034]步驟2)將待檢測(cè)樣品加入到所述混合有磁珠的裂解液中，混勻，室溫靜置5?10分鐘；
[0035]步驟3)將所述PCR擴(kuò)增管放置在磁力架上，待磁珠全部吸附至一側(cè)后將混合液吸出；
[0036]步驟4)將PCR擴(kuò)增管從磁力架上取下，將洗滌液加入步驟3)得到的PCR擴(kuò)增管中，再將其放回磁力架上，待磁珠吸附至一側(cè)后，立即將洗滌液吸走；
[0037]步驟5)將配制好的PCR反應(yīng)液加入到步驟4)得到的PCR擴(kuò)增管中，使磁珠與所述PCR反應(yīng)液充分混勻，離心，進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0038]更優(yōu)選地，所述PCR反應(yīng)為實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。
[0039]本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供一種上述磁珠法提取核酸的試劑盒的應(yīng)用。所述試劑盒用于PCR、酶切、分子雜交、文庫(kù)構(gòu)建或Southern雜交過(guò)程中的核酸提取。
[0040]本發(fā)明的有益效果為:
[0041]本發(fā)明磁珠法核酸提取的裂解液可以充分、有效地裂解細(xì)胞，加快裂解進(jìn)程，同時(shí)，保護(hù)核酸免受氧化，避免DNA自身二聚體形成。此外，本發(fā)明裂解液性質(zhì)溫穩(wěn)定，不受季節(jié)、溫度、鹽離子濃度等影響，并能充分配合磁珠進(jìn)行核酸吸附，使提取核酸的效果達(dá)到最優(yōu)化。本發(fā)明提供的磁珠核酸提取的洗滌液可以有效去除殘留的雜質(zhì)，避免核酸的丟失，且少量殘余的洗滌液不會(huì)影響PCR擴(kuò)增結(jié)果，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確。
【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的方法檢測(cè)HBVDNA的結(jié)果圖；
[0043]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2的方法檢測(cè)HBVDNA的結(jié)果圖；
[0044]圖3為本發(fā)明實(shí)施例3的方法檢測(cè)HBVDNA的結(jié)果圖；
[0045]圖4為使用本發(fā)明裂解液進(jìn)行磁珠法提取擴(kuò)增HBVDNA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品與使用傳統(tǒng)胍鹽裂解液進(jìn)行磁珠法提取擴(kuò)增HBV DNA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果比較圖；
[0046]圖5為使用本發(fā)明不含有乙醇的洗滌液與使用常規(guī)洗滌液后對(duì)HBVDNA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品PCR擴(kuò)增的影響比較圖；
[0047]圖6為實(shí)施例6中使用本發(fā)明裂解液進(jìn)行磁珠法提取擴(kuò)增HBVDNA的結(jié)果圖；
[0048]圖7為實(shí)施例6中使用其他裂解液進(jìn)行磁珠法提取擴(kuò)增HBVDNA的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0049]本發(fā)明公開(kāi)了一種磁珠法提取核酸的裂解液，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。需要特別指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明，并且相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍的基礎(chǔ)上對(duì)本文所述內(nèi)容進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0050]在本發(fā)明中，除非另有說(shuō)明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。同時(shí)，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語(yǔ)的定義和解釋。
[0051]本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“磁珠”，是指磁性微球(簡(jiǎn)稱磁珠)，現(xiàn)已廣泛用于細(xì)胞分離、酶的固定、核酸純化等多個(gè)領(lǐng)域。
[0052]本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“裂解液”，即“l(fā)ysisbuffer”，是指為了使樣品中的核酸游離在裂解體系中所需加入的一種配制液體。
[0053]本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“洗滌液”，即“washbuffer”，是指可以去除核酸以外雜質(zhì)所需加入的試劑。
[0054]本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“指示劑”，是化學(xué)試劑中的一類，其在一定介質(zhì)條件下，其顏色能發(fā)生變化。
[0055]本發(fā)明中使用的例如“0.01?0.05 % N-月桂酰肌氨酸鈉”、“1?2 %曲通X-100”中的百分比是指物質(zhì)的純度。
[0056]為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0057]實(shí)驗(yàn)材料與儀器
[0058]以下實(shí)施例中所用的PCR擴(kuò)增儀器為上海宏石醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
[0059]樣本采用臨床化驗(yàn)室HBVDNA定量檢測(cè)后的血清。
