本發(fā)明涉及樣品中多種核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的測定方法

知識背景

實(shí)時(shí)PCR可以連續(xù)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的產(chǎn)生過程中的標(biāo)記的監(jiān)測。目前，可用的方法為利用標(biāo)記的探針或DNA嵌入染料來監(jiān)控PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增。為了這個(gè)目的，可以利用含有熒光團(tuán)和例如相距10-30個(gè)堿基的淬滅劑的單寡核苷酸探針。由于Taq聚合酶的5'-3'雙鏈特異性核苷酸外切酶活性，這樣的TaqMan探針可以在擴(kuò)增期間被水解，把從所述熒光團(tuán)從淬滅劑上分離，導(dǎo)致熒光增加。通常使用的實(shí)時(shí)PCR儀器配備有熒光檢測器和軟件能夠估計(jì)循環(huán)閾指示值(Ct)，在這個(gè)循環(huán)中熒光比背景熒光更大的，為陽性反應(yīng)。

然而，公認(rèn)的難點(diǎn)在于已公布檢測結(jié)果的不可重復(fù)性，由于PCR熱循環(huán)性能的多變性，不同DNA聚合酶的低效，個(gè)人原因和在樣品基質(zhì)中存在的PCR抑制劑都可以妨礙實(shí)驗(yàn)室的實(shí)施，特別是那些具有廣泛的質(zhì)量保證程序。缺乏可重復(fù)的方法，常常迫使檢測實(shí)驗(yàn)室花費(fèi)大量資源適應(yīng)已公布的測定結(jié)果。因此，有必要具有國際認(rèn)可的，基于公開配方的可獲得的PCR方法，其靶基因，運(yùn)行特性和驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)都是公知的，而且為了替代微生物方法驗(yàn)證遵循ISO標(biāo)準(zhǔn)。

一些已公布的PCR程序的一個(gè)主要缺點(diǎn)是不包含內(nèi)部擴(kuò)增對照。對比(外部)陽性對照，內(nèi)部擴(kuò)增對照是在非常相同的樣品中的不存在靶DNA序列，它可以與靶序列共同擴(kuò)增。在一個(gè)沒有內(nèi)部擴(kuò)增對照PCR中，陰性反應(yīng)(無條帶或信號)可能意味著在反應(yīng)中沒有靶序列的存在。但是，因?yàn)闊嵫h(huán)儀故障，不正確的PCR混合物，DNA聚合酶失活，或特別是樣品基質(zhì)中存在抑制物，它也可能意味著該反應(yīng)被抑制。特別是，提取核苷酸之后，仍可能存在來自臨床樣品(例如血紅蛋白)、環(huán)境樣品(例如，腐殖酸和富里酸)和核苷酸提取(例如乙醇洗滌劑，或離液劑)期間采用的化學(xué)品的抑制劑。當(dāng)PCR受擴(kuò)增抑制劑影響時(shí)，從假陰性中區(qū)分真陰性結(jié)果是可以實(shí)現(xiàn)的。

通過含有能指示PCR抑制劑的存在和影響的內(nèi)部核苷酸對照，可以增加診斷測定法的可靠性。內(nèi)部陽性對照通常與存在的靶序列被同時(shí)擴(kuò)增，其標(biāo)記的熒光團(tuán)可以產(chǎn)生與測定靶序列使用的熒光不同波長的熒光，兩種不同頻道的熒光被實(shí)時(shí)PCR測定儀檢測到。PCR常用的內(nèi)部對照是質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含與測定靶標(biāo)類似的序列，除了探針區(qū)域。有限數(shù)量的內(nèi)部陽性對照分子可被加入到單獨(dú)的靶標(biāo)測定中并與靶核苷酸共同擴(kuò)增。因此，內(nèi)部陽性對照信號是把極少量的靶標(biāo)核苷酸進(jìn)行充分?jǐn)U增到足以產(chǎn)生陽性信號的證據(jù)。

但是，一些設(shè)備如LightCycler1.2和LightCycler2(羅氏應(yīng)用科學(xué)，印第安納波利斯，美國)，加固高級病原鑒定設(shè)備儀(R.A.P.I.D.)(愛達(dá)荷州技術(shù)，鹽湖城，猶他州，美國)，以及手持式實(shí)時(shí)PCR儀僅配備了一個(gè)光源和相關(guān)的排放或者發(fā)射通道。

為了克服這一缺陷，P.Jothikumar等(BioTechniques 46：519524(2009))設(shè)計(jì)創(chuàng)建了一個(gè)三重標(biāo)記探針作為內(nèi)部陽性對照(IPC)，其采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)和TaqMan技術(shù)的組合。IPC探針，5'端用FAM和Cy5.5熒光標(biāo)記，在3'端用黑洞猝滅劑(Black Hole Quencher，BHQ)標(biāo)記，通過來自FAM熒光的能量轉(zhuǎn)移使的Cy5.5發(fā)光。第二，在多重通道的靶標(biāo)特異的TaqMan測定中分別利用5'和3'末端的FAM和BHQ1標(biāo)記的探針。因此，一個(gè)激發(fā)源被用來產(chǎn)生兩種不同的熒光(FAM和Cy5,5)，可以被實(shí)時(shí)PCR儀中的兩個(gè)獨(dú)立的通道檢測到。

Rosenstraus等(Rosenstraus et al.,Journal of Clinical Microbiology,36,191-197(1998))描述了用于常規(guī)診斷性PCR的內(nèi)部對照，其中利用單獨(dú)的，靶子特異的和內(nèi)部對照特異的寡核苷酸捕捉探針，特定靶標(biāo)和內(nèi)部對照在各自的反應(yīng)中被檢測到。

Gruber等(Gruber et al.,Applied and Environmental Microbiology,67,2837-2839(2001))描述了定量病毒DNA的實(shí)時(shí)PCR方法包括雙重?cái)U(kuò)增，內(nèi)標(biāo)，以及雙色熒光檢測，而不需要產(chǎn)生外部標(biāo)準(zhǔn)化曲線。

然而，在本領(lǐng)域仍舊需要檢測多種核苷酸的適當(dāng)?shù)姆椒ǎ鐦悠分械陌袠?biāo)核苷酸和內(nèi)部對照核苷酸。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一些測定例如樣品中多種被分析物的測定。

在一方面，檢測樣品中核苷酸存在和/或存在的數(shù)量的方法包括:

(a)提供

一定數(shù)量的第一核苷酸；

一定數(shù)量的第二核苷酸；

一定數(shù)量FRET化合物，其可以與第一核苷酸形成復(fù)合物，其中FRET化合物包括第一核苷酸特異的結(jié)合區(qū)域，和第一可檢測標(biāo)記，其在未復(fù)合的狀態(tài)時(shí)為第一可檢測特征，在復(fù)合狀態(tài)時(shí)，為不同于第一可檢測特征的第二可檢測特征；一定數(shù)量的報(bào)告化合物，可以與第二核苷酸形成復(fù)合物，其中每一個(gè)報(bào)告化合物包括與第二核苷酸特異的結(jié)合區(qū)域和第二可檢測標(biāo)記；并且能夠捕捉報(bào)告化合物的結(jié)合成員；其中第二核苷酸與報(bào)告化合物形成的復(fù)合物抑制了結(jié)合成員對報(bào)告化合物的捕捉；

(b)形成復(fù)合物，每一個(gè)形成的復(fù)合物包括一個(gè)第一核苷酸和一個(gè)FRET化合物；

(c)一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集與一個(gè)第二核苷酸形成復(fù)合物；

(d)捕捉剩余的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸復(fù)合的報(bào)告化合物的子集；

(e)測定被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值；

(f)測定結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值。

該方法進(jìn)一步包括測定第二核苷酸存在和/或存在數(shù)量的指示值，該指示值的測定是基于結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物存在和/或存在數(shù)量的指示值。

在一些實(shí)施例中，F(xiàn)RET化合物的第一和/或第二可檢測標(biāo)記是熒光標(biāo)記。特別的，第一可檢測標(biāo)記和第二可檢測標(biāo)記釋放的光譜范圍都為300nm至850nm，例如450nm至750nm或550nm至650nm。在一個(gè)實(shí)例中，第一可檢測標(biāo)記和第二可檢測標(biāo)記是完全相同的。

被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值可以用復(fù)合狀態(tài)的FRET化合物被檢測到。

另外，第一核苷酸可以是一種被分析物，例如一種第一被分析物。第二核苷酸可以從被分析物的組合中選取，例如第二被分析物，和對照核苷酸。對照核苷酸可以從陽性擴(kuò)增對照和陰性擴(kuò)增對照中選擇。

在一些實(shí)施例中，每個(gè)樣品中第一核苷酸的存在數(shù)量可以少于100個(gè)拷貝數(shù)。另外或可選擇的，每個(gè)樣品中第二核苷酸的存在數(shù)量可以是100個(gè)拷貝數(shù)或更多。

進(jìn)一步，以下步驟是可以同時(shí)進(jìn)行的，(i)每一個(gè)形成的復(fù)合物包括第一核苷酸和FRET化合物，(ii)一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集和至少一定數(shù)量的第二核苷酸子集組成復(fù)合物，(iii)捕捉剩余的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸復(fù)合的一定數(shù)量的報(bào)告化合物的子集。

根據(jù)另一實(shí)施例，該方法還包括以所述第一和/或第二核苷酸為目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增。或者，如在以第一和/或第二核苷酸為目標(biāo)進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的情況下，核苷酸在一定數(shù)量的報(bào)告化合物的子集和至少一定數(shù)量的第二核苷酸形成復(fù)合物的步驟之前，第一和第二核苷酸的擴(kuò)增被啟動。此外，如在第一和/或第二核苷酸進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的情況下，以下步驟可以同時(shí)進(jìn)行，(i)每一個(gè)形成的復(fù)合物包括第一核苷酸和FRET化合物，(ⅱ)一定數(shù)量的報(bào)告化合物的子集和至少一定數(shù)量的第二核苷酸形成復(fù)合物，(ⅲ)捕捉剩余的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸的復(fù)合的報(bào)告化合物的子集以及(iv)以所述第一和/或第二核苷酸為目標(biāo)的擴(kuò)增。

進(jìn)一步，結(jié)合成員可以包括一個(gè)或多個(gè)不同的報(bào)告特異捕捉化合物，這些化合物可以捕捉結(jié)合成員上的報(bào)告化合物。報(bào)告特異捕捉化合物可以是寡核苷酸。特別的，不同的報(bào)告特異捕捉化合物，例如寡核苷酸，可以根據(jù)結(jié)合成員被組合在不同位置。

通過與報(bào)告特異捕捉化合物形成復(fù)合物，報(bào)告化合物可以被捕捉在結(jié)合成員上。

根據(jù)具體的實(shí)施方案中，能與第二核苷酸形成復(fù)合物的報(bào)告因子的至少部分互作位點(diǎn)，也能與報(bào)告特異性捕捉化合物形成復(fù)合物。特別的，報(bào)告特異性捕捉化合物和所述第二核苷酸競爭地與報(bào)告化合物形成復(fù)合物。

在一些實(shí)施方案中，被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示指示值，和/或結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示指示值是在一個(gè)反應(yīng)室中被測定的，該反應(yīng)室包括結(jié)合成員和蓋元件。蓋元件可以被配置為至少部分可變形的，那樣所述反應(yīng)室的內(nèi)部體積具有一種松弛狀態(tài)和一種壓縮狀態(tài)的不同體積。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值可以在具有松弛狀態(tài)內(nèi)部體積的反應(yīng)室中被測定。另外，表示被結(jié)合成員捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值可以在具有壓縮狀態(tài)內(nèi)部體積的反應(yīng)室中被測定。例如，表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值是在具有松弛狀態(tài)內(nèi)部體積的反應(yīng)室中被測定的，以及表示結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值是在具有壓縮狀態(tài)內(nèi)部體積的反應(yīng)室中被測定。

另外，表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值和表示結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值可以被連續(xù)的或同時(shí)測定。

在另一個(gè)實(shí)施例中，報(bào)告化合物是寡核苷酸。

該方法進(jìn)一步包括以第一和/或第二核苷酸為目標(biāo)擴(kuò)增之前，以其為目標(biāo)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，樣品中核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的測定方法包括：

提供一定數(shù)量的第一核苷酸；一定數(shù)量的第二核苷酸；能與第一核苷酸形成復(fù)合物的一定數(shù)量的FRET化合物，其中FRET化合物包括與第一核苷酸特異的結(jié)合區(qū)域，和第一可檢測標(biāo)記，第一可檢測標(biāo)記具有，一種未復(fù)合狀態(tài)即第一可檢測特征，以及復(fù)合狀態(tài)即第二可檢測特征，第二可檢測特征不同于第一可檢測特征；可以與第二核苷酸形成復(fù)合物的一定數(shù)量的報(bào)告化合物，其中每一個(gè)報(bào)告化合物包括能與第二核苷酸特異的結(jié)合區(qū)域和第二可檢測標(biāo)記；以及能捕捉報(bào)告化合物的結(jié)合成員；其中第二核苷酸與報(bào)告化合物形成的復(fù)合物抑制結(jié)合成員對報(bào)告化合物的捕捉；以第一和/或第二核苷酸為目標(biāo)的擴(kuò)增；每個(gè)形成的復(fù)合物包括第一核苷酸和FRET化合物；一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集與一個(gè)第二核苷酸形成復(fù)合物；

捕捉剩余的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸的復(fù)合的報(bào)告化合物的子集；

測定表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值；

測定表示被結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值；

在一些實(shí)施例中，擴(kuò)增包括一個(gè)雙鏈核苷酸變性的步驟，其中雙鏈核苷酸包括報(bào)告化合物與第二核苷酸形成的復(fù)合物，報(bào)告化合物與報(bào)告特異捕捉化合物形成的復(fù)合物，雙鏈報(bào)告化合物和雙鏈的第一和/或第二核苷酸?？蛇x擇的或另外，擴(kuò)增可以包括引物化合物退火到第一和/或第二核苷酸上的步驟，其中優(yōu)選的退火步驟是與一些步驟同時(shí)進(jìn)行的，這些步驟是一定數(shù)量報(bào)告化合物的子集與至少一定數(shù)量的第二核苷酸子集形成復(fù)合物和/或捕捉剩余的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸復(fù)合的報(bào)告化合物的子集。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，擴(kuò)增是一種等溫?cái)U(kuò)增(isothermal NEAR)方法。例如，該等溫?cái)U(kuò)增方法是一種等溫切口酶擴(kuò)增反應(yīng)。在這樣的實(shí)施例中，樣品中核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的測定方法包括：

