專利名稱：：多孔樹脂珠和利用其制備核酸的方法多孔樹脂珠和利用其制備核酸的方法技術(shù)領(lǐng)城本發(fā)明涉及多孔樹脂珠和利用其制備核酸的方法，所述多孔樹脂珠包含芳香族單乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物。
背景技術(shù)：
：基于亞磷酰胺法(phosphommiditemethod)的固相合成方法被廣泛用于化學(xué)地合成核酸，比如DNA和RNA。在該方法中，將固相合成用栽體填裝到反應(yīng)柱中并應(yīng)用于自動核酸合成儀，其中所述載體擔(dān)栽預(yù)先經(jīng)可裂解的連接體連接的將變成待合成核酸的3'端的核苷。隨后，根椐合成程序在合成循環(huán)中重復(fù)進(jìn)行(l)核苷的5'-OH基團(tuán)的脫保護(hù)；(2)將核苷亞磷酰胺偶聯(lián)到所述5，-OH基團(tuán)上；(3)未反應(yīng)的5，-OH基團(tuán)的加帽；和(4)所得亞磷酸酯的氧化，由此合成出具有期望序列的核酸。最后通過使用氨等水解可裂解的連接體，從固相合成用栽體上切掉合成的核酸(例如非專利文獻(xiàn)1)。常規(guī)地,CPG(可控孔玻璃)、硅膠等的無機(jī)顆粒已被廣泛用作核酸的固相合成用載體。作為對它們的替代，已經(jīng)開發(fā)出具有改良的化學(xué)穩(wěn)定性的高度交聯(lián)的、不溶脹的多孔聚苯乙烯顆粒(例如,專利文獻(xiàn)l)和使得在核酸藥物的制備中實(shí)現(xiàn)核酸的大量合成的低交聯(lián)的、可溶脹的多孔聚苯乙烯顆粒。同時(shí)，相較于DNA的合成，RNA的合成遇到這樣的問題amidite的偶聯(lián)效率因?yàn)楸仨毷褂迷谄?，-OH基團(tuán)上結(jié)合有保護(hù)基的亞磷酰胺而降低，其導(dǎo)致所得RNA純度的降低。為了在合成RNA的同時(shí)最小化純度的降低，有必要減少核苷-連接體鍵合的量，其中所述核苷在固相合成用栽體上用作合成起始點(diǎn)，但是，這卻導(dǎo)致每單位量的固相合成栽體的合成量降低的新問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究以解決上述問題，并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)利用由特定的芳香族單乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物構(gòu)成的多孔樹脂珠作為固相合成用栽體，來進(jìn)行RNA的化學(xué)合成時(shí)，可以化學(xué)地合成高純度的RNA而不會降低合成的量。本發(fā)明人基于該發(fā)現(xiàn)進(jìn)行了進(jìn)一步研究，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明涉及以下[l]-[8]:[1〗多孔樹脂珠,其包含第一芳香族單乙彿基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物。[2]上述[l]所述的多孔樹脂珠，其中所述共聚物進(jìn)一步包含具有能夠通過脫水縮合反應(yīng)結(jié)合到羧基的官能團(tuán)的第二芳香族單乙烯基化合物作為結(jié)構(gòu)單元。[3]上述[l]所述的多孔樹脂珠，其中在所迷共聚物中所迷(甲基)丙烯酰胺衍生物單元的含量是0.3-4mmol/g。[4]上述[2]所述的多孔樹脂珠，其中存在于所述第二芳香族單乙烯基化合物中的所迷官能團(tuán)是氨基或羥基。[5]上述[4]所述的多孔樹脂珠，其中在所述共聚物中所述氨基或羥基的含量是0.05-lmmol/g。〖6]上述[l]所述的多孔樹脂珠，其中所述(甲基)丙烯酰胺衍生物選自由N-烷基(甲基)丙烯酰胺、N,N-二烷基(甲基)丙烯酰胺、N-烷氧基(甲基)丙烯酰胺、2-(甲基)丙烯酰胺鏈烷磺酸、N-羥烷基(甲基)丙烯酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、雙丙酮丙烯酰胺、N,N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺和丙烯?；鶈徇M成的組。[7]上迷[l]所述的多孔樹脂珠，其中所迷二乙烯基化合物是二乙烯基苯。