本發(fā)明涉及生物傳感器，特別涉及表面增強(qiáng)拉曼散射和適體在直接檢測和/或定量各種分析物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
復(fù)雜生物樣品中特定生物分子的定量測量是許多分子診斷測試的關(guān)鍵部分。然而，以與廉價(jià)、讀取結(jié)果快速、手持式、用電池運(yùn)行的護(hù)理現(xiàn)場(point-of-care)用設(shè)備的開發(fā)相容的方式來適當(dāng)?shù)販y量多種不同分析物類型仍然是很大的挑戰(zhàn)。例如，在傳染病領(lǐng)域中，急需能夠在診斷諸如結(jié)核(TB)、瘧疾、HIV等疾病時(shí)提供有用的信息的快速的護(hù)理現(xiàn)場用設(shè)備。在TB領(lǐng)域(和更通常的領(lǐng)域)，現(xiàn)有的潛在護(hù)理現(xiàn)場診斷測試有多種局限，其中包括：·在檢測所需的分析物濃度方面，測定靈敏度不足，導(dǎo)致假陰性結(jié)果；·檢測試劑缺少特異性，導(dǎo)致假陽性結(jié)果；·檢測試劑的溫度穩(wěn)定性差，導(dǎo)致假陰性和假陽性結(jié)果。為了說明這些局限，Dheda等觀察到，對(duì)于結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)來源的脂阿拉伯甘露聚糖(LAM，一種復(fù)雜的糖脂)，現(xiàn)有的基于抗體的酶聯(lián)免疫測定(ELISA)在尿中進(jìn)行時(shí)有99％的特異性，但僅有13％的靈敏度，這使得對(duì)于臨床應(yīng)用而言有不可接受的高假陰性率1。相比之下，痰液中的同一測試得到～86％的靈敏度，但僅有～15％的特異性，這導(dǎo)致了不可接受的高假陽性率。Dheda等確定，痰液中的假陽性是由于測定中所使用的抗LAM抗體與共居于口腔中的其他微生物(致病性和非致病性)所產(chǎn)生的LAM樣聚合物有交叉反應(yīng)性1。相反，假陰性結(jié)果的原因可能是固有的抗體-抗原親和力，以及生物樣本中的低抗原濃度和ELISA方法的固有檢測極限。因此，在消除假陰性結(jié)果(通過提高檢測極限)和假陽性結(jié)果(通過提供與所捕獲的分析物的身份有關(guān)的直接信息)的同時(shí)快速準(zhǔn)確地測量患者樣本中的特定M.tb來源的化合物(例如LAM)的濃度的能力將是TB診斷測試中的重大進(jìn)步，但現(xiàn)在還尚未實(shí)際可行。在另一實(shí)例中，外科領(lǐng)域中的一個(gè)重要挑戰(zhàn)是對(duì)患者施用正確劑量的麻醉劑。眾所周知，個(gè)體患者對(duì)大部分藥物樣分子(包括麻醉劑)的代謝速率差異極大，這是因?yàn)樵诶缂?xì)胞色素P450酶方面存在個(gè)體間多態(tài)變化2。結(jié)果，諸如麻醉劑(例如，二異丙酚)等藥物的活性形式的血漿濃度在高代謝者和空代謝者之間可能差異極大，進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)藥物施用的響應(yīng)不同，外科手術(shù)過程中的極端結(jié)果是患者因施用劑量對(duì)其基因型來說過低而在手術(shù)中醒來，或者是患者因施用劑量對(duì)其基因型來說過高而死亡。因此，在缺乏各個(gè)個(gè)體患者的能夠用來預(yù)先計(jì)算確切最佳劑量的定量藥物基因組學(xué)數(shù)據(jù)時(shí)，在手術(shù)室中實(shí)時(shí)地快速準(zhǔn)確地測量和監(jiān)測個(gè)體患者的化合物(例如二異丙酚)血漿濃度的能力將是麻醉學(xué)的重大進(jìn)步，不過這種能力實(shí)際上還不能實(shí)現(xiàn)。上文發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)有的潛在護(hù)理現(xiàn)場診斷測試中的多種缺點(diǎn)可通過使用如下所述的新型表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)測定平臺(tái)來解決。表面增強(qiáng)拉曼散射是公知的振動(dòng)光譜技術(shù)，其因超靈敏、極具特異性和對(duì)生物分子的低檢測極限而引起了相當(dāng)大的關(guān)注3；據(jù)報(bào)道，與傳統(tǒng)拉曼光譜相比，SERS的系宗平均拉曼信號(hào)提高了8個(gè)數(shù)量級(jí)，使其基本上能夠檢測單個(gè)分子4。SERS現(xiàn)象利用強(qiáng)烈的局部倏逝波(一種電磁場，可通過表面電漿子的光學(xué)激發(fā)而在金屬表面和接合處產(chǎn)生)來獲得表面所吸附的分子的拉曼光譜或“標(biāo)志性特征(signature)”。傳統(tǒng)上，SERS測量是對(duì)具有“拉曼活性”的單獨(dú)的純化合物進(jìn)行，這些化合物定位于在倏逝波有效范圍內(nèi)的適當(dāng)金屬表面上。通常使用諸如金或銀等貴金屬作為SERS表面，但也可以使用諸如銅、鐵、鈷、鎳、鈀和鉑等其它過渡金屬5。由于倏逝波的傳播從形成波的邊界開始隨距離呈指數(shù)衰減，SERS測量通常對(duì)定位于金屬表面20nm內(nèi)的化合物進(jìn)行3,6，不過已有報(bào)道稱在最多120nm的距離處有SERS增強(qiáng)7。重要的是，由于入射光子的拉曼位移與所研究的分子結(jié)構(gòu)有直接關(guān)系，SERS技術(shù)具有高度選擇性，并且每種分子都具有可量化的獨(dú)特的拉曼標(biāo)志性特征。因此，SERS基本上可用于確定化合物的身份(通過將所測得的SERS光譜與參比SERS光譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較)并測量其濃度。因此，通過提供被檢測分子的身份的定量信息，用SERS檢測生物分子(包括生物標(biāo)志物)可以潛在地大大提高診斷性測定的靈敏度和特異性，同時(shí)還提供了更低的檢測極限。然而，當(dāng)應(yīng)用于不同分子的復(fù)雜混合物時(shí)，源自該混合物的不同組分的重疊SERS光譜使得在沒有進(jìn)行一些預(yù)先分離或劃分步驟的情況下鑒定和定量該混合物中單個(gè)組分的任務(wù)基本不可能完成；這種考慮迄今一直在限制著SERS在醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用。