專利名稱：多孔樹脂珠粒及使用其制造核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及 一種多孔樹脂珠粒。更例示性地，本發(fā)明涉及含有第一芳族單乙烯 基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯腈-第二芳族單乙烯基化合物共聚物的多孔樹 脂珠粒。所述多孔樹脂珠粒在合成核酸時特別有用。
背景技術(shù)：
使用亞磷酰胺法的固相合成方法被廣泛用于核酸如DNA寡核苷酸和RNA的化 學(xué)合成。在所述方法中，例如，首先通過可切割的連接體如琥珀?；?，將成為待合成的 核酸的3’ _末端的核苷預(yù)先負載至固相合成載體上，并且將所述載體放入反應(yīng)柱中且安 置在自動核酸合成儀上。之后，例如，以下列根據(jù)所述自動核酸合成儀的合成程序的方 式，將合成試劑注入所述反應(yīng)柱中。(1)通過三氯乙酸/ 二氯甲烷溶液、二氯乙酸/甲苯 溶液等對核苷5’ -OH基進行脫保護，(2)通過核苷亞磷酰胺(核酸單體)/乙腈溶液和 活化劑(四唑等)/乙腈溶液，使阿米迪特(amidite)與5’ -OH基進行偶聯(lián)反應(yīng)；(3)通 過乙酸酐/吡啶/甲基咪唑/THF等對未反應(yīng)的5’ -OH基進行封端，以及⑷通過碘/ 水/吡啶等對亞磷酸酯進行氧化。通過重復(fù)所述合成循環(huán)，合成了具有預(yù)期序列的核酸。通過用氨、甲胺等對可 切割的連接體進行水解，將最后合成的核酸從所述固相合成載體中切出(參見非專利文 獻1) O作為在核酸合成中待使用的固相合成載體，迄今已使用CPG(可控孔度玻璃)、 硅膠等無機粒子，但是近年來，已經(jīng)開始使用能夠增加每重量固相合成載體的合成核酸 量的樹脂珠粒，以便以合適的價格和大量來進行合成。作為這種樹脂珠粒，例如可提及 高交聯(lián)且不溶脹的多孔聚苯乙烯珠粒(參見專利文獻1)、低交聯(lián)且溶脹的多孔聚苯乙烯 珠粒(參見專利文獻2)等。然而，當將作為合成起點的核苷連接體的負載量增加至太高水平，以便進一步 增加重量固相合成載體的合成核酸量時，會造成阿米迪特的偶聯(lián)效率變差且獲得的核酸 純度顯著降低的問題。例如，可商購的固相合成載體的核苷連接體負載量的上限迄今最 多為約200 μ mol/g,所述負載量的核苷連接體能夠以高純度合成20個堿基的DNA寡核苷酸。已通過使用丙烯腈抑制多孔樹脂珠粒在各種有機溶劑中的溶脹比波動來進行嘗 試以改進核酸合成能力(參見專利文獻3)。然而，盡管該文獻中使用的多孔樹脂珠粒在 各種有機溶劑中多孔樹脂珠粒的溶脹比波動小，但是對核酸合成能力還需要進一步的改進。專利文獻1 JP-A-3-68593專利文獻2 JP-A-2005-325272專利文獻3 JP-A-2008-74979非專利文獻1:核酸化學(xué)的當前規(guī)程(2000)，第3.6單元，未改性寡核苷酸的合成(Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry (2000), UNIT 3.6 Synthesis of Unmodified Oligonucleotides)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于以高合成量和高純度來合成核酸的多孔樹脂珠 粒。本發(fā)明人已首次出 乎其意料地發(fā)現(xiàn)，在含有第一芳族單乙烯基化合物-二乙烯 基化合物_(甲基)丙烯腈_第二芳族單乙烯基化合物共聚物的多孔樹脂珠粒中，當在核 酸合成中使用其中(1)所述第二芳族單乙烯基化合物含有能夠通過脫水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合的基 團，并且(2)干體積為 2 至 3ml/g，的多孔樹脂珠粒作為固相合成載體時，提高了獲得的核酸合成量并且提高了其純度。基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人已進一步進行深入研究，結(jié)果完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明涉及下列多孔樹脂珠粒，用于制造核酸的方法等。(1) 一種多孔樹脂珠粒，所述多孔樹脂珠粒包含第一芳族單乙烯基化合物-二乙 烯基化合物_(甲基)丙烯腈_第二芳族單乙烯基化合物共聚物，其中所述第二芳族單乙 烯基化合物含有能夠通過脫水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合的基團，并且其中所述多孔樹脂珠粒 具有2至3ml/g的干體積。(2)在(1)中所述的多孔樹脂珠粒，其中所述能夠通過脫水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合
