從直腸癌石蠟包埋組織中提取dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種DNA提取方法，特別涉及一種從直腸癌石蠟包埋組織中提取DNA 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 福爾馬林固定石蠟包埋組織作為一種最為方便的臨床材料來源，常被用于大宗病 例的回顧性研究。近年，隨著眾多與疾病診斷、預(yù)后及治療相關(guān)的分子標(biāo)記物的出現(xiàn)，以石 蠟組織切片為材料進(jìn)行分子水平的基因檢測及篩查已成為臨床診斷及相關(guān)研究的常規(guī)手 段。對于各種基因分析方法而言，重要的是首先獲得足夠純度和數(shù)量的DNA。傳統(tǒng)的酚/氯 仿抽提法是最早從直腸癌石蠟包埋組織中純化DNA的方法，雖可滿足PCR等分析要求，但其 所用試劑毒性強、操作步驟復(fù)雜、樣品損失量大，交叉污染也隨之增多，不適合大量臨床標(biāo) 本特別是常規(guī)檢測的需要。目前已發(fā)展了多種改良方法以簡化操作步驟，包括一些商品化 的試劑盒，但仍然存在不同程度的缺陷。為此，本研究提出一種從直腸癌石蠟切片中快速提 取DNA的方法，只通過較少的步驟即可獲得足夠純度和數(shù)量的DNA，可有效用于PCR擴增和 DNA測序。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種安全、簡易、快速和高效的、并 適于普通實驗室應(yīng)用和工業(yè)化生產(chǎn)的從直腸癌石蠟包埋組織中提取DNA的方法。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0005] 從直腸癌石蠟包埋組織中提取DNA的方法，包括如下步驟：
[0006] (1)脫蠟：將待處理的石蠟包埋組織切成厚度為5-10μm的組織片，取3片組織片 置于無菌的1. 5ml離心管內(nèi)，加入125-250μLpH為8. 0-8. 5的提取緩沖液，用膠帶密封 后，置于微波爐中高火加熱l_2min，取出后迅速離心，離心速度為14000-20000r/min，離心 時間為8-12min，取出置-20°C條件下冷卻直至水相和蠟層有機相出現(xiàn)分層，使離心管中上 層蠟片充分硬化，傾斜離心管，用滅菌注射器將底部含有DNA的組織混合溶液吸出，得樣品 A；
[0007] (2)消化和抽提：將步驟①所得樣品中A轉(zhuǎn)至新收集管，加入占樣品A1倍體積的 裂解緩沖液，56-60°C水浴恒定溫加熱30min-3h，加熱期間分次或一次性添加20mg/mL蛋白 酶K溶液5-10μL，加熱期間搖床定時震蕩30min/次，煮沸8-15min滅活蛋白酶K，然后離 心，離心速度為14000-20000r/min，離心時間為8_12min，得上清液B;
[0008] (3)沉淀：將步驟②所得的上清液B轉(zhuǎn)移到另一Eppendorf管，加入1/10體積的 3mo1/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無水乙醇，混勻，-20°C放置20分鐘左右，DNA形成絮狀沉淀， 用玻棒撈出DNA沉淀，用70%冷乙醇洗DNA沉淀，三次，除去液體，真空抽或者室溫干燥，將 分離純化的DNA溶解于TE緩沖液，溶解后的DNA于4°C保存。
[0009]優(yōu)選的，所述的提取緩沖液pH為 8. 0-8. 5,由 50mmol/LTris-HCL，lmmol/LEDTA， 0· 5%Tween-20 組成，體積比為 5:1:0. 8。
[0010]優(yōu)選的，所述的裂解緩沖液pH為 8. 0-8. 5,由 10mmol/LTris-HCL，0. 5%Tween-20， 450g/mL蛋白酶K組成，體積比為100:200:1。
[0011] 優(yōu)選的，所述的ΤΕ緩沖液pH為8. 0-8. 5,由10mMTris堿，ImMEDTA組成，體積比 為 5:1。
