞便中PCR反應(yīng)的抑制物是有效的制備DNA模板最關(guān)鍵的一步。該發(fā)明無論是理論分析和實(shí)驗(yàn)證明，這種臨床樣本處理方法可以大大提高臨床樣本用于PCR檢測的特異性和敏感性，避免了假陰性的結(jié)果，同時(shí)對(duì)于早期感染或隱性攜帶者的活體檢測也將很有幫助。本發(fā)明方法成功的解決了 PCR檢測前處理的繁瑣、時(shí)間長的限制瓶頸，通過對(duì)樣品病原菌的富集，大量核酸的獲取，PCR抑制物的去除，使其后續(xù)PCR檢測的特異性和敏感性增加，彰顯技術(shù)進(jìn)步。


下面將結(jié)合附圖對(duì)發(fā)明作進(jìn)一步說明。附圖1-1巴氏桿菌不同型標(biāo)準(zhǔn)株的多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析參照?qǐng)D，從左至右l、DL2000，2-4依次為巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株A、B、E型，5為陰性對(duì)照。附圖1-2病死牛不同組織樣品經(jīng)前處理后的多重PCR產(chǎn)物的凝膠電泳分析圖，多重PCR檢測結(jié)果從左至右1、DL2000, 2、巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株A型標(biāo)準(zhǔn)株陽性對(duì)照，3_5依次為肺、肝、脾，6、陰性對(duì)照。附圖2-1產(chǎn)氣莢膜梭菌不同型標(biāo)準(zhǔn)株多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析參照?qǐng)D， 從左至右1、DL2000，2-4依次為產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)株A、B、C、D型，5為陰性對(duì)照。附圖2-2病死羊不同組織樣品經(jīng)前處理后的多重PCR產(chǎn)物的凝膠電泳分析圖，多重PCR檢測結(jié)果從左至右1、DL2000，2、產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)株D株陽性對(duì)照，3-7依次為肺、 肝、脾、腸內(nèi)膜、糞便，8、陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例細(xì)菌PCR檢測樣品的前處理方法，應(yīng)用于巴氏桿菌感染樣品及產(chǎn)氣莢膜梭菌感染樣品的檢測一、巴氏桿菌感染樣品的多重PCR檢測；取羊肺炎病料包括肺、肝和脾組織；無菌操作將少許病變組織(肺、肝、脾)各接種于含TSB (大豆胰蛋白胨)培養(yǎng)液中，37°C恒溫培養(yǎng)，12小時(shí)；無菌操作用接種環(huán)蘸取少許培養(yǎng)液接入到TSB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)證；取 Iml 菌液，離心 5000 轉(zhuǎn) /min, 5min ；棄上清保留菌沉淀，用無菌雙蒸水洗2遍；加入IOOul無菌雙蒸水懸浮。100°C煮沸約10分鐘左右；離心12000轉(zhuǎn)/min，3min,上清為菌粗制DNA。PCR分型檢測包括PCR反應(yīng)液，巴氏桿菌血清型A、B、E三對(duì)特異引物組合，菌DNA 模板的制備；其中巴氏桿菌的反應(yīng)的退火溫度為55°C ；擴(kuò)增體系為10倍buffer(含 Mg2+)5. 0ul,dNTP 1. 5ul (10mmol/l)，3 對(duì)特異上下游引物各 1. Oul (10umol/l)，Taq DNA 聚合酶2. 5U，模板10ul，用雙蒸水補(bǔ)足至50ul ；PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95°C 5分鐘預(yù)變性；然后94°C 30秒，550C 30秒，72°C 45秒，共30個(gè)循環(huán)后再72°C 10分鐘延伸；其中巴氏桿菌PCR產(chǎn)物的凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后，3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株的核酸樣品均可擴(kuò)增出與試驗(yàn)設(shè)計(jì)大小相符目的條帶；C403-A株(巴氏桿菌A型)樣品擴(kuò)增出了 1044bp和460bp兩條帶，C405-B株(巴氏桿菌B型)擴(kuò)增出了 760bp和460bp兩條帶， C393-E株(巴氏桿菌E型)擴(kuò)增出了 5 Ilbp和460bp兩條帶，圖1_1為巴氏桿菌A\B\E三株標(biāo)準(zhǔn)菌株的PCR電泳結(jié)果作為參照。圖1-2為羊肺炎臨床組織樣品經(jīng)過前處理后PCR檢測結(jié)果，根據(jù)擴(kuò)增片段大小確定有巴氏桿菌A型感染。