的基團是選自氨基、氨烷基、羥基和羥烷基的基團。(3)在⑴或⑵中所述的多孔樹脂珠粒，其中源自所述(甲基)丙烯腈的結(jié)構(gòu) 單元的量為1至4mmol/g。(4)在⑴至(3)中任一項所述的多孔樹脂珠粒，其中基于單體的總量，所述二 乙烯基化合物的量為2至10mol%。(5)在⑴至(4)中任一項所述的多孔樹脂珠粒，其中所述二乙烯基化合物是二
乙煉基苯。(6) 一種制造核酸的方法，所述方法包含將核苷或核苷酸通過可切割的連接體順 序結(jié)合至(1)至(5)中任一項所述的多孔樹脂珠粒，由此獲得寡核苷酸。本發(fā)明的多孔樹脂珠粒具有高核酸合成量和核酸合成純度。因此，當使用本發(fā) 明的多孔珠粒時，與使用常規(guī)多孔樹脂珠粒的情況相比，能夠有效地進行核酸的合成。
具體實施例方式本發(fā)明的多孔樹脂珠粒含有第一芳族單乙烯基化合物_ 二乙烯基化合物_ (甲基) 丙烯腈_第二芳族單乙烯基化合物共聚物。在本文中，術(shù)語“第一芳族單乙烯基化合 物_ 二乙烯基化合物_(甲基)丙烯腈_第二芳族單乙烯基化合物共聚物”是指含有如下 結(jié)構(gòu)單元的共聚物，所述結(jié)構(gòu)單元各自分別源自第一芳族單乙烯基化合物、二乙烯基化 合物、(甲基)丙烯腈和第二芳族單乙烯基化合物。換言之，術(shù)語“第一芳族單乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯腈-第二芳族單乙烯基化合物共聚物”是指通過 將作為單體的第一芳族單乙烯基化合物、二乙烯基化合物、(甲基)丙烯腈和第二芳族單 乙烯基化合物共聚而獲得的共聚物。提供本發(fā)明多孔樹脂珠粒的結(jié)構(gòu)單元(即，第一芳族單乙烯基化合物-二乙烯基 化合物_(甲基)丙烯腈-第二芳族單乙烯基化合物共聚物的結(jié)構(gòu)單元)之一的“第一芳族 單乙烯基化合物”是指苯乙烯或其取代產(chǎn)物。作為苯乙烯的取代產(chǎn)物，例如可以提及這 樣的化合物，在所述化合物中，利用碳原子數(shù)為1至5的烷基(例如，甲基、乙基、正丙 基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、仲戊基或叔戊基)、 鹵原子、羧基、磺酸酯基、氰基、碳原子數(shù)為1至5的烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、 丙氧基、丁氧基或戊氧基)、硝基、酰基(例如，乙酰氧基或苯甲酰氧基)等來取代苯乙 烯的一個以上氫原子。作為這種第一芳族單乙烯基化合物，例如例示性地可以提及苯乙烯；作為苯 環(huán)部分被取代的苯乙烯的“核烷基取代的苯乙烯”，如鄰甲基苯乙烯、間甲基苯乙烯、 對甲基苯乙烯、2，4-二甲基苯乙烯、乙基苯乙烯、三甲基苯乙烯和對叔丁基苯乙烯；
“α-烷基取代的苯乙烯”，如α-甲基苯乙烯和α-甲基對甲基苯乙烯；作為苯環(huán)部分 被鹵代的苯乙烯的“核鹵代苯乙烯”，如氯苯乙烯、二氯苯乙烯、氟苯乙烯、五氟苯乙 烯、溴苯乙烯；“鹵代烷基苯乙烯”，如氯甲基苯乙烯和氟甲基苯乙烯；“酰氧基苯乙 烯”，如羥基苯乙烯、羥甲基苯乙烯、苯甲酸乙烯酯、苯乙烯磺酸鈉、氰基苯乙烯、甲 氧基苯乙烯、乙氧基苯乙烯、丁氧基苯乙烯、硝基苯乙烯、乙酰氧基苯乙烯和苯甲酰氧 基苯乙烯等，然而不限于此。優(yōu)選作為第一芳族單乙烯基化合物的是苯乙烯。提供本發(fā)明多孔樹脂珠粒的結(jié)構(gòu)單元之一的“二乙烯基化合物”是指芳族二乙 烯基化合物、二(甲基)丙烯酸酯或其取代產(chǎn)物。作為芳族二乙烯基化合物的取代產(chǎn)物或 二(甲基)丙烯酸酯的取代產(chǎn)物，可以提及例如其中將所述芳族二乙烯基化合物或二(甲 基)丙烯酸酯的一個以上氫原子用下列基團取代的化合物碳原子數(shù)為1至5的烷基；鹵 原子；羧基；磺酸酯基；氰基；碳原子數(shù)為1至5的烷氧基；和硝基。