提供一定數(shù)量的第一核苷酸；一定數(shù)量的第二核苷酸；一定數(shù)量的能與第一核苷酸形成復(fù)合物的FRET化合物，其中FRET化合物包括與第一核苷酸特異的結(jié)合區(qū)域和第一可檢測標(biāo)記，第一可檢測標(biāo)記具有，一種未復(fù)合狀態(tài)即第一可檢測特征，以及復(fù)合狀態(tài)即第二可檢測特征，第二可檢測特征不同于第一可檢測特征；一定數(shù)量的報(bào)告化合物可以與第二核苷酸形成復(fù)合物，其中每一個(gè)報(bào)告化合物包括能與第二核苷酸特異的結(jié)合區(qū)域和第二可檢測標(biāo)記；以及能捕捉報(bào)告化合物的結(jié)合成員；其中第二核苷酸與報(bào)告化合物形成的復(fù)合物抑制結(jié)合成員對報(bào)告化合物的捕捉；以第一和/或第二核苷酸為目標(biāo)的等溫?cái)U(kuò)增，如等溫切口酶擴(kuò)增反應(yīng)；每一個(gè)形成的復(fù)合物包括一個(gè)第一核苷酸和一個(gè)FRET化合物；一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集與一個(gè)第二核苷酸形成復(fù)合物；

捕捉剩余的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸的復(fù)合的報(bào)告化合物的子集；

測定表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值；

測定表示結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值；

其中優(yōu)選的以下步驟可以同時(shí)進(jìn)行，(i)每一個(gè)形成的復(fù)合物包括一個(gè)第一核苷酸和一個(gè)FRET化合物，(ⅱ)一定數(shù)量的報(bào)告化合物的子集和至少一定數(shù)量的第二核苷酸子集形成復(fù)合物，(ⅲ)捕捉剩余的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸的復(fù)合的報(bào)告化合物的子集，以及(iv)以所述第一和/或第二核苷酸為目標(biāo)擴(kuò)增。

在其他實(shí)施例中，擴(kuò)增是一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，其中優(yōu)選的循環(huán)擴(kuò)增是PCR，其中優(yōu)選的進(jìn)行PCR包括使用具有核酸外切酶活性的聚合酶。例如，表示結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值是在循環(huán)擴(kuò)增進(jìn)行至少一個(gè)循環(huán)后被測定，優(yōu)選的在循環(huán)擴(kuò)增進(jìn)行每一個(gè)循環(huán)后被測定。然后在每次測定表示結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值之后，表示第一和/或第二核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值可以被測定。

在這樣的實(shí)施例中，測定樣品中核苷酸存在和/或存在數(shù)量的方法包括：

提供一定數(shù)量的第一核苷酸；一定數(shù)量的第二核苷酸；一定數(shù)量的能與第一核苷酸形成復(fù)合物的FRET化合物，其中FRET化合物包括與第一核苷酸特異的結(jié)合區(qū)域和第一可檢測標(biāo)記，第一可檢測標(biāo)記具有，一種未復(fù)合狀態(tài)即第一可檢測特征，以及復(fù)合狀態(tài)即第二可檢測特征，第二可檢測特征不同于第一可檢測特征；一定數(shù)量的報(bào)告化合物可以與第二核苷酸形成復(fù)合物，其中每一個(gè)報(bào)告化合物包括第二核苷酸特異的結(jié)合區(qū)域和第二可檢測標(biāo)記；以及能捕捉報(bào)告化合物的結(jié)合成員；其中第二核苷酸與報(bào)告化合物形成的復(fù)合物抑制結(jié)合成員對報(bào)告化合物的捕捉；以第一和/或第二核苷酸為目標(biāo)進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增，如PCR；每一個(gè)形成的復(fù)合物包括一個(gè)第一核苷酸和一個(gè)FRET化合物；一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集與一個(gè)第二核苷酸形成復(fù)合物；

捕捉剩余的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸的復(fù)合的報(bào)告化合物的子集；

測定表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值；

測定表示結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值；

其中優(yōu)選的第一和第二核苷酸的擴(kuò)增是在一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集與至少一定數(shù)量的第二核苷酸子集形成的復(fù)合物步驟前啟動。

在上述方法中，表示第二核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值可以根據(jù)校正曲線被測定，該校正曲線與表示報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值及第二核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值的有關(guān)。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，測定樣品中核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的方法包括：

在反應(yīng)室中提供一定數(shù)量的第一核苷酸；一定數(shù)量的第二核苷酸；一定數(shù)量的能與第一核苷酸形成復(fù)合物的FRET化合物，其中FRET化合物包括與第一核苷酸特異的結(jié)合區(qū)域和第一可檢測標(biāo)記，第一可檢測標(biāo)記具有，一種未復(fù)合狀態(tài)即第一可檢測特征，以及復(fù)合狀態(tài)即第二可檢測特征，第二可檢測特征不同于第一可檢測特征；一定數(shù)量的報(bào)告化合物可以與第二核苷酸形成復(fù)合物，其中每一個(gè)報(bào)告化合物包括能與第二核苷酸特異的結(jié)合區(qū)域和第二可檢測標(biāo)記；其中反應(yīng)室包括能捕捉報(bào)告化合物的結(jié)合成員，其中第二核苷酸與報(bào)告化合物形成的復(fù)合物抑制了結(jié)合成員對報(bào)告化合物的捕捉；配制的蓋元件至少是部分可變形的；

以第一和/或第二核苷酸為目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，例如，等溫或循環(huán)擴(kuò)增；

每一個(gè)形成的復(fù)合物包括一個(gè)第一核苷酸和一個(gè)FRET化合物；一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集與一個(gè)第二核苷酸形成復(fù)合物；

捕捉剩余的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸復(fù)合的報(bào)告化合物的子集；

測定溶液中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值；

測定表示結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值，基于表示結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值，測定表示第二核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值。

在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，測定樣品中核苷酸存在和/或存在數(shù)量的方法包括：

在反應(yīng)室中提供一定數(shù)量的第一核苷酸；一定數(shù)量的第二核苷酸；一定數(shù)量的能與第一核苷酸形成復(fù)合物的FRET化合物，其中FRET化合物包括第一核苷酸特異的結(jié)合區(qū)域和第一可檢測標(biāo)記，第一可檢測標(biāo)記具有，一種未復(fù)合狀態(tài)即第一可檢測特征，以及復(fù)合狀態(tài)即第二可檢測特征，第二可檢測特征不同于第一可檢測特征；一定數(shù)量的報(bào)告化合物可以與第二核苷酸形成復(fù)合物，其中每一個(gè)報(bào)告化合物包括能與第二核苷酸特異的結(jié)合區(qū)域和第二可檢測標(biāo)記；其中反應(yīng)室包括能捕捉報(bào)告化合物的結(jié)合成員，其中第二核苷酸與報(bào)告化合物形成的復(fù)合物抑制了結(jié)合成員對報(bào)告化合物的捕捉；配制的蓋元件至少是部分可變形的，那樣所述反應(yīng)室的內(nèi)部體積具有一種松弛狀態(tài)和一種壓縮狀態(tài)；

以第一和/或第二核苷酸為目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，例如等溫或循環(huán)擴(kuò)增；

每一個(gè)形成的復(fù)合物包括一個(gè)第一核苷酸和一個(gè)FRET化合物；一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集與一個(gè)第二核苷酸形成復(fù)合物；

捕捉剩余的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸復(fù)合的報(bào)告化合物的子集；

在松弛狀態(tài)內(nèi)部體積的反應(yīng)室中測定表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值；

在具有壓縮狀態(tài)內(nèi)部體積的反應(yīng)室中測定表示結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值，并且基于結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值，測定表示第二核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值。

在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，測定樣品中核苷酸存在和/或存在數(shù)量的方法包括：

在反應(yīng)室中提供一定數(shù)量的第一核苷酸；一定數(shù)量的第二核苷酸；一定數(shù)量的能與第一核苷酸形成復(fù)合物的FRET化合物，其中FRET化合物包括第一核苷酸特異的結(jié)合區(qū)域和第一可檢測標(biāo)記，第一可檢測標(biāo)記具有，一種未復(fù)合狀態(tài)即第一可檢測特征，以及復(fù)合狀態(tài)即第二可檢測特征，第二可檢測特征不同于第一可檢測特征；一定數(shù)量的報(bào)告化合物可以與第二核苷酸形成復(fù)合物，其中每一個(gè)報(bào)告化合物包括第二核苷酸特異的結(jié)合區(qū)域和第二可檢測標(biāo)記；其中反應(yīng)室包括能捕捉報(bào)告化合物的結(jié)合成員，其中第二核苷酸與報(bào)告化合物形成的復(fù)合物抑制了結(jié)合成員對報(bào)告化合物的捕捉；配制的蓋元件至少是部分可變形的，那樣所述反應(yīng)室的內(nèi)部體積具有一種松弛狀態(tài)和一種壓縮狀態(tài)；以第一和/或第二核苷酸為目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，例如等溫或循環(huán)擴(kuò)增；

每一個(gè)形成的復(fù)合物包括一個(gè)第一核苷酸和一個(gè)FRET化合物；一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集與一個(gè)第二核苷酸形成復(fù)合物；

捕捉剩余的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸復(fù)合的報(bào)告化合物的子集；

在具有松弛狀態(tài)內(nèi)部體積的反應(yīng)室的溶液中測定表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值；

在具有壓縮狀態(tài)內(nèi)部體積的反應(yīng)室中測定表示結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值，并且基于表示結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值，測定表示第二核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值。

在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，測定樣品中核苷酸存在和/或存在數(shù)量的方法包括：

在反應(yīng)室中引進(jìn)一定數(shù)量的第一核苷酸；一定數(shù)量的第二核苷酸；一定數(shù)量的能與第一核苷酸形成復(fù)合物的FRET化合物，其中FRET化合物包括與第一核苷酸特異的結(jié)合區(qū)域和第一可檢測標(biāo)記，第一可檢測標(biāo)記具有，一種未復(fù)合狀態(tài)即第一可檢測特征，以及復(fù)合狀態(tài)即第二可檢測特征，第二可檢測特征不同于第一可檢測特征；一定數(shù)量的報(bào)告化合物可以與第二核苷酸形成復(fù)合物，其中每一個(gè)報(bào)告化合物包括第二核苷酸特異的結(jié)合區(qū)域和第二可檢測標(biāo)記；其中反應(yīng)室包括第一表面、第二表面和一個(gè)能捕捉報(bào)告化合物的結(jié)合成員，其中第一和第二表面間的距離是可變的，那樣所述反應(yīng)室具有一種松弛狀態(tài)的內(nèi)部體積和一種壓縮狀態(tài)的內(nèi)部體積，其中第二核苷酸與報(bào)告化合物形成的復(fù)合物抑制了結(jié)合成員對報(bào)告化合物的捕捉；

以第一和/或第二核苷酸為目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，例如等溫或循環(huán)擴(kuò)增；

每一個(gè)形成的復(fù)合物包括一個(gè)第一核苷酸和一個(gè)FRET化合物；一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集與一個(gè)第二核苷酸形成復(fù)合物；

捕捉剩余的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸復(fù)合的報(bào)告化合物的子集；

在具有松弛狀態(tài)內(nèi)部體積的反應(yīng)室的溶液中測定被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值；

在具有壓縮狀態(tài)內(nèi)部體積的反應(yīng)室中測定表示結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值，并且基于結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值，測定表示第二核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值。

從下文要描述的實(shí)施例中可以清晰的看到上文已定義的一些方面以及更深入的解讀，并用這些實(shí)施例來解釋說明。

附圖的簡要說明

下文中將詳細(xì)描述實(shí)施例，但本發(fā)明不意味著受限于實(shí)施例。附圖中的說明是示意作用的。

圖1是如本文描述的典型的檢測裝置的示意圖。

圖2是如本文描述的一個(gè)反應(yīng)室的示意圖。

圖3顯示了本文描述的方法的典型實(shí)施例中大部分體積(溶液)和一個(gè)微陣列交替產(chǎn)生的熒光圖。

圖4顯示了熒光圖形的數(shù)據(jù)分析，分別來自圖3所示的大部分體積(溶液，見圖4a)的熒光圖像和微陣列所產(chǎn)生的熒光圖像(見圖4b)。

圖5a)顯示了存在靶標(biāo)DNA的情況下競爭性報(bào)告因子監(jiān)測的擴(kuò)增與分子信標(biāo)間的比較。

圖5b)顯示了沒有靶標(biāo)DNA存在的對照反應(yīng)情況下競爭性報(bào)告因子監(jiān)測的擴(kuò)增與分子信標(biāo)間的比較。

圖6顯示了溶液中熒光信號強(qiáng)度的時(shí)間進(jìn)程(第一/靶標(biāo)核苷酸的檢測)。

圖7顯示了對于IPC(內(nèi)部陽性對照)和PHC(陽性雜交對照)的陣列上的熒光信號強(qiáng)度的時(shí)間進(jìn)程。由于溶液中缺乏競爭者PHC信號強(qiáng)度進(jìn)程符合二級動力學(xué)。

詳細(xì)說明

說明書的詳細(xì)內(nèi)容，其中，在本說明書和權(quán)利要求中使用的術(shù)語“包含”或“包括”，它不排除其他元件或步驟。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“由......組成”被認(rèn)為是術(shù)語“包括”的任意實(shí)施例。如果在下文中一個(gè)組合被定義為包括至少一定數(shù)目的實(shí)施例，這也是可以理解為公開一個(gè)組合，該組合可以任意地且僅由這些實(shí)施例組成。

除非特別的規(guī)定，當(dāng)指一個(gè)單名詞如“一個(gè)”或“一種”時(shí)，一種不確定或確定的定冠詞被使用，這包括那個(gè)名詞的復(fù)數(shù)形式。例如在提到的一種第一或第二核苷酸時(shí)，這也可以被理解為多種第一或/第二核苷酸。反之亦然，當(dāng)名詞的復(fù)數(shù)形式被使用時(shí)，這也可以被理解為單數(shù)形式。