許多研究已經(jīng)表明，微流控(micro-fluidics)技術(shù)與SERS的組合可以用于檢測痕量爆炸物8。還已經(jīng)報(bào)道，SERS可用于各種應(yīng)用，包括檢測污染物和DNA，并且已經(jīng)設(shè)計(jì)出了能夠準(zhǔn)確檢測非常低濃度的血糖的SERS納米生物傳感器9,10。一些學(xué)術(shù)小組已經(jīng)試圖通過將SERS與作為特定分子的分離和富集基質(zhì)的適體(aptamer)結(jié)合來增強(qiáng)SERS的檢測能力11,12。適體是結(jié)合特定靶分子并且在靶分析物的存在下折疊為3D構(gòu)象的寡聚核酸或肽13。特別是，DNA適體是高度穩(wěn)定的核酸類多聚物，其可以以高親和力和高度辨識(shí)的方式結(jié)合蛋白、核酸、糖、脂質(zhì)和小分子；因此，它們的分子識(shí)別性質(zhì)與抗體相當(dāng)，并可能超過抗體，同時(shí)由于其更小的物理尺寸(DNA適體長度通?！?00nt，其分子量≤35kDa)而可能比抗體與SERS更相容。DNA適體通常通過使用體外選擇方法生成，并且通常表現(xiàn)出比抗體更大的對(duì)熱和濕度的耐受性，這是因?yàn)槠漭^小的尺寸、磷酸二酯鍵的內(nèi)在穩(wěn)定性，而且因?yàn)槠湓陧憫?yīng)于同種抗原的存在時(shí)通常采取可逆的折疊構(gòu)象。Cho等11使用基于適體的SERS傳感器來檢測凝血酶。在他們的方法中，首先將亞甲基藍(lán)標(biāo)記的抗凝血酶適體物理吸附至金納米顆粒上；在亞甲藍(lán)標(biāo)記的適體位于金表面附近時(shí)，可出現(xiàn)亞甲基藍(lán)(具有拉曼活性的染料)的SERS。然而，在凝血酶的存在下，所述抗凝血酶適體發(fā)生了構(gòu)象變化，這種構(gòu)象變化削弱了與金表面的物理締合，使得所述適體-分析物復(fù)合物(因此使得亞甲基藍(lán)標(biāo)記)擴(kuò)散離開該表面，并淬滅了SERS信號(hào)。因而，認(rèn)為所產(chǎn)生的亞甲基藍(lán)SERS信號(hào)減少間接地指示了適體與凝血酶結(jié)合11。在一個(gè)不同的方法中，Huh和Erickson12首次用拉曼活性染料FITC標(biāo)記了蛋白質(zhì)加壓素；當(dāng)FITC標(biāo)記的加壓素結(jié)合了固定化的抗加壓素適體時(shí)，F(xiàn)ITC標(biāo)記被帶到表面的附近，使得可測量FITC染料的強(qiáng)SERS信號(hào)，從而給出加壓素與適體結(jié)合的間接數(shù)據(jù)12。值得注意的是，上述兩種適體-SERS測定法均涉及從金表面上置換帶拉曼標(biāo)記的適體11或使帶拉曼標(biāo)記的蛋白與固定化的適體結(jié)合12。因此從根本上說，這兩種方法均監(jiān)測拉曼標(biāo)記的移動(dòng)，而不是直接監(jiān)視特定的適體-配體捕獲事件本身。因此，這些測定不提供適體所結(jié)合的分析物的身份的相關(guān)信息，而只是提供已經(jīng)結(jié)合了某物質(zhì)的信息，所以與現(xiàn)有的ELISA測試或其他熒光檢測技術(shù)在信息內(nèi)容上沒有根本區(qū)別。Neumann等14描述了對(duì)由適體與靶分子(例如蛋白質(zhì)或有機(jī)配體)結(jié)合引起的適體構(gòu)象變化的SERS類檢測。在這項(xiàng)工作中，Neumann等人證明，存在于C6-烷基硫醇自組裝單層(“SAM”，“適體-SAM”)上的未結(jié)合的熱變性適體的SERS光譜可再現(xiàn)地以適體的腺嘌呤環(huán)呼吸模式為主導(dǎo)，但注意到在結(jié)合特定配體時(shí)，適體-SAM的SERS光譜以再現(xiàn)性明顯較差的模式改變14。于是Neumann等致力于通過測量未結(jié)合的熱變性適體-SAM的適體-SAMSERS光譜、然后確定所產(chǎn)生的適體-SAMSERS光譜在配體結(jié)合時(shí)發(fā)生的再現(xiàn)性明顯喪失，來推測靶分子與固定化的適體的結(jié)合14。利用圓二色光譜，Neumann等證明，例如在抗可卡因適體-SAM中，特定靶分子可卡因可以誘導(dǎo)出可測量的構(gòu)象變化，但這種變化也可由相關(guān)但不同的分子苯佐卡因和咖啡因誘導(dǎo)14。因此，正如之前一樣，Neumann等的SERS法不能對(duì)適體-分析物復(fù)合物本身的身份提供直接的光譜信息；相反，Neumann等只是推斷某物質(zhì)已經(jīng)結(jié)合了適體-SAM(例如其實(shí)例中的可卡因、苯佐卡因或咖啡因)并誘導(dǎo)出適體-SAMSERS光譜的再現(xiàn)性明顯較差的變化。仍然需要檢測和測量復(fù)雜生物樣品中給定分析物的量，所述生物樣品例如可還包含能夠與給定分析物交叉反應(yīng)從而在其他測定中產(chǎn)生假陽性數(shù)據(jù)的其他分子。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
因此，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種鑒定生物樣品中的分析物分子的方法，所述方法包括以下步驟：利用分析物特異性適體將所述分析物分子捕獲在表面上，測量所得到的特異性適體-分析物復(fù)合物的SERS光譜和SERS信號(hào)強(qiáng)度，和將所測得的SERS光譜與參比SERS光譜數(shù)據(jù)庫比較，從而驗(yàn)證所捕獲的分析物分子的身份。還可以將所測得的SERS信號(hào)強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，從而對(duì)所捕獲的分析物的豐度進(jìn)行定量。本發(fā)明因此提供了一種新型的基于適體的SERS檢測技術(shù)，該技術(shù)通過產(chǎn)生與已結(jié)合至適體的分析物的身份有關(guān)的鑒定和定量用光譜信息來直接監(jiān)測適體-分析物捕獲事件。根據(jù)該發(fā)明，測量在表面上形成的適體-分析物復(fù)合物的可再現(xiàn)SERS光譜，并將該光譜信息直接用于推導(dǎo)出與特定的適體-分析物復(fù)合物的身份有關(guān)的定量信息，因此，基于利用適體-分析物復(fù)合物的拉曼光譜對(duì)所捕獲的分析物分子身份的驗(yàn)證，能夠區(qū)分真、假陽性。