本發(fā)明涉及赤霉素殘留，尤其涉及一種葉菜赤霉素殘留檢測樣品前處理方法。同時本發(fā)明還涉及葉菜赤霉素殘留檢測方法。

背景技術(shù)：

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的植物生長調(diào)節(jié)劑大部分是以天然的五大植物激素為先導(dǎo)，經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造衍生而來，是具有植物激素活性的人工合成的化學(xué)物質(zhì)，具有增強(qiáng)抗逆性、改善品質(zhì)、增加產(chǎn)量等作用。近年來，隨著設(shè)施農(nóng)業(yè)、反季節(jié)栽培等高效農(nóng)業(yè)的飛速發(fā)展，我國植物生長調(diào)節(jié)劑產(chǎn)量增長幅度很大，每年遞增量達(dá)幾千噸。植物生長調(diào)節(jié)劑屬于農(nóng)藥，具有一定的毒性，使用不當(dāng)可能會引起人畜的急、慢性中毒，導(dǎo)致疾病的發(fā)生，甚至影響到下一代的健康。

目前對于植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測，大多采用氣相色譜（GC）、高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS) 及多級質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。由于赤霉素性質(zhì)的特殊性，目前國內(nèi)外所建立的赤霉素分析前處理方法主要基于傳統(tǒng)萃取技術(shù)和SPE等凈化技術(shù)。例如采用甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑萃取結(jié)合SPE或QuEChERS前處理方法，采用PSA、C18、GCB等吸附劑凈化。這些技術(shù)存在提取時間較長，凈化步驟繁瑣費(fèi)時，成本高等不足。此外，目前采用的前處理方法多應(yīng)用于茄果類和瓜果類樣品中，將其應(yīng)用于葉類蔬菜等基質(zhì)較復(fù)雜的樣品處理時，由于存在色素和成復(fù)雜，會出現(xiàn)檢測基線不穩(wěn)定、效果不穩(wěn)定、重現(xiàn)性較差等問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對菠菜、莧菜等葉菜基質(zhì)成分的特殊性以及目前赤霉素檢測前處理過程中存在的問題，本發(fā)明提供一種準(zhǔn)確度較高、重現(xiàn)性較好、耗時短、操作簡便的葉菜赤霉素殘留檢測樣品的前處理方法。

本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：一種葉菜赤霉素殘留檢測樣品的前處理方法，將葉菜組織打碎，然后加入提取試劑、無水硫酸鎂和無水乙酸鈉，進(jìn)行渦旋提取，提取結(jié)束后離心分離，所得的上清液經(jīng)微孔濾膜過濾后，即得葉菜赤霉素檢測樣品溶液。

所述葉菜與含有乙酸的甲醇的質(zhì)量體積比為1：3~4。本發(fā)明中含有乙酸的甲醇優(yōu)選含有1~2%乙酸的甲醇溶液。

所述無水硫酸鎂的添加量0.05-0.2g/mL。所述無水乙酸鈉的添加量0.01-0.05g/mL。

所述渦旋提取條件：渦旋提取時間1~5分鐘，高速離心，離心轉(zhuǎn)速5000rpm，離心5min。

本發(fā)明另一個目的是提供一種葉菜赤霉素殘留檢測方法。該方法采用上述前處理方法對葉菜樣品進(jìn)行處理，獲得樣品溶液，然后進(jìn)行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法進(jìn)行檢測，最終獲得葉菜中赤霉素的含量。

具體地，一種葉菜赤霉素殘留檢測方法，包括以下步驟：

(1) 樣品的預(yù)處理：將葉菜組織打碎，然后加入提取試劑、無水硫酸鎂和無水乙酸鈉，進(jìn)行渦旋提取，提取結(jié)束后離心分離，所得的上清液經(jīng)微孔濾膜過濾后，即得葉菜赤霉素檢測樣品溶液；

(2) 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：按照步驟（1）所述的樣品預(yù)處理方法處理不含赤霉素的葉菜樣品，所得的樣品溶液將赤霉素分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.001 mg/L、0.005 mg/L、0.010 mg/L、0.050 mg/L、0.10 mg/L、0.50 mg/L、1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；

(3) 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析：將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液按濃度由低到高用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測定，以定量離子峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程；然后在相同條件下將前處理的樣品液用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測定，采用外標(biāo)法計(jì)算待測赤霉素殘留量的測定值。