用于制備核酸的方法，包括將核苷酸結(jié)合到各自通過可裂解的連接體結(jié)合到上迷[1H7]任一項(xiàng)所迷的多孔樹脂珠上的核苷、核苷酸或多核苷酸上以得到延長的多核普酸。本發(fā)明提供多孔樹脂珠，其在核酸合成中用作固相合成用栽體時(shí)，使得能實(shí)現(xiàn)核酸的大量合成而不降低其合成純度。本發(fā)明所述多孔樹脂珠的使用，使得即便是對于難以化學(xué)地合成的核酸如RNA,也可以避免合成量的降低和合成純度的降低。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供多孔樹脂珠，其包含芳香族單乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物。此處所用術(shù)語"芳香族單乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物"指的是包含芳香族單乙烯基化合物，二乙烯基化合物和(甲基)丙烯酰胺衍生物作為其結(jié)構(gòu)單元的共聚物。該共聚物可以通過共聚芳香族單乙烯基化合物單體、二乙烯基化合物單體和(甲基)丙烯酰胺衍生物單體來制備。本發(fā)明所述的多孔樹脂珠中，芳香族單乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物的含量通常為80重量％或更多，優(yōu)選90重量％或更多，更優(yōu)選95重量％或更多，和最優(yōu)選基本100重量％。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的多孔樹脂珠由芳香族單乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物構(gòu)成。本發(fā)明所述多孔樹脂珠中使用的第一芳香族單乙烯基化合物的選擇并無特別限定；實(shí)例包括苯乙烯；核烷基取代(nuclearalkyl-substituted)的苯乙烯比如鄰甲基苯乙烯、間甲基苯乙烯、對甲基苯乙烯、2,4-二甲基苯乙烯、乙基苯乙烯、三曱基苯乙烯和對叔丁基苯乙烯；a-烷基取代的苯乙烯比如a-甲基苯乙烯和a-曱基-對甲基笨乙烯；核面代笨乙烯比5如氯苯乙烯、二氯苯乙烯、氟苯乙烯、五氟苯乙彿和溴苯乙烯；卣代烷基苯乙烯比如氯甲基苯乙烯和氟甲基苯乙烯;羥基苯乙烯;羥甲基苯乙烯;苯甲酸乙烯基酯;苯乙烯磺酸鈉;氰基苯乙烯;甲氧基苯乙烯；乙氧基苯乙烯;丁氧基苯乙烯;硝基苯乙烯;酰氧基苯乙烯比如乙酰氧基苯乙烯和苯甲酰氧基苯乙烯等。所迷第一芳香族單乙烯基化合物優(yōu)選苯乙烯。此處，所述第一芳香族單乙烯基化合物與下述第二芳香族單乙烯基化合物的區(qū)別在于所迷第一芳香族單乙烯基化合物不具有能夠通過脫水縮合反應(yīng)結(jié)合到羧基的官能團(tuán)。來自第一芳香族單乙烯基化合物單體的典型結(jié)構(gòu)單元是下述結(jié)構(gòu)單元(a)。-ch—ch2—d'(a)在組成本發(fā)明所迷的多孔樹脂珠的共聚物中，來自第一芳香族單乙烯基化合物單體的結(jié)構(gòu)單元的含量沒有特別限定，且含量優(yōu)選l-9.5mmol/g,更優(yōu)選2-9mmol/g,還更優(yōu)選3-8mmol/g。本發(fā)明的多孔樹脂珠中使用的二乙烯基化合物的選擇并無特別限定；實(shí)例包括芳香族二乙烯基化合物比如二乙烯基苯、甲基二乙烯基苯、二乙烯基甲苯和二乙烯基萘；單和多乙二醇二(甲基)丙烯酸酯比如乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二甘醇二(甲基)丙烯酸酯、三甘醇二(甲基)丙烯酸酯和四甘醇二(甲基)丙烯酸酯;單和多丙二醇二(甲基)丙烯酸酯比如丙二醇二(甲基)丙烯酸酯和二丙二醇二(甲基)丙烯酸酯；二(甲基)丙烯酸酯化合物比如1,2-丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，3-丁二醇二(曱基)丙烯酸酯、1,4-丁二醇二(曱基)丙烯酸酯、1>戊二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，6-己二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，9-壬二醇二(曱基)丙烯酸酯、1,10-癸二醇二(曱基)丙烯酸酯、2-甲基-l,8-辛二醇(甲基)丙烯酸酯和1，4-環(huán)己二醇二甲基丙烯酸酯等。