所述生物樣品可以是其中所述分析物只是多種其他組分中的一種組分的復(fù)雜生物樣品。所述適體可以是DNA適體。所述分析物分子可以是蛋白、肽、核酸、脂質(zhì)、糖脂、糖、麻醉劑、藥物、完好的細(xì)胞、細(xì)菌病原體或病毒病原體。優(yōu)選的是，所述分析物分子可以是指示受試對(duì)象的感染、疾病或醫(yī)學(xué)狀況的分析物，或者可以是麻醉劑化合物或其代謝物。所述表面可包含兩親性分子的自組裝單層(SAM)，并且所述SAM可以直接或間接地被所述適體分子衍生化(derivatized)。所述適體可直接附著在所述SAM的兩親性分子上，或可以直接附著在所述表面上并被SAM包圍。所述SAM可以以共價(jià)方式被覆有低聚乙二醇分子層。所述低聚乙二醇分子可具有暴露的末端，并且其中的約1％～80％可以直接或間接地被適體分子衍生化。所述適體可存在于所述表面上的未衍生化的低聚乙二醇聚合物層之上。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種傳感器，所述傳感器用于從復(fù)雜生物樣品中捕獲所關(guān)注的分析物以測量所捕獲的分析物的SERS光譜，所述傳感器包括：附著在基體的金屬(例如，金或銀)表面上的兩親性分子的自組裝單層(SAM)，和對(duì)所關(guān)注的分析物具有特異性的適體；其中，所述SAM被覆有與所述SAM的兩親性分子結(jié)合的低聚乙二醇分子層。所述SAM的兩親性分子中的一部分可以直接或間接地被適體分子衍生化。本發(fā)明還包含了包括本發(fā)明的傳感器的檢測器。所述檢測器適當(dāng)?shù)剡€可包含激光器和SERS檢測器。附圖說明圖1顯示了AgFON表面上的6-巰基己醇SAM的偏移SERS光譜。(a)制備SAM后立即獲取的SERS光譜；(b)制備SAM后2.5周獲取的SERS光譜。注意，需要將信號(hào)相對(duì)于光譜(a)放大200倍才能觀察到相似特征；(c)制備SAM之后14周獲取的SERS光譜。注意，其代表相對(duì)于光譜(a)有10倍信號(hào)放大。圖2顯示了Oligo1官能化的AgNP表面的SERS光譜。(a)在如Y軸所示的不同的陰極電勢下獲取的偏移SERS光譜；(b)在如Y軸所示的陽極階梯電壓下隨后獲得的偏移SERS光譜。圖3顯示了在同一Oligo1官能化的AgNP表面上間隔6個(gè)月獲取的兩個(gè)偏移SERS光譜。這些光譜在相對(duì)于Ag/AgCl為-0.4V下獲取。圖4顯示了在結(jié)合Oligo2之前和之后獲取的Oligo1官能化的AgNP表面的偏移SERS光譜。作為參考，還偏移顯示了AgNP表面上的脫氧腺苷單磷酸酯的SERS光譜。圖5顯示了在結(jié)合了亂序Oligo3后獲取的Oligo1官能化的AgNP表面的SERS光譜。該偏移光譜在如Y軸所示的相對(duì)于Ag/AgCl的不同陰極電勢下獲取。圖6顯示了在如Y軸所示的相對(duì)于Ag/AgCl的不同陰極電勢下獲取的Oligo1官能化C12-SAM衍生化的AgNP表面的SERS光譜。(a)與互補(bǔ)Oligo2溫育后獲取的偏移SERS光譜；與亂序Oligo3溫育后獲取的偏移SERS光譜。圖7顯示了在AgNP表面上為區(qū)分活細(xì)菌而獲取的偏移的可再現(xiàn)SERS光譜。這些SERS光譜可用于形成參比SERS光譜的代表性數(shù)據(jù)庫。(a)金黃色葡萄球菌(S.aureus)的SERS光譜；(b)大腸桿菌的SERS光譜；(c)表皮葡萄球菌(S.epidermis)的SERS光譜；(d)蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)的SERS光譜。圖8是典型的AgFON表面的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像。圖9是在銀表面上形成適體官能化的SAM的示意圖(R-NH2＝5’-氨基修飾的DNA適體)。圖10是適體官能化SAM衍生化的AgFONSERS傳感器表面的示意圖。圖11是描繪具有可再現(xiàn)3D結(jié)構(gòu)的位于適體官能化SAM衍生化的AgFON表面上的適體-分析物復(fù)合物的示意圖。圖12是用于實(shí)時(shí)監(jiān)測麻醉劑血漿濃度的SERS生物傳感器的設(shè)置的示意圖。圖13是放置在流動(dòng)池中的SERS生物傳感器的示意圖。圖14是與SERS生物傳感器連接的微流控系統(tǒng)的示意圖。圖15是在尖端具有SERS傳感器的纖維光學(xué)探針的示意圖。具體實(shí)施方式本文描述了一種基于適體的SERS檢測技術(shù)，該技術(shù)通過產(chǎn)生與已結(jié)合了適體的分析物的身份有關(guān)的光譜學(xué)信息來直接監(jiān)測適體-分析物捕獲事件。測量了在表面上形成的適體-分析物復(fù)合物的可再現(xiàn)SERS光譜，并將該光譜信息直接用于推導(dǎo)出與特定的適體-分析物復(fù)合物的身份有關(guān)的鑒定和/或定量用信息。這使得能夠在對(duì)復(fù)雜生物樣品的定量分析物測定中區(qū)分真、假陽性。所要檢測的分析物可以是大分子，例如蛋白質(zhì)(例如γ-干擾素、結(jié)核分枝桿菌6kDa早期分泌抗原[ESAT-6]、前列腺特異性抗原、惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)乳酸脫氫酶、簇連蛋白)、肽(例如胰島素、NMDA受體肽、B-型利尿鈉肽)、核酸(例如結(jié)核分枝桿菌rpoB基因片段(包括其抗藥性編碼突變形式)、HIV病毒RNA、惡性瘧原蟲基因組DNA片段、鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)DNA片段、甲型流感病毒RNA)、脂質(zhì)(例如膽固醇、分枝菌素、分枝菌酸、結(jié)核菌醇雙結(jié)核蠟酸酯)、糖脂(例如脂阿拉伯甘露聚糖、脂多糖、鞘氨醇、半乳糖神經(jīng)酰胺硫酸酯)、糖(例如Thomsen-Friedenreich抗原、葡萄糖)、麻醉劑(例如二異丙酚、地西泮、硫噴妥、嗎啡、芬太尼、瑞芬太尼、利多卡因)、藥物(例如伊馬替尼、吉非替尼、依法韋倫、利福平、青蒿素、甲基苯丙胺)，或者可以是完好的細(xì)胞(例如惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax)、布氏錐蟲(Trypanosomabrucei)、循環(huán)癌細(xì)胞)、細(xì)菌病原體(例如結(jié)核分枝桿菌、鼠傷寒沙門菌、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenza)、大腸桿菌、幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumonia)、單核細(xì)胞增生利斯特菌(Listeriamonocytogenes)、霍亂弧菌(Vibriocholerae))或病毒病原體(例如B或C亞型的HIV-1、甲型流感病毒、乙型肝炎病毒、登革熱病毒、人乳頭狀瘤病毒)。