此外，本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求中的術(shù)語第一、第二、第三或(a)、(b)、(c)等被用于區(qū)分相似的元件并不一定按描述順序或時(shí)間順序。這可以被理解為這些使用的術(shù)語在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下是可互換的，本文所述的實(shí)施例可以用不同于本文描述或示例的順序被實(shí)施。

這些術(shù)語的定義將在所使用術(shù)語的下文中進(jìn)一步被詮釋。

生物樣品的分析可以包括測定樣品中是否存在一種或多種核苷酸(例如，DNA,RNA,mRNA，rRNA)。例如一種分析方法可以研究一種樣品來測定是否具有表示特定病原物的核苷酸的存在。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，測定樣品中多種核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的方法包括：

(a)提供

一定數(shù)量的第一核苷酸；

一定數(shù)量的第二核苷酸；

一定數(shù)量的能與第一核苷酸形成復(fù)合物的FRET化合物，其中FRET化合物包括與第一核苷酸特異的結(jié)合區(qū)域和第一可檢測標(biāo)記，第一可檢測標(biāo)記具有，一種未復(fù)合狀態(tài)即第一可檢測特征，以及復(fù)合狀態(tài)即第二可檢測特征；

一定數(shù)量的報(bào)告化合物，報(bào)告化合物可以與第二核苷酸形成復(fù)合物，其中每一個(gè)報(bào)告化合物包括第二核苷酸特異的結(jié)合區(qū)域以及第二可檢測的標(biāo)記；

可以捕捉報(bào)告化合物的結(jié)合成員；其中第二核苷酸與報(bào)告化合物形成的復(fù)合物抑制了結(jié)合成員對報(bào)告化合物的捕捉；

(b)每一個(gè)形成的復(fù)合物包括一個(gè)第一核苷酸和一個(gè)FRET化合物；

(c)一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集與一個(gè)第二核苷酸形成復(fù)合物；

(d)捕捉剩余的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸復(fù)合的報(bào)告化合物子集；

(e)測定表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值；

(f)測定表示結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值。

特別的，第一核苷酸可以通過測定溶液中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值來檢測，然而第二核苷酸，如對照核苷酸，可以通過測定結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值來檢測。這可以避免了使用不同的發(fā)色團(tuán)來檢測溶液中的多種核苷酸。另外，通過表面結(jié)合的底物或探針來檢測表示對照的存在和/或存在數(shù)量的指示值，那么實(shí)施與擴(kuò)增無關(guān)的對照是可行的，如酶對照，從而避免相應(yīng)的假擴(kuò)增子的合成。

本文所述術(shù)語“核苷酸”或“靶標(biāo)核苷酸”或“靶標(biāo)被分析物”，表示可以用所述方法檢測的任何核苷酸分子(例如可以與FRET化合物形成復(fù)合物的靶標(biāo)核苷酸，或可以與報(bào)告化合物形成復(fù)合物的靶標(biāo)核苷酸或?qū)φ蘸塑账幔辉斠娤挛?。這樣的核苷酸分子包括自然產(chǎn)生的核苷酸例如脫氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核酸(RNA)也可以是人工設(shè)計(jì)的核苷酸，如核苷酸類似物尤其如肽核酸(PNA)或鎖核酸(LNA)，它們可以用重組基因技術(shù)產(chǎn)生或化學(xué)合成(例如自然產(chǎn)生的核苷酸的具體實(shí)施例包括DNA序列如基因組DNA或cDNA分子以及RNA序列如hnRNA，mRNA或rRNA分子或它們的反向互補(bǔ)核苷酸序列。這些核苷酸可以是任何長度，單鏈或雙鏈分子。一般，靶標(biāo)核苷酸的長度為10至10000個(gè)核苷酸，如20至2000個(gè)核苷酸，30至1000個(gè)核苷酸或50至500個(gè)核苷酸。如本文使用的術(shù)語“核苷酸”可以被理解為核糖核苷酸和脫氧核苷酸(如RNA和DNA分子)。

靶標(biāo)被分析物或靶標(biāo)核苷酸可以是一種與細(xì)菌或病毒感染有關(guān)的核苷酸。

與細(xì)菌感染有關(guān)的核苷酸意味著源于細(xì)菌的任何核苷酸分子(如其核苷酸序列與細(xì)菌基因組中的相應(yīng)序列是相同的或互補(bǔ)的)，它們存在于已經(jīng)被一種或多種細(xì)菌感染的待分析的液體樣品中。引起細(xì)菌感染的細(xì)菌的實(shí)例包括結(jié)核分枝桿菌，鏈球菌，假單胞菌，志賀氏桿菌，彎曲桿菌，金黃色葡萄球菌，大腸桿菌和沙門氏菌。其中具有最高風(fēng)險(xiǎn)的細(xì)菌性疾病是肺結(jié)核，由細(xì)菌結(jié)核桿菌引起，殺死每年約200萬人，主要集中在撒哈拉以南非洲。因此，在一些實(shí)施例中，待檢測的靶標(biāo)核苷酸或靶被分析物與由結(jié)核分枝桿菌引起的感染相關(guān)。

與病毒感染有關(guān)的核苷酸意味著源于病毒的任何核苷酸分子(例如其核苷酸序列與病毒基因組中的相應(yīng)序列是相同的或互補(bǔ)的)，它們存在于已經(jīng)被一種或多種病毒感染的待分析的液體樣品中。病毒侵染染宿主，從寄主中獲得的液體的樣品，可以是任何DNA病毒(即具有DNA基因組的病毒)或RNA病毒(即具有RNA基因組的病毒)(參照如,Büchen-Osmond,C.(2003).Taxonomy and Classification of Viruses.In:Manual of Clinical Microbiology,8th ed.,vol.2,p.1217-1226,ASM Press,Washington DC)。DNA病毒的實(shí)例尤其包括乳多空病毒家族(例如乳頭狀瘤病毒)，腺病毒家族(例如腺病毒)和皰疹病毒家族(例如EB病毒，巨細(xì)胞病毒)。RNA病毒的實(shí)例特別包括小核糖核酸家族(例如脊髓灰質(zhì)炎病毒，鼻病毒)黃病毒科家族(例如丙型肝炎病毒)，絲狀病毒家族(例如馬爾堡病毒，埃博拉病毒)和逆轉(zhuǎn)錄病毒家族(例如人免疫缺陷病毒(HIV))。在一些實(shí)施方案中，待檢測的靶標(biāo)核苷酸與逆轉(zhuǎn)錄病毒成員引起的感染有關(guān)，特別是它們與HIV引起的感染有關(guān)聯(lián)。如本文所用的術(shù)語“HIV”，指HIV-1和HIV-2的種屬以及它們衍生的任何亞型。

因?yàn)樵S多DNA病毒以及逆轉(zhuǎn)錄病毒(特別是，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制通常需要把RNA病毒基因組反轉(zhuǎn)錄為DNA)，可以將它們的遺傳信息以潛在前病毒的形式整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組，術(shù)語“與病毒感染相關(guān)的核苷酸”不僅指來自游離的和感染細(xì)胞相關(guān)病毒的核苷酸，還指被整合到宿主的基因組中的潛在前病毒DNA分子，反轉(zhuǎn)錄的病毒DNA分子(即病毒復(fù)制的“中間體“)，和潛在前病毒DNA衍生的轉(zhuǎn)錄物(即被宿主DNA基因組的轉(zhuǎn)錄得到RNA分子)。

一般，本文公開的方法中靶標(biāo)核苷酸不是單獨(dú)純在的形式，而是包括一種或多種靶標(biāo)核苷酸的樣品的形式。這里使用的術(shù)語“一種或多種種屬”指一種或多種不同類型的核苷酸如具有不同核苷酸序列的分子和/或具有不同來源的分子(如來自不同病原物感染的寄主細(xì)胞的核苷酸)

一般，這里所用的第一核苷酸是如上所述的一種靶標(biāo)被分析物或靶標(biāo)核苷酸。

在一些實(shí)施例中，第二核苷酸可以是如上所述的靶標(biāo)被分析物。另外或可選擇的，第二核苷酸可以是一種對照核苷酸。對照核苷酸可以包括陽性和陰性擴(kuò)增對照，下文有更詳細(xì)的描述。

假如第一和第二核苷酸都是靶標(biāo)被分析物，第二核苷酸一般不同于第一核苷酸，即不同類型的核苷酸如具有不同核苷酸序列的分子和/或不同來源的分子(即受不同病原物感染的寄主細(xì)胞的核苷酸)。在這個(gè)實(shí)施例中，第一核苷酸也可以被作為第一靶標(biāo)被分析物，并且第二核苷酸也可以被作為第二靶標(biāo)被分析物。例如第一版被分析物與HIV感染有關(guān)，第二靶標(biāo)被分析物與HCV感染有關(guān)。

一般，第一和/或第二核苷酸的擴(kuò)增子，即靶標(biāo)被分析物和/或?qū)φ蘸塑账岬臄U(kuò)增子，具有10至300個(gè)核苷酸，例如15至250個(gè)核苷酸，30至200個(gè)核苷酸或50至100個(gè)核苷酸。

另外，這里使用的“第二核苷酸”也可以包括超過一種核苷酸類型例如不同于第一靶標(biāo)被分析物的一種或多種靶標(biāo)被分析物(即第二、第三、第四、第五靶標(biāo)被分析物等)并且一種或多種對照核苷酸(即陽性和陰性擴(kuò)增對照核苷酸)。

這里所用的術(shù)語“樣品”指可以使用這里所述的方法被分析的任何液體，其可以包括一種或多種待測的靶標(biāo)核苷酸。然后，樣品可以包括溶于水或適當(dāng)緩沖液(即Tris/EDTA)的純化的核苷酸制備物以及各種生物樣品?？梢杂帽疚乃龅姆椒ǚ治龅囊后w樣品的實(shí)例特別包括有機(jī)和無機(jī)化學(xué)溶液，飲用水，污水，人類和非人類體液例如全血，血漿，血清，尿，痰液，唾液或腦脊髓，來自動物、植物或組織培養(yǎng)物的細(xì)胞提取物，原核生物和真核生物的細(xì)胞懸浮液，噬菌體制劑等的細(xì)胞提取物。

在具體的實(shí)施例中，例如當(dāng)靶標(biāo)核苷酸與細(xì)菌侵染有關(guān)如結(jié)核桿菌感染的情況下，可以用本文所述的方法分析的液體樣品是人類唾液樣品或人類尿液樣品。

在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，例如當(dāng)靶標(biāo)核苷酸與病毒侵染有關(guān)如HIV或丙型肝炎C病毒感染的情況下，可以用本文所述的方法分析的液體樣品是人類全血樣品或人類血漿樣品。

這里所用的術(shù)語“全血”指具有所有成分的血液。在其他詞語中，全血包括血細(xì)胞如紅細(xì)胞、白血球和血小板，以及懸浮有血細(xì)胞的血漿。

樣品進(jìn)一步包括一種或多種附加試劑例如稀釋劑、溶劑或緩沖液，它們可以來自樣品的任意純化過程和/或?yàn)槭褂帽疚乃龇椒ㄖ暗臉悠诽幚磉^程。然而，在一些實(shí)施例中，被分析的樣品是未經(jīng)處理的樣品例如未經(jīng)處理的全血樣品。本文所用的術(shù)語“未經(jīng)處理的”，可以理解為收集樣本后(例如，從患者抽血)至使用本文所述的方法正如下方所述的檢測裝置中進(jìn)行以此為目標(biāo)的檢測之前，沒有進(jìn)一步的樣品處理發(fā)生(例如，分餾方法，干燥/重建，等等)。

包括這樣未經(jīng)處理樣品的典型的核苷酸的檢測方法如下文所述。

待分析的流體樣品的體積可以是在1微升至30毫升的范圍內(nèi)，例如5微升至20毫升或10微升至10毫升。

特別的，待分析的尿液或唾液樣品的體積可以在1微升至30毫升的范圍內(nèi)，一般是在1微升至25毫升的范圍內(nèi)或1毫升至20毫升或1毫升至15毫升或1毫升至10毫升。在特別的實(shí)施例中或唾液的體積是在5毫升至15毫升的范圍內(nèi)例如約10毫升。然而樣品的體積超過30毫升也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

另外，待分析的全血或血漿樣品的體積可以在1微升至50微升的范圍內(nèi)，一般在1微升至45微升或1微升至40微升或1微升至30微升或1微升至25微升或1微升至20微升或1微升至15微升。在具體的實(shí)施例中，流體樣品的體積如人類全血是在1微升至10微升的范圍內(nèi)。然而分在樣品為全血的情況下樣品體積超過50微升也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

這里所用的術(shù)語“報(bào)告分子”或“報(bào)告化合物”可以指任何能與一種或多種第二核苷酸形成復(fù)合物的分子并且其能在支持成員上被捕捉，例如結(jié)合成員，其中

與第二核苷酸形成的復(fù)合物抑制了支持成員上對報(bào)告化合物的捕捉，例如結(jié)合成員。因此這里所用的“能形成復(fù)合物”指報(bào)告化合物與第二核苷酸間的任何互作。特別的，該術(shù)語可以指分子間通過一個(gè)共同的或不同的結(jié)合域?qū)崿F(xiàn)的相互結(jié)合，結(jié)合域被包含在報(bào)告分子中，調(diào)節(jié)與靶標(biāo)的互作(例如通過互補(bǔ)的核苷酸之間的Watson-Crick堿基配對)。一般，互作是可逆的。類似的，術(shù)語“在支持成員上被捕捉”或“在結(jié)合成員上被捕捉”也指任何報(bào)告分子與既定的結(jié)合成員間的直接或間接(例如通過捕捉分子；詳見下文)的互作。這種互作一般也是可逆的。

一般來說報(bào)告化合物可以是具有10至100個(gè)核苷酸的核苷酸分子(即如上所述的RNA或DNA分子)，例如15至50個(gè)核苷酸，15至40個(gè)核苷酸或20至30個(gè)核苷酸。通常報(bào)告分子是單鏈核苷酸分子或寡核苷酸。報(bào)告化合物被這樣設(shè)計(jì)，那樣這個(gè)報(bào)告化合物與待測的第二核苷酸結(jié)合抑制了結(jié)合成員對報(bào)告化合物的捕捉。