該二乙烯基化合物優(yōu)選二乙烯基苯。6二乙烯基苯包括鄰、間和對二乙烯基苯及其混合物。來自二乙烯基化合物單體的典型結(jié)構(gòu)單元是下迷結(jié)構(gòu)單元(c)。在構(gòu)成本發(fā)明所述的多孔樹脂珠的共聚物中，來自二乙烯基化合物單體的結(jié)構(gòu)單元的含量(mmol)并無特別限定，含量通常為0.1-2mmol/g,優(yōu)選為0.2-lmmol/g,且更優(yōu)選為0.3-0.8mmol/g。若該二乙烯基化合物含量過低，則所述多孔樹脂珠不會具有足夠的耐溶劑性、熱穩(wěn)定性或多孔性，其進(jìn)而有時(shí)導(dǎo)致在核酸的固相合成中難以獲得期望的效果。若該二乙烯基化合物含量過高，則其在有機(jī)溶劑中的溶脹性會降低，其進(jìn)而有時(shí)導(dǎo)致通過固相合成而合成的核酸量的減少及其合成純度的降低。N-烷基(曱基)丙烯酰胺中含有的烷基是直鏈或支鏈烷基，通常具有1-6個碳原子，優(yōu)選1-3個碳原子。N-烷基(甲基)丙彿酰胺的實(shí)例包括N-甲基(曱基)丙烯酰胺，N-乙基(甲基)丙烯酰胺，N-正丙基(曱基)丙烯酰胺，N-異丙基(甲基)丙烯酰胺，N-叔丁基(甲基)丙烯酰胺和N-月桂基(甲基)丙烯酰胺。N-烷氧基烷基(曱基)丙烯酰胺中含有的烷氧基是直鏈或支鏈烷氧基，通常具有1-6個碳原子,優(yōu)選1-3個碳原子。N-烷氧基烷基(甲基)丙烯酰胺中含有的烷基是直鏈或支鏈烷基，通常具有1-6個碳原子，優(yōu)選1-3個碳原子。N-烷氧基烷基(甲基)丙烯酰胺的實(shí)例包括N-甲氧基甲基(甲基)丙烯酰胺,N-乙氧基曱基(甲基)丙烯酰胺，N-丙氧基甲基(曱基)丙烯酰胺，N-丁氧基甲基(甲基)丙烯酰胺,N-乙氧基乙基(甲基)丙烯酰胺,N-甲氧基丙基(甲基)丙烯酰胺,N-乙氧基丙基(曱基)丙烯酰胺和N-異丙氧基乙基(曱基)丙烯酰胺。2-(甲基)丙烯酰胺鏈烷磺酸中含有的烷烴是直鏈或支鏈烷烴，通常具有l(wèi)-6個碳原子，優(yōu)選為1-3個碳原子。2-(甲基)丙烯酰胺鏈烷磺酸的實(shí)例包括2-丙烯酰胺丙烷磺酸，2-丙烯酰胺正丁烷磺酸，2-丙烯酰胺正己烷磺酸和2-丙烯酰胺-2-曱基丙烷磺酸所述(曱基)丙烯酰胺衍生物優(yōu)選是雙丙酮丙烯酰胺，N-異丙基(曱基)丙烯酰胺，N-甲氧基甲基(甲基)丙烯酰胺或N,N，-二甲基(甲基)丙烯酰胺。來自(甲基)丙烯酰胺衍生物單體的典型結(jié)構(gòu)單元是以下結(jié)構(gòu)單元。在構(gòu)成本發(fā)明所述的多孔樹脂珠的共聚物中，來自(甲基)丙烯酰胺衍生物單體的結(jié)構(gòu)單元的含量通常為0.3-4mmol/g,優(yōu)選0.4-3.5mmol/g，且更優(yōu)選0.6-3mmol/g。若所述(甲基)丙烯酰胺衍生物的含量過低，則得不到避免合成的核酸的量降低和合成純度降低的預(yù)期效果；若所述(甲基)丙烯酰胺衍生物的含量過高,則多孔樹脂珠難以形成。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所迷的多孔樹脂珠中的共聚物，除了第一芳香族單乙烯基化合物之外，進(jìn)一步包含第二芳香族單乙烯基化合物作為其結(jié)構(gòu)單元，所述第二芳香族單乙烯基化合物具有能夠通過脫水縮合反應(yīng)結(jié)合到羧基的官能團(tuán)。在連接核苷和多孔樹脂珠中使用這種官能團(tuán)是有利的，因?yàn)楫?dāng)用于核酸合成的連接體具有羧基時(shí)，它可以容易地結(jié)合到該羧基上。這類官能團(tuán)的實(shí)例包括，但不限于氨基和羥基。所述第二芳香族單乙烯基化合物的實(shí)例包括,但不限于得自所述第一芳香族單乙烯基化合物的一個或多個氫原子被能夠通過脫水縮合反應(yīng)結(jié)合到羧基的官能團(tuán)取代的化合物。特別地，所述第二芳香族單乙烯基化合物例示為輕基苯乙烯單體比如羥基苯乙烯或其取代衍生物；羥烷基苯乙烯單體比如羥甲基苯乙烯或其取代衍生物；酰氧基苯乙烯比如乙酰氧基苯乙烯,乙?；趸揭蚁┖捅郊柞Ｑ趸揭蚁?其中所述酰氧基通過水解轉(zhuǎn)化為輕基；氨基苯乙烯單體比如氨基苯乙烯或其取代衍生物；氨基烷基笨乙烯單體比如氨基甲基苯乙烯或其取代衍生物；和它們的?；瘑误w，等等。