[0060]為了詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明方法的【具體實(shí)施方式】中實(shí)施例1和實(shí)施例2，分別按照以下濃度配制1L裂解液的工作液以便后續(xù)操作使用:方案1) 0.2N氫氧化鈉、0.3M氯化鉀、0.01 % N-月桂酰肌氨酸鈉、5mM EDTA、0.3M Tris-HCL、1 % 曲通_100、3mM DTT和0.001wt%的溴酚藍(lán)。方案2)0.4N氫氧化鈉、0.6M氯化鉀、0.05 %N-月桂酰肌氨酸鈉、5mM EDTA、0.6M Tris-HCL、2wt % 曲通-100、8mM DTT和0.0Olwt % 的溴酚藍(lán)。
[0061]為了詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明方法的【具體實(shí)施方式】中實(shí)施例1和實(shí)施例2，分別按照磁珠和裂解液的體積比為1: 100和1.5: 100的比例將磁珠加入上述已配制好的裂解液中，即混合有磁珠的裂解液方案1) 1L裂解液中加入10ml自然沉淀24小時(shí)的磁珠，混勾?；旌嫌写胖榈牧呀庖悍桨?) 1L裂解液中加入15ml自然沉淀24小時(shí)的磁珠，混勻。
[0062]為了詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明方法的【具體實(shí)施方式】中實(shí)施例1和實(shí)施例2，分別按照以下組成成分配制1L的洗滌液工作液以便后續(xù)操作使用:洗滌液方案1)0.3M氯化鉀、0.001被％的石綠、用乙酸將pH值調(diào)至4。洗滌液方案2) 0.6M氯化鉀、0.00 lwt %的石綠、用乙酸將pH值調(diào)至5。
[0063]實(shí)施例1:HBV DNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)
[0064]分別采用根據(jù)上述混合有磁珠的裂解液方案1)和洗滌液方案1)配制的試劑對(duì)臨床診斷明確且經(jīng)過(guò)檢測(cè)HBV DNA定量值為SXlOhU/ml乙肝患者血清進(jìn)行如下步驟的操作:
[0065](l)PCR裂解液的分裝:將配制好的混有磁珠的裂解液按照每管ΙΟΟμΙ分裝到專用PCR管中。
[0066](2)加樣:取ΙΟΟμΙ的血清加入到上述分裝有混合有磁珠的裂解液的PCR管中，用吸頭輕輕吹打混勻5次，室溫靜置10分鐘。
[0067](3)吸棄液體:將上述PCR管放置到八聯(lián)排磁力架上，靜置2分鐘，用移液器在磁珠對(duì)側(cè)將液體吸掉，注意勿吸掉磁珠。
[0068](4)洗滌:從八聯(lián)排磁力架上取下PCR管，并將已配制好的洗滌液每管加入200μ1，重新放置到八聯(lián)排磁力架上，無(wú)需等候時(shí)間直接用移液器或負(fù)壓栗吸棄洗滌液，注意吸凈殘液。
[0069](5)將2.0μ1(?υ/μ1)單位的Taq DNA聚合酶與38.0μ1 PCR反應(yīng)液(所述反應(yīng)液為包括濃度40ηηιο1/μ1上下游引物和30ηηιο1/μ1探針；20ηηιο1/μ1的Tris堿；20mmol/yl氯化鎂；50mmolAU氯化鉀、200umolAU的dNTP和0.001wt%的石綠指示劑的熒光PCR擴(kuò)增試劑混合液)混勻，加入到步驟(4)得到的PCR擴(kuò)增管中，封蓋，輕輕將磁珠彈下來(lái)，保證磁珠與PCR反應(yīng)液徹底混勻。
[0070]其中正向引物序列為HBVF 5’-TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG-3’，反向引物序列為HBVR 5’-GCACAGCTTGGAGGCTTGT-3’，探針序列為HBVP 5 ’-FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB-3 ’。
[0071](6)離心:水平離心機(jī)3000RPM離心45秒。
[0072 ] (7)將上述得到的PCR管放置于PCR儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。
[0073]擴(kuò)增程序:37°C，2min ； 95°C，5分鐘；進(jìn)行45-50循環(huán)的95°C，10秒鐘和61 °C，45秒鐘，在61°C檢測(cè)熒光信號(hào)。
[0074]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明，按照本實(shí)例的試劑配比方案，可以有效準(zhǔn)確檢測(cè)出HBV DNA定量值為2X lOhU/ml的乙肝患者血清標(biāo)本。
[0075]實(shí)施例2:HBV DNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)
[0076]分別采用根據(jù)上述混合有磁珠的裂解液方案2)和洗滌液方案2)配制的試劑對(duì)臨床診斷明確且經(jīng)過(guò)檢測(cè)HBV DNA定量值為SXlOhU/ml乙肝患者血清進(jìn)行如下步驟的操作:
[0077](l)PCR裂解液的分裝:將配制好的混有磁珠的裂解液按照每管ΙΟΟμΙ分裝到專用PCR管中。
[0078](2)加樣:取ΙΟΟμΙ的血清加入到上述分裝有混合有磁珠的裂解液的PCR管中，用吸頭輕輕吹打混勻5次，室溫靜置5分鐘。
[0079](3)吸棄液體:將上述PCR管放置到八聯(lián)排磁力架上，靜置2分鐘，用移液器在磁珠對(duì)側(cè)將液體吸掉，注意勿吸掉磁珠。
[0080](4)洗滌:從八聯(lián)排磁力架上取下PCR管，并將已配制好的洗滌液每管加入200μ1，重新放置到八聯(lián)排磁力架上，無(wú)需等候時(shí)間直接用移液器或負(fù)壓栗吸棄洗滌液，注意吸凈殘液。
[0081 ] (5)將2.0μ1(?υ/μ1)單位的Taq DNA聚合酶與38.0μ1 PCR反應(yīng)液(所述反應(yīng)液為包括濃度40ηηιο1/μ1上下游引物和30ηηιο1/μ1探針；20ηηιο1/μ1的Tris堿；20mmol/yl氯化鎂；50mmolAU氯化鉀、200umolAU的dNTP和0.001wt%的石綠指示劑的熒光PCR擴(kuò)增試劑混合液)混勻，加入到步驟(4)得到的PCR擴(kuò)增管中，封蓋，輕輕將磁珠彈下來(lái)，保證磁珠與PCR反應(yīng)液徹底混勻。
[0082] 其中正向引物序列為HBVF 5’-TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG-3’，反向引物序列為HBVR 5’-GCACAGCTTGGAGGCTTGT-3’，探針序列為HBVP 5 ’-TCACCTCTGCCTAATC-3 ’。
[0083 ] (6)離心:水平離心機(jī)3000RPM離心45秒。
[0084](7)將上