核苷酸報(bào)告分子可以包含至少一個(gè)特異結(jié)合域(這里也指“互作位點(diǎn)”)即不僅能與第二核苷酸互作(例如與第二核苷酸的至少部分互補(bǔ)序列區(qū)域結(jié)合，因而允許例如報(bào)告分子和待測的第二核苷酸間Watson-Crick堿基配對)，而且能在結(jié)合成員被捕捉。通常報(bào)告化合物中包括的特異結(jié)合域的長度為至少12個(gè)核苷酸，例如至少15個(gè)核苷酸，至少18個(gè)核苷酸或至少22個(gè)核苷酸。在具體的實(shí)施例中，報(bào)告化合物的結(jié)合部分的核苷酸序列是與第二核苷酸的相應(yīng)的核苷酸序列互補(bǔ)的。

可以采用一種或多種種類的報(bào)告分子，例如依賴不同類型核苷酸的數(shù)量，例如待測的第二核苷酸。術(shù)語“一種或多種種類”指一種或多種不同類型的報(bào)告化合物例如一種或多種具有不同核苷酸序列的核苷酸分子。

這里所用的“結(jié)合成員”可以指任何固體基質(zhì)，在這些固體基質(zhì)上報(bào)告分子可以被捕捉。這樣的基質(zhì)實(shí)例尤其包括合成顆粒例如磁珠(如，聚苯乙烯順磁珠，也被稱為)和乳膠珠。本文所用的“結(jié)合成員”，可以指任何固體基質(zhì)，在這些固體基質(zhì)上報(bào)告化合物可以被直接的(通過包含在報(bào)告化合物中的錨定基團(tuán))或以間接的方式被捕捉，間接的方式為通過一種或多種報(bào)告特異捕捉化合物，能通過共價(jià)或非共價(jià)互作捕捉報(bào)告化合物到結(jié)合成員上?？梢允褂玫慕Y(jié)合成員的實(shí)例尤其包括陣列元件的基板(例如，顯微鏡載玻片，晶片或陶瓷材料)。

這里所用的術(shù)語“報(bào)告特異捕捉化合物”或“報(bào)告特異捕捉分子”指可以被附著到或固定在結(jié)合成員上的任何化合物或分子，，顯示了特異的結(jié)合性和/或特征性反應(yīng)，促使具有報(bào)告化合物的復(fù)合物的形成(即與報(bào)告化合物結(jié)合)。核苷酸或寡核苷酸一般被用作報(bào)告特異捕捉分子。被用作報(bào)告特異捕捉分子的核苷酸實(shí)例

包括天然的核苷酸例如脫氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)以及核苷酸類似物例如特別是肽核苷酸(PNA)或鎖核苷酸(LNA)。天然的核苷酸的具體實(shí)例包括DNA序列如基因組DNA或cDNA分子以及RNA分子例如hnRNA,mRNA或rRNA分子或它們的逆轉(zhuǎn)錄核苷酸序列。這樣的核苷酸可以是任何長度并且可以是單鏈或雙鏈分子。一般報(bào)告特異捕捉化合物是具有10至100個(gè)核苷酸長度的單鏈寡核苷酸，如具有15至50個(gè)核苷酸或20至30個(gè)核苷酸。

報(bào)告特異捕捉化合物可以包括至少一個(gè)特異序列區(qū)域(如結(jié)合域)，其被配置用來與報(bào)告化合物結(jié)合，例如，通過報(bào)告特異捕捉分子與待測的核苷酸間的堿基配對來與報(bào)告分子的互補(bǔ)序列區(qū)域互作。一般特異結(jié)合區(qū)域的長度至少為12個(gè)核苷酸，如至少15個(gè)核苷酸，如至少18個(gè)核苷酸，如至少22個(gè)核苷酸，在特定的實(shí)施例中，報(bào)告特異捕捉化合物的結(jié)合域的核苷酸序列與報(bào)告化合物的相應(yīng)核苷酸序列互補(bǔ)。

在一些實(shí)施例中，能與第二核苷酸形成復(fù)合物的報(bào)告化合物的至少部分互作位點(diǎn)也能與報(bào)告特異捕捉化合物形成復(fù)合物。特別的，報(bào)告特異捕捉分子和第二核苷酸競爭與報(bào)告化合物形成復(fù)合物，如報(bào)告特異特異捕捉分子和第二核苷酸中各自包含的結(jié)合區(qū)域識別報(bào)告分子上的相同或至少相似的對應(yīng)序列。這里所用的術(shù)語“類似序列”指那些僅一個(gè)或多個(gè)單核苷酸錯配(例如不互補(bǔ)的核苷酸對)或由一個(gè)或多個(gè)單核苷酸的添加，插入或缺失的序列(或缺少核苷酸殘基)。因此包括在報(bào)告特異捕捉分子和第二核苷酸中的各自的結(jié)合區(qū)域至少可以是部分相同的。這里所用的術(shù)語“部分相同”指如上所述僅一個(gè)或多個(gè)單核苷酸不同的序列，或具有重疊結(jié)合位點(diǎn)的序列，如共享一個(gè)共同核苷酸序列但在序列的其他部分至少有一個(gè)不同的地方。然而也可能報(bào)告特異捕捉分子與靶標(biāo)核苷酸的各自包含的結(jié)合區(qū)域識別不同的不重疊(如相鄰的)報(bào)告分子的序列，使報(bào)告特異捕捉分子或者靶標(biāo)核苷酸與報(bào)告分子結(jié)合到報(bào)告分子上，來空間干擾另外一個(gè)與報(bào)告分子的結(jié)合。

在一些實(shí)施例中，一方面報(bào)告化合物與第二核苷酸形成復(fù)合物，另一方在結(jié)合成員上捕捉報(bào)告化合物(如通過與報(bào)告特異捕捉分子形成復(fù)合物)，這些步驟間的化學(xué)平衡分別受報(bào)告特異捕捉分子(與報(bào)告化合物的序列有關(guān))和報(bào)告化合物(與第二核苷酸有關(guān))的序列相似和/或部分相同程度變化的影響。

例如，可以選擇報(bào)告特異捕捉分子序列，那樣與報(bào)告化合物序列有關(guān)的結(jié)合區(qū)域比與第二核苷酸序列有關(guān)的報(bào)告化合物序列的結(jié)合區(qū)域的更短或更長。在這種方式下，報(bào)告化合物與第二核苷酸相關(guān)的結(jié)合親和力，跟報(bào)告化合物與報(bào)告特異捕捉分子相關(guān)的結(jié)合親和力相比會增加或減少。

可以采用一種或多種種類的報(bào)告特異捕捉分子。術(shù)語“一種或多種種類”指一種或多種不同類型的報(bào)告特異捕捉分子例如具有不同核苷酸序列的一種或多種核苷酸分子。同時(shí)使用超過一個(gè)種類的報(bào)告特異捕捉分子也被稱為“文庫”。這樣的文庫包括至少兩種但也包括更多不同的分子，如至少10種不同種類，至少20種不同種類，至少50種不同種類等等。不同的報(bào)告特異捕捉化合物或文庫也可以被排列在結(jié)合成員的不同位置。例如它們可以以陣列的形式或其他空間排列存在。

這里所用的術(shù)語“陣列”(也被稱為“微陣列”)指一種捕捉分子的已確定的空間排列如在結(jié)合成員上的報(bào)告特異捕捉分子，也被稱為“底物”，其中在陣列中的每一個(gè)分子的位置是被分開的。一般陣列包括已確定的位點(diǎn)或預(yù)定的區(qū)域，如所謂的“陣列元件”或“斑點(diǎn)”，它們可以以特別的方式被排列，其中每一個(gè)陣列元件一般僅包括一種報(bào)告特異捕捉分子。在結(jié)合成員上的報(bào)告特異捕捉分子的排列可以通過共價(jià)或非共價(jià)互作的方式實(shí)現(xiàn)。

FRET效率可以被測定并用來鑒定所述的第一核苷酸與FRET化合物間的互作。本技術(shù)人員公知通過監(jiān)測FRET供體或FRET受體發(fā)出的熒光的改變，有多種方式可以測定FRET的效率。

特別的熒光共振能力轉(zhuǎn)移(FRET),熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，共振能量轉(zhuǎn)移(RET)或電子能量轉(zhuǎn)移(EET),是兩種發(fā)色團(tuán)間的能量轉(zhuǎn)移機(jī)制。供體發(fā)色團(tuán)這里被簡單的稱為供體或發(fā)色圖，最初是電子激發(fā)態(tài)，通過非輻射偶極-偶極耦合可以轉(zhuǎn)換能量給受體發(fā)色團(tuán)，這里被稱為受體或淬滅劑。假如(供體)發(fā)色圖和淬滅劑彼此在一定的距離內(nèi)FRET效率的檢測可以被確定。當(dāng)供體和受體發(fā)色團(tuán)都是熒光時(shí)，術(shù)語“熒光能量共振轉(zhuǎn)移”是被經(jīng)常使用的。

這里所用的FRET化合物可以指能與第一核苷酸形成復(fù)合物的一種化合物，其中FRET化合物包括可以一個(gè)供體發(fā)色圖(如熒光標(biāo)記)，該供體發(fā)色團(tuán)可以被光源被激發(fā)。另外，在這個(gè)實(shí)施例中第一核苷酸可以設(shè)有受體發(fā)色圖或猝滅劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)RET化合物包括一個(gè)受體發(fā)色團(tuán)或猝滅劑，并且第一核苷酸包括一個(gè)供體發(fā)色團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)RET化合物可以同時(shí)包括一個(gè)供體發(fā)色團(tuán)和一個(gè)受體發(fā)色團(tuán)或，換句話說，一個(gè)發(fā)色團(tuán)和一個(gè)猝滅劑。

這里所用的第一可檢測標(biāo)記指供體發(fā)色團(tuán)或FRET化合物的發(fā)色團(tuán)。一般第一可檢測標(biāo)記或FRET化合物的供體發(fā)色團(tuán)是一個(gè)熒光標(biāo)記或熒光團(tuán)。

FRET化合物的復(fù)合狀態(tài)是指FRET化合物處于與第一核苷酸復(fù)合的狀態(tài)。FRET化合物的未復(fù)合狀態(tài)是指FRET化合物處于未與第一核苷酸復(fù)合的狀態(tài)。

這里所用的FRET化合物的第一可檢測特征可以指一種狀態(tài)，其中發(fā)色團(tuán)是猝滅，如熒光團(tuán)。在這個(gè)實(shí)施例中，第二可檢測特征可以指一種狀態(tài)，其發(fā)色團(tuán)是開啟的，如熒光團(tuán)。相應(yīng)的，溶液中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸捕捉的存在和/或存在數(shù)量的指示值可以在FRET化合物的復(fù)合狀態(tài)中被確定。

在其他的實(shí)施例中，這里所用的第一可檢測特性可以指發(fā)色團(tuán)的發(fā)射狀態(tài)是開啟的，如熒光團(tuán)。在這個(gè)實(shí)施例中，第二可檢測特性可以指發(fā)色團(tuán)的發(fā)射狀態(tài)是猝滅的，如熒光團(tuán)。

在一些實(shí)施例中，因?yàn)楣w發(fā)色團(tuán)和受體發(fā)色團(tuán)的距離很靠近，例如在1至10nm的距離內(nèi)，當(dāng)FRET化合物處于未復(fù)合狀態(tài)時(shí)，如未與第一核苷酸復(fù)合，該距離使得FRET處于供體發(fā)色團(tuán)和受體發(fā)色團(tuán)之間，發(fā)色團(tuán)如熒光團(tuán)的發(fā)射狀態(tài)被猝滅。因?yàn)楣w發(fā)色團(tuán)和受體發(fā)色團(tuán)不在一定的距離內(nèi)，該距離允許FRET處于供體發(fā)色團(tuán)和受體發(fā)色團(tuán)之間，當(dāng)FRET復(fù)合物處于復(fù)合狀態(tài)時(shí)，如與第一核苷酸復(fù)合，發(fā)色團(tuán)如熒光團(tuán)的發(fā)射狀態(tài)被開啟。

在一些實(shí)施例中，因?yàn)楣w發(fā)色團(tuán)和受體發(fā)色團(tuán)的距離很靠近，例如在1至10nm的距離內(nèi)，當(dāng)FRET化合物處于復(fù)合狀態(tài)時(shí)，如與第一核苷酸復(fù)合，該距離使得FRET處于供體發(fā)色團(tuán)和受體發(fā)色團(tuán)之間，發(fā)色團(tuán)的發(fā)射狀態(tài)被猝滅,如熒光團(tuán)。因?yàn)楣w發(fā)色團(tuán)和受體發(fā)色團(tuán)不在一定的距離內(nèi)，當(dāng)FRET復(fù)合物未處于復(fù)合狀態(tài)時(shí)，如未與第一核苷酸復(fù)合，該距離允許FRET處于供體發(fā)色團(tuán)和受體發(fā)色團(tuán)之間，發(fā)色團(tuán)如熒光團(tuán)的發(fā)射狀態(tài)被開啟。

在一些實(shí)施例中，F(xiàn)RET化合物包括LightCycler探針系統(tǒng)。在這個(gè)實(shí)施例中，LightCycler探針系統(tǒng)包括FRET供體化合物和FRET受體化合物。一般，F(xiàn)RET供體化合物和FRET受體化合物都是寡核苷酸。FRET供體化合物和FRET受體化合物可以與第一核苷酸在一定的位置結(jié)合，該位置足夠靠近FRET。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，LightCycler探針系統(tǒng)由一對熒光標(biāo)記的單鏈寡核苷酸探針組成。一條寡核苷酸探針可以在3’端用供體熒光染料標(biāo)記，其他寡核苷酸探針可以用受體熒光染料在5’端標(biāo)記。游離的第二探針的3’羥基基團(tuán)可以用磷酸集團(tuán)鎖住防止DNA聚合酶的延伸。一般兩個(gè)標(biāo)記間相互間隔1至5個(gè)核苷酸。在PCR的退火步驟過程中，PCR引物與LightCycler探針可以雜交到它們的特異靶標(biāo)位點(diǎn)，使供體染料非常貼近受體染料。當(dāng)供體染料受到LightCycler儀器的光激發(fā)時(shí)，通過熒光能量共振轉(zhuǎn)移能量從供體轉(zhuǎn)移到受體染料。當(dāng)兩種探針在溶液中時(shí)是自由懸浮彼此分開的沒有能量轉(zhuǎn)移發(fā)生。檢測探針的雜交是通過供體熒光信號的減少或受體熒光信號的增加來檢測的。