所述第二芳香族單乙烯基化合物優(yōu)選未取代的對羥基苯乙烯、對氨基苯乙烯或?qū)σ阴Ｑ趸揭蚁?lt;formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>在構(gòu)成本發(fā)明所述的多孔樹脂珠的共聚物中，來自第二芳香族單乙烯基化合物單體的結(jié)構(gòu)單元的含量，通常為0.05-lmmol/g,優(yōu)選0.1-0.8mmol/g，且更優(yōu)選0.2-0.7mmol/g。若所述第二芳香族單乙烯基化合物過低，則得不到避免合成的核酸的量降低和合成純度降低的預(yù)期效果；若所述第二芳香族單乙烯基化合物過量，則多孔樹脂珠傾向于難以形成。在構(gòu)成本發(fā)明所述的多孔樹脂珠的共聚物中，能夠通過脫水縮合反應(yīng)結(jié)合到羧基的官能團(tuán)的含量優(yōu)選為0.05-lmmol/g，更優(yōu)選為0.1-0.8mmol/g，且還更優(yōu)選為0.2-0.7mmol/g。若所迷官能團(tuán)含量過低，則合成的核酸量容易降低；若所述官能團(tuán)含量過高，則核酸的純度容易下降。當(dāng)所述能夠通過脫水縮合反應(yīng)結(jié)合到羧基的官能團(tuán)是氨基或羥基時(shí)，在本發(fā)明所述的多孔樹脂珠中，所述氨基或羥基的含量按照J(rèn)ISK0070通過滴定來進(jìn)行測量。特別地，使用預(yù)定量的乙?；噭?乙酸酐和吡咬)對固相合成用栽體中的測量目標(biāo)羥基進(jìn)行乙?；?，通過使用氫氧化鉀滴定來測定在該乙?；^程中未被消耗的乙酸酐的量，并計(jì)算所述氨基的含量或羥基的含量。具體程序如下所示。將吡。定添加到25g的乙酸酐中，以使總體積為100ml，得到乙酰化試劑。稱量0.5-2g的樣品(干多孔樹脂珠)到燒瓶中，并精確添加0.5ml的上述乙酰化試劑和4.5ml的吡啶。在95-10(TC保持2hr后，將燒瓶中的混合物冷卻至室溫，之后添加lmi的蒸餾水。對該燒瓶加熱10min以分解在乙酰化中沒有消耗的乙酸酐。將該燒瓶中的所有內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至燒杯中，并用蒸餾水稀釋以使總體積為150ml,之后使用0.5mol/l的氫氧化鉀水溶液滴定稀釋液。另外，以相同方法，但不添加樣品來進(jìn)行空白測量。ii樣品的羥基的含量通過下述式(l)計(jì)算A=(B-C)x0.5(mol/l)xfxlOOO+M...(l)其中AOimol/g)為樣品的羥基含量；B(ml)為被添加以中和空白溶液的氫氧化鉀水溶液的量；C(ml)為被添加以中和樣品的氫氧化鉀水溶液的量；f為氬氧4b鐘7JC溶'液因子(fisafactorfortheaqueouspotassiumhydroxidesolution"M(g)為稱量出的樣品的重量。對本發(fā)明所述的多孔樹脂珠的孔大小、孔的數(shù)量等并無特別限定。所迷孔大小可通過中值孔徑來量化。本發(fā)明所述的多孔樹脂珠的中值孔徑并無特別限定，大小優(yōu)選為l-1000nm,更優(yōu)選為5-500nm,且還更優(yōu)選為10-200nm。若所述多孔樹脂珠的中值孔徑過小，當(dāng)本發(fā)明所述的多孔樹脂珠被用作化學(xué)反應(yīng)用栽體時(shí)，則有反應(yīng)區(qū)域降低至使得期望的反應(yīng)不太可能發(fā)生的程度的危險(xiǎn)，而且核酸合成中的堿基序列數(shù)容易小于所期望的數(shù)。相反，若所述多孔樹脂珠的中值孔徑過大，則所述珠表面(其用作上述反應(yīng)的區(qū)域)上的羥基和反應(yīng)中涉及的物質(zhì)之間的接觸機(jī)會下降，這對于栽體是潛在地不利的。所迷多孔樹脂珠的中值孔徑通過水銀孔隙率測定法來測定。特別地，將約0.2g樣品放入水銀孔隙率測定儀PoreMaster60-GT(QuantaChromeCo.)中，并通過水銀注射加壓法在140。的水銀接觸角和480dyn/cm的水銀表面張力條件下進(jìn)行測量。制備本發(fā)明所述多孔樹脂珠的方法的選擇并無特別限定。以下描述的是其一種制備方法，包含懸浮-共聚各個單體，并水解所得共聚物。在該制備方法中，首先利用有機(jī)溶劑和水，對第一芳香族單乙烯基化合物單體、二乙烯基化合物單體和(甲基)丙烯酰胺衍生物單體(和根據(jù)需要，具有被保護(hù)的能夠通過脫水縮合反應(yīng)結(jié)合到羧基的官能團(tuán)的第二芳香族單乙烯基化合物單體)進(jìn)行懸浮-共聚，以獲得芳香族單乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物。