PCR-核酸試紙條法檢測人α珠蛋白基因缺失的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種在巢式PCR法特異性擴(kuò)增靶模板的基礎(chǔ)上結(jié)合核酸試紙條進(jìn)行三種常見缺失型α-地中海貧血基因型檢測的技術(shù)，其檢測的主要原理是根據(jù)抗原和其特異性抗體的免疫學(xué)特異性結(jié)合，將核酸片段固定在核酸檢測試紙條上，然后通過可視的呈色乳膠顆粒在試紙條上顯色而檢測出結(jié)果，在巢式PCR核酸試紙條法檢測三種常見缺失型α-地中海貧血基因型中主要包括用于PCR擴(kuò)增的特異性PCR擴(kuò)增引物，一條5’末端帶生物素標(biāo)記的等位基因特異性引物，一條3’末端帶FITC標(biāo)記的特異性探針。
【專利說明】PCR-核酸試紙條法檢測人α珠蛋白基因缺失
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及對(duì)人類缺失型α珠蛋白基因的PCR檢測技術(shù)，具體的講是一種利用核酸試紙條對(duì)正常等位基因和中國人常見的缺失型α珠蛋白基因(--SM，-a3_7，-a42)的PCR檢測試劑盒及其方法，適合對(duì)人類缺失型a -珠蛋白基因的定性檢測，可用于對(duì)此三種缺失型a-地中海貧血癥的篩查和診斷。
【背景技術(shù)】
[0002]人類a珠蛋白基因簇位于16Pter -pl3.3。每條染色體各有2個(gè)a珠蛋基因，一對(duì)染色體共有4個(gè)a珠蛋白基因。a-珠蛋白基因位于人基因組的第16號(hào)染色體短臂末端a-珠蛋白基因簇中。該基因簇包括2個(gè)重復(fù)的a-珠蛋白基因、一個(gè)胚胎期a類基因、三個(gè)假基因和一個(gè)功能未明的基因，全長50kb。
[0003]a a基因處于兩個(gè)高度同源的重復(fù)單元中，這些單元包括了三個(gè)同源的片段(X、Y和Z)，其間被三個(gè)非同源區(qū)所分隔。當(dāng)?shù)谝淮螠p數(shù)分裂時(shí)，同源染色體間的錯(cuò)配和不等交換，導(dǎo)致兩a間丟失3.7kb從而產(chǎn)生a 2-a I融合基因，即為-a 3_7，由于該互換在右側(cè)的a I基因上進(jìn)行，又稱右側(cè)缺失。當(dāng)互換發(fā)生在兩個(gè)X片段之間，結(jié)果產(chǎn)生缺失左側(cè)a2基因4.2kb的染色體，成為左側(cè)缺失，又稱為-a42。另外，在東南亞人群中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)a珠蛋白基因完全缺失的情況，其缺失基因序列達(dá)20kb，為_se%又稱東南亞缺失。
[0004]Chehab等在1987年利用PCR技術(shù)對(duì)Bart’ s水腫胎兒的產(chǎn)前診斷。Chang等在1991又提出了 Gap-PCR對(duì)Chehab的方法又進(jìn)行進(jìn)一步的改進(jìn)。盡管目前市場有利用三個(gè)PCR反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳方法可快速有效的檢測α-珠蛋白基因的三種缺失。但是凝膠電泳檢測使得檢測過程太過于復(fù)雜，而且具有一定的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)還容易導(dǎo)致PCR擴(kuò)增污染物對(duì)實(shí)驗(yàn)室造成污染，使得結(jié)果出現(xiàn)假陽性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)中國人常見的三種缺失型α-地中海貧血的檢測問題，提供一種快速、穩(wěn)定和能預(yù)防實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增污染物污染的PCR檢測方法。