所述步驟(3)中，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件如下：

色譜柱：島津Shim-pack XR-ODSIII ,2.0mm×75mm, 1.6 μm；

流動相A：0.1%（v%）甲酸水；流動相B：乙腈；

梯度洗脫程序：0～2 min, 10%流動相B；2～5 min, 10%~95%流動相B；5～7 min, 95%流動相B；7.1 min, 10%流動相B；

流速：0.3 mL/min；

柱溫：40℃；

進(jìn)樣量：1μL；

電噴霧ESI離子源，負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）檢測；

霧化氣流速：3 L/min；

加熱氣流速：10 L/min；

干燥氣流速：10 L/min；

離子源接口溫度：300℃；

脫溶劑溫度：250℃；

加熱塊溫度：400℃。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.耗時短、步驟簡單、成本低：本發(fā)明提供的葉菜中赤霉素殘留檢測樣品前處理方法為稀釋法，經(jīng)過對提取溶劑種類、提取溶劑量、提取時間、提取鹽各因素的優(yōu)化，采用甲醇和乙酸的混合溶劑作為赤霉素殘留的提取劑，采用渦旋提取代替?zhèn)鹘y(tǒng)的振蕩提取，高速離心代替?zhèn)鹘y(tǒng)的抽濾，無需采用吸附劑進(jìn)行凈化，離心后直接過濾膜進(jìn)樣檢測，操作簡便快速，極大地簡化了樣品預(yù)處理步驟，節(jié)約了時間和成本提高了前處理效率。

2.準(zhǔn)確度、精密度高：本發(fā)明提供的檢測方法，考慮到液相色譜-質(zhì)譜的定性定量分析中，基質(zhì)效應(yīng)影響儀器的靈敏度和重現(xiàn)性，且是影響準(zhǔn)確定性及定量的重要因素，本發(fā)明采用同樣來源的空白樣品進(jìn)行前處理配制成基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，以抵消基質(zhì)效應(yīng)對方法精密度以及結(jié)果準(zhǔn)確度的影響。本發(fā)明提供的檢測方法回收率在70.9%~88.6%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在1.5%~5.8%之間，準(zhǔn)確度高，精密度高，重現(xiàn)性好，完全滿足農(nóng)藥殘留的檢測要求。

3.線性好：本發(fā)明提供葉菜赤霉素殘留檢測的前處理方法和檢測方法，在0.001 mg/L~1.0 mg/L濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999。

4.檢出限地：本發(fā)明檢出限0.001 mg/kg。

附圖說明

圖1為菠菜中赤霉素的線性范圍；

圖2為莧菜中赤霉素的線性范圍。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

(1) 葉菜樣品的前處理：用組織勻漿機(jī)將菠菜打碎，備用。稱取5.00 g樣品，加入20 mL甲醇（含1%乙酸）提取液、1.0 g無水硫酸鎂、0.2 g無水乙酸鈉，渦旋儀渦旋提取2 min；渦旋后以5000 r/min離心5 min；離心后取上層液用尼龍66微孔濾膜進(jìn)行過濾，得待測樣品溶液。

(2)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：按照步驟（1）所述的樣品預(yù)處理方法處理不含赤霉素的葉菜樣品，所得的樣品溶液將赤霉素分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.001 mg/L、0.005 mg/L、0.010 mg/L、0.050 mg/L、0.10 mg/L、0.50 mg/L、1.0 mg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

(3)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析：將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液按濃度由低到高用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測定，以定量離子峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程；然后在相同條件下將前處理所得待測樣品溶液用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測定，采用外標(biāo)法計(jì)算待測赤霉素殘留量的測定值。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件：

色譜條件：色譜柱：島津Shim-pack XR-ODSIII (2.0mm×75mm, 1.6 μm)；

流動相A：0.1%（v%）甲酸水；流動相B：乙腈；

梯度洗脫程序：0～2 min, 10%流動相B；2～5 min, 10%~95%流動相B；5～7 min, 95%流動相B；7.1 min, 10%流動相B；流速：0.3 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：1μL；

質(zhì)譜條件：電噴霧ESI離子源，負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）檢測。

霧化氣流速：3 L/min；加熱氣流速：10 L/min；干燥氣流速：10 L/min；離子源接口溫度：300℃；脫溶劑溫度：250℃；加熱塊溫度：400℃，質(zhì)譜參數(shù)見表1。

