一種磁珠法提取核酸的裂解液的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種磁珠法提取核酸的裂解液。
【背景技術(shù)】
[0002]核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象，因此核酸的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作。核酸提取是指利用物理、化學(xué)方法將核算從載體中分離出來(lái)的過(guò)程。目前，在國(guó)內(nèi)大部分醫(yī)療機(jī)構(gòu)及科研領(lǐng)域均需要從大批量血液樣本中提取核酸。因此，為了保證抽提出高濃度的核酸，人們不斷開(kāi)發(fā)出新的技術(shù)。
[0003]核酸提取方法繁多，包括傳統(tǒng)的酚-氯仿法、鹽析法、濾膜離心柱法等。這些方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，但總體上核酸提取的效果差強(qiáng)人意。磁珠法是通過(guò)磁性硅膠吸附細(xì)胞，隨后加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。從細(xì)胞中游離出來(lái)的核酸被吸附到磁性顆粒表面，而蛋白等分子不被吸附而留在溶液中。在磁場(chǎng)作用下，磁性顆粒與液體分離。此時(shí)，棄去含有雜質(zhì)的液體，并用相應(yīng)的洗脫液洗脫磁珠上吸附的核酸。該方法不需離心，操作簡(jiǎn)單，可以使核酸提取效率顯著升高，已成為目前新興的核酸提取技術(shù)。
[0004]在本領(lǐng)域中，磁珠法提取核酸普遍使用的裂解液為含有胍鹽的裂解液。胍鹽是一種強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑，采用高濃度的胍鹽來(lái)裂解細(xì)胞，可迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，裂解細(xì)胞，使核酸從蛋白質(zhì)中釋放出來(lái)。磁珠法提取核酸所使用的磁珠，表面包裹了各種活性集團(tuán)，有研究表明裂解液中的離子強(qiáng)度、pH等條件會(huì)直接影響這些功能集團(tuán)的活性，進(jìn)而影響磁珠吸附核酸的量。有研究表明，當(dāng)胍鹽裂解液稀釋度降低到60%以下時(shí)，樣品DNA回收效率明顯降低。目前臨床常用的檢測(cè)樣本中，往往一些樣本(如腦組織樣本)需先經(jīng)其他方法處理，再提取純化核酸。面對(duì)這種情況，就必須控制加入經(jīng)前處理的樣本量，以保證胍鹽液的濃度，避免因過(guò)量稀釋而影響磁珠與核酸的結(jié)合，從而導(dǎo)致核酸回收效率降低，檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。此夕卜，胍鹽成分不穩(wěn)定，尤其易受室溫、季節(jié)溫度影響，導(dǎo)致裂解效果大相徑庭。因此，面對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的這些缺點(diǎn)，市場(chǎng)上急需要一種用途廣泛，使用方便，裂解效率更高的新型磁珠法提取核酸的裂解液。
[0005]與此同時(shí)，磁珠法提取核酸的洗滌液中往往采用含有乙醇的低鹽溶液，然而在經(jīng)過(guò)最后一步洗滌過(guò)程中，難于將乙醇去除干凈，而乙醇是很多反應(yīng)，特別是PCR反應(yīng)的中度抑制物。因此，殘留的乙醇將會(huì)嚴(yán)重影響PCR擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此外，用含有乙醇的洗滌液清洗磁珠時(shí)，會(huì)造成磁珠在乙醇溶劑中的劇烈蹦跳，極易導(dǎo)致污染。因此，如何解決這一問(wèn)題，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，成為亟待解決的重要問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個(gè)方面是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中磁珠法核酸提取的裂解液效率低的缺點(diǎn)，提供了一種磁珠法提取核酸的裂解液。