在特定實(shí)施方式中，分析物是二異丙酚或脂阿拉伯甘露聚糖。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，分析物在分離狀態(tài)下具有固有的強(qiáng)SERS光譜(即分析物本身具有拉曼活性)(例如葡萄糖、乳酸脫氫酶、二異丙酚、DNA、RNA、吉非替尼、6-硫鳥嘌呤、吉西他濱、完好的結(jié)核分枝桿菌、完好的HIV-1病毒粒子)，不過還可以對(duì)其他分析物執(zhí)行該方法。分析物可以存在于包含復(fù)雜混合物的生物樣品(例如血液(包括全血和血漿)、唾液、痰、尿、腦脊液或糞便)中，其中所關(guān)注的分析物只是許多組分之一。對(duì)樣品中的分析物的鑒定和/或定量例如可以用來診斷或監(jiān)測疾病、感染或醫(yī)學(xué)狀況(例如肺結(jié)核、瘧疾、HIV病毒/艾滋病)，或可用來監(jiān)控對(duì)患者的麻醉藥施用。自組裝單層(SAM)是兩親性分子的有組織層，其中所述分子的一端(“頭部基團(tuán)”)顯示出對(duì)表面的特殊親和力15。通常，在本發(fā)明的SAM中，表面可以是金屬，例如金、銀、銅、鐵、鈷、鎳、鈀或鉑，并且頭部基團(tuán)可以是巰基。優(yōu)選地，所述表面可以是金或銀納米顆粒，或可以是被覆金膜或銀膜的納米球。除了頭部基團(tuán)外，SAM的兩親性分子還包含可在末端具有官能團(tuán)的疏水性尾部。所述官能團(tuán)的實(shí)例包括N-羥基琥珀酰亞胺酯、環(huán)氧化物、胺、羧酸、酰肼或氨基氧基基團(tuán)。在頭部基團(tuán)與表面結(jié)合時(shí)，兩親性分子的疏水尾部經(jīng)歷緩慢的2D自組織。疏水性尾部一般可以是烷基鏈，長度通常為約6至約16個(gè)碳。例如，所述烷基鏈的長度可為6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個(gè)碳。所得的SAM的有序化程度取決于許多因素，包括烷基鏈的長度：烷基鏈越長，組織程度越高并且SAM的穩(wěn)定性越高。良好形成的SAM通常對(duì)溫度、溶劑和電勢顯示出高穩(wěn)定性。良好形成的SAM例如可以由11-巰基十一醇、12-巰基十二烷酸或16-巰基十六烷酸的溶液制備，但用于制備SAM的其他試劑也是本領(lǐng)域公知的?？衫枚喾N分子來使該官能團(tuán)化學(xué)衍生化，包括但不限于以所關(guān)注的特定分析物為目標(biāo)的DNA適體、RNA適體或肽適體，以及抵抗大分子非特異性吸附的聚合物。該聚合物的實(shí)例包括乙二醇聚合物、乙烯亞胺聚合物、透明質(zhì)酸或羧甲基葡聚糖。這種化學(xué)衍生化通常在SAM形成后進(jìn)行，但在一些實(shí)施方式中，也可以在SAM形成之前對(duì)兩親性分子進(jìn)行化學(xué)衍生化15。SAM可以以共價(jià)方式被覆有低聚乙二醇分子層。所述低聚乙二醇聚合物的長度可以適當(dāng)?shù)厥?至12個(gè)乙二醇單元(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)單位長)，并且其可以與形成SAM的兩親性分子尾部的官能團(tuán)結(jié)合。例如，可以使用2-{2-[2-(1-巰基十一烷-11-基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙醇(HS-(CH2)11-(OC2H4)3-OH；1-巰基十一烷基-11-三(乙二醇)；HS-C11-EG3)、2-(2-{2-[2-(1-巰基十一烷-11-基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醇(HS-C11-EG4)、2-{2-[2-(2-{2-[2-(1-巰基十一烷-11-基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙醇(HS-C11-EG6)、11-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-十一烷-1-巰基(HS-(CH2)11-(OC2H4)3-OCH3；HS-C11-EG3-OMe)或11-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-十一烷-1-巰基(HS-C11-EG6-OMe)來形成共價(jià)被覆有低聚乙二醇分子層的穩(wěn)定SAM。在一些實(shí)施方式中，低聚乙二醇封端的烷基硫醇類SAM可以在由銀或金納米顆粒構(gòu)成的表面上或者在由被覆有銀膜或金膜的納米球構(gòu)成的表面上組裝。適當(dāng)?shù)?，適體可以使低聚乙二醇封端的SAM衍生化，從而使得形成SAM的底層兩親性分子中的一部分(適宜地為約1％～80％)直接或間接地被適體分子衍生化。在一些實(shí)施方式中，超過約2％、約5％或約10％且小于約70％、約60％或約50％的形成SAM的底層兩親性分子可以直接或間接地被適體分子衍生化。一些或全部低聚乙二醇分子可以在其暴露的末端被對(duì)所關(guān)注的分析物有特異性的適體衍生化。作為另一選擇，適體可以直接附著在SAM的兩親性分子上。在一些實(shí)施方式中，適體可以存在于未衍生化的低聚乙二醇聚合物層上。在其他實(shí)施方式中，適體可以直接附著在表面上，并且可以可選地被低聚乙二醇封端的SAM包圍。適體可以適當(dāng)?shù)厥菍?duì)所關(guān)注的分析物有特異性的DNA適體、RNA適體或肽適體。