隨后水解該共聚物，并根椐需要對含有的具有能夠通過脫水縮合反應(yīng)結(jié)合到羧基的官能團(tuán)的第二芳香族單乙烯基化合物進(jìn)行脫保護(hù)，由此獲得多孔樹脂珠。作為用于上述懸浮共聚中的第一芳香族單乙烯基化合物單體、二乙烯基化合物單體、(甲基)丙烯酰胺衍生物單體和第二芳香族單乙烯基化合物單體，可以提及以上提到的用以例示構(gòu)成本發(fā)明所述多孔樹脂珠的各共聚物的結(jié)構(gòu)單元的化合物。所述第二芳香族單乙烯基化合物單體中含有的能夠通過脫水縮合反應(yīng)結(jié)合到羧基的官能團(tuán)優(yōu)選被保護(hù)。根據(jù)官能團(tuán)的種類來選擇適當(dāng)種類的保護(hù)基團(tuán)。例如,當(dāng)所述官能團(tuán)是羥基時(shí)，優(yōu)選使用酰氧基作為保護(hù)基。酰氧基是由式X-CO-O-表示的基團(tuán)(其中，X為烷基)；優(yōu)選由X表示的烷基部分具有l(wèi)-5個碳原子的酰氧基，優(yōu)選乙酰氧基。上述懸浮共聚中使用的第二芳香族單乙烯基化合物單體的優(yōu)選具體實(shí)例包括對乙酰氧基苯乙烯、對笨甲酰氧基苯乙紼等。也可以不保護(hù)所述第二芳香族單乙烯基化合物而制備本發(fā)明所述多孔樹脂珠的用于固相合成的載體。但是，由于具有能夠通過脫水縮合反應(yīng)結(jié)合到羧基的官能團(tuán)的未被保護(hù)的第二芳香族單乙烯基化合物(例如,羥基苯乙烯等)是不穩(wěn)定的單體，因而操作和保存不容易。由于該原因，優(yōu)選上述的方法，其中，對具有被保護(hù)的能夠通過脫水縮合反應(yīng)結(jié)合到羧基的官能團(tuán)的第二芳香族單乙彿基化合物進(jìn)行懸浮-共聚，并對如此得到的共聚物進(jìn)行水解。在所述懸浮共聚中，加入的第一芳香族單乙烯基化合物單體的量，相對于第一芳香族單乙烯基化合物單體、二乙烯基化合物單體和(曱基)丙烯酰胺衍生物單體(以及根椐需要使用的第二芳香族單乙烯基化合物單體)的總量，通常為卜9.5mmol/g，優(yōu)選2-9mmol/g，更優(yōu)選3-8mmol/g,且還更優(yōu)選4-7mmol/g。在所述懸浮共聚中，加入的二乙烯基化合物單體的量，相對于第一芳香族單乙烯基化合物單體、二乙烯基化合物單體和(曱基)丙烯酰胺衍生物單體(以及根據(jù)需要使用的第二芳香族單乙烯基化合物單體)的總量，通常為0.1-2mmol/g，優(yōu)選0.2-lmmol/g,且更優(yōu)選0,3-0.8mmol/g。在所述懸浮共聚中，加入的(曱基)丙烯酰胺衍生物單體的量，相對于第一芳香族單乙烯基化合物單體、二乙烯基化合物單體和(曱基)丙烯酰胺衍生物單體(以及根據(jù)需要使用的第二芳香族單乙烯基化合物單體)的總量，通常為0.3-4mmol/g,優(yōu)選0.4-3.5mmol/g,且更優(yōu)選0.6-3mmol/g。在所迷懸浮共聚中，當(dāng)使用第二芳香族單乙烯基化合物單體時(shí)，加入的第二芳香族單乙烯基化合物單體的量，相對于第一芳香族單乙烯基化合物單體、二乙烯基化合物單體、(曱基)丙烯酰胺衍生物單體以及第二芳香族單乙烯基化合物單體的總量，通常為0.05-lmmol/g,優(yōu)選0.1-0.8mmol/g，且更優(yōu)選0.2-0.7mmol/g。上述懸浮共聚通過在水中攪拌并乳化上述單體和有機(jī)溶劑的混合物來進(jìn)行。如在此處所使用的那樣，術(shù)語"有機(jī)溶劑"指的是懸浮共聚系統(tǒng)中的除水之外的溶劑。在本發(fā)明中，上迷有機(jī)溶劑包括烴和醇。有用的烴包括脂肪族飽和或不飽和烴和芳族烴，優(yōu)選具有5-12個碳原子的脂肪族烴，更優(yōu)選正己烷、正庚烷、正辛烷、異辛烷、十一烷、十二烷等。在懸浮共聚過程中醇的存在使得所得珠為多孔性的。醇的實(shí)例包括脂肪族醇，在其烷基中的碳原子數(shù)優(yōu)選為5-12;更優(yōu)選的醇包括2-乙基己醇、叔戊醇、壬醇、2-辛醇、癸醇、月桂醇、環(huán)己醇等。上述烴和醇的重量比取決于所用的烴和醇的選擇而適當(dāng)可以變化。根據(jù)該重量比,所得多孔樹脂珠的比表面積是可變的。在所述懸浮共聚中，有機(jī)溶劑的重量，相對于單體的總重量，優(yōu)選為0.5-2.5倍，更優(yōu)選為0.8-2.0倍。