[0007]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0008]一種磁珠法提取核酸的裂解液，所述裂解液由0.2?0.4N氫氧化鈉、0.3?0.6M氯化鉀、0.01?0.05%N-月桂酰肌氨酸鈉、5mM EDTA、0.3?0.6M Tris-HCL和1?2%曲通X-100組成。
[0009]在本發(fā)明技術(shù)方案中，發(fā)明人創(chuàng)造性地使用特定量的曲通X-100和N-月桂酰肌氨酸鈉配合氫氧化鈉進(jìn)行核酸提取。不僅可以充分裂解細(xì)胞，同時(shí)可加快裂解速度快，整個(gè)裂解時(shí)間僅需要5?10分鐘，與現(xiàn)有技術(shù)中的裂解方法相比，大大縮短了操作時(shí)間。同時(shí)，使用曲通X-100和終濃度N-月桂酰肌氨酸鈉可幫助氫氧化鈉徹底裂解細(xì)胞，使核酸充分釋放，并幫助磁珠有效吸附核酸，使核酸和蛋白有效地分離。
[0010]并且，在本發(fā)明技術(shù)方案中不使用胍鹽進(jìn)行核酸提取，從而可以有效避免胍鹽易受室溫、季節(jié)溫度、鹽離子濃度等影響造成的核酸提取效果下降。本發(fā)明裂解液在普通實(shí)驗(yàn)條件下即可進(jìn)行，且能充分配合磁珠進(jìn)行核酸的有效吸附，使提取核酸的效果達(dá)到最優(yōu)化，并保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠。
[0011 ] 作為優(yōu)選，所述裂解液由所述裂解液由0.25?0.35N氫氧化鈉、0.4?0.5M氯化鉀、0.02?0.04%N-月桂酰肌氨酸鈉、5mM EDTA、0.4?0.5M Tris-HCL和 1 ?2 % 曲通X-100組成。
[0012]更優(yōu)選地，所述裂解液由0.3N氫氧化鈉、0.45M氯化鉀、0.03 % N-月桂酰肌氨酸鈉、5mM EDTA、0.45M Tris-HCL和 1 % 曲通X-100組成。
[0013]作為優(yōu)選，在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述裂解液還包括3?8mMDTT。在本發(fā)明技術(shù)方案中還可以加入3?Smmol的DTT參與核酸的提取，這樣可以有效保護(hù)核酸不被氧化，而且可防止DNA自身二聚體的形成。
[0014]作為優(yōu)選，所述裂解液還包括不多于0.001wt%的提取指示劑。該提取指示劑可以起到良好的指示作用，防止實(shí)驗(yàn)操作中的錯(cuò)加、漏加、多加。其中，所述提取指示劑選自溴酚藍(lán)、石綠、甲基紅、甲基橙、羅丹名、溴甲酚綠、品紅、二甲酚橙、二苯胺或剛果紅中的一種。
[0015]更優(yōu)選地，所述提取指示劑為溴酚藍(lán)。溴酚藍(lán)可以起到良好的指示劑作用，在本發(fā)明方法的裂解液中，在室溫條件下呈藍(lán)色，與待檢測(cè)樣品混合后顏色減退，從而提示操作者樣品的加入情況，避免因操作問(wèn)題帶來(lái)的樣本漏加、錯(cuò)加、多加的問(wèn)題。
[0016]所述磁珠法提取核酸中的磁珠可以為市售磁珠法核酸提取中所使用的任意常規(guī)磁珠。磁珠和裂解液可以按照任意比例混合。作為優(yōu)選，磁珠和裂解液的體積混合比例為1?1.5:100。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述磁珠按照以下方法制備:
[0017]步驟A)納米微球的制備:
[0018]在氬氣保護(hù)下，在含有13?17g硫酸亞鐵七水合物和8?12g三氯化鐵六水合物的水溶液中，每間隔10分鐘滴加lml 0.4M?0.6M氫氧化鈉溶液；當(dāng)反應(yīng)溶液變?yōu)槟z狀乳濁液時(shí)，每間隔20分鐘滴加lml 0.2M?0.3M氫氧化鈉溶液，搖床持續(xù)搖勻，搖床速度100轉(zhuǎn)/分鐘，待出現(xiàn)磁性后，繼續(xù)在氬氣保護(hù)下反應(yīng)4?10小時(shí);隨后在所得溶液中加入氯化鈉，使氯化鈉終濃度為0.5M?1M;室溫靜置18?36小時(shí)后使用去離子水漂洗至溶液pH為7 ;再使用
0.2M?0.3M的氫氧化鈉溶液配成磁珠體積百分比為20 %?40 %的磁珠懸液，即得；
[0019 ] 步驟B)通過(guò)表面修飾制備納米磁珠:
[0020]將步驟A)所得磁珠懸液在50°C?60°C條件下通入氬氣并均勻攪拌;加入60g九水硅酸鈉攪拌至完全溶解，每3min滴加0.5ml冰乙酸，搖床持續(xù)搖勻，搖床速度100轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌2h;當(dāng)pH值為6?8時(shí)，使用3倍于所述磁珠懸液體積的0.3M氯化鈉溶液漂洗5次，再使用