在其他實(shí)施例中，F(xiàn)RET化合物可以是分子信標(biāo)。分子信標(biāo)可以包括寡核苷酸雜交探針，能報(bào)告溶液中第一核苷酸的存在。分子信標(biāo)也常被稱為分子信標(biāo)探針。一般分子信標(biāo)是具有內(nèi)部猝滅發(fā)色團(tuán)的發(fā)夾形分子如熒光，當(dāng)它們與靶標(biāo)核苷酸序列結(jié)合時(shí)，如發(fā)色團(tuán)的發(fā)射如熒光團(tuán)被恢復(fù)。一個(gè)典型的分子信標(biāo)的長度可以是20至30個(gè)核苷酸，例如20,21,22,23,24,25,26,27,28,29或30個(gè)核苷酸,如25個(gè)核苷酸。中間的核苷酸例如中間15個(gè)核苷酸一般與靶標(biāo)核苷酸互補(bǔ)，相互不形成堿基配對，而每一個(gè)末端的核苷酸，如每一個(gè)末端的5個(gè)核苷酸，是相互互補(bǔ)的，而不是與靶標(biāo)核苷酸互補(bǔ)。

特別的，典型的分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)被分成4個(gè)部分，包括一個(gè)環(huán)，其一般是分子信標(biāo)上的18-30個(gè)堿基對，與靶標(biāo)序列互補(bǔ)，一個(gè)主干(或信標(biāo)桿)，其通過附著到環(huán)的兩個(gè)短的末端形成，如5-7個(gè)核苷酸，相互互補(bǔ)的寡核苷酸，其中在分子信標(biāo)的5’末端共價(jià)附著熒光染料，3’猝滅劑是非熒光的，可以共價(jià)附著到分子信標(biāo)的3’端?？蛇x擇的分子信標(biāo)的3’末端是共價(jià)附著的熒光染料，5’猝滅劑就是非熒光，可以共價(jià)附著到分子信標(biāo)的5’末端。分子信標(biāo)的制備對在本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是有據(jù)可查的。

當(dāng)上述的分子信標(biāo)是閉合的環(huán)形時(shí)，猝滅殘基靠近熒光團(tuán)，導(dǎo)致后者熒光發(fā)射的猝滅。在這個(gè)實(shí)施例中，假如待測的第一核苷酸與環(huán)的直鏈互補(bǔ)，那么雜交會發(fā)生。第一核苷酸與環(huán)間形成的雙鏈體可能比環(huán)的主干更穩(wěn)定，因?yàn)榍罢叩碾p鏈體包括了更多的堿基對。分子信標(biāo)的構(gòu)形改變迫使莖雜交體解離，熒光和猝滅劑

相互分離，恢復(fù)熒光。因此，一旦熒光與猝滅劑具有一定的距離，光照射雜交物導(dǎo)致熒光發(fā)射。具有發(fā)射光說明發(fā)生了雜交，因此在檢測樣品中第一核苷酸序列是存在的。

在其他實(shí)施例中，F(xiàn)RET化合物可以從環(huán)tag探針、鏈置換探針或Taqman探針中選擇。

對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說這些和其他FRET化合物是公知的。FRET的使用如下列文獻(xiàn)所述：Marras,S.A.E.(2006)Methods Mol Biol.335,3-16；Liu,B.et al.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102,589-593；and Szollosi,J.et al.(2002)J.Biotechnol.82,251-266，它們的相關(guān)內(nèi)容被明確的包含在參考文獻(xiàn)中。如馬哈斯(Marras,S.A.E.(2006)Methods Mol Biol.335,3-16)詳細(xì)描述了對于不同類型的熒光雜交探針和熒光分光光度熱循環(huán)儀適當(dāng)?shù)臒晒鈭F(tuán)淬滅劑組合的選擇，也描述了熒光雜交探針的示例性的熒光標(biāo)記和猝滅劑標(biāo)簽。

FRET化合物的存在數(shù)量一般是過量的與報(bào)告化合物的種類相比，如超過5倍至100倍或10倍至80倍或20倍至50倍或30倍至40倍。

另外，第一核苷酸可以以很低的拷貝數(shù)量在樣品中存在。在一些實(shí)施例中，每份樣品中存在的第一核苷酸可以少于100個(gè)拷貝。例如，每份樣品中存在的第一核苷酸化合物可以是80個(gè)拷貝或更少，或70個(gè)拷貝或更少，或60個(gè)拷貝或更少，或50個(gè)拷貝或更少，或40個(gè)拷貝或更少，或20個(gè)拷貝或更少，或10個(gè)拷貝或更少。

在另一個(gè)實(shí)施例中，每份樣品中存在的第二核苷酸可以是100個(gè)拷貝或更多，如每份樣品中200個(gè)拷貝或更多，或每份樣品至少300個(gè)拷貝，或每份樣品至少400個(gè)拷貝，或每份樣品至少500個(gè)拷貝，或每份樣品至少600個(gè)拷貝，或每份樣品至少700個(gè)拷貝，或每份樣品至少800個(gè)拷貝，或每份樣品至少900個(gè)拷貝，或每份樣品至少1000個(gè)拷貝，或至少5000個(gè)拷貝，或至少10000個(gè)拷貝。

這里所用的術(shù)語“確定表示結(jié)合成員上報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值”可以指參數(shù)的檢測/確定例如導(dǎo)電性，氧化還原電勢，光吸收，熒光強(qiáng)度或生物發(fā)光，它們被允許用于定量和/或定性測定在結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物。可以僅測定這些參數(shù)中的一個(gè)，但也可能可以同時(shí)的或連續(xù)的測定多個(gè)參數(shù)(如由適宜標(biāo)記產(chǎn)生的導(dǎo)電性和熒光信號的強(qiáng)度)。

為了進(jìn)行檢測反應(yīng)，報(bào)告化合物可以用一種或多種可檢測標(biāo)記來標(biāo)記，也被稱為“第二可檢測標(biāo)記”。這里所用的的術(shù)語“第二可檢測標(biāo)記”指任何化合物或基團(tuán)，其包括一種或多種適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)物質(zhì)或酶，可以直接的或間接的產(chǎn)生一種可檢測的化合物或化學(xué)的、物理的或酶促反應(yīng)信號。因此這樣的標(biāo)記是必要的因?yàn)槠渫ㄟ^與所述的報(bào)告化合物互作，可促進(jìn)目的報(bào)告化合物的檢測這里所用的術(shù)語可以被理解為包括兩種可檢測標(biāo)記本身(也被稱為“標(biāo)簽”)以及任何耦合到一種或多種這樣的可檢測標(biāo)簽上的化合物。此外，通過標(biāo)記干擾可檢測信號的產(chǎn)生的基團(tuán)也屬于可檢測標(biāo)記(如只要猝滅劑和熒光彼此很靠近，猝滅劑“劫持”發(fā)射導(dǎo)致熒光的激發(fā))?？蓹z測標(biāo)記可以被整合到或附著到靶標(biāo)核苷酸上，如以修飾和/或標(biāo)記核糖核苷酸，脫氧核苷酸或雙脫氧核苷酸的形式。

使用的可檢測標(biāo)簽或標(biāo)記包括任何化合物，其可直接的或間接的產(chǎn)生化學(xué)的、物理的或酶促反應(yīng)的可檢測化合物或信號。在本領(lǐng)域可采用很多方法進(jìn)行添加標(biāo)記(詳見如Sambrook,J.et al.,supra；and Lottspeich,F.,and Zorbas H.,supra)。標(biāo)記可特別選自熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、有色標(biāo)記、發(fā)色標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、半抗原、生物素、金屬復(fù)合物、金屬和硅體金。所有這些標(biāo)記類型都是本領(lǐng)域已被公開確認(rèn)的。這些標(biāo)記介導(dǎo)的物理反應(yīng)的實(shí)例是當(dāng)使用放射性標(biāo)記時(shí)對于X射線的放射或激發(fā)或發(fā)射能產(chǎn)生熒光或磷光的發(fā)射。堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶和β-內(nèi)酰胺酶是酶標(biāo)記的實(shí)例，它們可以催化發(fā)色反應(yīng)產(chǎn)物的形成。

在具體的實(shí)施例中，第二可檢測標(biāo)記是一種熒光標(biāo)記。本領(lǐng)域中多種熒光是已被公開確定并可以從不同的供應(yīng)商獲得的(詳見例如The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,10th ed.(2006),Molecular Probes,Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA,USA)。

在一些實(shí)施例中，F(xiàn)RET化合物的第一可檢測標(biāo)記與報(bào)告化合物的第二可檢測標(biāo)記都是熒光標(biāo)記。在這些實(shí)施例中，第一可檢測標(biāo)記和第二可檢測標(biāo)記都可發(fā)射范圍為300nm至850nm，如450nm至750nm或550nm至650nm的波長。在具體的實(shí)施例中，第一可檢測標(biāo)記和第二可檢測標(biāo)記發(fā)射相同的波長，如完全相同的，如相同的熒光例如在具體的實(shí)施例中其中第一可檢測標(biāo)記和第二可檢測標(biāo)記發(fā)射相同的波長，例如是完全相同的，一般FRET化合物的數(shù)量與報(bào)告化合物的種類相比是過量存在的，如過量5倍至100倍或10倍至80倍或20倍至50倍或30倍至40倍。

為了檢測這些標(biāo)記，可使用適合的檢測系統(tǒng)，該方法用于確定表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在的數(shù)量及在結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值，如在微陣列上。檢測系統(tǒng)可以采用下述的手持式檢測裝置。一般檢測系統(tǒng)被置于結(jié)合成員的相反位置。適宜的檢測系統(tǒng)的選擇依賴于幾個(gè)參數(shù)，例如待測的標(biāo)記類型或采用的分析種類。各種光學(xué)檢測系統(tǒng)是本領(lǐng)域公開確認(rèn)的?？刹捎玫臋z測系統(tǒng)和方法的常用描述可以在如Lottspeich,F.and Zorbas H.(同上)中找到。

通常情況下，檢測系統(tǒng)是基于光譜刺激熒光標(biāo)記的核苷酸產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度的比較。熒光是特殊的分子，在受到特殊波長激發(fā)時(shí)導(dǎo)致一種特有的吸收和發(fā)射行為能發(fā)射出的它們特有的光。特別的熒光信號的定量檢測是通過熒光顯微法的改良方法進(jìn)行的(參照Lichtman,J.W.,and Conchello,J.A.(2005)Nature Methods 2,910-919；Zimmermann,T.(2005)Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.95,245-265)因此信號作為光吸收和光發(fā)射的結(jié)果，分別可以通過一種或多種過濾器和/或堇青石分開，并在適當(dāng)?shù)臋z測器上成像。數(shù)據(jù)分析采用數(shù)字圖像處理方式進(jìn)行。圖像處理可以用本領(lǐng)域熟知的多種軟件包處理(如EIKONA或Image-PRO的數(shù)學(xué)數(shù)字圖像處理系統(tǒng))。以此為目的的的適當(dāng)?shù)能浖荌conoclust軟件(Clondiag芯片技術(shù)公司，耶拿，德國)。

適當(dāng)?shù)臋z測系統(tǒng)可以基于檢測熒光信號的“經(jīng)典”方法如熒光顯微法或暗視野的熒光顯微法(參考如Lakowicz,J.R.(1999)Principles of Fluorescence Spectroscopy,2^nd ed.,Plenum Publishing Corp.,NY)。

另一個(gè)可用的光學(xué)檢測系統(tǒng)是共聚焦熒光顯微方法，所述目標(biāo)對象是通過點(diǎn)光源在透鏡的聚焦平面上被照明。點(diǎn)光源，目標(biāo)對象和點(diǎn)光源檢測器可以位于光學(xué)上的共軛平面。(Diaspro,A.(2002)Confocal and 2-photon-microscopy:Foundations,Applications and Advances,Wiley-Liss,Hobroken,NJ.)詳細(xì)描述了這種共聚焦系統(tǒng)的實(shí)例。熒光光學(xué)系統(tǒng)通常是沒有自動對焦的熒光顯微鏡，例如具有固定焦點(diǎn)的熒光顯微鏡。

另外所用的熒光檢測方法尤其包括全內(nèi)熒光顯微鏡(見Axelrod,D.(1999)Surface fluorescence microscopy with evanescent illumination,in:Lacey,A.(ed.)Light Microscopy in Biology,Oxford University Press,New York,399-423)，熒光生命周期成像顯微鏡(見例如Dowling,K.et al.(1999)J.Mod.Optics 46,199-209),fluorescence resonance energy transfer (FRET；see,for example,Periasamy,A.(2001)J.Biomed.Optics 6,287-291)，生物性光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET；see,e.g.,Wilson,T.,and Hastings,J.W.(1998)Annu.Rev.Cell Dev.Biol.14,197-230)和熒光相關(guān)光譜(見如Hess,S.T.et al.(2002)Biochemistry 41,697-705)。

在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括測定表示第二核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值，基于結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值。特別的，在特定的樣品中可以計(jì)算存在的一種或多種第二核苷酸的存在和/或存在數(shù)量，基于第二核苷酸與報(bào)告分子形成復(fù)合物前的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量與形成所述的復(fù)合物之后結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的數(shù)量。

為了進(jìn)行檢測反應(yīng)，報(bào)告化合物可以包括上述的一種或多種可檢測標(biāo)記。例如報(bào)告化合物可以包括兩種可檢測標(biāo)記。在具體的實(shí)施例中，可檢測標(biāo)記是上述的熒光標(biāo)記?？蓹z測標(biāo)記可以被整合或附著到報(bào)告分子上，如以修飾和/或標(biāo)記核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸或雙脫氧核苷酸的方式。

為了檢測這樣的標(biāo)記，用于實(shí)施該方法所用的檢測儀器可以進(jìn)一步包括一個(gè)檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)適用于確定結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值。例如檢測系統(tǒng)適用于確定結(jié)合成員上捕捉的靶標(biāo)核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值，如上所述。