若該值過大或過小，則所得多孔樹脂珠的比表面積降低，其進(jìn)而使得化學(xué)地合成的反應(yīng)產(chǎn)物的量降低。在本發(fā)明中，可通過本身已知的方法來進(jìn)行懸浮共聚。特別地，在懸浮共聚中，可使用已知的分散體穩(wěn)定劑和過氧化物比如過氧化苯甲酰(聚合引發(fā)劑)。上述分散體穩(wěn)定劑的其它實(shí)例包括，但不限于親水性的護(hù)膠劑比如聚乙烯醇、聚丙烯酸、明膠、淀粉和羧甲基纖維素；或不溶性粉末比如碳酸鉤、碳酸鎂、磷酸鈣、硫酸鋇、疏酸鈣和膨潤土等。所添加的分散體穩(wěn)定劑的量并無特別限定，相對于懸浮聚合系統(tǒng)中水的重量，該量優(yōu)選0.01-10重量％。若該值過小，則懸浮聚合中分散體穩(wěn)定性可能降低，這可能導(dǎo)致產(chǎn)生大量的聚集體。若該值過大，則可能導(dǎo)致產(chǎn)生大量微珠。上述聚合引發(fā)劑的實(shí)例包括，但不限于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的引發(fā)劑，包括過氧化物比如過氧化二笨曱酰、過氧化二月桂酰、過氧化二硬酯酰、1,1-二(叔丁基過氧基)-2-甲基環(huán)己烷、1,1-二(叔己基過氧基)-3，3,5-三甲基環(huán)己烷、l,l-二(叔己基過氧基)環(huán)己烷、l,l-二(叔丁基過氧基)環(huán)己烷、二叔己基過氧化物、叔丁基異丙苯基過氧化物、二叔丁基過氧化物、己酸1,1，3,3-四甲基丁基過氧基-2-乙基酯、己酸叔己基過氧基-2-乙基酯、己酸叔丁基過氧基-2-乙基酯和叔丁基過氧基異丙基單碳酸酯；和偶氮化合物比如2,2，-偶氮雙異丁腈、2,2，-偶氮雙-2-甲基丁腈和2，2，-偶氮雙-2，4-二曱基戊腈。用于所迷懸浮共聚的反應(yīng)條件可以適當(dāng)設(shè)定；例如可提及在60-90。C攪拌30min-48hr。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的程序和條件實(shí)現(xiàn)水解，該水解用以對共聚物中被保護(hù)的基團(tuán)進(jìn)行脫保護(hù)。例如，可使用酸催化劑或堿催化劑通過水解將酰氧基轉(zhuǎn)化為羥基。應(yīng)注意的是在水解處理中，并不是所有保護(hù)基團(tuán)都必須被除去。通過上述處理，可獲得本發(fā)明所述的多孔樹脂珠。在該方法中，可適當(dāng)進(jìn)行進(jìn)一步的處理比如干燥和分級。本發(fā)明所述的多孔樹脂珠可作為栽體用于各種化學(xué)合成反應(yīng)，并且可以特別有效地用在核酸合成中。此處所用術(shù)語核酸指的是線型化合物(寡核苦酸)，其中核苷酸經(jīng)由磷酸二酯鍵連接，并且被認(rèn)為包括DNA,RNA等。所述核酸可以為單鏈的或雙鏈的。因?yàn)槠湓试S使用核酸合成儀有效合成，所以所述核酸優(yōu)選為單鏈的。本發(fā)明所述的多孔樹脂珠可以很好地作為核酸，特別是RNA的合成用固相栽體。使用本發(fā)明所述的多孔樹脂珠作為固相栽體，使得能夠在極高產(chǎn)率和純度下合成期望的RNA。盡管尚不完全清楚為何本發(fā)明所述的多孔樹脂珠適于RNA合成，但是可能與(曱基)丙烯酰胺衍生物的親水性有關(guān)。此處所用核酸合成反應(yīng)特別指的是核酸延長反應(yīng)。特別地，將核苷酸結(jié)合到各自通過可裂解的連接體結(jié)合到本發(fā)明所述的多孔樹脂珠上的核苷、核苷酸或多核苷酸上，由此得到延長的多核苷酸。連接體指的是通過共價(jià)鍵連接兩個分子的分子。有用的連接體包括在固相核酸合成中本身已知的用于連接載體和核酸的那些。優(yōu)選的連接體包括下式所示的核苷-琥珀酰連接體(洗滌)對所得聚合產(chǎn)物進(jìn)行過濾和使用蒸餾水和丙酮(WakoPureChemicalIndustries)洗滌，并分散于丙酮中以使總體積為約2L。使用超聲均化器分散該聚合產(chǎn)物，之后對分散體進(jìn)行過濾和使用蒸餾水和丙酮洗滌，并將產(chǎn)物分散在丙酮中以使總體積為約1L。