作為這樣的二乙烯基化合物，例示性地，例如可以提及芳族二乙烯基化合物 如二乙烯基苯、甲基二乙烯基苯、二乙烯基甲苯和二乙烯基萘；二(甲基)丙烯酸酯化 合物如乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二甘醇二(甲基)丙烯酸酯、三甘醇二(甲基)丙烯 酸酯、四甘醇二(甲基)丙烯酸酯，另外的多羥基乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二 (甲基)丙烯酸酯、二丙二醇二(甲基)丙烯酸酯，另外的多羥基丙二醇二(甲基)丙烯 酸酯、1，2-丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，3-丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，4-丁二 醇二(甲基)丙烯酸酯、1，5-戊二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，6-己二醇二(甲基)丙 烯酸酯、1，9-壬二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，10-癸二醇二(甲基)丙烯酸酯、2-甲 基-1，8-辛二醇二(甲基)丙烯酸酯以及1，4-環(huán)己二醇二(甲基)丙烯酸酯；等。優(yōu) 選作為本發(fā)明二乙烯基化合物的是二乙烯基苯。關(guān)于所述二乙烯基苯，優(yōu)選使用鄰、間 或?qū)Χ蚁┗交蚱浠旌衔镒鳛樘峁┧鼋Y(jié)構(gòu)單元的化合物。在它們之中，特別優(yōu)選間 或?qū)Χ蚁┗?。所述二乙烯基化合物在本發(fā)明的多孔樹脂珠粒中起交聯(lián)劑的作用。由 于存在當交聯(lián)劑的量小時，多孔樹脂珠粒易于溶脹這一趨勢，所以所述二乙烯基化合物 的量可有助于增加溶脹比。
提供本發(fā)明多孔樹脂珠粒的結(jié)構(gòu)單元之一的“(甲基)丙烯腈”是指“丙烯腈” 或“甲基丙烯腈”，或“丙烯腈和甲基丙烯腈兩者”。即，關(guān)于源自本發(fā)明多孔樹脂珠 粒中含有的(甲基)丙烯腈的結(jié)構(gòu)單元，可以各自獨立含有源自丙烯腈的結(jié)構(gòu)單元或源自 甲基丙烯腈的結(jié)構(gòu)單元或者可以含有這些單元兩者。
提供本發(fā)明多孔樹脂珠粒的結(jié)構(gòu)單元之一的“第二芳族單乙烯基化合物”是指 含有“能夠通過脫水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合的官能團”的苯乙烯或其取代產(chǎn)物。因此，在 合成目標核酸的情況下，將核苷與所述多孔樹脂珠粒連接，并且當在所述情況下的連接 體中存在羧基時，能夠容易地將連接體的羧基與所述多孔樹脂珠粒連接，從而從能夠有 效地進行核酸合成的觀點來看是有利的。作為這種“能夠通過脫水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合 的官能團”，可以提及氨基、氨烷基、羥基、羥烷基等。更優(yōu)選地，可以提及伯胺基、 氨甲基、羥基、羥甲基等。優(yōu)選的是，將所述“能夠通過脫水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合的官 能團”布置在乙烯基的對位，但也可以是鄰位或間位。
作為這種第二芳族單乙烯基化合物，例如例示性地可以提及氨基苯乙烯單體 或其取代產(chǎn)物如氨基苯乙烯；氨烷基苯乙烯單體或其取代產(chǎn)物如氨甲基苯乙烯；羥基 苯乙烯單體或其取代產(chǎn)物如羥基苯乙烯；羥烷基苯乙烯單體或其取代產(chǎn)物如羥甲基苯乙 烯；等，在其中優(yōu)選對氨基苯乙烯、對氨甲基苯乙烯、對羥基苯乙烯和對羥甲基苯乙 火布。
作為羥基苯乙烯單體或氨基苯乙烯單體的“取代產(chǎn)物”，可以提及其中除“能 夠通過脫水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合的官能團”之外的一個以上氫原子被下列基團取代的那 些化合物碳原子數(shù)為1至5的烷基；鹵原子；羧基；磺酸酯基；氰基；甲氧基；硝基；等。