[0012] 優(yōu)選的，所述的石蠟包埋組織切片標(biāo)本儲存時間為24小時-10年。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是：
[0014] 實驗證明本發(fā)明的方法分離提取步驟短，能夠高效剝離直腸癌組織中的DNA上的 蛋白質(zhì)以及RNA物質(zhì)，獲得較長片段DNA產(chǎn)品，避免了現(xiàn)有技術(shù)存在難以提取乳腺等患惡性 腫瘤軟組織中DNA的問題；
[0015] 本發(fā)明所用試劑為低毒化合物，對環(huán)境和人體的危害??；由于不易被分解，所獲得 的產(chǎn)品可方便于遠(yuǎn)途運輸和室溫存貯；
[0016] 本發(fā)明可以從存檔病理蠟塊中提取出高質(zhì)量的DNA，進(jìn)行腫瘤分子生物學(xué)的相關(guān) 研究，使DNA研究不再依賴于新鮮或冰凍的組織，這在臨床診斷、鑒別診斷和評估患者預(yù)后 等方面均具有重要價值；
[0017] 本發(fā)明操作簡便、操作人員不需專業(yè)的技術(shù)便可操作，設(shè)備簡單、成本低廉，所得 到的DNA得率和純度都極高；
[0018] 本發(fā)明經(jīng)過消化處理的DNA可直接用于PCR擴增和測序；
[0019] 該發(fā)明適于普通實驗室應(yīng)用和工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0020] 下面的實施例可以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明，但并不對本發(fā)明做任何 限制。
[0021] 實施例1
[0022] 一種從直腸癌石蠟包埋組織中提取DNA的方法，包括如下步驟：
[0023] 第一步：取樣，樣品儲存時間為24小時
[0024] 第二步：分離提取DNA
[0025] ①脫蠟：將待處理的石蠟包埋組織切成厚度為5μm的組織片，取3片組織片置于 無菌的1. 5ml離心管內(nèi)，加入125μLpH為8. 0的提取緩沖液，用膠帶密封后，置于微波爐中 高火加熱lmin，取出后迅速離心，離心速度為14000r/min，離心時間為8min，取出置-20°C 條件下冷卻直至水相和蠟層有機相出現(xiàn)分層，使離心管中上層蠟片充分硬化，傾斜離心管， 用滅菌注射器將底部含有DNA的組織混合溶液吸出，得樣品A;
[0026] ②消化和抽提：將步驟①所得樣品中A轉(zhuǎn)至新收集管100μL，加入裂解緩沖液 100μL，56°C水浴恒定溫加熱30min，加熱期間分次添加20mg/mL蛋白酶Κ溶液5μL，加熱 期間搖床定時震蕩30min/次，煮沸8min滅活蛋白酶Κ，然后離心，離心速度為14000r/min， 離心時間為8min，得上清液B;
[0027] ③沉淀：將步驟②所得的上清液B200μL轉(zhuǎn)移到另一Eppendorf管，加入 20μL3mol/L醋酸鈉和400μL冰冷無水乙醇，混勻，-20°C放置20分鐘左右，DNA形成絮狀 沉淀，用玻棒撈出DNA沉淀，用70%冷乙醇洗DNA沉淀，三次，除去液體，真空抽干，將分離純 化的DNA溶解于TE緩沖液，溶解后的DNA于4°C保存。
[0028]其中提取緩沖液pH為 8. 0,由 50mmol/LTris-HCL91. 9μL，lmmol/LEDTA18. 4μL， 0.5%Tween-2014.7yL組成；裂解緩沖液pH為 8.0,由 10mmol/LTris-HCL33yL，0.5% Tween-2066μL，450g/mL蛋白酶K1μL組成；TE緩沖液pH為 8. 0,由 10mMTris堿 5mL， ImMEDTA組成lmL。
[0029] 實施例2
[0030] 一種從直腸癌石蠟包埋組織中提取DNA的方法，包括如下步驟：
[0031] 第一步：取樣，樣品儲存時間為10年
[0032] 第二步：分離提取DNA