實(shí)施例4進(jìn)行與實(shí)施例1相同的程序，除了使用37g的苯乙烯(WakoPureChemicalIndustries),4g(0.41mmol/g)的對乙酰氧基苯乙烯(Aldrich)，7g(0.49mmol/g)的二乙烯基苯(55°/0含量，WakoPureChemicalIndustries)和12g(1.55mmol/g)的N-甲氧基甲基甲基丙烯酰胺(WakoChemical)作為單體，和使用55g的2-乙基己醇(WakoPureChemicalIndustries)和25g的異辛烷(WakoPureChemicalIndustries)作為有機(jī)溶劑，由此獲得由對輕基苯乙烯-苯乙烯-二乙烯基苯-N-甲氧基甲基甲基丙烯酰胺共聚物組成的多孔樹脂珠的固相合成用栽體。實(shí)施例5進(jìn)行與實(shí)施例1相同的程序，除了使用25g的苯乙烯(WakoPureChemicalIndustries),4g(0.41mmol/g)的對乙酰氧基苯乙烯(Aldrich)，7g(0.49mmol/g)的二乙烯基苯(55%含量，WakoPureChemicalIndustries),12g(1.77mmol/g)的N-異丙基丙烯酰胺(WakoPureChemicalIndustries)和12g的曱基丙烯腈(WakoPureChemicalIndustries)作為單體，和使用72g的l-癸醇(WakoPureChemicalIndustries),由此獲得由對羥基苯乙烯-苯乙烯-二乙烯基苯-N-異丙基丙烯酰胺-曱基丙烯腈共聚物組成的多孔樹脂珠的固相合成用栽體。實(shí)施例6進(jìn)行與實(shí)施例1相同的程序，除了使用40g的笨乙烯(WakoPureChemicalIndustries)，6g(0.62mmol/g)的對乙酰氧基苯乙烯(Aldrich)，9g(0.52mmol/g)的二甲基丙烯酸三甘醇酯(Shin-NakamuraChemicalCo.，Ltd.,商品名NKEster3G)和5g(0.84mmol/g)的N,N-二甲基丙烯酰胺(WakoPureChemicalIndustries)作為單體，和使用84g的l-癸醇(WakoPureChemicalIndustries)作為有機(jī)溶劑，由此獲得由對羥基苯乙烯-苯乙烯-二甲基丙烯酸三甘醇酯-N,N-二甲基丙烯酰胺共聚物組成的多孔樹脂20珠的固相合成用載體。比較例1進(jìn)行與實(shí)施例1相同的程序，除了使用49g的苯乙烯(WakoPureChemicalIndustries),4g(0.41mmol/g)的對乙酰氧基苯乙烯(Aldrich)和7g(0.49mmol/g)的二乙烯基苯(55%含量，WakoPureChemicalIndustries)作為單體，和使用52g的2-乙基己醇(WakoPureChemicalIndustries)和23g的異辛烷(WakoPureChemicalIndustries),由此獲得由對羥基苯乙烯-苯乙烯-二乙烯基苯共聚物組成的多孔樹脂珠的固相合成用載體。(RNA合成和評價(jià))使用實(shí)施例l-6和比較例1中所得多孔樹脂珠的固相合成用栽體，如下合成RNA和評價(jià)?；旌?克的各固相合成用栽體、0.095g的DMT-dT-3，-琥珀酸酯(BeijingOMChemicals)、0'045g的HBTU(Novabiochem)、0細(xì)ml的N,N-二異丙基乙基胺(Aldrich)和10ml的乙腈(WakoPureChemicalIndustries),并在室溫下攪拌該混合物12hr以引起反應(yīng)。過濾反應(yīng)產(chǎn)物并用乙腈洗滌，之后干燥載體。將其與2.5ml的CapA(20。/。乙酸酐/800/0乙腈)、2.5ml的CapB(20。/。N-甲基咪唑/30。/o吡啶/50。/o乙腈)、0.025g的4-二甲基氨基吡啶(Aldrich)和5ml的乙腈(WakoPureChemicalIndustries)混合，并在室溫下在攪拌下使該混合物反應(yīng)12hr。過濾反應(yīng)產(chǎn)物并用乙腈洗滌，之后在減壓下干燥載體，以獲得DMT-dT-3，-琥珀酸酯結(jié)合于其上的固相合成用栽體。經(jīng)由針對使用對甲苯磺酸/乙腈溶液脫保護(hù)的DMT基團(tuán)的吸光測定(412nm)，計(jì)算鍵合的DMT-dT-3，-琥珀酸酯的量。將10mg如此獲得的其中DMT-dT-3，-琥珀酸酯結(jié)合于其上的固相合成用栽體置于合成柱中，并應(yīng)用于AppliedBiosystems3400DNA合成儀(AppliedBiosystems)，由此，在l^imol合成規(guī)模和去DMT(DMT-off)的條件下，合成核酸(d丁xlmer+rA、rG、rC和rUx21mer的混合序列)。