可通過直接使用在制造初期含有“能夠通過脫水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合的官能 團”的第二芳族單乙烯基化合物來制造本發(fā)明的多孔樹脂珠粒(在下文中描述制造方 法)，但是其也可以通過由懸浮共聚合等一次合成多孔樹脂珠粒，然后引入“能夠通過脫 水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合的官能團”來制造。特別地，當將具有羥基作為所述“能夠通過 脫水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合的官能團”的第二芳族單乙烯基化合物作為提供本發(fā)明多孔樹 脂珠粒的結(jié)構(gòu)單元的單體引入時(即，將羥基苯乙烯作為提供本發(fā)明多孔樹脂珠粒的結(jié) 構(gòu)單元的單體引入)，優(yōu)選通過后一制造方法來制造珠粒，因為所述羥基苯乙烯本身是非 常不穩(wěn)定的單體，原因在于其傾向于引起聚合且因此不易對其進行操作和保存。
根據(jù)這種制造過程，作為成為本發(fā)明“第二芳族單乙烯基化合物”基礎(chǔ)的芳族 單乙烯基化合物，可以提及例如酰氨基苯乙烯如乙酰氨基苯乙烯；酰氧基苯乙烯如乙 酰氧基苯乙烯、乙酰氧基苯乙烯(ethanoyloxystyrene)和苯甲酰氧基苯乙烯；鹵烷基苯乙 烯如氯甲基苯乙烯；等。
可將通過懸浮共聚合等合成的多孔樹脂珠粒中源自酰氧基苯乙烯或酰氨基苯乙 烯的結(jié)構(gòu)單元，通過用堿或酸水解而轉(zhuǎn)化成作為本發(fā)明多孔樹脂珠粒結(jié)構(gòu)單元的“源自 第二芳族單乙烯基化合物的結(jié)構(gòu)單元”，例示性地為源自羥基苯乙烯、氨基苯乙烯等的 結(jié)構(gòu)單元。而且，可將源自鹵烷基苯乙烯的結(jié)構(gòu)單元，通過與鄰苯二甲酰亞胺和胼、 氨、氫氧化鈉等的反應(yīng)轉(zhuǎn)化為作為本發(fā)明多孔樹脂珠粒的結(jié)構(gòu)單元的“源自第二芳族單 乙烯基化合物的結(jié)構(gòu)單元”，例示性地為源自氨烷基苯乙烯、羥烷基苯乙烯等的結(jié)構(gòu)單元。即，通過與鄰苯二甲酰亞胺和胼、氨等的反應(yīng)，可將源自鹵烷基苯乙烯的結(jié)構(gòu)單元 轉(zhuǎn)化為源自氨烷基苯乙烯的結(jié)構(gòu)單元，并且通過與氫氧化鈉等的反應(yīng)，可將源自鹵烷基 苯乙烯的結(jié)構(gòu)單元轉(zhuǎn)化為源自羥烷基苯乙烯的結(jié)構(gòu)單元。優(yōu)選的是，將被轉(zhuǎn)化成為所述 “能夠通過脫水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合的官能團”的酰氧基、酰氨基、鹵烷基等布置在乙 烯基的對位，但也可以是鄰位或間位。
或者，可以對通過懸浮共聚合等合成的包含第一芳族單乙烯基化合物-二乙烯 基化合物_(甲基)丙烯腈化合物共聚物的多孔樹脂珠粒進行后處理，從而將鹵烷基引入 源自第一芳族單乙烯基化合物的結(jié)構(gòu)單元的芳環(huán)中，隨后將其轉(zhuǎn)化為源自氨烷基苯乙烯 或羥烷基苯乙烯的結(jié)構(gòu)單元。例如，通過向包含第一芳族單乙烯基化合物-二乙烯基化 合物_(甲基)丙烯腈化合物共聚物的多孔樹脂珠粒分散體中加入氯甲基醚和氯化鋅并使 它們發(fā)生反應(yīng)來引入氯甲基。接下來，經(jīng)由通過使所述共聚物與氨反應(yīng)來引入氨甲基， 從而引入“源自第二芳族單乙烯基化合物的結(jié)構(gòu)單元”。即使通過這種制造過程也能夠 獲得本發(fā)明的多孔樹脂珠粒。優(yōu)選的是，將鹵烷基布置在乙烯基的對位，但也可以是鄰 位或間位。
盡管基于本發(fā)明多孔樹脂珠粒的結(jié)構(gòu)單元的總量，源自第一芳族單乙烯基化合 物的結(jié)構(gòu)單元(也可以稱作“第一單乙烯基化合物結(jié)構(gòu)單元”)的量不受特殊限制，但是 對于每重量多孔樹脂珠粒，其占有量優(yōu)選為3.0至8.3mmol/g，更優(yōu)選為4.5至S.Ommol/ go 進一步優(yōu)選為5.0至7.5mmol/g。
當源自第一單乙烯基化合物的結(jié)構(gòu)單元的量小于上述范圍時，所述多孔樹脂珠 粒的耐溶劑性、熱穩(wěn)定性和多孔性可能不充分，從而當被用于核酸的固相合成時，幾乎 不能預(yù)期所需的效果。而且，當源自第一單乙烯基化合物的結(jié)構(gòu)單元的量大于上述范 圍時，在有機溶劑中的溶脹度降低，從而當被用于核酸的固相合成時，核酸的合成量變 小，并且進一步地，核酸純度也減小。