[0033] ①脫蠟：將待處理的石蠟包埋組織切成厚度為10μm的組織片，取3片組織片置于 無菌的1. 5ml離心管內(nèi)，加入250μLpH為8. 5的提取緩沖液，用膠帶密封后，置于微波爐中 高火加熱2min，取出后迅速離心，離心速度為20000r/min，離心時間為12min，取出置-20°C 條件下冷卻直至水相和蠟層有機相出現(xiàn)分層，使離心管中上層蠟片充分硬化，傾斜離心管， 用滅菌注射器將底部含有DNA的組織混合溶液吸出，得樣品A;
[0034] ②消化和抽提：將步驟①所得樣品中A轉(zhuǎn)至新收集管100μL，加入裂解緩沖 液100μL，60°C水浴恒定溫加熱3h，加熱期間分次或一次性添加20mg/mL蛋白酶Κ溶液 1(^1，加熱期間搖床定時震蕩3〇1^11/次，煮沸151^11滅活蛋白酶1(，然后離心，離心速度為 20000r/min，離心時間為12min，得上清液B;
[0035] ③沉淀：將步驟②所得的上清液B200μL轉(zhuǎn)移到另一Eppendorf管，加入20μL的 3mol/L醋酸鈉和400μL冰冷無水乙醇，混勻，-20°C放置20分鐘左右，DNA形成絮狀沉淀， 用玻棒撈出DNA沉淀，用70%冷乙醇洗DNA沉淀，三次，除去液體，真空抽或者室溫干燥，將 分離純化的DNA溶解于TE緩沖液，溶解后的DNA于4°C保存。
[0036]其中提取緩沖液pH為 8. 5,由 50mmol/LTris-HCL91. 9μL，lmmol/LEDTA18. 4μL， 0.5%Tween-2014.7yL組成；裂解緩沖液pH為 8.5,由 10mmol/LTris-HCL33yL，0.5% Tween-2066yL，450g/mL蛋白酶KlyL組成；TE緩沖液pH為 8.5,由 10mmol/LTris堿 5mL,lmmol/LEDTAlmL組成。
[0037] 實施例3
[0038] 一種從直腸癌石蠟包埋組織中提取DNA的方法，包括如下步驟：
[0039] 第一步：取樣，樣品儲存時間為8年
[0040] 第二步：分離提取DNA
[0041] ①脫蠟：將待處理的石蠟包埋組織切成厚度為8μπι的組織片，取3片組織片置于 無菌的1. 5ml離心管內(nèi)，加入200μLpH為8. 3的提取緩沖液，用膠帶密封后，置于微波爐中 高火加熱lmin，取出后迅速離心，離心速度為16000r/min，離心時間為10min，取出置-20°C 條件下冷卻直至水相和蠟層有機相出現(xiàn)分層，使離心管中上層蠟片充分硬化，傾斜離心管， 用滅菌注射器將底部含有DNA的組織混合溶液吸出，得樣品A;
[0042] ②消化和抽提：將步驟①所得樣品中A100μL轉(zhuǎn)至新收集管，加入裂解緩沖液 100μL，60°C水浴恒定溫加熱2h，加熱期間分次添加20mg/mL蛋白酶Κ溶液8μL，加熱期間 搖床定時震蕩30min/次，煮沸10min滅活蛋白酶Κ，然后離心，離心速度為16000r/min，離 心時間為10min，得上清液B;
[0043] ③沉淀：將步驟②所得的上清液B200μL轉(zhuǎn)移到另一Eppendorf管加入20μL的 3mol/L醋酸鈉和400μL冰冷無水乙醇，混勻，-20°C放置20分鐘左右，DNA形成絮狀沉淀， 用玻棒撈出DNA沉淀，用70%冷乙醇洗DNA沉淀，三次，除去液體，真空抽或者室溫干燥，將 分離純化的DNA溶解于TE緩沖液，溶解后的DNA于4°C保存。
[0044]其中提取緩沖液pH為 8. 3,由 50mmol/LTris-HCL91. 9μL，lmmol/LEDTA18. 4μL， 0.5%Tween-2014.7yL組成；裂解緩沖液pH為 8.3,由 10mmol/LTris-HCL33yL，0.5% Tween-2066yL，450g/mL蛋白酶KlyL組成；TE緩沖液pH為 8.3,由 10mmol/LTris堿 5mL,lmmol/LEDTAlmL組成。
[0045] 實施例4
[0046] 一種從直腸癌石蠟包埋組織中提取DNA的方