在合成完成之后，對柱進(jìn)行干燥；之后將核酸從固相合成用載體切掉，對堿基氨基基團(tuán)進(jìn)行脫保護(hù)，通過過濾分離固相合成用載體。對所得濾液進(jìn)行UV吸光測定(260nm),測定核酸的OD結(jié)果(ODyield)(相當(dāng)于合成的核酸的量)。接下來，干燥濾液，對所得RNA的2'羥基進(jìn)行脫保護(hù)，并通過HPLC(Waters)來計(jì)算全長。/。(具有期望序列長度的RNA的比例)。結(jié)果示于表1中。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>由表清楚可知，所有本發(fā)明所述多孔樹脂珠的固相合成用栽體均比比較例顯示更高數(shù)值的OD結(jié)果(合成的RNA的量)和全長％(合成純度)。工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供多孔樹脂珠，其當(dāng)在核酸合成中用作固相合成用栽體時(shí)，允許實(shí)現(xiàn)核酸的大量合成而不降低其合成純度。本發(fā)明所述多孔樹脂珠的使用，使得即便是對于難以化學(xué)地合成的核酸如RNA，也可以避免合成量的降低和合成純度的降低。相關(guān)申請的交叉引用本申請以在日本提交(提交日2008年06月25日)的專利申請No.2008-165379為基礎(chǔ)，其內(nèi)容通過該引用全部整合于此。引用目錄專利文獻(xiàn)1:JP-A-3-68593專利文獻(xiàn)2:JP-A-2005-325272非專利文獻(xiàn)1:CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistry(2000)權(quán)利要求1.多孔樹脂珠，包含第一芳香族單乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物。2.權(quán)利要求1的多孔樹脂珠，其中所述共聚物進(jìn)一步包含具有能夠通過脫水縮合反應(yīng)結(jié)合到羧基的官能團(tuán)的第二芳香族單乙烯基化合物作為結(jié)構(gòu)單元。3.權(quán)利要求1的多孔樹脂珠，其中在所述共聚物中所述(甲基)丙烯酰胺衍生物單元的含量是0.3-4mmol/g。4.權(quán)利要求2的多孔樹脂珠，其中存在于所述第二芳香族單乙烯基化合物中的所述官能團(tuán)是氨基或羥基。5.權(quán)利要求4的多孔樹脂珠，其中在所述共聚物中所迷氨基或羥基的含量是0.05-1mmol/g。6.權(quán)利要求l的多孔樹脂珠，其中所述(曱基)丙烯酰胺衍生物選自由N-烷基(甲基)丙烯酰胺、N,N-二烷基(甲基)丙烯酰胺、N-烷氧基(曱基)丙烯酰胺、2-(甲基)丙烯酰胺鏈烷磺酸、N-羥烷基(甲基)丙烯酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、雙丙酮丙烯酰胺、N，N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺和丙烯?；鶈徇M成的組。7.權(quán)利要求1的多孔樹脂珠，其中所述二乙烯基化合物是二乙烯基苯。8.用于制備核酸的方法，包括將核苷酸結(jié)合到各自通過可裂解的連接體結(jié)合到權(quán)利要求l-7任一項(xiàng)的多孔樹脂珠上的核苷、核苷酸或多核苷酸上以得到延長的多核苷酸。全文摘要本發(fā)明涉及多孔樹脂珠和利用其制備核酸的方法。本發(fā)明提供含有芳香族單乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物的多孔樹脂珠。優(yōu)選所述共聚物進(jìn)一步包含第二芳香族單乙烯基化合物作為結(jié)構(gòu)單元，所述第二芳香族單乙烯基化合物具有能夠通過脫水縮合反應(yīng)結(jié)合到羧基的官能團(tuán)。文檔編號C08F212/00GK101613430SQ20091015087公開日2009年12月30日申請日期2009年6月25日優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日發(fā)明者前田惠里,小西達(dá)也,森健二郎申請人:日東電工株式會社