述得到的PCR管放置于PCR儀內(nèi)進行擴增。
[0085]擴增程序:37°C，2min ； 95°C，5分鐘；進行45-50循環(huán)的95°C，10秒鐘和61 °C，45秒鐘，在61°C檢測熒光信號。
[0086]實驗結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明，按照本實例的試劑配比方案，可以有效準確檢測出HBV DNA定量值為2X lOhU/ml的乙肝患者血清標(biāo)本。
[0087]實施例3:HBV DNA的實時熒光定量PCR檢測
[0088]按照以下組分比例配制混合有磁珠的裂解液和洗滌液:
[0089]0.3N氫氧化鈉、0.45M氯化鉀、0.03%Ν-月桂酰肌氨酸鈉、5mM EDTA、0.45M Tris-HCL、1% 曲通X-100、3mM DTT和0.001wt% 的溴酚藍。
[0090]按照磁珠和裂解液的體積比為1: 100加入自然沉淀24小時的磁珠，混勻。
[0091]洗滌液:0.3M氯化鉀、0.00 lwt %的石綠、用乙酸將pH值調(diào)至4。
[0092]使用以上裂解液和洗滌液對臨床診斷明確且經(jīng)過檢測HBV DNA定量值為2XlOhU/ml乙肝患者血清進行如下步驟的操作:
[0093](l)PCR裂解液的分裝:將配制好的混有磁珠的裂解液按照每管ΙΟΟμΙ分裝到專用PCR管中。
[0094](2)加樣:取ΙΟΟμΙ的血清加入到上述分裝有混合有磁珠的裂解液的PCR管中，用吸頭輕輕吹打混勻5次，室溫靜置5分鐘。
[0095](3)吸棄液體:將上述PCR管放置到八聯(lián)排磁力架上，靜置2分鐘，用移液器在磁珠對側(cè)將液體吸掉，注意勿吸掉磁珠。
[0096](4)洗滌:從八聯(lián)排磁力架上取下PCR管，并將已配制好的洗滌液每管加入200μ1，重新放置到八聯(lián)排磁力架上，無需等候時間直接用移液器或負壓栗吸棄洗滌液，注意吸凈殘液。
[0097](5)將2.0μ1(?υ/μ1)單位的Taq DNA聚合酶與38.0μ1 PCR反應(yīng)液(所述反應(yīng)液為包括濃度40ηηιο1/μ1上下游引物和30ηηιο1/μ1探針；20ηηιο1/μ1的Tris堿；20mmol/yl氯化鎂；50mmolAU氯化鉀、200umolAU的dNTP和0.001wt%的石綠指示劑的熒光PCR擴增試劑混合液)混勻，加入到步驟(4)得到的PCR擴增管中，封蓋，輕輕將磁珠彈下來，保證磁珠與PCR反應(yīng)液徹底混勻。
[0098]其中正向引物序列為HBVF 5’-TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG-3’，反向引物序列為HBVR 5’-GCACAGCTTGGAGGCTTGT-3’，探針序列為HBVP 5 ’-TCACCTCTGCCTAATC-3 ’。
[0099 ] (6)離心:水平離心機3000RPM離心45秒。
[0100] (7)將上述得到的PCR管放置于PCR儀內(nèi)進行擴增。
[0101 ] 擴增程序:37°C，2min ； 95°C，5分鐘；進行45-50循環(huán)的95°C，10秒鐘和61 °C，45秒鐘，在61°C檢測熒光信號。
[0102]實驗結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，按照本實例的試劑配比方案，可以有效準確檢測出HBV DNA定量值為2X lOhU/ml的乙肝患者血清標(biāo)本。
[0103]如圖3所示，使用本實施例的裂解液和洗滌液對2X lO'lU/ml的乙肝患者血清標(biāo)本進行檢測時，不僅可以有效對其定量，并且其PCR的效率高于實施例1和實施例2的PCR效率。
[0104]實施例4:使用本發(fā)明裂解液與使用現(xiàn)有技術(shù)中胍鹽裂解液的比較
[0105]為了驗證本發(fā)明裂解液與胍鹽裂解液之間的差異，采用胍鹽裂解液的基礎(chǔ)配方進行配制:5M異硫氰酸胍、50mm Tris_HCL、20%Triton X_100o
[0106]除了分別使用本發(fā)明實施例3的裂解液和按照以上組分配制的胍鹽裂解液以外，利用與實施例3相同的方法對臨床診斷明確且經(jīng)過檢測HBV DNA定量值為2X107IU/ml和20IU/ml的乙肝患者血清進行實時熒光定量PCR檢測。
[0107]結(jié)果如圖4所示，實驗結(jié)果表明，使用本發(fā)明的裂解液提取HBVDNA的擴增曲線梯度明顯優(yōu)于使用胍鹽裂解液的擴增曲線梯度。無論是在HBV DNA濃度為2X107IU/ml，還是再HBV DNA濃度在20IU/ml時，本發(fā)明擴增曲線的Ct值要比胍鹽裂解液擴增曲線的Ct值提前至少1個Ct值。
[0108]實施例5:使用本發(fā)明洗滌液與使用現(xiàn)有技術(shù)中洗滌液的比較
[0109]為了驗證乙醇對核酸提取的影響，使用本發(fā)明不含乙醇的洗滌液與傳統(tǒng)含乙醇的洗滌液進行比較。其中含乙醇的洗滌液配制方法:20mM NaCl、2mM Tris_HCl、80%乙醇。
[0110]除了分別使用本發(fā)明實施例3的洗滌液和按照以上組分配制的常規(guī)洗滌液以外，利用與實施例3相同的方法對臨床診斷明確且經(jīng)過檢測HBV DNA定量值為2X107IU/ml、2X103IU/ml和20IU/ml的乙肝患者血清進行實時熒光定量PCR檢測。