盡管基于本發(fā)明多孔樹脂珠粒的結(jié)構(gòu)單元的總量，源自二乙烯基化合物的結(jié)構(gòu) 單元(也可以稱作“二乙烯基化合物結(jié)構(gòu)單元”)的量不受特殊限制，但是對于每重量多 孔樹脂，其占有量優(yōu)選為0.2至l.Ommol/g，更優(yōu)選為0.25至0.8mmol/g，進一步優(yōu)選為 0.3 至 0.7mmol/g。
當源自二乙烯基化合物的結(jié)構(gòu)單元的量小于上述范圍時，多孔樹脂珠粒的耐溶 劑性、熱穩(wěn)定性和多孔性可能不充分，從而當被用于核酸的固相合成時，幾乎不能預(yù)期 所需的效果。而且，當源自二乙烯基化合物的結(jié)構(gòu)單元的量大于上述范圍時，在有機溶 劑中的溶脹度降低，從而當被用于核酸的固相合成時，核酸的合成量可能變小，并且進 一步地，核酸純度也可能減小。
本發(fā)明多孔樹脂珠粒在乙腈中顯著溶脹，但其干體積為2至3ml/g。與通常的 多孔樹脂珠粒比較，所述干體積較小。然而，由于本發(fā)明的多孔樹脂珠粒在乙腈中顯示 大的溶脹比，因此能夠擴大使用乙腈的核酸合成的反應(yīng)范圍，由此能夠改進核酸合成的 反應(yīng)性。因此，根據(jù)本發(fā)明，能夠獲得用于固相合成載體中的多孔樹脂珠粒，與用于核 酸合成應(yīng)用的常規(guī)多孔樹脂珠粒相比，所述多孔樹脂珠粒能夠合成同時具有高的合成量 及合成純度的核酸。
因此，為了將本發(fā)明多孔樹脂珠粒的干體積調(diào)整為2至3ml/g，有必要考慮基于多孔樹脂珠粒結(jié)構(gòu)單元的總量，源自(甲基)丙烯腈的結(jié)構(gòu)單元(也可以稱作“(甲基) 丙烯腈結(jié)構(gòu)單元”)的量。
基于本發(fā)明的多孔樹脂珠粒結(jié)構(gòu)單元的總量，源自(甲基)丙烯腈的結(jié)構(gòu)單元的 量優(yōu)選為1至4mmol/g，更優(yōu)選為1.5至3.5mmol/g，進一步優(yōu)選為1.8至3.0mmol/g。
當源自(甲基)丙烯腈的結(jié)構(gòu)單元的量小于上述范圍時，幾乎不能獲得所需干重 的多孔樹脂珠粒，并且當被用于核酸的固相合成時幾乎不能預(yù)期所需的效果。而且，當 所述量大于上述范圍時，幾乎不能形成多孔樹脂珠粒自身。通過全氮分析來測定本發(fā)明 多孔樹脂珠粒中源自(甲基)丙烯腈的結(jié)構(gòu)單元的量。例示性地，這是通過將樣品放入 鉬盤，在微量天平中對其進行稱重，然后通過微量全氮分析儀TN-110 (由三菱化學(xué)株式 會社制造)來測定氮的量，并由源自(甲基)丙烯腈的結(jié)構(gòu)單元的分子量計算而得到。
盡管不受特殊限制，但是基于本發(fā)明多孔樹脂珠粒的結(jié)構(gòu)單元的總重量，源自 第二芳族單乙烯基化合物的結(jié)構(gòu)單元(也可以稱作“第二芳族單乙烯基化合物結(jié)構(gòu)單 元”)的量優(yōu)選為0.05至1.5mmol/g，更優(yōu)選為0.1至1.0mmol/g，進一步優(yōu)選為0.2至 0.8mmol/g。
這是因為當源自第二芳族單乙烯基化合物的結(jié)構(gòu)單元的量小于上述范圍時，幾 乎不能獲得其效果，而當所述量大于上述范圍時幾乎不能形成多孔樹脂珠粒本身。
在本發(fā)明多孔樹脂珠粒中，關(guān)于源自第二芳族單乙烯基化合物的結(jié)構(gòu)單元所具 有的“能夠通過脫水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合的官能團”的量，例如在氨基、氨烷基、羥基 或羥烷基的情況下，對于每重量多孔樹脂珠粒，“能夠通過脫水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合的 官能團”的占有量優(yōu)選為0.05至1.5mmol/g，更優(yōu)選為0.1至l.Ommol/g，進一步優(yōu)選為 0.2 至 0.8mmol/g。
當所述“能夠通過脫水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合的官能團”的量小于上述范圍時， 則存在當被用作核酸固相合成的載體時，核酸的合成量變小的趨勢。而且，當所述量大 于上述范圍時，則存在當被用作核酸固相合成的載體時，核酸純度降低的趨勢。