適體可以是先前描述的適體(如果有的話)或可通過本領(lǐng)域公知的方法來鑒定，例在US5,475,096和US5,843,653中描述的將固定化的分析物分子用于富集步驟的體外選擇法或SELEX(憑借指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化)法。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，所關(guān)注的分析物的適體無需限于以下實(shí)施例中描述的具有特定序列的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，使適體-低聚乙二醇-SAM表面與含有分析物的樣品接觸，從而在表面上形成適體-分析物復(fù)合物，之后可以可選地洗滌表面以除去未結(jié)合的物質(zhì)，并且可以可選地對(duì)表面施加可變電壓。然后測量所得到的適體-分析物復(fù)合物的SERS光譜和SERS信號(hào)強(qiáng)度。而后可以將所測得的SERS光譜與參比SERS光譜數(shù)據(jù)庫比較，從而確定所捕獲的分析物的身份。通過將所測得的SERS信號(hào)強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，可以確定原始樣品中該分析物的量。適體官能化的SAM充當(dāng)分隔層，使得分析物能夠在距離銀膜足夠近的地方被捕獲和富集，從而能夠基于電漿子共振而充分激發(fā)適體-分析物復(fù)合物，從適體-分析物復(fù)合物產(chǎn)生強(qiáng)SERS信號(hào)。適當(dāng)?shù)氖?，官能化的SAM(例如，低聚乙二醇封端的SAM)還可以減少對(duì)表面(以及對(duì)SAM本身)的非特異性大分子吸附，從而降低下游SERS光譜中的背景信號(hào)，由此提高了信噪比。根據(jù)本發(fā)明，通過使適體呈現(xiàn)于低聚乙二醇分子層之上并同時(shí)使適體保持在表面倏逝波的有效范圍內(nèi)，適體官能化的SAM最大限度地減少了適體和SAM表面之間的物理相互作用；在分析物與適體結(jié)合時(shí)，這種適體官能化的SAM產(chǎn)生了針對(duì)特定適體-分析物復(fù)合物的可再現(xiàn)的獨(dú)特SERS光譜，從而能夠確定已結(jié)合至適體的分析物的身份，并且能夠確定樣品中存在的分析物的量。在實(shí)時(shí)監(jiān)控諸如麻醉劑等分析物時(shí)，必須選擇適體以使分析物可以在對(duì)于所需的測量頻率而言適當(dāng)?shù)臅r(shí)間尺度上進(jìn)行可逆的結(jié)合/分離。這可以通過使用以下抗分析物適體來實(shí)現(xiàn)，該適體的結(jié)合親和力(Kd)在微摩爾至納摩爾范圍內(nèi)，從而使分析物從適體-分析物復(fù)合物上解離的半衰期(t1/2)的時(shí)間尺度為數(shù)分鐘，而不是數(shù)小時(shí)。圖10繪出了這樣一種官能化的生物傳感器表面，并且示出了處于解折疊狀態(tài)的適體。當(dāng)SERS生物傳感器與目標(biāo)分析物接觸時(shí)，如圖11所示，適體通常發(fā)生構(gòu)象變化以采取能夠以高親和力和特異性結(jié)合分析物分子的“活性”構(gòu)象。本發(fā)明的傳感器表面上的適體-分析物復(fù)合物的SERS光譜因被捕獲的分析物中以及結(jié)合有分析物的適體中的獨(dú)特振動(dòng)模式而產(chǎn)生。因此，適體-分析物復(fù)合物的SERS光譜與分離的適體或分析物的SERS光譜均不同。在優(yōu)選實(shí)施方式中，DNA適體的精確核苷酸序列以及適體-分析物復(fù)合物的精確的可再現(xiàn)的三維形狀導(dǎo)致了特定適體-分析物復(fù)合物的獨(dú)特的可極化性，并由此導(dǎo)致了獨(dú)特的振動(dòng)模式，從而產(chǎn)生具有獨(dú)特的可測量的SERS標(biāo)志性特征的適體-分析物復(fù)合物，而不論該分析物本身是否具有強(qiáng)的SERS標(biāo)志性特征?？梢詫⒗鼈鞲衅鞯募ぐl(fā)波長調(diào)至對(duì)每種特定適體-分析物復(fù)合物而言是最佳的。也可使用傅立葉變換法來對(duì)以寬譜光源照射納米顆粒時(shí)獲得的SERS光譜進(jìn)行去卷積(deconvolute)。因此，本發(fā)明的方法和傳感器在以下兩種情況中有效：所要檢測的分析物分子在分離狀態(tài)下具有固有的強(qiáng)SERS光譜(例如葡萄糖、乳酸脫氫酶、二異丙酚、DNA、RNA、吉非替尼、6-硫鳥嘌呤、吉西他濱、完好的結(jié)核分枝桿菌、完好的HIV-1病毒粒子)；和，所要檢測的分析物分子在分離狀態(tài)下沒有固有的強(qiáng)SERS光譜(例如ESAT-6、γ-干擾素、胰島素)。本發(fā)明的一個(gè)重要特征是能夠?qū)γ糠N適體-分析物復(fù)合物產(chǎn)生可再現(xiàn)的SERS光譜的能力。這在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中通過以下方式來實(shí)現(xiàn)：在金屬表面上提供形成良好(即高度組織化)的穩(wěn)定SAM，在所述形成良好的SAM上覆蓋能抵抗非特異性大分子吸附的聚合物層，并用適體使所述形成良好的SAM的一部分進(jìn)一步衍生化。因此，在適體捕獲特定的分析物時(shí)，抵抗大分子非特異性地吸附本發(fā)明的SAM表面的聚合物層還用于使所得到的適體-分析物復(fù)合物與SAM表面之間的非特異性非共價(jià)相互作用最小化，并使所得到的適體-分析物復(fù)合物能夠埋入或穿透SAM的程度最小化。這是重要的，因?yàn)檫m體-分析物復(fù)合物和SAM表面之間的非特異性非共價(jià)相互作用，以及適體-分析物復(fù)合物在SAM表面中或穿透SAM表面的任何包埋，都能夠以可再現(xiàn)性差的方式扭曲適體-分析物復(fù)合物的SERS光譜。在沒有這樣的扭曲的情況下，特定的適體-分析物復(fù)合物的SERS標(biāo)志性特征由此獨(dú)特地并可再現(xiàn)地代表了相關(guān)的適體-配體捕獲事件，并由此提供了與所關(guān)注的分析物的確切身份有關(guān)的定量信息。作為另一選擇，對(duì)每種適體-分析物復(fù)合物產(chǎn)生可再現(xiàn)SERS光譜的能力可以在本發(fā)明另一實(shí)施方式中通過以下方式來實(shí)現(xiàn)：用適體直接官能化金屬表面，然后用抵抗非特異性大分子吸附的良好形成的SAM包圍固定化的適體。