一種核酸檢測方法和試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種核酸檢測方法和試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，核酸檢測在進(jìn)一步研究遺傳性疾病、確定癌變基因及藥物抗性篩選方面 發(fā)揮著重要作用。例如，單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorphism,SNP)，其是 由單個核苷酸-A，T，C或G的改變而引起的DNA序列的改變，造成包括人類在內(nèi)的物種之間 染色體基因組的多樣性。這種SNP位點突變的核酸的準(zhǔn)確檢測為對進(jìn)一步確診疾病提供了 參考基礎(chǔ)。因此對于檢測核酸突變在生命科學(xué)領(lǐng)域有著無比重要的意義，而核酸檢測方法 的研究已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。
[0003] 針對現(xiàn)有已知的核酸突變類型主要有以下幾種檢測方法：
[0004] 1)Southern印跡法，可以篩選出基因的缺失、插入和移碼重組等突變形式。但該技 術(shù)需要使用到放射性同位素作為標(biāo)記，危及研發(fā)人員的人生安全，再且，分子印跡法檢測周 期長，操作復(fù)雜；
[0005] 2)直接測序法，測序方法成本高、操作復(fù)雜，對于突變比例低于15 %~20%的樣 本，使用測序方法進(jìn)行檢測，就難以發(fā)現(xiàn)，再且，一次測序過程中僅可以檢測一條序列的堿 基組成情況，對于多條序列，則需要分別進(jìn)行測序，耗時耗力；
[0006] 3)實時熒光定量PCR，熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、自動化程度高 的特點，但也存在樣品易污染、假陽性率高的缺點，且每次只能檢測一種突變類型；
[0007] 4)電泳技術(shù)，包括瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳等，其操作簡單，檢測周 期短，但電泳技術(shù)只可以區(qū)分不同長短的核酸序列，對于具體發(fā)生哪個位點的哪種突變，核 酸序列的具體組成的確定等，則無法獲知；
[0008] 5)DNA芯片技術(shù)，該方法快速簡單、自動化程度高，然而，無論是固相芯片還是液相 芯片，均需要儀器進(jìn)行結(jié)果的判讀，而檢測儀器價格昂貴，儀器操作程序復(fù)雜，無法進(jìn)行大 規(guī)模推廣和應(yīng)用；
[0009] 6)膠體金技術(shù)，膠體金技術(shù)由于其獨特的光學(xué)、電學(xué)性質(zhì)以及生物親和效應(yīng)，目前 在催化、傳感器和DNA分析領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，它是免疫親和技術(shù)、印跡技術(shù)、免疫標(biāo)記 技術(shù)和層析技術(shù)的結(jié)合，使用時只需插入樣本液體，數(shù)分鐘就可以作出準(zhǔn)確的結(jié)果判讀，目 前，市面上的膠體金檢測DNA產(chǎn)品，主要是選用DNA抗原從而將DNA包被形成待測抗原，通 過使用金標(biāo)抗體對該待測抗原進(jìn)行標(biāo)記，將單克隆抗體包被在檢測線處，利用抗原抗體特 異性結(jié)合的免疫反應(yīng)原理，在檢測線處形成抗體-待測抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物，在對照線處 形成抗金標(biāo)抗體-金標(biāo)抗體復(fù)合物，從而檢測目標(biāo)DNA，該技術(shù)中多種抗原和抗體的結(jié)合是 通過抗原決定簇之間的相互識別來實現(xiàn)的，不同抗原抗體的空間構(gòu)型不可避免地影響其相 互的識別和結(jié)合，從而影響到檢測的信號強度，再且非特異性的結(jié)合也使該技術(shù)的假陽性 商。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種全新的核酸檢測的方法和試紙條，提高檢 測核酸的準(zhǔn)確度和簡便性；