在本發(fā)明多孔樹脂珠粒中，關(guān)于源自第二芳族單乙烯基化合物的結(jié)構(gòu)單元具有 的“能夠通過脫水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合的官能團”的量，例如在氨基、氨烷基、羥基或 羥烷基的情況下，通過基于JIS K 0070的滴定來對其進行測定。例示性地，可使用已知 量的乙?；噭?乙酸酐/吡啶)，通過對目標固相合成載體的羥基進行乙?；缓笸?過氫氧化鉀滴定來測定乙?；聪牡囊宜狒牧?，從而能夠計算所述官能團的量。
用于制造本發(fā)明多孔樹脂珠粒的方法不受特殊限制，并且可以提及，例如
(1)用于制造多孔樹脂珠粒的方法，所述方法包括使用有機溶劑和水，使第一芳 族單乙烯基化合物、二乙烯基化合物、(甲基)丙烯腈和含有能夠通過脫水縮合反應(yīng)與羧 基結(jié)合的官能團的第二芳族單乙烯基化合物進行懸浮共聚合；
(2)用于制造多孔樹脂珠粒的方法，所述方法包括通過懸浮共聚合等合成多孔樹 脂珠粒，然后將能夠通過脫水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合的官能團引入到源自第二芳族單乙烯 基化合物等的結(jié)構(gòu)單元中。
在進行所述懸浮共聚合時，基于第一芳族單乙烯基化合物、二乙烯基化合物、(甲基)丙烯腈和第二芳族單乙烯基化合物的總量，所述第一芳族單乙烯基化合物的量 (給料量)優(yōu)選為31至85mol%，更優(yōu)選為45至82mol%，進一步優(yōu)選為53至76mol%。
在進行所述懸浮共聚合時，基于第一芳族單乙烯基化合物、二乙烯基化合物、(甲基)丙烯腈和第二芳族單乙烯基化合物的總量，所述二乙烯基化合物的量(給料量) 優(yōu)選為2至10mol%，更優(yōu)選為2.5至8mol%，進一步優(yōu)選為3至7mol%。
在進行所述懸浮共聚合時，基于第一芳族單乙烯基化合物、二乙烯基化合物、(甲基)丙烯腈和第二芳族單乙烯基化合物的總量，所述(甲基)丙烯腈的量(給料量) 優(yōu)選為10至40mol%，更優(yōu)選為13至;35mol%，進一步優(yōu)選為18至30mol%。
在進行所述懸浮共聚合時，基于第一芳族單乙烯基化合物、二乙烯基化合物、(甲基)丙烯腈和第二芳族單乙烯基化合物的總量，所述第二芳族單乙烯基化合物的量 (給料量)優(yōu)選為0.5至15mol%，更優(yōu)選為1至10mol%，進一步優(yōu)選為2至8mol%。 在包括通過懸浮共聚合等來一次合成多孔樹脂珠粒，然后引入“能夠通過脫水縮合反應(yīng) 與羧基結(jié)合的官能團”的制造方法的情況下，上述量對于成為第二芳族單乙烯基化合物 的基礎(chǔ)的芳族單乙烯基化合物相同。
通過攪拌和使上述各化合物(在下文中有時將待進行懸浮共聚合的本發(fā)明多孔 樹脂珠粒的各個組成成分(即，第一芳族單乙烯基化合物、二乙烯基化合物、(甲基)丙 烯腈和第二芳族單乙烯基化合物)稱作“單體”)和有機溶劑的混合物在水中乳化來進行懸浮共聚合。
在本發(fā)明中，有機溶劑是指在懸浮共聚合體系中除了水之外的溶劑，并合適地 使用烴和醇。例示性地，作為所述烴，可使用脂肪族飽和或不飽和烴或者芳族烴，其 中優(yōu)選碳原子數(shù)為5至12的脂肪族烴，并且更優(yōu)選地，可以提及正己烷、正庚烷、正辛 烷、異辛烷、十一烷、十二烷等。另外，優(yōu)選使醇共存，以便增加在此時(在下文中， 將以增加多孔性為目的而使用的醇稱作“成孔劑”)獲得的珠粒的多孔性。作為依據(jù)本 發(fā)明的醇，例如，可提及脂肪醇，并且其碳原子數(shù)優(yōu)選為5至9。作為這種醇，例示性 地，可提及2-乙基己醇、戊醇(例如，叔戊醇)、壬醇、2-辛醇、環(huán)己醇等。
取決于烴和醇的例示性組合，可任選地改變待用于懸浮共聚合中的烴和醇的重 量比，從而能夠增加固相合成載體的比表面積。烴和醇的優(yōu)選混合比為以重量比計1 9 至 6 4。
在懸浮共聚合時，基于上述各單體的總重量，有機溶劑的重量優(yōu)選為0.5至2.5 倍，更優(yōu)選為0.8至2.2倍，進一步優(yōu)選為1.0至2.0倍。當該值大于或小于上述值時， 所得多孔樹脂珠粒的比表面積變小，并且通過使用珠粒的化學(xué)反應(yīng)的合成反應(yīng)產(chǎn)物的量變小。
根據(jù)本發(fā)明，可通過應(yīng)用常規(guī)的已知方法來進行用于進行懸浮共聚合的方法本 身。