[0111]結(jié)果如圖5所示，實驗結(jié)果表明，含有乙醇的洗滌液的擴增曲線均落后于本發(fā)明洗滌液，且隨著檢測樣品濃度的降低，其影響越發(fā)明顯。在檢測20IU/ml HBV DNA時，其Ct值落后于本發(fā)明Ct值約4個Ct。
[0112]實施例6:使用本發(fā)明裂解液與使用其他裂解液的比較
[0113]為了驗證本發(fā)明可以有效配合磁珠使用提取核酸，且提取效率遠高于現(xiàn)有技術(shù)，使用本發(fā)明與其他的提取技術(shù)進行比較。進行對比的裂解液基礎(chǔ)配制方法為:400mM KC1、10%Triton X_100、50mg/ml蛋白酶K、10mM NaOH。
[0114]除了分別使用本發(fā)明裂解液和按照以上組分配制的裂解液以外，利用與實施例3相同的方法對臨床診斷明確且經(jīng)過檢測HBV DNA定量值為2X 105IU/ml和2X 103IU/ml的乙肝患者血清進行實時熒光定量PCR檢測。
[0115]結(jié)果如圖6、7所示，實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的裂解液可以充分裂解病毒，使核酸釋放。無論是在高濃度的2 X 105IU/ml或是較低濃度的2 X 103IU/ml，其Ct值和提取效率均要高于其他裂解液。
[0116]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.一種磁珠法提取核酸的裂解液，其特征在于，所述裂解液由0.2?0.4N氫氧化鈉、0.3?0.6M氯化鉀、0.01?0.05%N-月桂酰肌氨酸鈉、5mM EDTA、0.3?0.6M Tris-HCL和1?2%曲通X-100組成。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液由0.25?0.35N氫氧化鈉、0.4?0.5M氯化鉀、0.02?0.04%N-月桂酰肌氨酸鈉、5mM EDTA、0.4?5M Tris_HCL和1?2%曲通X-100組成。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液由0.3N氫氧化鈉、0.45M氯化鉀、0.03%N-月桂酰肌氨酸鈉、0.45M Tris-HCL、5mM EDTA和1 %曲通X-100組成。4.根據(jù)權(quán)利要求1?3任意一項所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液還包括3?8mMDTT05.根據(jù)權(quán)利要求1?3任意一項所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液還包括不多于0.001wt%的提取指示劑，所述提取指示劑選自溴酚藍、石綠、甲基紅、甲基橙、羅丹名、溴甲酚綠、品紅、二甲酚橙、二苯胺或剛果紅中的一種，優(yōu)選為溴酚藍。6.一種磁珠法核酸提取的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如權(quán)利要求1?3任意一項所述的裂解液和洗滌液。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述洗滌液為0.3?0.6M氯化鉀溶液，所述洗滌液的pH值為4?5。8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于，所述洗滌液還包括不多于0.00lwt %的洗滌指示劑，所述洗滌指示劑選自溴酚藍、石綠、甲基紅、甲基橙、羅丹名、溴甲酚綠、品紅、二甲酚橙、二苯胺或剛果紅中的一種，優(yōu)選為石綠。9.一種如權(quán)利要求1?3任意一項所述的裂解液的應(yīng)用，其特征在于，所述裂解液用于提取細胞、細菌、血清、血漿、唾液、尿液或胸腹水中的核酸，優(yōu)選為血清或血漿，更優(yōu)選為在PCR檢測中提取待測樣品的細胞、細菌、血清、血漿、唾液、尿液或胸腹水中的核酸。10.—種如權(quán)利要求6所述的試劑盒的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑盒用于PCR、酶切、分子雜交、文庫構(gòu)建或Southern雜交過程中的核酸提取。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種磁珠法提取核酸的裂解液，所述裂解液由0.2～0.4N氫氧化鈉、0.3～0.6M氯化鉀、0.01～0.05％N-月桂酰肌氨酸鈉、5mM？EDTA、0.3～0.6M？Tris-HCL和1～2％曲通X-100組成。本發(fā)明磁珠法核酸提取的裂解液可以充分、有效地裂解細胞，加快裂解進程，同時，保護核酸免受氧化，避免DNA自身二聚體形成。此外，本發(fā)明裂解液性質(zhì)溫穩(wěn)定，不受季節(jié)、溫度、鹽離子濃度等影響，并能充分配合磁珠進行核酸吸附，使提取核酸的效果達到最優(yōu)化。本發(fā)明提供的磁珠核酸提取的洗滌液可以有效去除殘留的雜質(zhì)，避免核酸的丟失，且少量殘余的洗滌液不會影響PCR擴增結(jié)果，保證檢測結(jié)果的準確。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105420230
【申請?zhí)枴緾N201610022017
【發(fā)明人】王海濱, 王棽, 周其玲, 馮小霞
【申請人】北京納捷診斷試劑有限公司
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2016年1月14日