方法的線性關(guān)系：赤霉素在菠菜中的線性范圍見圖1 。由圖中可知，在0.001 mg/L~1.0 mg/L范圍內(nèi)，赤霉素呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999以上，以0.001 mg/L基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子對應(yīng)色譜信號的3倍信噪比( S/N )確定方法的檢出限為0.001 mg/kg，且方法準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，完全滿足農(nóng)藥殘留的檢測要求。

方法的精密度和準(zhǔn)確度：方法的精密度以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD判定，方法的準(zhǔn)確度以添加回收率判定。按上述方法在空白菠菜、莧菜樣品中準(zhǔn)確加入0.010、0.10、0.50mg/kg濃度水平的赤霉素，每水平重復(fù)3次，計(jì)算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見表2。由表2 可知，赤霉素在菠菜中添加0.010、0.10、0.50mg/kg濃度水平的平均回收率為70.4%-88.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%-5.8%，試驗(yàn)結(jié)果滿足回收率在70%-120%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%的農(nóng)藥殘留分析要求。

本發(fā)明的菠菜赤霉素殘留檢測方法具備了較高的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性?？捎糜跈z測菠菜中赤霉素殘留，提高測定方法的準(zhǔn)確性。

實(shí)施例2

(1) 葉菜樣品的前處理：將莧菜用組織勻漿機(jī)打碎，備用。稱取5.00 g樣品，加入20 mL甲醇（含1%乙酸）提取液、1.0 g無水硫酸鎂、0.2 g無水乙酸鈉，渦旋儀渦旋提取2 min；渦旋后以5000 r/min離心5 min；離心后取上層液用尼龍66微孔濾膜進(jìn)行過濾，得待測樣品溶液。

(2)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：按照步驟（1）所述的樣品預(yù)處理方法處理不含赤霉素的葉菜樣品，所得的樣品溶液將赤霉素分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.001 mg/L、0.005 mg/L、0.010 mg/L、0.050 mg/L、0.10 mg/L、0.50 mg/L、1.0 mg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

(3)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析：將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液按濃度由低到高用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測定，以定量離子峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程；然后在相同條件下將前處理所得待測樣品溶液用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測定，采用外標(biāo)法計(jì)算待測赤霉素殘留量的測定值。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件：

色譜條件：色譜柱：島津Shim-pack XR-ODSIII (2.0mm×75mm, 1.6 μm)；

流動相A：0.1%（v%）甲酸水；流動相B：乙腈；

梯度洗脫程序：0～2 min, 10%流動相B；2～5 min, 10%~95%流動相B；5～7 min, 95%流動相B；7.1 min, 10%流動相B；流速：0.3 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：1μL；

質(zhì)譜條件：電噴霧ESI離子源，負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）檢測。

霧化氣流速：3 L/min；加熱氣流速：10 L/min；干燥氣流速：10 L/min；離子源接口溫度：300℃；脫溶劑溫度：250℃；加熱塊溫度：400℃，質(zhì)譜參數(shù)見表3。

方法的線性關(guān)系：赤霉素在莧菜中的線性范圍見圖2 。由個圖中可知，在0.001 mg/L~1.0 mg/L范圍內(nèi)，赤霉素呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999以上，以0.001 mg/L基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子對應(yīng)色譜信號的3倍信噪比( S/N )確定方法的檢出限為0.001 mg/kg，且方法準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，完全滿足農(nóng)藥殘留的檢測要求。

方法的精密度和準(zhǔn)確度：方法的精密度以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD判定，方法的準(zhǔn)確度以添加回收率判定。按上述方法在空白莧菜樣品中準(zhǔn)確加入0.010、0.10、0.50mg/kg濃度水平的赤霉素，每水平重復(fù)3次，計(jì)算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見表4。由表4可知，赤霉素在莧菜中添加0.010、0.10、0.50mg/kg濃度水平的平均回收率為70.9%-85.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%-5.2%，試驗(yàn)結(jié)果滿足回收率在70%-120%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%的農(nóng)藥殘留分析要求。

本發(fā)明的莧菜的赤霉素殘留檢測方法具備了較高的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。可用于檢測莧菜中赤霉素殘留，提高測定方法的準(zhǔn)確性。

本發(fā)明可用其他的不違背本發(fā)明的精神或主要特征的具體形式來概述。本發(fā)明的上述實(shí)施例都只能認(rèn)為是對本發(fā)明的說明而不是限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對以上實(shí)施例所作的任何細(xì)微修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。