[0011] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種全新的核酸檢測的方法和試紙條，使其可實施 多個核酸的并行檢測。
[0012] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0013] -種核酸檢測方法，根據(jù)每一個待測核酸設(shè)計5'端帶有標(biāo)簽序列的上游引物以及 5'端偶聯(lián)有第一配對物的下游引物，然后以所設(shè)計的引物PCR擴增待測核酸，擴增產(chǎn)物變 性后與包被膠體金的第二配對物結(jié)合，再與標(biāo)記有所述標(biāo)簽序列的檢測線結(jié)合，根據(jù)檢測 線顯色情況進(jìn)行結(jié)果判讀；
[0014] 所述標(biāo)簽序列為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)、序列內(nèi)部和序列間不形成二聚體、不存在錯 配、與人類基因組DNA和所述引物之間不存在特異性結(jié)合的序列，所述核苷酸序列大小為 20~50bp；
[0015] 所述第一配對物和第二配對物可相互特異性相結(jié)合。以下簡稱第一種核酸檢測方 法。
[0016] 作為優(yōu)選，所述第一種核酸檢測方法為SNP位點核酸檢測方法，根據(jù)每一個待測 SNP位點核酸設(shè)計兩條5'端帶有標(biāo)簽序列的上游引物以及一條5'端偶聯(lián)有第一配對物的 下游引物，然后以所設(shè)計的引物PCR擴增待測SNP位點核酸，擴增產(chǎn)物變性后與包被膠體金 的第二配對物結(jié)合，再與標(biāo)記有所述標(biāo)簽序列的檢測線結(jié)合，根據(jù)檢測線顯色情況進(jìn)行結(jié) 果判讀；
[0017] 所述兩條上游引物分別為針對待測SNP位點核酸野生型擴增引物和待測SNP位點 核酸突變型擴增引物，且兩條上游引物所帶有的標(biāo)簽序列不同且不互補。
[0018] 基于同樣的檢測原理，本發(fā)明還同時提供另一種檢測方案：
[0019] 根據(jù)每一個待測核酸設(shè)計5'端帶有標(biāo)簽序列和墊片序列的上游引物以及5'端偶 聯(lián)有第一配對物的下游引物，然后以所設(shè)計的引物PCR擴增待測核酸，擴增產(chǎn)物與包被膠 體金的第二配對物結(jié)合，再與標(biāo)記有反標(biāo)簽序列的檢測線結(jié)合，根據(jù)檢測線顯色情況進(jìn)行 結(jié)果判讀；
[0020] 所述標(biāo)簽序列為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)、序列內(nèi)部和序列間不形成二聚體、不存在錯 配、與人類基因組DNA和所述引物之間不存在特異性結(jié)合的序列，所述核苷酸序列大小為 20~50bp；
[0021] 所述第一配對物和第二配對物可相互特異性相結(jié)合，所述反標(biāo)簽序列和標(biāo)簽序列 反向互補配對；
[0022] 所述墊片序列位于標(biāo)簽序列和上游引物之間起連接作用，且不能與堿基配對。以 下簡稱第二種核酸檢測方法。
[0023] 作為優(yōu)選，所述第二種核酸檢測方法為SNP位點核酸檢測方法，根據(jù)每一個待測 SNP位點核酸設(shè)計兩條5'端帶有標(biāo)簽序列和墊片序列的上游引物以及一條5'端偶聯(lián)有第 一配對物的下游引物，然后以所設(shè)計的引物PCR擴增待測SNP位點核酸，擴增產(chǎn)物與包被膠 體金的第二配對物結(jié)合，再與標(biāo)記有反標(biāo)簽序列的檢測線結(jié)合，根據(jù)檢測線顯色情況進(jìn)行 結(jié)果判讀；
[0024] 所述兩條上游引物分別為針對待測SNP位點核酸野生型擴增引物和待測SNP位點 核酸突變型擴增引物，且兩條上游引物所帶有的標(biāo)簽序列不同且不互補。