在懸浮共聚合中待使用的分散體穩(wěn)定劑不受特殊限制，并且可使用常規(guī)已知的 聚乙烯醇、聚丙烯酸、明膠、淀粉、羧甲基纖維素等親水保護性膠體試劑，以及碳酸 鈣、碳酸鎂、磷酸鈣、硫酸安定(valium sulfate)、硫酸鈣、膨潤土等微溶性粉末等。盡 管分散體穩(wěn)定劑的量不受特殊限制，但是優(yōu)選基于懸浮共聚合體系中水的重量，分散體 穩(wěn)定劑的量為0.01至10重量％。當該值較小時，可能破壞懸浮共聚合的分散穩(wěn)定性，并 且可能形成大量聚集體。當該值較大時，可能形成大量的微小珠粒。
在進行懸浮共聚合時待使用的聚合引發(fā)劑不受特殊限制，并且可使用常規(guī)已知的過氧化二苯甲酰、過氧化二月桂酰、過氧化二硬脂酰、1，1-二(叔丁基過氧化)-2-甲 基環(huán)己烷、1，1-二(叔己基過氧化)_3，3，5-三甲基環(huán)己烷、1，1-二(叔己基過氧 化)環(huán)己烷、1，ι-二(叔丁基過氧化)_環(huán)己烷、二叔己基過氧化物、叔丁基異丙苯基過 氧化物、二叔丁基過氧化物、1，1，3，3-四甲基丁基過氧化-2-乙基己酸酯、叔己基過 氧化-2-乙基己酸酯、叔丁基過氧化-2-乙基己酸酯、叔丁基過氧化異丙基一碳酸酯和類 似的過氧化物、以及2，2’ -偶氮雙異丁腈、2，2’ -偶氮雙-2-甲基丁腈、2，2’ -偶 氮雙-2，4-二甲基戊腈和類似的偶氮化合物。聚合引發(fā)劑的添加量不受特殊限制，并且 可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇合適的量。
可任選地設(shè)定進行懸浮共聚合的反應(yīng)條件，并且例如，可以提及在60至90°C 下攪拌30分鐘至48小時。例如，攪拌速率為IOOrpm至l,000rpm，優(yōu)選為200rpm至 500rpm。通過懸浮共聚合，能夠獲得第一芳族單乙烯基化合物-二乙烯基化合物_(甲 基)丙烯腈-第二芳族單乙烯基化合物共聚物。
任選對這樣獲得的共聚物進行洗滌、干燥、分級等處理。另外，在通過懸浮共 聚合等合成多孔樹脂珠粒之后，可以將能夠通過脫水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合的官能團引入 源自第二芳族單乙烯基化合物的結(jié)構(gòu)單元中。引入方法如前文中所述。
通過上述處理能夠獲得本發(fā)明的多孔樹脂珠粒?？蓪⒃摱嗫讟渲榱Ｓ米鞴滔?合成載體。
本發(fā)明的“多孔樹脂珠?！辈⒉豢偸潜仨氾@示嚴格的球形，并且其至少可以為 粒狀。然而，從能夠增加其填充固相合成反應(yīng)柱的效率并且其幾乎不會破碎的觀點來 看，本發(fā)明的多孔樹脂珠粒(用于固相合成的載體)優(yōu)選為球形。
通過激光衍射散射法測定的本發(fā)明多孔樹脂珠粒的中值粒徑不受特殊限制，但 是優(yōu)選為1至1,000 μ m，更優(yōu)選為10至500 μ m，進一步優(yōu)選為20至300 μ m。通過激 光衍射散射法來測定本發(fā)明多孔樹脂珠粒的中值粒徑。例示性地，使用50體積％的乙醇 水溶液作為分散介質(zhì)，通過激光衍射散射型粒徑分布分析儀LA_950(由日本堀場株式會 社制造)測定粒徑來計算平均粒徑。
中值粒徑取決于在懸浮聚合的情況下在聚合開始前的攪拌條件、成孔劑的種類 和量以及在進行懸浮聚合時的分散體穩(wěn)定劑的濃度。因此，通過調(diào)整這些條件，可以將 中值粒徑調(diào)整在所需范圍內(nèi)。作為成孔劑，可提及上述的醇。另外，在溶脹條件下中值 粒徑的增大有助于增加多孔樹脂珠粒的溶脹比。
通過壓汞法測定的本發(fā)明多孔樹脂珠粒的中值孔徑不受特殊限制，但是優(yōu)選為1 至l,000nm，更優(yōu)選為5至500nm，進一步優(yōu)選為10至300nm。
通過壓汞法來測定本發(fā)明多孔樹脂珠粒的中值孔徑。例示性地，將0. 多孔樹 脂珠粒放入水銀測孔儀PoreMastereO-GT中(由康塔儀器公司制造)，并在140°的汞接 觸角和480dyn/cm的汞表面張力的條件下通過壓汞法來測定。
本發(fā)明的多孔樹脂珠粒的干體積優(yōu)選為2至3ml/g，更優(yōu)選為2.2至3ml/g，進 一步優(yōu)選為2.2至2.8ml/g。本發(fā)明的多孔樹脂珠粒具有在上述范圍內(nèi)的干體積并因此能 夠進行與迄今已開發(fā)的用于核酸合成的多孔樹脂珠粒相比，合成量和合成純度都高的核 酸合成。