在所述適體捕獲特定分析物時(shí)，周圍的SAM用于使所得的適體-分析物復(fù)合物與SAM表面之間的非特異性非共價(jià)相互作用最小化，并使所得到的適體-分析物復(fù)合物能夠埋入或穿透SAM的程度最小化。SAM還用于抵抗大分子對(duì)本發(fā)明的SAM表面的非特異性吸附。本發(fā)明的方法沒有使用指示劑。本發(fā)明的方法還可以在不使用將光束分為多個(gè)光束的結(jié)構(gòu)體的情況下和在不使用包括低分辨率衍射光柵色散元件以接受散射輻射并將其分為不同波長分量的裝置的情況下實(shí)施。本發(fā)明各方面的優(yōu)選特征在進(jìn)行必要的變更后如在各其他方面中所定義的相同。本發(fā)明其它特征和細(xì)節(jié)將通過以下非限制性實(shí)例而變得清楚可見。實(shí)施例1.自組裝單層衍生化的SERS傳感器表面的制備和分析為了制備自組裝單層(SAM)衍生化的SERS傳感器表面，將玻璃蓋片在食人魚洗液中清潔并在去離子水中洗滌。將600nm二氧化硅顆粒以5％(重量/體積)懸浮在去離子水中，然后滴涂在蓋片上。然后將玻璃蓋片上的所得的密集堆積的二氧化硅顆粒插入到氣相沉積室中，并以0.24nms-1的速率沉積200nm銀，從而形成適合于SERS的位于納米顆粒上的銀膜(AgFON)，基本如3所述。然后將復(fù)制的各AgFON表面浸沒在6-巰基己醇溶液(乙醇中的1mM溶液)或12-巰基十二烷酸溶液(乙醇中的1mM溶液；目錄號(hào)705241，SigmaAldrich)中，并于室溫溫育過夜，從而在納米結(jié)構(gòu)銀表面上形成各個(gè)自組裝單層。溫育后，用乙醇反復(fù)清洗SAM衍生化的AgFON表面。在納米結(jié)構(gòu)銀表面上制備SAM后，利用DeltaNu臺(tái)式色散型拉曼光譜儀(空氣冷卻的CCD，785nm二極管激光器)在14周的時(shí)間內(nèi)通過SERS定期監(jiān)測SAM的穩(wěn)定性。這些SERS測定清楚地表明，在2.5周的時(shí)間內(nèi)，“C6SAM”(即，使用6-巰基己醇形成的SAM)已大量降解(圖1)。然而，觀察到“C12SAM”(即，使用12-巰基十二烷酸形成的SAM)的SERS光譜(圖2)在相同時(shí)間內(nèi)是穩(wěn)定的(數(shù)據(jù)未示出)。這些數(shù)據(jù)符合基于文獻(xiàn)的預(yù)期，即，鏈越長的SAM應(yīng)當(dāng)越穩(wěn)定。因此值得注意的是，現(xiàn)有技術(shù)中，Neumann等經(jīng)由C6-連接體將DNA適體固定在銀表面上，并觀察到再現(xiàn)性差的適體SERS光譜，這可能是由于形成了不完整的、不均勻的和不穩(wěn)定的SAM。2.DNA官能化的膠體銀SERS傳感器表面的制備和分析加入1％(重量/體積)檸檬酸鈉溶液(10ml；純度>99.5％)來還原1mM的硝酸銀(500ml；純度>99.9％)沸騰溶液，從而產(chǎn)生銀納米顆粒(AgNP)膠體(預(yù)期NP直徑為30nm～60nm)。沸騰30分鐘后，離心收集膠體銀NP(3600×g，15分鐘)，然后以3份5μL的等分試樣滴涂在市售絲網(wǎng)印刷電極(SPE)的碳漆工作電極上，然后使電極完全干燥，從而產(chǎn)生適合于SERS的AgNP表面。將二硫化物形式的5’-巰基封端的DNA寡核苷酸(Oligo1；5’-HS-(CH2)6-TCCTGGGCTGGCGGGTCGCTTCC-3’(SEQIDNO:1))重懸在50mMNa2PO4pH7.4中至濃度為2mM，并與AgNP表面溫育過夜，從而經(jīng)由5’-巰基將寡核苷酸固定在納米結(jié)構(gòu)銀表面上；二硫鍵的還原(以釋放巰基)自發(fā)地原位出現(xiàn)。然后將SPE上的DNA官能化的膠體銀SERS傳感器表面插入電化學(xué)電池中，該電池由玻璃伏安電池以及固定絲網(wǎng)印刷電極的迷你USB適配器組成。該電極與恒壓儀偶接，然后以不同的陰極電位對(duì)固定化的寡核苷酸進(jìn)行電化學(xué)SERS測量，其中以100mV的增加幅度使在陰極方向上施加的電勢從0.0V至-1.0V逐步變化。絲網(wǎng)印刷電極包括內(nèi)置的反電極(碳)和參比電極(Ag/AgCl)，并且所有的電位都相對(duì)于Ag/AgCl測量。使用DeltaNu臺(tái)式色散型拉曼光譜儀(空氣冷卻的CCD，785nm二極管激光器)以中高功率(46.5mW)和30秒的采集時(shí)間獲得SERS光譜。所得到的SERS光譜清楚地表明該DNA寡核苷酸已經(jīng)固定在銀NP表面上，并且還表明，通過將陰極電勢改變?yōu)橄鄬?duì)于Ag/AgCl為負(fù)電勢，可以調(diào)節(jié)DNA官能化的AgNP表面的SERS信號(hào)強(qiáng)度，從而使固定化的DNA寡核苷酸的SERS光譜不再以檸檬酸的光譜為主導(dǎo)(圖2a)。當(dāng)隨后使電壓逐步陽極化時(shí)，保留了DNA官能化的AgNP表面的SERS光譜(圖2b)。隨后在6個(gè)月的時(shí)間內(nèi)定期記錄固定化的DNA寡核苷酸的SERS光譜，在此期間沒有觀察到信號(hào)的明顯衰減(圖3)，這表明DNA官能化的膠體銀SERS傳感器表面是穩(wěn)定的。3.利用DNA官能化SAM衍生化的SERS傳感器表面對(duì)結(jié)核分枝桿菌DNA片段進(jìn)行無標(biāo)記檢測將復(fù)制的DNA官能化的膠體銀SERS傳感器表面(利用Oligo1根據(jù)實(shí)施例2制備)與互補(bǔ)性DNA寡核苷酸(Oligo2；5’-GGAAGCGACCCGCCAGCCCAGGA-3’(SEQIDNO:2)；在50mMNa2PO4pH7.4中為2mM)或與亂序序列DNA寡核苷酸(Oligo3；5’-ACCGAGCCAGGCAGCCAGGGCAC-3’(SEQIDNO:3)；在50mMNa2PO4pH7.4中為2mM)在室溫下溫育1小時(shí)，以使DNA雜交。然后按照實(shí)施例2的方式為每種DNA官能化SAM衍生化的SERS傳感器表面記錄SERS光譜。所得光譜顯示，通過SERS，可以以無標(biāo)簽并且無擴(kuò)增的方式檢測到Oligo2(其序列源自結(jié)核分枝桿菌的IS6110基因組DNA序列，并且與固定化的Oligo1的序列完美互補(bǔ))與固定化的Oligo1的雜交(圖4)。