[0025] 本發(fā)明上述兩種技術(shù)方案中，所述上有引物根據(jù)現(xiàn)有公布的核酸突變類型有針對 性進(jìn)行設(shè)計。在檢測SNP位點核酸時，所述上游引物可按照ARMS-PCR引物進(jìn)行設(shè)計。同時， 本發(fā)明所述檢測方法可以實現(xiàn)多種基因多種突變類型的并行檢測，各序列之間互不干擾， 只需要采用互不相同的標(biāo)簽序列或反標(biāo)簽序列即可。
[0026] 在本發(fā)明第一種核酸檢測方法中，擴增產(chǎn)物變性后，其一端是帶有與標(biāo)簽序列互 補配對的反標(biāo)簽序列，另一端帶有第一配對物，第一配對物先與包被膠體金的第二配對物 結(jié)合，隨后，帶有反標(biāo)簽序列的擴增產(chǎn)物在檢測線處被標(biāo)簽序列捕獲，使膠體金沉淀顯紅 色。
[0027]為了檢測的嚴(yán)謹(jǐn)性，作為優(yōu)選，在變性后的擴增產(chǎn)物與包被膠體金的第二配對物 結(jié)合前，將包被膠體金的第二配對物與質(zhì)檢線上標(biāo)記的第一配對物結(jié)合，如果顯色則表明 包被膠體金的第二配對物正確無誤。更優(yōu)選地，所述質(zhì)檢線為標(biāo)記有核苷酸序列修飾的第 一配對物，所述核苷酸序列為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)、序列內(nèi)部和序列間不形成二聚體、不存在錯 配、與人類基因組DNA和所述引物之間不存在特異性結(jié)合的序列，所述核苷酸序列大小為 20-50bp。最優(yōu)選地，所述核苷酸序列選自SEQIDN0:21-25。
[0028] 在本發(fā)明第二種核酸檢測方法中，由于增加了不能和堿基配對的墊片序列，擴增 產(chǎn)物中的標(biāo)簽序列部分不會退火形成雙鏈，呈單鏈狀態(tài)，故擴增產(chǎn)物無需變性，擴增后的產(chǎn) 物其一條鏈上帶有成單鏈狀態(tài)的標(biāo)簽序列，而另一條鏈帶有第一配對物，第一配對物先與 包被膠體金的第二配對物結(jié)合結(jié)合，隨后，帶有反標(biāo)簽序列的擴增產(chǎn)物在檢測線處被標(biāo)簽 序列捕獲，使膠體金沉淀顯紅色。
[0029]為了檢測的嚴(yán)謹(jǐn)性，作為優(yōu)選，在擴增產(chǎn)物與包被膠體金的第二配對物結(jié)合前，將 包被膠體金的第二配對物與質(zhì)檢線上標(biāo)記的第一配對物結(jié)合，如果顯色則表明包被膠體金 的第二配對物正確無誤。更優(yōu)選地，所述質(zhì)檢線為標(biāo)記有核苷酸序列修飾的第一配對物，所 述核苷酸序列為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)、序列內(nèi)部和序列間不形成二聚體、不存在錯配、與人類基 因組DNA和所述引物之間不存在特異性結(jié)合的序列，所述核苷酸序列大小為20_50bp。最優(yōu) 選地，所述核苷酸序列選自SEQIDN0:21-25。
[0030] 本發(fā)明所述上游引物和下游引物的設(shè)計可參照本領(lǐng)域公知的引物設(shè)計原則，根據(jù) 待檢測的核酸突變類型進(jìn)行設(shè)計，其中ARMS-PCR上游引物可參照本領(lǐng)域ARMS-PCR引物設(shè) 計原則來設(shè)計，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)本領(lǐng)域公知知識獲得所需要的引物。同時，對于標(biāo) 簽序列、第一配對物和引物的偶聯(lián)也屬于本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本領(lǐng) 域已有技術(shù)付諸實施。
[0031] 作為優(yōu)選，所述第一配對物為生物素，所述第二配對物為親和素，更優(yōu)選地為所述 第一配對物為生物素，所述第二配對物為鏈霉親和素。除此之外，本發(fā)明還可以采用其他類 似于生物素和親和素這種可以特異性結(jié)合的配對物。
[0032] 作為優(yōu)選，兩種核酸檢測方法中所述標(biāo)簽序列均