[0006]本發(fā)明技術(shù)方案包括對(duì)人基因組DNA待測樣本的PCR擴(kuò)增以及對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸試紙條快速檢測，其特征在于用不同特異性的引物分別對(duì)正常等位基因和缺失等位基因(α，α 3_7，α 4_2，-sea)進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。該方法的檢測方案為:引物可針對(duì)缺失擴(kuò)增特異性的產(chǎn)物，然后再利用巢式PCR技術(shù)對(duì)缺失型和正常型的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。所涉及的引物為圖4。
[0007]1.發(fā)明原理
本發(fā)明是一種在巢式PCR法特異性擴(kuò)增靶模板的基礎(chǔ)上結(jié)合核酸試紙條進(jìn)行三種常見缺失型α-地中海貧血基因型檢測的技術(shù)。其檢測的主要原理是根據(jù)抗原和其特異性抗體的免疫學(xué)特異性結(jié)合，將核酸片段固定在核酸檢測試紙條上，然后通過可視的呈色乳膠顆粒在試紙條上顯色而檢 測出結(jié)果。其反應(yīng)原理和步驟如圖1在巢式PCR核酸試紙條法檢測三種常見缺失型α -地中海貧血基因型中主要包括用于PCR擴(kuò)增的特異性PCR擴(kuò)增引物，一條5’末端帶生物素標(biāo)記的等位基因特異性引物，一條3’末端帶FITC標(biāo)記的特異性探針。巢式PCR核酸試紙條法主要包括以下幾個(gè)步驟:a:取樣,取待測樣本于滅菌的0.2ml PCR管中；
其特征在于:
b:PCR擴(kuò)增，先對(duì)特異性的靶模板通過普通的PCR進(jìn)行擴(kuò)增，PCR的擴(kuò)增體系如下
(1)在滅菌的0.2ml PCR管中，在20ul的反應(yīng)體系中，針對(duì)不同的基因型分別加入不同的PCR擴(kuò)增引物PF/PR和探針P5B/D3F，為了達(dá)到富集靶序列的目的，同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物并不進(jìn)行任何的標(biāo)記，同時(shí)加入一條5’末端帶生物素標(biāo)記的等位基因特異性引物，一條3’末端帶FITC標(biāo)記的特異性探針；
(2)等濃度的四種脫氧核苷酸dATP,dTTP, dGTP, dCTP各0.2-0.5 mmol/L ；
(3)1Ox 反應(yīng)緩沖液為 2ul，其中分別為 20mmol/L Tris-HCl PH8.9,50mmol/L KCl,MgCl2 1.5mmol/L ；
(4)分別加入提取好的人基因組DNA4ul和石蠟油20ul，短暫離心后進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR 循環(huán)參數(shù)為 95 0C 5min ;93-96 °C Imin ;60_72°C Imin ；72 °C 2min ;30_50 個(gè)循環(huán)；93-96V 30s ；45-55 °C 1min ；2~10 個(gè)循環(huán)；95 °C 5min ；
c:利用巢式PCR擴(kuò)增對(duì)步驟b的產(chǎn)物進(jìn)行第二步特異性擴(kuò)增在巢式PCR擴(kuò)增過程中，將反應(yīng)的退火溫度將到適合P5B延伸的溫度進(jìn)行擴(kuò)增，只有當(dāng)5’末端標(biāo)記抗原A的等位基因特異性引物與步驟2中擴(kuò)增產(chǎn)物上完全互補(bǔ)時(shí)，該引物才能在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行延伸，其延伸產(chǎn)物能與反應(yīng)液中3’末端標(biāo)記抗原B的探針進(jìn)行結(jié)合。
[0008]d:在試紙條上，將特異性抗A抗體吸附于乳膠顆粒，在乳膠顆粒表面形成抗體包被；將另一無色特異性抗B抗體，以線條狀固定于膜上，形成檢測線；
e:取反應(yīng)產(chǎn)物5-20ul，到核酸試紙條的加樣處，加上IOOul的緩沖液；約3_5min后判讀檢測結(jié)……
帶抗原A和抗原B的雜交產(chǎn)物首先與顆粒表面的抗體A結(jié)合，形成抗原B —寡核苷酸鏈抗原A-顆?？贵wA的有色顆粒復(fù)合物。有色的復(fù)合物在溶液中通過毛細(xì)現(xiàn)象沿纖維膜向上流動(dòng)。當(dāng)復(fù)合物遇到固定于膜上的抗體B線條時(shí)，待檢的抗原B —寡核苷酸鏈抗原A-顆?？贵wA復(fù)合物與線條上的抗體B結(jié)合，形成線條抗體B —抗原B —寡核苷酸鏈抗原A-顆?？贵wA的有色顆粒復(fù)合物。有色的線條抗體B —抗原B —寡核苷酸鏈抗原A-顆?？贵wA的顆粒復(fù)合物滯留在線上，形成肉眼可見的有色線條。此為陽性。