然而，SERS光譜還表明，可觀察到Oligo3的非特異性結(jié)合，據(jù)推測是因?yàn)镺ligo3與AgNP表面的直接物理吸附(圖5)。為了消除這一非特異性結(jié)合，將DNA官能化的膠體銀SERS傳感器表面(利用Oligo1根據(jù)實(shí)施例2制備)在12-巰基十二烷酸溶液(乙醇中的1mM溶液)中于室溫溫育過夜，從而形成自組裝單層(SAM)，其回填在納米結(jié)構(gòu)銀表面上；該“C12SAM”包圍但未替代預(yù)先固定化的Oligo1分子，從而產(chǎn)生了適合于SERS的DNA官能化SAM衍生化的AgNP表面。隨后將復(fù)制的DNA官能化C12SAM衍生化的膠體銀SERS傳感器表面與Oligo2或Oligo3(DNA濃度和緩沖液如前所述)在室溫下溫育1小時(shí)，以使DNA雜交。然后記錄每種上述DNA官能化SAM衍生化的SERS傳感器表面的SERS光譜。所得光譜表明，通過SERS可以以無標(biāo)簽且無擴(kuò)增的方式檢測到Oligo2與固定化的Oligo1的序列特異性雜交(圖6a；注意～730cm-1和～1328cm-1的峰是雜交的寡核苷酸的特征)，但再不能觀察到Oligo3的非特異性結(jié)合(圖6b；注意～730cm-1和～1328cm-1的峰消失)，據(jù)推測這是因?yàn)镃12SAM現(xiàn)在阻止了Oligo3與AgNP表面的物理吸附。此外，還觀察到在DNA官能化C12SAM衍生化的膠體銀SERS傳感器表面上與固定化的Oligo1雜交的Oligo2的SERS光譜在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中和在復(fù)制的傳感器表面上可以再現(xiàn)。此外，在尿或似尿緩沖液中進(jìn)行雜交時(shí)，可以記錄到Oligo2與固定化的Oligo1雜交的等同的SERS光譜，這表明尿液中存在的其它無機(jī)分子(例如氯離子)或生物分子(例如，任何非互補(bǔ)性經(jīng)腎DNA片段)不會(huì)干擾在這種DNA官能化C12SAM衍生化的膠體銀SERS傳感器表面上進(jìn)行的SERS測定。利用這種DNA官能化C12SAM衍生化的膠體銀SERS傳感器系統(tǒng)，觀察到了以下結(jié)果：通過使陰極電壓逐步變?yōu)橄鄬?duì)于Ag/AgCl為負(fù)的電勢，由Oligo2與Oligo1的特異性雜交導(dǎo)致的SERS光譜的強(qiáng)度可增加3～5倍，但在該過程中SERS光譜中的峰的分布沒有變化(圖6a)。本實(shí)施例展示了在本發(fā)明的SAM衍生化表面上獲得DNA適體-分析物結(jié)合事件的可再現(xiàn)SERS光譜的能力。在納米結(jié)構(gòu)銀表面上，固定化的DNA寡核苷酸與良好形成的穩(wěn)定SAM的組合使得能夠均勻地呈現(xiàn)固定化的DNA寡核苷酸，從而使它們能夠在接近表面的地方選擇性地結(jié)合所關(guān)注的分析物(在此情況下，為互補(bǔ)性DNA寡核苷酸)，由此產(chǎn)生更強(qiáng)的可再現(xiàn)SERS信號(hào)。此外，SAM還用于降低納米結(jié)構(gòu)銀表面上的非特異性大分子吸附，從而提高了下游SERS光譜的信噪比，這也是對(duì)生物傳感器應(yīng)用的要求。4.利用DNA適體官能化SAM衍生化的SERS傳感器表面檢測惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶基本按照實(shí)施例3所述在絲網(wǎng)印刷電極上制備DNA官能化SAM衍生化的膠體銀SERS傳感器表面，不同之處如下：使用體外選擇的5’-巰基-抗惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶的DNA適體17(適體4；5’-HS-(CH2)6-GTTCGATTGGATTGTGCCGGAAGTGCTGGCTCGAAC-3’(SEQIDNO:4)；在50mMNa2PO4pH7.4中為2mM)來代替Oligo1；并使用1-巰基十一烷基-11-三(乙二醇)(HS-(CH2)11-(OC2H4)3-OH；HS-C11-EG3；ProChimiaSurfaces,Poland)(在乙醇中為1mM)來代替12-巰基十二烷酸。將重組惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶(pfLDH；在10mMHEPESpH7.5中為1μg/ml)在適體4官能化C11-EG3-SAM衍生化的AgNP表面上溫育30分鐘；然后用1ml10mMHEPESpH7.5洗滌該表面3次，以去除未結(jié)合的pfLDH，并按前述方式記錄SERS光譜。然后將所記錄的光譜與參比SERS光譜數(shù)據(jù)庫比較，以確認(rèn)所捕獲的生物分子的身份。該實(shí)施例中，低聚乙二醇封端的C11SAM增強(qiáng)了對(duì)傳感器表面上的非特異性大分子吸附的抗性，同時(shí)DNA適體提供了對(duì)pfLDH蛋白的特異性識(shí)別；這些的組合使得能夠測量所得適體-分析物復(fù)合物的可再現(xiàn)SERS光譜，這包括獲自疑似瘧疾患者的血液或血漿樣品中的pfLDH被適體所捕獲的情況。由于產(chǎn)生分析物-特異性適體的體外選擇程序通常可鑒定數(shù)種能夠選擇性地緊密結(jié)合目標(biāo)分析物的獨(dú)特核酸序列，因此還可以利用替代性的經(jīng)體外選擇的5’-巰基-抗惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶DNA適體(例如5’-HS-(CH2)6-GAACTCATTGGCTGGAGGCGGCAGTACCGCTTGAGTTC-3’(SEQIDNO:5),17)來代替適體4以用于對(duì)惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶進(jìn)行基于SERS的檢測。5.利用RNA適體官能化SAM衍生化的SERS傳感器表面檢測病毒病原體基本按照實(shí)施例4所述在絲網(wǎng)印刷電極上制備RNA官能化SAM衍生化的膠體銀SERS傳感器表面，并作如下改變：使用5’-巰基-抗gp120RNA適體(適體5；5’-HS-(CH2)6-GGGAGGACGAUGCGGAAUUGAGGGACCACGCGCUGCUUGUUGUGAUAAGCAGUUUGUCGUGAUGGCAGACGACUCGCCCGA-3′(SEQIDNO:6))18來代替抗惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶的DNA適體；如前文所述，使用1-巰基十一烷基-11-三(乙二醇)形成回填的SAM以包圍固定化的RNA適體。