0.3M氯化鈉溶液配制成磁珠體積百分比為20 %?40 %的磁珠懸液;在得到的磁珠懸液中加入30g PEG-1750，搖床持續(xù)搖勻，搖床速度100轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌24h;使用3倍于所述磁珠懸液體積的0.3M的氯化鈉溶液漂洗5次;再使用0.3M氯化鈉溶液和疊氮鈉配制成磁珠體積百分比為40 % -60 %的磁珠懸液，即得所述納米磁珠。
[0021]通過(guò)以上方法制備的磁珠具有如下優(yōu)勢(shì):適用性廣，能純化多種不同樣品；可通過(guò)改變反應(yīng)條件能控制磁珠大小和表面修飾基團(tuán)的數(shù)量;可在水相中呈表面顆粒均勻，分散性好。區(qū)別其它有機(jī)溶劑得到的磁珠，以上方法制備的磁珠核酸吸附量大，制備方法簡(jiǎn)單，成本低，無(wú)需復(fù)雜大型設(shè)備，適合實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)化生產(chǎn)。
[0022]本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供了一種磁珠法核酸提取的試劑盒。該試劑盒包括上述裂解液和洗滌液。
[0023]其中，所述洗滌液可以為任意市售核酸提取所用洗滌液。作為優(yōu)選，所述洗滌液為
0.3?0.6M氯化鉀溶液，所述洗滌液的pH值為4?5。
[0024]作為優(yōu)選，在本發(fā)明中，用乙酸將所述洗滌液的pH值調(diào)整為4?5。
[0025]在本發(fā)明中，使用0.3?0.6M氯化鉀作為洗滌液的主要成分，其不含有乙醇。以PCR反應(yīng)為例，乙醇是PCR反應(yīng)的中度抑制物，少量殘存會(huì)影響PCR擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此外，磁珠在含有乙醇的溶液中不穩(wěn)定，易蹦跳而導(dǎo)致污染。核酸在偏酸性的氯化鉀中溶解率低，避免核酸的丟失，使用本發(fā)明洗滌液僅需洗滌一次，且少量殘余液不會(huì)影響PCR擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確有效。
[0026]為了便于觀察操作過(guò)程中殘液是否吸凈，防止多加、漏加、錯(cuò)加等操作失誤，所述洗滌液還包括不多于0.001wt%的洗滌指示劑，所述洗滌指示劑選自溴酚藍(lán)、石綠、甲基紅、甲基橙、羅丹名、溴甲酚綠、品紅、二甲酚橙、二苯胺或剛果紅中的一種。
[0027]作為優(yōu)選，所述洗滌指示劑與以上所述提取指示劑不同。
[0028]更優(yōu)選地，所述洗滌指示劑為石綠。
[0029]由于本發(fā)明試劑盒中提供了特殊的裂解液和洗滌液，因此在其應(yīng)用于分子生物學(xué)檢測(cè)，特別是PCR檢測(cè)中，洗滌過(guò)程只需要一步即可完成，并且無(wú)需放置時(shí)間，既減少了操作過(guò)程中發(fā)生污染的可能性，又節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間。
[0030]本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供一種上述磁珠法提取核酸的裂解液的應(yīng)用。所述裂解液可用于提取細(xì)胞、細(xì)菌、血清、血漿、唾液、尿液或胸腹水中的核酸，優(yōu)選為血清或血漿，更優(yōu)選為在PCR檢測(cè)中提取待測(cè)樣品的細(xì)胞、細(xì)菌、血清、血漿、唾液、尿液或胸腹水中的核酸。
[0031]作為優(yōu)選，所述PCR的方法為:將混合有磁珠的裂解液和待檢測(cè)樣品加入到PCR擴(kuò)增管中，混勻，靜置，進(jìn)行磁吸后吸出混合液，將得到的磁珠洗滌一次;在上述PCR擴(kuò)增管中加入配制好的PCR反應(yīng)液，對(duì)目標(biāo)核酸進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0032]更優(yōu)選地，所述PCR方法的步驟包括:
[0033]步驟1)將混合有磁珠的裂解液加入到PCR擴(kuò)增管中；
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