[0009]在巢式PCR反應(yīng)時(shí)，如果加入的特異性引物末端不能與模板完全匹配，那么該引物就無法進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，也就不能形成抗原B —寡核苷酸鏈抗原A-顆?？贵wA的有色顆粒復(fù)合物。因此有色顆粒將不能與膜上的檢測線結(jié)合而越過此線，不能形成肉眼可見的有色線條。此為陰性。
[0010]在巢式PCR核酸試紙條法檢測三種常見缺失型α -地中海貧血基因型時(shí)，根據(jù)不同缺失型和正常型的序列分別相對(duì)應(yīng)的特異性引物、帶有標(biāo)記的等位基因特異性引物和探針，然后利用試紙條進(jìn)行檢測。綜合四種檢測結(jié)果判斷被檢者是何種基因型(表2)。
[0011]
【權(quán)利要求】
1.一種利用核酸試紙條檢測缺失型α珠蛋白基因的PCR檢測試方法，其步驟如下: a:取樣,取待測樣本于滅菌的0.2ml PCR管中； 其特征在于: b:PCR擴(kuò)增，先對(duì)特異性的靶模板通過普通的PCR進(jìn)行擴(kuò)增，PCR的擴(kuò)增體系如下: (1)在滅菌的0.2mlPCR管中，在20ul的反應(yīng)體系中，針對(duì)不同的基因型分別加入不同的PCR擴(kuò)增引物PF/PR和探針P5B/D3F，同時(shí)加入一條5’末端帶生物素標(biāo)記的等位基因特異性引物，一條3’末端帶FITC標(biāo)記的特異性探針； (2)等濃度的四種脫氧核苷酸dATP，dTTP，dGTP，dCTP各0.2-0.5 mmol/L ； (3)IOx 反應(yīng)緩沖液為 2ul，其中分別為 20mmol/L Tris-HCl PH8.9,50mmol/L KCl,MgCl2 1.5mmol/L ； (4)分別加入提取好的人基因組DNA4ul和石蠟油20ul，短暫離心后進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR 循環(huán)參數(shù)為 95 0C 5min ;93-96 °C Imin ;60_72°C Imin ；72 °C 2min ;30_50 個(gè)循環(huán)；93-96V 30s ；45-55 °C Imin ；2~10 個(gè)循環(huán)；95 °C 5min ； c:利用巢式PCR擴(kuò)增對(duì)步驟b的產(chǎn)物進(jìn)行第二步特異性擴(kuò)增， 在巢式PCR擴(kuò)增過程中，將反應(yīng)的退火溫度將到適合P5B延伸的溫度進(jìn)行擴(kuò)增；d:在試紙條上，將特異性抗A抗體吸附于乳膠顆粒，在乳膠顆粒表面形成抗體包被；將另一無色特異性抗B抗體，以線條狀固定于膜上，形成檢測線； e:檢測:取反應(yīng)產(chǎn)物5-20ul，到核酸試紙條的加樣處，加上IOOul的緩沖液；約3_5min后判讀檢測結(jié)果?！?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用核酸試紙條檢測缺失型α珠蛋白基因的PCR檢測試劑盒，其特征在于，步驟b中(2)中dATP, dTTP, dGTP, dCTP各0.2 mmol/L, (4)中，PCR循環(huán)參數(shù)為 95°C 5min ；95°C Imin ；60°C Imin ；72°C 2min ；40 個(gè)循環(huán)；95°C 30s ；45°C Imin ；2-10個(gè)循環(huán)；95°C 5min ;步驟e中限反應(yīng)物為IOul。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103820527SQ201210460987
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月16日
【發(fā)明者】胡琳, 江建輝, 侯建華, 徐高連, 孫悅 申請(qǐng)人:蘇州優(yōu)貝沃生物技術(shù)有限公司