在測定過程中，表示第一和/或第二核苷酸存在和/或存在數(shù)量的指示值的測定/確定可以僅進(jìn)行一次或超過一次。如果在單個(gè)測定過程中超過一個(gè)檢測步驟被進(jìn)行，在一些實(shí)施例中獲得的結(jié)果的均值可以被計(jì)算出。為了確定一種或多種第一或第二核苷酸的存在、長度或序列并/或計(jì)算它/它們的數(shù)量，在一次或多次檢測循環(huán)中獲得的數(shù)據(jù)可以被分析并用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的適當(dāng)?shù)挠?jì)算機(jī)軟件進(jìn)行精確的處理。

在一些實(shí)施例中，測定結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值包括指示值的時(shí)間依賴性監(jiān)測，例如隨著時(shí)間的推移重復(fù)進(jìn)行測定/檢測步驟并監(jiān)測指示值的過程。另外或可選擇的，測定FRET化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值包括指示值的時(shí)間依賴性的監(jiān)測，例如隨著時(shí)間的推移重復(fù)進(jìn)行確定/檢測步驟并監(jiān)測指示指示值的過程。

在一些實(shí)施例中，其中第一和/或第二核苷酸進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)展，結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值和/或表示FRET化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值的時(shí)間依賴性可以包括每秒、每2秒、每3秒、每5秒、每10秒、每20秒、每30秒、每60秒、每90秒或每120秒進(jìn)行測定/檢測步驟。

在一些實(shí)施例中，其中第一和/或第二核苷酸進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)展，表示結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值和/或表示FRET化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值的時(shí)間依賴性可以包括每一個(gè)循環(huán)、每兩個(gè)循環(huán)、每三個(gè)循環(huán)、每四個(gè)循環(huán)、每五個(gè)循環(huán)進(jìn)行測定/檢測步驟。

在進(jìn)一步的實(shí)施例中，表示第二核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值是基于報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值以及第二核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值相關(guān)的校正曲線決定的。

在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括在進(jìn)行一定數(shù)量的報(bào)告化合物的子集簇與至少一定數(shù)量的第二核苷酸的子集簇形成復(fù)合體的步驟之后，從結(jié)合成員上釋放剩余的報(bào)告化合物子集，捕捉剩余的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸復(fù)合的一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集簇，并測定結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值。這里所用的術(shù)語“釋放”指從結(jié)合成員上分開的或釋放的報(bào)告分子。這是可以被實(shí)現(xiàn)的，例如通過裂解任何共價(jià)鍵的酶促反應(yīng)或在這樣的情況下，其中核苷酸報(bào)告分子通過互補(bǔ)堿基配被報(bào)告特異核苷酸捕捉分子耦合到結(jié)合成員上，通過增加進(jìn)行測定的反應(yīng)室的溫度，導(dǎo)致核苷酸鏈分離(即變性)。

在進(jìn)一步的實(shí)施例中，釋放、形成復(fù)合物、捕捉和測定步驟是重復(fù)N次，其中N是一個(gè)大于或等于1的整數(shù)。換句話說，該方法是以循環(huán)方式進(jìn)行。在具體的實(shí)施例中，該整數(shù)N是≥5,≥10或≥20。

另外，以下步驟是可以同時(shí)進(jìn)行的，一定數(shù)量的報(bào)告化合物的子集與至少一定數(shù)量的第二核苷酸的子集形成復(fù)合物的步驟，和剩余的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸復(fù)合的一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集的捕捉步驟。

在另一個(gè)實(shí)施例中，以下的步驟都是同時(shí)進(jìn)行的，步驟(i)每一個(gè)形成的復(fù)合物包括一個(gè)第一核苷酸和一個(gè)FRET化合物，(ii)一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集與至少一定數(shù)量的第二核苷酸子集形成復(fù)合物，(iii)捕捉剩余的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸復(fù)合的一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集。

在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括以第一和第二核苷酸為目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，即以相同的物質(zhì)為目標(biāo)來實(shí)施進(jìn)一步檢測之前，為了幫助進(jìn)一步檢測，增加其在樣品中的存在數(shù)量。

在一定數(shù)量的報(bào)告化合物與至少一定數(shù)量的第二核苷酸的子集形成復(fù)合物的步驟之前，第一和第二核苷酸的擴(kuò)展可以被啟動。尤其是，以多種核苷酸為目標(biāo)的擴(kuò)增，當(dāng)允許報(bào)告化合物與第二核苷酸形成復(fù)合物的時(shí)候，未與第二核苷酸復(fù)合的報(bào)告化合物將在結(jié)合成員上被重新捕捉。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，以下的步驟都是同時(shí)進(jìn)行的，步驟(i)每一個(gè)形成的復(fù)合物包括一個(gè)第一核苷酸和一個(gè)FRET化合物，(ii)一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集與至少一定數(shù)量的第二核苷酸子集形成復(fù)合物，(iii)捕捉剩余的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸復(fù)合的一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集，(iv)以第一和/或第二核苷酸為目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增

一般，核苷酸擴(kuò)增是通過等溫?cái)U(kuò)增方法實(shí)施的。在等溫條件下擴(kuò)增核苷酸避免了熱循環(huán)的使用。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說有幾種等溫核苷酸擴(kuò)增方法是已知的，包括轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增，基于核苷酸序列的擴(kuò)增，RNA介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)，鏈置換擴(kuò)增，滾環(huán)擴(kuò)增，環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增，等溫多重置換擴(kuò)增，解旋酶依賴性擴(kuò)增，單引物等溫?cái)U(kuò)增，和循環(huán)依賴解旋酶擴(kuò)增。等溫核苷酸擴(kuò)增技術(shù)參照文獻(xiàn)(P.Gill and A.Ghaemi,Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids,27(3):224-243(2008))。

在這里所述的方法中使用的一個(gè)等溫?cái)U(kuò)增的實(shí)例是切口酶擴(kuò)增反應(yīng)(NEAR)，其可以采用一種鏈置換DNA聚合酶，在由切口酶造成的切口處啟動，從靶標(biāo)序列上快速擴(kuò)增出很多短核苷酸。

在這里所述的方法中使用的一個(gè)等溫?cái)U(kuò)增的實(shí)例是環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)，其使用如4-6個(gè)引物識別如靶標(biāo)DNA的6-8個(gè)特別的區(qū)域。鏈置換DNA聚合酶啟動合成，兩個(gè)引物形成環(huán)結(jié)構(gòu)來促進(jìn)隨后的幾輪擴(kuò)增。

在這里所述的方法中使用的一個(gè)等溫?cái)U(kuò)增的實(shí)例是鏈置換擴(kuò)增(SDA)，其依賴于鏈置換DNA聚合酶，典型的為Bst DNA聚合酶，大片段或Klenow片段(3'-5'外切)，在切口位點(diǎn)啟動，該位點(diǎn)被包含在引物中由有限直鏈限制性內(nèi)切酶或切口酶造成。切口位點(diǎn)被每一次聚合酶的置換步驟重新生成，導(dǎo)致指數(shù)式擴(kuò)增。

在這里所述的方法中使用的一個(gè)等溫?cái)U(kuò)增的實(shí)例是解旋酶依賴的擴(kuò)增(HDA)，其采用解旋酶的雙鏈DNA解旋活性，通過鏈置換DNA聚合酶使得引物退火并延伸。像PCR，該系統(tǒng)只需要兩個(gè)引物。

在一些實(shí)施例中，在等溫?cái)U(kuò)增過程中，上述的FRET化合物如分子信標(biāo)被用于測定第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量，并且上述的報(bào)告化合物的用于測定第二核苷酸的存在和/或存在數(shù)量。在這些實(shí)施例中，第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量可以通過FRET化合物的方式來確定，例如分子信標(biāo)，其可以與第一核苷酸特異的結(jié)合，并根據(jù)溶液中第一核苷酸的存在數(shù)量，在溶液中產(chǎn)生上述的信號。第二核苷酸的存在和/或存在數(shù)量可以通過檢測標(biāo)記的報(bào)告化合物在結(jié)合成員表面如微陣列產(chǎn)生的信號被測定，，該標(biāo)記報(bào)告化合物同時(shí)與第二核苷酸和附著在結(jié)合成員如微陣列的表面上的報(bào)告特異捕捉分子特異的結(jié)合。

在可選擇的實(shí)施例中，核苷酸擴(kuò)增是通過循環(huán)擴(kuò)增的方式進(jìn)行的。循環(huán)擴(kuò)增可以包括可以等于或大于2的任何數(shù)量的擴(kuò)增循環(huán)。通常循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)包括至少10個(gè)或至少20個(gè)循環(huán)。一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增的實(shí)例是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。PCR是分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法，其在文獻(xiàn)中被詳細(xì)描述如(Sambrook et al.,supra)和(Ausubel,F.M.et al.,supra.)。一般PCR采用熱穩(wěn)定DNA聚合酶進(jìn)行雙鏈DNA分子的擴(kuò)增。

在一些實(shí)施例中，在擴(kuò)增中使用的DNA聚合酶具有核苷酸外切酶活性，特別是5'→3'核苷酸外切酶活性。這樣的DNA聚合酶實(shí)例尤其包括Taq DNA聚合酶或Tth DNA聚合酶(其可以從多個(gè)供應(yīng)商市售獲得)。DNA聚合酶通過這種5'→3'核苷酸外切酶活性可以侵襲與第二核苷酸結(jié)合的報(bào)告分子的5'末端，導(dǎo)致這個(gè)報(bào)告分子被逐漸降解。結(jié)果就是在擴(kuò)增反應(yīng)過程中結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的數(shù)量又減少了?？蛇x擇的，采用的DNA聚合酶也可以展現(xiàn)3'→5'核苷酸外切酶活性(“校對活性”)用來去除在新的DNA鏈上特定序列位置上添加的不正確的核苷酸。這樣的同時(shí)具有核酸外切酶活性的DNA聚合酶的實(shí)例尤其包括PwoDNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶(兩種酶都可以從各種供應(yīng)商市售獲得)。假如想要降解報(bào)告化合物來產(chǎn)生和/或促進(jìn)可檢測信號，一般使用具有5'→3'核苷酸外切酶的DNA聚合酶。

在一些實(shí)施例中，在循環(huán)擴(kuò)增過程中上述的FRET化合物如TaqMan探針被用于測定第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量，并且如上所述的報(bào)告化合物被用于測定第二核苷酸的存在和/或存在數(shù)量。在這樣的實(shí)施例中，第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量可以通過FRET化合物的方式被測定，F(xiàn)RET化合物例如TaqMan探針與第一核苷酸特異結(jié)合，并且如上所述在溶液中產(chǎn)生信號依賴于溶液中存在的第一核苷酸的擴(kuò)增數(shù)量。第二核苷酸的存在和/或存在數(shù)量可以通過檢測由標(biāo)記報(bào)告化合物在結(jié)合成員如微陣列的表面產(chǎn)生的信號來測定，該標(biāo)記報(bào)告化合物同時(shí)與第二核苷酸和附著在結(jié)合成員如微陣列的表面上報(bào)告特異捕捉分子特異的結(jié)合。

如果第一和/或第二核苷酸是一種RNA分子，該方法進(jìn)一步包括在以第一和/或第二核苷酸為目標(biāo)的為目標(biāo)擴(kuò)增前，如上所述以第一和/或第二核苷酸為目標(biāo)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄是另一種分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法，也在文獻(xiàn)中被詳細(xì)描述如(Sambrook et al.,supra)和(Ausubel,F.M.et al.,supra.)。

在一個(gè)測定核苷酸存在和/或存在數(shù)量的典型實(shí)施例中，如樣品中的第一核苷酸，擴(kuò)增對照對照可以被用于檢測擴(kuò)增抑制物。特別的，第二核苷酸可以是一種內(nèi)部對照對照核苷酸，選自內(nèi)部陽性擴(kuò)增對照和對照內(nèi)部陰性擴(kuò)增對照。這樣的對照對照核苷酸可以被添加到樣品中，如上所述的體液樣品。

內(nèi)部擴(kuò)增對照的構(gòu)建可用幾種方法進(jìn)行，在于本技術(shù)人員的選擇和判斷。內(nèi)部擴(kuò)增對照可以是質(zhì)粒DNA，其攜帶克隆的內(nèi)部擴(kuò)增對照序列或純化的PCR產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，內(nèi)部擴(kuò)增核苷酸是一種人工合成核苷酸，其在通常條件下是不存在于待分析的體液樣品中的。例如內(nèi)部對照核苷酸是在擴(kuò)增前被反轉(zhuǎn)錄的盔甲RNA。

內(nèi)部陽性擴(kuò)增對照核苷酸或競爭性內(nèi)部擴(kuò)增對照核苷酸或內(nèi)部陽性對照可以從靶標(biāo)被分析物的部分序列或全序列來設(shè)計(jì)。特別的，第一核苷酸和內(nèi)部陽性擴(kuò)增對照核苷酸可以具有相同的引物結(jié)合位點(diǎn)。例如，內(nèi)部陽性擴(kuò)增對照核苷酸可以具有與第一核苷酸的部分序列相對應(yīng)的序列。共享的同一引物結(jié)合位點(diǎn)可以允許相似的或基本相同的擴(kuò)增條件。為了避免第一核苷酸和內(nèi)部陽性擴(kuò)增對照核苷酸間的競爭，可以過量使用相應(yīng)的擴(kuò)增子引物。

在這個(gè)實(shí)施例中，結(jié)合成員上的報(bào)告化合物結(jié)合位點(diǎn)，如報(bào)告特異捕捉探針，是內(nèi)部陽性擴(kuò)增對照核苷酸特異的，允許其區(qū)分在結(jié)合成員上的內(nèi)部陽性擴(kuò)增對照核苷酸和任意其他對照核苷酸。

內(nèi)部陰性擴(kuò)增對照核苷酸或非競爭性內(nèi)部擴(kuò)增對照核苷酸可以是一種核苷酸，其序列不必與靶標(biāo)被分析物或內(nèi)部陽性擴(kuò)增對照核苷酸具有同源性。例如，內(nèi)部陰性擴(kuò)增對照核苷酸可以具有一種序列，其不包括擴(kuò)增子引物的引物結(jié)合位點(diǎn)，該序列用于擴(kuò)增靶標(biāo)核苷酸或第一核苷酸或內(nèi)部陽性擴(kuò)增對照核苷酸。