二、產(chǎn)氣莢膜梭菌感染樣品檢測；取羊羔猝死剖檢樣品，包括肝、脾、肺、腸和糞便；無菌操作，將樣品分別接種于厭氣肝湯中，37°C恒溫厭氧培養(yǎng)，12小時(shí)；無菌操作用接種環(huán)蘸取少許培養(yǎng)液接入到厭氣肝湯中，37°C恒溫厭氧培養(yǎng)，12 小時(shí)；取 Iml 菌液，離心 5000 轉(zhuǎn) /min, 5min ；棄上清保留菌沉淀，用無菌雙蒸水洗2遍；加入IOOul無菌雙蒸水懸浮。100°C煮沸約10分鐘左右；離心12000轉(zhuǎn)/min，3min,上清為粗制菌DNA。PCR分型檢測包括PCR反應(yīng)液，巴氏桿菌血清型A、B、E三對(duì)特異引物組合，菌DNA 模板制備；其中巴氏桿菌的反應(yīng)的退火溫度為55°C ；擴(kuò)增體系為10倍buffer(含 Mg2+)5. Oul,dNTP 1. 5ul (10mmol/l)，3 對(duì)特異上下游引物各 1. Oul (10umol/l)，Taq DNA 聚合酶2. 5U，模板10ul，用雙蒸水補(bǔ)足至50ul ；PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95°C 5分鐘預(yù)變性；然后94°C 30秒，550C 30秒，72°C 45秒，共30個(gè)循環(huán)后再72°C 10分鐘延伸；
其中巴氏桿菌PCR產(chǎn)物的凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后，3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株的核酸樣品均可擴(kuò)增出與試驗(yàn)設(shè)計(jì)大小相符目的條帶；C403-A株(巴氏桿菌A型)樣品擴(kuò)增出了 1044bp和460bp兩條帶，C405-B株(巴氏桿菌B型)擴(kuò)增出了 760bp和460bp兩條帶， C393-E株(巴氏桿菌E型)擴(kuò)增出了 5 Ilbp和460bp兩條帶，圖2_1為巴氏桿菌A\B\E三株標(biāo)準(zhǔn)菌株的PCR電泳結(jié)果作為參照。圖2-2為臨床組織樣品經(jīng)過前處理后PCR檢測結(jié)果， 根據(jù)擴(kuò)增片段大小確定有巴氏桿菌A型感染。 以上檢測中所用作為陽性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)菌株均購自中國菌種保藏中心。
權(quán)利要求
1.一種簡單快速適用于細(xì)菌PCR檢測樣品的前處理方法，其特征在于在無菌操作下取需量的病變組織、分泌物或糞便的臨床樣本，接種于增菌培養(yǎng)液中，在37°C下恒溫培養(yǎng) 12-16小時(shí)；無菌條件下取需量的培養(yǎng)液，再次接種于同種增菌液中，振蕩培養(yǎng)4-6小時(shí)；取 l-2ml菌液離心，轉(zhuǎn)速為5000轉(zhuǎn)/min，5-6分鐘得到菌體沉淀；用雙蒸水洗滌菌體2_3遍后， 加入IOOul無菌雙蒸水懸浮，在100°C下煮沸約10-12分鐘，離心，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/min，3-4 分鐘得上清液，即為菌粗制DNA，再進(jìn)行后續(xù)的PCR分型檢測即可。
2.按照權(quán)利要求1所述的PCR檢測的前處理方法，其特征在于實(shí)驗(yàn)檢測中作為陽性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)(或參考)菌株均購自中國菌種保藏中心。
3.按照權(quán)利要求1所述的PCR檢測的前處理方法，其特征在于選用的實(shí)驗(yàn)材料均為市售產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明提供的一種簡單快速適用于細(xì)菌PCR檢測樣品的前處理方法，在無菌操作下取需量的病變組織、分泌物或糞便的臨床樣本，接種于增菌培養(yǎng)液中，在37℃下恒溫培養(yǎng)12-16小時(shí)；無菌條件下取需量的培養(yǎng)液，再次接種于同種增菌液中，振蕩培養(yǎng)4-6小時(shí)；取1-2ml菌液離心，轉(zhuǎn)速為5000轉(zhuǎn)/min，5-6分鐘得到菌體沉淀；用雙蒸水洗滌菌體2-3遍后，加入100ul無菌雙蒸水懸浮，在100℃下煮沸約10-12分鐘，離心，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/min，3-4分鐘得上清液，即為菌粗制DNA，再進(jìn)行后續(xù)的PCR分型檢測即可。實(shí)驗(yàn)檢測中作為陽性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)(或參考)菌株均購自中國菌種保藏中心。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102242185SQ201010171590
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2010年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日
發(fā)明者李建軍, 楊學(xué)云, 段新華, 王志才, 王登峰 申請(qǐng)人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院