當干體積小于上述干體積下限時，核酸的合成量和合成純度降低。在另一方面，當干體積大于上述干體積上限時，由于樹脂含量較少，所以核酸合成的起點數(shù)目變 小，結(jié)果每個反應(yīng)容器的核酸合成量降低。當干體積小時，通常認為核酸合成的范圍變 小，這對核酸合成是不利的。然而，盡管與通常的固相合成樹脂珠粒相比體積較小，但 是與通常的固相合成樹脂珠粒相比，本發(fā)明的多孔樹脂珠粒能夠出乎意料地增加核酸的 合成量和合成純度。
通過量筒來測定本發(fā)明多孔樹脂珠粒的干體積。例示性地，將l.OOg多孔樹脂珠 粒放入IOml容量的量筒中，通過稍微加入振動來將多孔樹脂珠粒完全填充于量筒中，然 后測定其表觀體積。
干體積取決于在懸浮共聚合時(甲基)丙烯腈單體的量。存在以下趨勢當(甲 基)丙烯腈的混合量為10至40mOl%時，與不混合(甲基)丙烯腈的情況相比，所得多 孔樹脂珠粒的干體積變小。
另外，干體積受在進行懸浮共聚合時要與單體混合的有機溶劑的量和種類影 響。存在以下趨勢隨著有機溶劑的量變少，干體積變小。然而，當有機溶劑的量太少 時，孔徑變得太小，因此核酸合成能力降低，從而基于單體的總重量，有機溶劑的量優(yōu) 選為0.5至2.5倍。
可將本發(fā)明的多孔樹脂珠粒用作各種化學(xué)合成反應(yīng)的載體，并且可將其特別有 效地用在核酸合成中。
關(guān)于使用本發(fā)明多孔樹脂珠粒的核酸合成，可以應(yīng)用常規(guī)已知的方法。例如， 將下列的核苷琥珀?；B接體
O
(其中DMT是5’-保護基，并且B1是堿基)
與本發(fā)明多孔樹脂珠粒上能夠通過脫水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合的官能團結(jié)合。接 下來，以其變?yōu)轭A(yù)定的核苷酸序列的方式，從該核苷的5’末端逐步地結(jié)合核苷亞磷酰 胺?？墒褂米詣雍铣蓛x來進行該合成反應(yīng)。例如，通過向填充有核苷琥珀酰基連接體 結(jié)合的多孔樹脂珠粒的裝置的反應(yīng)柱中順序進料5’ -OH去保護試劑、核苷亞磷酰胺溶 液、阿米迪特活化劑溶液、氧化劑溶液、封端劑溶液、作為洗滌液的乙腈等來重復(fù)所述 反應(yīng)。最后，例如通過利用堿溶液使其水解來切去琥珀?；B接體部分，從而獲得所需 核酸?？墒褂贸Ｒ?guī)已知的連接體，例如，可列舉與核苷連接體結(jié)合并具有下列結(jié)構(gòu)的多 孔樹脂珠粒等。
權(quán)利要求
1.一種多孔樹脂珠粒，所述多孔樹脂珠粒包含第一芳族單乙烯基化合物-二乙烯基 化合物-(甲基)丙烯腈-第二芳族單乙烯基化合物共聚物，其中所述第二芳族單乙烯基 化合物含有能夠通過脫水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合的基團，并且其中所述多孔樹脂珠粒具有2 至3ml/g的干體積。
2.權(quán)利要求1中所述的多孔樹脂珠粒，其中所述能夠通過脫水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合的 基團是選自氨基、氨烷基、羥基和羥烷基的基團。
3.權(quán)利要求1或2中所述的多孔樹脂珠粒，其中源自所述(甲基)丙烯腈的結(jié)構(gòu)單元 的量為1至4mmol/g。
4.權(quán)利要求1至3中任一項所述的多孔樹脂珠粒，其中基于單體的總量，所述二乙烯 基化合物的量為2至10mol%。
5.權(quán)利要求1至4中任一項所述的多孔樹脂珠粒，其中所述二乙烯基化合物是二乙烯 基苯。
6.一種制造核酸的方法，所述方法包含將核苷或核苷酸通過可切割的連接體順序結(jié) 合至權(quán)利要求1至5中任一項所述的多孔樹脂珠粒，由此獲得寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多孔樹脂珠粒及使用其制造核酸的方法，所述多孔樹脂珠粒含有第一芳族單乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯腈-第二芳族單乙烯基化合物共聚物，其中所述第二芳族單乙烯基化合物含有能夠通過脫水縮合反應(yīng)與羧基結(jié)合的基團，并且其中所述多孔樹脂珠粒具有2至3ml/g的干體積。
文檔編號C08F212/36GK102020813SQ201010287590
公開日2011年4月20日 申請日期2010年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月17日
發(fā)明者前田惠里, 小西達也, 森健二郎 申請人:日東電工株式會社