另外，在這個(gè)實(shí)施例中，在結(jié)合成員上的報(bào)告化合物的結(jié)合位點(diǎn)是內(nèi)部陰性擴(kuò)增對照核苷酸特異的，以區(qū)分陰性擴(kuò)增對照核苷酸、內(nèi)部陽性擴(kuò)增對照核苷酸以及其他結(jié)合成員上的對照核苷酸。在內(nèi)部陰性擴(kuò)增對照核苷酸沒有擴(kuò)增時(shí)，報(bào)告化合物特異的報(bào)告化合物結(jié)合位點(diǎn)上的信號被希望在整個(gè)過程中保持一致，該報(bào)告化合物能與內(nèi)部陰性擴(kuò)增對照核苷酸形成復(fù)合物。例如，對于一個(gè)有效的測試，為了報(bào)告化合物能與內(nèi)部陰性擴(kuò)增對照核苷酸形成復(fù)合物，報(bào)告化合物上報(bào)告化合物特異的結(jié)合位點(diǎn)上的信號可能需要與沒有報(bào)告Ct指示值時(shí)保持一致，否則測試被認(rèn)為無效。

其他對照也可以用于這里所述的方法。例如對于這里所述的內(nèi)部擴(kuò)增對照，附加的或可選擇的，對照可以選自陽性雜交對照、處理陽性對照、處理陰性對照和試劑對照。

陽性雜交對照可以是一種報(bào)告化合物，其不與任何第一和第二核苷酸形成復(fù)合物。

處理陽性對照可以是被摻入足夠數(shù)量的靶標(biāo)被分析物的陰性樣品，并在整個(gè)過程中被加工處理。

處理陰性對照可以指被摻入足夠數(shù)量的與靶標(biāo)被分析物密切相關(guān)但非靶標(biāo)被分析物的陰性樣品，其在整個(gè)過程中被加工處理。

非模板對照(空白)指含有各種試劑的對照，但不是靶標(biāo)或內(nèi)部擴(kuò)增對照核苷酸。

對于核苷酸擴(kuò)增，檢測儀器被用于實(shí)施該方法，該方法包括一種或多種溫度控制單位和/或溫度調(diào)節(jié)單位用來控制和/或調(diào)節(jié)設(shè)備或反應(yīng)室里面的溫度。這樣的溫度控制單位和/或溫度調(diào)節(jié)單位可以包括一種或多種單獨(dú)的加熱和/或冷卻元件，其可以直接接觸檢測裝置的反應(yīng)室。一般，一種或多種加熱和/或冷卻元件有導(dǎo)熱材料制作成。這樣的導(dǎo)熱材料的實(shí)例尤其包括硅，陶瓷材料如氧化二鋁陶瓷，和/或像高級鋼，鋁，銅，或銅的金屬。適用于實(shí)施這里所述方法的溫度控制單位和/或溫度調(diào)節(jié)的實(shí)例性的詳細(xì)描述也可以在專利WO 01/02094中找到，其相關(guān)的內(nèi)容在這里被明確的提及。

反應(yīng)室中溫度的檢測可以通過本領(lǐng)域公知的各種方法來進(jìn)行，如通過使用完整的電阻傳感器，半導(dǎo)體傳感器，光導(dǎo)傳感器，多色染料或液晶。此外反應(yīng)室中的溫度可以通過腔室內(nèi)的完整的溫度傳感器、高溫計(jì)或傳感器、或通過來參數(shù)隨溫度的改變來測量，如檢測發(fā)生表面的折射指數(shù)或樣品的pH指示值，例如通過測定pH敏感指示劑的顏色改變來測定。

在一些實(shí)施例中如出于安全的原因，反應(yīng)室可以在核苷酸擴(kuò)增啟動之前不可逆的封閉。不可逆的封閉反應(yīng)室可以采用通過封閉入口，和任意的反應(yīng)室的出口。例如與反應(yīng)室連接的通道和/或閥可以是熱封閉的或焊接的。通過使熱栓與通道或閥接觸，從而塑料杯熔化并且通道或閥被鎖定，那樣通道塑料通道或閥就被熱封閉了。

提供第一和/或第二核苷酸的步驟可以包括從樣品中包含的生物材料中釋放第一和/或第二核苷酸。結(jié)果是，樣品被加熱來破壞細(xì)胞膜和/或病毒衣殼(如通過采用如上所述的溫度控制單位和/或溫度調(diào)節(jié)單位)。在一些實(shí)施例中，這個(gè)釋放步驟包括使體液樣品與溶解試劑接觸，例如含有一種或多種洗滌劑的試劑，其可以分裂細(xì)胞膜和/或病毒衣殼。這樣的溶解試劑是本領(lǐng)域公知的(見例如Sambrook,J.et al.(1989)Molecular,Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)并可以通過很多供應(yīng)商市售獲得。

該方法可以進(jìn)一步包括使第一和/或第二核苷酸從伴隨物中分離。

用于表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值，以及在結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值可以被連續(xù)的或同時(shí)測定。

接下去，要討論的檢測裝置或測定系統(tǒng)或微流體盒的實(shí)例，一般能進(jìn)行大多數(shù)這里所述的發(fā)放的所有步驟。示例性的檢測裝置、反應(yīng)室和相應(yīng)的方法也在專利WO 2005/108604,WO 2008/055915,WO 2008/135564和T.Ulrich等(T.Ulrich et al.,PloS ONE,7,4,e35438(2012))被詳細(xì)描述，它們的相關(guān)內(nèi)容在這里被明確指出。

特別的，這里所述的方法可以在一個(gè)檢測轉(zhuǎn)置中被實(shí)施，通過在擴(kuò)增過程中去除來自溶液的背景信號，該檢測裝置能檢測在結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值。在一個(gè)實(shí)施例中，這個(gè)從檢測轉(zhuǎn)置的反應(yīng)室移除溶液是可逆的。例如，為了擴(kuò)增和檢測，可以使用包含如下所述反應(yīng)室的檢測裝置。

特別的，表示溶液中被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值和/或表示在結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值可以在包含結(jié)合成員和蓋元件的反應(yīng)室中被檢測。結(jié)合成員被配制在蓋元件上面或在蓋元件相對的表面。在這些實(shí)施例中，蓋元件可以被配置為至少部分可變形的，使得所述反應(yīng)室具有松弛狀態(tài)的內(nèi)部體積和處于壓縮狀態(tài)的內(nèi)部體積。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，表示被溶液中的FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值和/或表示在結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值可以在一個(gè)反應(yīng)室中被檢測，該反應(yīng)室包含第一表面、第二表面和能捕捉報(bào)告化合物的結(jié)合成員，其中第一和第二標(biāo)記間的距離是可變的，那樣反應(yīng)室具有松弛狀態(tài)的內(nèi)部體積和處于壓縮狀態(tài)的內(nèi)部體積。

特別的，在具有壓縮狀態(tài)內(nèi)部體積的反應(yīng)室中，含有未與結(jié)合成員連接的可檢測標(biāo)記的液體，從所述結(jié)合成員和與結(jié)合成員相對的反應(yīng)室的表面之間的區(qū)域被移除。因此，在具有松弛狀態(tài)內(nèi)部體積的反應(yīng)室中，含有未與結(jié)合成員連接的可檢測標(biāo)記的液體，不從所述結(jié)合成員和與結(jié)合成員相對的反應(yīng)室的表面之間的區(qū)域被移除。

特別的，表示被溶液中的FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值在具有松弛狀態(tài)內(nèi)部體積的反應(yīng)室內(nèi)被測定。另外，表示結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值可以在具有壓縮狀態(tài)內(nèi)部體積的反應(yīng)室內(nèi)被測定。

例如，測定被捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值可以采用一個(gè)操縱柔性蓋元件的變形的致動器。蓋元件可以在減小反應(yīng)室體積的方式下變形。在這樣的實(shí)施例中，測定被捕捉的報(bào)告化合物存在和/或存在數(shù)量的指示值后，反應(yīng)室的體積再次增加。另外或可選擇的，在檢測過程中致動器可以壓縮反應(yīng)室來減少可變該元件與基質(zhì)間的距離，因而移除含有物質(zhì)的液體，該物質(zhì)未與來自檢測區(qū)域的結(jié)合成員耦合。

在一個(gè)示例性實(shí)施例中，結(jié)合成員被配制在反應(yīng)室中并且所有步驟都在反應(yīng)室中進(jìn)行，這些步驟是形成包括第一核苷酸和FRET化合物的每一個(gè)復(fù)合物；形成一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集與第二核苷酸形成的復(fù)合物；和捕捉一定數(shù)量的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸復(fù)合的剩余報(bào)告化合物子集。另外，以第一和/或第二核苷酸為目標(biāo)來擴(kuò)增和/或關(guān)于結(jié)合成員(重新)捕捉報(bào)告化合物也可以在反應(yīng)室中進(jìn)行。

提供第一和/或第二核苷酸可以在空間上與各種步驟分開進(jìn)行，這些步驟是形成每個(gè)都含有一個(gè)第一核苷酸和一個(gè)FRET化合物的復(fù)合物，形成一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集與第二核苷酸的復(fù)合物；以第一和/或第二核苷酸為目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，捕捉未在結(jié)合成員上與第二核苷酸形成復(fù)合物的一定數(shù)量的剩余的報(bào)告化合物，測定表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值，以及測定表示在結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值。

這里所述的方法可以如在一個(gè)檢測裝置中進(jìn)行，該裝置包含適用于容納液體的反應(yīng)室，其中反應(yīng)室至少包括一個(gè)結(jié)合成員，并與一個(gè)微流體網(wǎng)絡(luò)液體連通。例如該方法可在一個(gè)檢測裝置中進(jìn)行，該裝置包括一個(gè)硬基質(zhì)、至少部分覆蓋上述基質(zhì)的可變形的蓋元件，在基質(zhì)中形成的一種結(jié)構(gòu)或反應(yīng)室，適用于容納液體并包括至少一個(gè)結(jié)合成員，該結(jié)合成員適用于捕捉報(bào)告化合物，并且為了測定

報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值，任選的微流體網(wǎng)絡(luò)至少與反應(yīng)室通過進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)相互連接，如該結(jié)構(gòu)用于提供第一和/或第二核苷酸的結(jié)構(gòu)。檢測裝置可以被放置在探測器系統(tǒng)的相關(guān)位置或里面。這樣的探測器系統(tǒng)可以包括一個(gè)致動器裝置，該致動器用于使可變蓋元件壓向硬基質(zhì)。

示例性檢測裝置如圖1所示。這樣的檢測裝置的機(jī)械模塊可以包括用于可逆的壓縮和釋放檢測裝置反應(yīng)室的活塞或致動器(a)。溫度控制模塊可以包括在中央(b)有孔的兩個(gè)珀?duì)柼?。結(jié)合成員的熒光圖(c)，如一個(gè)陣列，可以通過光學(xué)檢測模塊獲得(d)。通過過程控制模塊(e)可以控制所有組件的協(xié)調(diào)同步進(jìn)行，也可以控制擴(kuò)增反應(yīng)的熱動態(tài)。獲得圖像后，將雜交模式通過圖像分析模塊進(jìn)行分析。結(jié)果可以被可視化為結(jié)合成員的各個(gè)探針與反應(yīng)時(shí)間的強(qiáng)度曲線圖。

示例性反應(yīng)室如圖2所示。試驗(yàn)裝置的未經(jīng)壓縮的反應(yīng)室可以用含有高濃度的熒光標(biāo)記報(bào)告探針的反應(yīng)混合物填充。因此，結(jié)合成員上的雜交模式的成像，例如捕捉探針陣列，對抗背景是行不通的(a)。為了采集圖像，可采用活塞或致動器(b)施加壓力，結(jié)合成員(c)被緊密地壓在反應(yīng)室的頂部，從而移動所述熒光液(d)。移動的液體可以被壓入一個(gè)完整的氣動彈簧(e)中。獲取圖像(f)之后反應(yīng)室被允許松弛和液體樣品可以回到松弛的反應(yīng)室中。

在上述的測試裝置和反應(yīng)室中進(jìn)行的示例性方法中，樣品可以包含有競爭性的報(bào)告化合物和分子信標(biāo)，一旦形成供體發(fā)色團(tuán)特異的擴(kuò)增子，樣品中的熒光信號就改變了。結(jié)合成員可以包括具有報(bào)告特異捕捉化合物的微陣列，這個(gè)報(bào)告特異捕捉化合物適用于與報(bào)告化合物形成復(fù)合物，并在微陣列上生成熒光信號。報(bào)告化合物也對擴(kuò)增產(chǎn)物的序列具有特異性，例如用作內(nèi)部陽性擴(kuò)增對照或作為內(nèi)部陰性對照的模擬片段。反應(yīng)開始后，溶液與微陣列的圖像被交替地制作出(見圖3)。

對來自溶液和來自微陣列的圖形分別進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(見圖4)。

如圖4a所述，由于分子信標(biāo)與第一核苷酸的合成擴(kuò)增產(chǎn)物形成復(fù)合物，溶液中的熒光強(qiáng)度增加。圖4a所示是NEAR擴(kuò)增的特征曲線。圖4b顯示了由于報(bào)告化合物與溶液中第二核苷酸的合成擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合導(dǎo)致熒光信號減少。

這里所述的方法可以被用于免疫測定和核苷酸檢測的床邊護(hù)理。

下面的實(shí)施例僅用于說明具體實(shí)施方案，并且不應(yīng)當(dāng)被理解為以任何方式來限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)例1

肺結(jié)核DNA利用等溫NEAR在如圖1和圖2所示的檢測裝置中進(jìn)行擴(kuò)增，該檢測裝置包括一個(gè)可壓縮的反應(yīng)室和像結(jié)合成員一樣能捕捉報(bào)告化合物的陣列。樣品包括引物(反向引物：Tb_DR_R25c 5’-AGACTCCATATGGAGTCTCATCTTTCCGTCCCC-3’,正向引物：Tb_DR_F16 5’-CGACTCCATATGGAGTCGTCGTCAGACCCAAAA-3’)，分子信標(biāo)MB_P2_7(5’-TCGGGGCAGACCCAAAACCCCGA-3’)，報(bào)告化合物Anti_Tb_Target_CMA(5’-CCCAAAACCCCGAGAGG-3’)，酶(切口酶和鏈置換酶)和靶標(biāo)DNA。作為對照反應(yīng)，沒有靶標(biāo)DNA的情況下進(jìn)行這個(gè)擴(kuò)增也就是沒有模板對照。這個(gè)擴(kuò)增在56℃進(jìn)行600秒。每15秒采集圖像。結(jié)果如圖5a)和圖5b)所示。

如圖5a)所示，圖5a顯示了競爭性報(bào)告監(jiān)測擴(kuò)增與分子信標(biāo)間的比較，溶液中的熒光增加了，由于分子信標(biāo)與靶標(biāo)DNA形成復(fù)合物。此外，也可以看出陣列上報(bào)告化合物的信號減少了因?yàn)閳?bào)告化合物與NEAR擴(kuò)增產(chǎn)物形成的復(fù)合物。

圖5b)顯示了在沒有靶標(biāo)DNA的對照反應(yīng)中競爭性報(bào)告監(jiān)測擴(kuò)增與分子信號間的比較，因?yàn)槿鄙侔袠?biāo)DNA，溶液中的熒光隨時(shí)間保持不變。此外，除了典型的漂白效果，在陣列上報(bào)告化合物的信號不會減少。

實(shí)例2：

存在一個(gè)內(nèi)部陽性對照(IPC)和一個(gè)陽性雜交對照(PHC)的情況下肺結(jié)核DNA的檢測

肺結(jié)核DNA(靶標(biāo)DNA)和內(nèi)部陽性對照DNA(IPC)利用等溫NEAR在如圖1和圖2所示的檢測裝置中進(jìn)行，該檢測裝置包括一個(gè)可壓縮的反應(yīng)室和像結(jié)合成員一樣能捕捉報(bào)告化合物的陣列。靶標(biāo)被分析物和IPC的模板在引物結(jié)合位點(diǎn)上具有相同的序列，但與報(bào)告化合物和FRET化合物(這里是分子信標(biāo))的結(jié)合位點(diǎn)的序列各自不同。因此兩者的擴(kuò)增子可以被相同引物擴(kuò)增并且可以通過不同的探針彼此獨(dú)立地被檢測到。

擴(kuò)增反應(yīng)混合物包括引物(反向引物TB_DR_25c，正向引物TbDR_F16)，分子信標(biāo)MB_PS_7,IPC報(bào)告化合物和IPC。此外，不能與IPC擴(kuò)增子形成復(fù)合物的報(bào)告化合物被添加作為陽性雜交對照(PHC：5‘-ccgactactacgggacgctggga-3‘)為了顯示IPC報(bào)告物信號強(qiáng)度的改變是存在IPC擴(kuò)增子的特異表現(xiàn)。因此這個(gè)PHC對照在雜交動力學(xué)方面不同于IPC報(bào)告物。

模板靶標(biāo)：100GE(基因組當(dāng)量)

模板IPC500GE

正向引物濃度750nM

反向引物濃度50nM

報(bào)告物濃度IPC:10nM

報(bào)告物濃度PHC:10nM

分子信標(biāo)濃度200nM

擴(kuò)增在56℃進(jìn)行約600秒。每15秒采集圖像。結(jié)果如圖6和7所示。

雖然內(nèi)部陽性對照DNA最初比靶標(biāo)DNA多5倍，靶標(biāo)DNA可以用與內(nèi)部陽性對照DNA相同的測定方法來被檢測(檢測溶液中FRET化合物捕捉的靶標(biāo)被分析物，以及檢測陣列上的內(nèi)部陽性對照報(bào)告物)。由于溶液中缺乏競爭物，PHC信號強(qiáng)度過程具有二級動力學(xué)特點(diǎn)。

一些實(shí)施例涉及：

1.樣品中核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的測定方法，包括

(a)提供

一定數(shù)量的第一核苷酸；

一定數(shù)量的第二核苷酸；

一定數(shù)量的FRET化合物能與第一核苷酸形成復(fù)合物，其中FRET化合物包括第一核苷酸的區(qū)域特異的結(jié)合區(qū)域，以及第一可檢測標(biāo)記，其具有一種未復(fù)合狀態(tài)，即第一可檢測特征和一種復(fù)合狀態(tài)，即第二可檢測特征。

一定數(shù)量報(bào)告化合物能與第二核苷酸形成復(fù)合物，其中每一個(gè)報(bào)告化合物包括第二核苷酸特異的結(jié)合區(qū)域和第二可檢測標(biāo)記。

結(jié)合成員能捕捉報(bào)告化合物；其中形成的第二核苷酸與報(bào)告化合物的復(fù)合物

抑制了結(jié)合成員對報(bào)告化合物的捕捉；

(b)每一個(gè)形成的復(fù)合物包括一個(gè)第一核苷酸和一個(gè)FRET化合物；

(c)一定數(shù)量的報(bào)告化合物的子集與第二核苷酸形成復(fù)合物；

(d)捕捉未與結(jié)合成員上的第二核苷酸形成復(fù)合物的剩余的報(bào)告化合物的子集；

(e)測定表示FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值；

(f)測定表示結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值。

2.實(shí)施例的方法進(jìn)一步包括測定表示第二核苷酸存在和/或存在數(shù)量的指示值，基于結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值。

3.實(shí)施例1或2的方法中，其中第一可檢測標(biāo)記是一個(gè)熒光標(biāo)記。

4.實(shí)施例1至實(shí)施例3中的任意的方法中，其中第二可檢測標(biāo)記是一個(gè)熒光標(biāo)記。

5.實(shí)施例1至實(shí)施例4中的任意方法中，其中第一可檢測標(biāo)記和第二可檢測標(biāo)記都是熒光標(biāo)記。

6.實(shí)施例5的方法中，其中第一可檢測標(biāo)記和第二可檢測標(biāo)記發(fā)射的波長范圍為300nm至850nm。

7.在實(shí)施例5或?qū)嵤├?的方法中，其中第一可檢測標(biāo)記和第二可檢測標(biāo)記是完全相同的。

8.實(shí)施例1至實(shí)施例7的任意方法中，其中被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和存在數(shù)量的指示值是以FRET化合物的復(fù)合狀態(tài)被測定的。

9.實(shí)施例1至實(shí)施例8的任意方法中，其中第一核苷酸是一種被分析物。

10.實(shí)施例1至實(shí)施例9的任意方法中，其中第二核苷酸是選自第二被分析物和對照核苷酸。

11.實(shí)施例1至實(shí)施例10的任意方法中，其中每個(gè)樣品中第一核苷酸的存在數(shù)量小于100個(gè)拷貝。

12.實(shí)施例1至實(shí)施例11的任意方法中，其中第二核苷酸是存在的，其存在數(shù)量是每個(gè)樣品100個(gè)拷貝或更多。

13.實(shí)施例1至實(shí)施例12的任意方法中，其中以下步驟是同時(shí)進(jìn)行的，(i)每一個(gè)形成的復(fù)合物包括一個(gè)第一核苷酸和一個(gè)FRET化合物，(ii)一定數(shù)量報(bào)告化合物子集與至少一定數(shù)量的第二核苷酸子集形成復(fù)合物，(iii)捕捉剩余的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸復(fù)合一定數(shù)量的報(bào)告化合物的子集。

14.實(shí)施例1至實(shí)施例13的任意方法中，進(jìn)一步包括以第二和/或第二核苷酸為目標(biāo)的擴(kuò)增，其中可選擇的，在一定數(shù)量的報(bào)告化合物的子集與至少一定數(shù)量的第二核苷酸的子集形成復(fù)合物的步驟之前，第一和第二核苷酸的擴(kuò)增被啟動了。

15.在實(shí)施例14的方法中，其中以下的步驟是同時(shí)進(jìn)行的，(i)每一個(gè)形成的復(fù)合物包括一個(gè)第一核苷酸和一個(gè)FRET化合物，(ii)一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集與至少一定數(shù)量的第二核苷酸的子集形成復(fù)合物，(iii)捕捉剩余的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸復(fù)合的一定數(shù)量的報(bào)告化合物的子集，，以及(iv)以第一和/或第二核苷酸為目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增。

16.在實(shí)施例14或15的方法中，其中第二核苷酸可以選自陽性擴(kuò)增對照和陰性擴(kuò)增對照。

17.實(shí)施例1至實(shí)施例16的任意方法中，其中結(jié)合成員包括一個(gè)或多個(gè)不同的報(bào)告特異捕捉化合物，其能捕捉結(jié)合成員上的報(bào)告化合物。

18.在實(shí)施例17的方法中，其中報(bào)告特異捕捉化合物是寡核苷酸。

19.在實(shí)施例17和18的方法中，其中不同的報(bào)告特異捕捉化合物被配制在與結(jié)合成員有關(guān)的不同位置。

20.在實(shí)施例17和19的方法中，其中通過與報(bào)告特異捕捉化合物形成復(fù)合物，報(bào)告化合物在結(jié)合成員上被捕捉。

21.在實(shí)施例17和20的方法中，其中能與第二核苷酸形成復(fù)合物的報(bào)告化合物的至少部分互作位點(diǎn)也能與報(bào)告特異捕捉化合物形成復(fù)合物。

22.在實(shí)施例17和21的方法中，其中報(bào)告特異捕捉化合物與第二核苷酸競爭來與報(bào)告化合物形成復(fù)合物。

23.在實(shí)施例1至實(shí)施例22的方法中，其中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值和/或表示結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值是在含有結(jié)合成員和蓋元件的反應(yīng)室中被測定的。

24.在實(shí)施例23的方法中，其中蓋元件被配制為至少部分可變形的，那樣反應(yīng)室具有一個(gè)松弛狀態(tài)的內(nèi)部體積和一個(gè)壓縮狀態(tài)的內(nèi)部體積。

25.在實(shí)施例24的方法中，其中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值是在具有松弛狀態(tài)內(nèi)部體積的反應(yīng)室中被測定的。

26.在實(shí)施例23至25的方法中，其中表示在結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值是在具有壓縮狀態(tài)內(nèi)部體積的反應(yīng)室中被測定的。

27.在實(shí)施例1至26的任意方法中，其中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值，及表示結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值是連續(xù)的或同時(shí)被測定的。

28.在實(shí)施例1至27的任意方法中，其中報(bào)告化合物是寡核苷酸。

29.在實(shí)施例1至28的任意方法中，進(jìn)一步包括在以第一和/或第二核苷酸為目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增前，以它們?yōu)槟繕?biāo)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

30.在實(shí)施例14至29的任意方法中，其中擴(kuò)增包括使雙鏈核苷酸變性的步驟，其中雙鏈核苷酸包括報(bào)告化合物與第二核苷酸的復(fù)合物，報(bào)告化合物與報(bào)告特異捕捉化合物的復(fù)合物，雙鏈報(bào)告化合物和雙鏈第一和/或第二核苷酸，和/或擴(kuò)增包括引物化合物對第一和/或第二核苷酸退火的步驟，其中可選擇的退火步驟是與形成復(fù)合物的步驟和/或捕捉報(bào)告化合物的步驟同時(shí)進(jìn)行的，形成的復(fù)合物的步驟是一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集與至少一定數(shù)量的第二核苷酸子集形成的復(fù)合物，捕捉步驟是捕捉剩余的未與結(jié)合成員上的第二核苷酸復(fù)合的一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集的步驟。

31.在實(shí)施例14至30的任意方法中，其中擴(kuò)增是等溫?cái)U(kuò)增方法，其中可選擇的等溫?cái)U(kuò)增方法是等溫NEAR。

32.在實(shí)施例14至30的任意方法中，其中擴(kuò)增是一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，其中可選擇的循環(huán)擴(kuò)增是一個(gè)PCR，其中可選擇的進(jìn)行PCR包括采用具有核苷酸外切酶活性的聚合酶，其中表示在結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值可選擇在循環(huán)擴(kuò)增進(jìn)行至少一個(gè)循環(huán)后被測定的，可選擇在循環(huán)擴(kuò)增的每個(gè)循環(huán)后被測定，其中表示第一和/或第二核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值可選擇在每次測定結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值后被測定。

33.在實(shí)施例2至32的任意方法中，其中表示第二核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值是基于校正曲線被測定的，該校正曲線與報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值以及第二核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值有關(guān)。

34.測定樣品中核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的方法包括在反應(yīng)室中提供一定數(shù)量的第一核苷酸；一定數(shù)量的第二核苷酸；一定數(shù)量的能與第一核苷酸形成復(fù)合物的FRET化合物，，其中FRET化合物包括第一核苷酸特異的結(jié)合域，并且第一可檢測標(biāo)記具有一種未復(fù)合狀態(tài)，即第一可檢測特征，和一種復(fù)合狀態(tài)，及第二可檢測特征；以及一定數(shù)量的能與第二核苷酸形成復(fù)合物的報(bào)告化合物，其中每一個(gè)報(bào)告化合物包括第二核苷酸特異的結(jié)合域和第二可檢測標(biāo)記；其中反應(yīng)室包括能捕捉報(bào)告化合物的結(jié)合成員，其中第二核苷酸報(bào)告化合物形成的復(fù)合物抑制了結(jié)合成員對報(bào)告化合物的捕捉，被配制的蓋元件是至少部分可變形的，那樣反應(yīng)室具有松弛狀態(tài)的內(nèi)部體積和壓縮狀態(tài)的內(nèi)部體積；以第一和/或第二核苷酸和為目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增；每一個(gè)形成的復(fù)合物包括一個(gè)第一核苷酸和一個(gè)FRET化合物；

一定數(shù)量的報(bào)告化合物子集與一個(gè)第二核苷酸形成復(fù)合物；

捕捉未與結(jié)合成員上的第二核苷酸復(fù)合的剩余的一定數(shù)量的報(bào)告化合物的子集；測定在具有松弛狀態(tài)內(nèi)部體積的反應(yīng)室里的溶液中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值；

測定在具有壓縮狀態(tài)內(nèi)部體積的反應(yīng)室里中表示結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物的存在和/或存在數(shù)量的指示值，并且，基于表示結(jié)合成員上捕捉的報(bào)告化合物存在和/或存在數(shù)量的指示值，測定第二核苷酸的存在和/或存在數(shù)量的指示值。