注意，在適體5中，將所有胞嘧啶(C)和尿嘧啶核苷分別替換為2′-脫氧-2’-氟-胞嘧啶和2′-脫氧-2’-氟-尿嘧啶，以提供對(duì)核酸酶的抗性18。將完好的HIV假病毒的懸浮液在適體5官能化C11-EG3-SAM衍生化的AgNP表面上溫育30分鐘，然后用1ml10mMHEPESpH7.5洗滌該表面3次，以去除未結(jié)合的HIV假病毒，并按照前文所述記錄可再現(xiàn)的SERS光譜。然后將所記錄的光譜與參比SERS光譜數(shù)據(jù)庫比較，從而確認(rèn)所捕獲的病毒病原體的身份。在該實(shí)例中，低聚乙二醇封端的C11SAM增強(qiáng)了對(duì)傳感器表面上的非特異性大分子吸附的抗性，同時(shí)DNA適體提供了對(duì)HIV假病毒表面上的gp120蛋白的特異性識(shí)別；這些因素的組合使得能夠測量所得適體-HIV假病毒復(fù)合物的可再現(xiàn)SERS光譜，這包括獲自疑似HIV感染患者的血液或血漿樣品中的HIV假病毒被適體所捕獲的情況。如前述，可使用顯示出充分親和力和特異性的體外選擇的其他抗gp120RNA適體來代替適體5，例如5’-HS-(CH2)6-GGGAGGACGAUGCGGACAUAGUAAUGACACGGAGGAUGGAGAAAAAACAGCCAUCUCUUGACGGUCAGACGACUCGCCCGA-3’(SEQIDNO:7)18。6.利用DNA適體官能化SAM-衍生化的SERS傳感器表面來檢測完好的細(xì)菌病原體基本按照實(shí)施例5所述在絲網(wǎng)印刷電極上制備DNA官能化SAM衍生化的膠體銀SERS傳感器表面，并作如下改變：使用體外選擇的5’-巰基-抗CFP10.ESAT6DNA適體(適體6；例如參考文獻(xiàn)19中的CSIR2.11或CSIR2.19)來代替抗惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶的DNA適體；如前文所述，使用1-巰基十一烷基-11-三(乙二醇)形成回填的SAM以包圍固定化的DNA適體。將活的結(jié)核分枝桿菌H37Rv的懸浮液(M.tb；106個(gè)桿菌/ml)在適體6官能化C11-EG3-SAM衍生化的AgNP表面上溫育30分鐘，然后用1ml10mMHEPESpH7.5洗滌該表面3次，以去除未結(jié)合的M.tb，并按照前文所述記錄可再現(xiàn)的SERS光譜。然后將所記錄的光譜與參比SERS光譜數(shù)據(jù)庫比較(例如見圖7)，從而確認(rèn)所捕獲的細(xì)菌病原體的身份。在該實(shí)例中，低聚乙二醇封端的C11SAM增強(qiáng)了對(duì)傳感器表面上的非特異性大分子吸附的抗性，同時(shí)DNA適體提供了對(duì)結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁中存在的CFP10ESAT6異源二聚體的特異性識(shí)別；這些因素的組合使得能夠測量所得的適體-M.tb復(fù)合物的可再現(xiàn)SERS光譜，這包括獲自疑似結(jié)核(TB)病患者的液化痰樣品中的M.tb桿菌被適體所捕獲的情況。根據(jù)TB疾病狀態(tài)，這種液化痰樣品可含有多達(dá)約104個(gè)M.tb桿菌/ml，并且還會(huì)含有可能表達(dá)ESAT6直系同源蛋白并因此可能被抗CFP10.ESAT6適體交叉識(shí)別的其他未鑒定微生物(例如，其它放線菌，例如非結(jié)核性分枝桿菌，或葡萄球菌，例如金黃色葡萄球菌)的混合物19；這些微生物可通過將所記錄的適體-分析物復(fù)合物的SERS光譜與參比數(shù)據(jù)庫比較而與M.tb區(qū)分開，從而在本發(fā)明的針對(duì)痰中M.tb桿菌的存在的SERS測定中能夠區(qū)分真、假陽性結(jié)果。7.制備DNA適體官能化SAM衍生化的SERS傳感器表面以檢測麻醉劑二異丙酚圖8示出了按實(shí)施例1所述制備的AgFON表面的掃描電子顯微鏡圖像。然后可以按如下方式在AgFON表面上形成混合適體官能化的SAM：在二甲亞砜中，將羧酸封端的六(乙二醇)十六烷硫醇(HSC16EG6CH2COOH)和三(乙二醇)十六烷硫醇(HSC16EG3OH)的50:50摩爾比混合物制備成最終濃度為0.1mgmL-1，并與AgFON表面在室溫下溫育過夜，從而形成SAM。然后將SAM衍生化的AgFON表面用去離子水洗滌，然后用乙醇洗滌，并在氮?dú)饬髦懈稍?。然后，將SAM衍生化的AgFON表面在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和NHS的溶液(在無水二甲基甲酰胺中的終濃度分別為0.2M和0.05M)中溫育2小時(shí)，從而將SAM的羧酸部分活化為N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯，然后用去離子水洗滌，然后用乙醇洗滌，并在氮?dú)饬髦懈稍铩Ｔ诟患襟E中利用固定化形式的麻醉劑化合物二異丙酚和標(biāo)準(zhǔn)SELEX程序13分離出抗二異丙酚的DNA適體。然后利用DNA合成來產(chǎn)生該抗二異丙酚DNA適體的5’氨基修飾形式。然后將100mM的5'-氨基修飾的抗二異丙酚DNA適體溶液與NHS活化的SAM衍生化的AgFON表面在磷酸鹽緩沖鹽水溶液(pH8.0)中于室溫下溫育過夜，從而在5'-氨基修飾的抗二異丙酚DNA適體與NHS活化的SAM之間形成酰胺鍵。最后，用去離子水洗滌在AgFON表面上形成的適體官能化的SAM，然后用乙醇洗滌，并在氮?dú)饬髦懈稍?。這個(gè)過程示于圖9中。8.對(duì)麻醉劑血漿濃度的實(shí)時(shí)監(jiān)測下面的實(shí)例描述了SERS生物傳感器在實(shí)時(shí)監(jiān)測麻醉劑(例如二異丙酚)中的體外應(yīng)用。圖12示出了將SERS生物傳感器用于此類應(yīng)用的設(shè)置。SERS生物傳感器可以封裝在諸如流動(dòng)池(2)等裝置中。在流量調(diào)節(jié)器(1)的控制下，使血液以合適的流速(10～100μl分鐘-1)流過流動(dòng)池。將包括拉曼光譜儀(3)(其帶有集成的激光源、檢測器和相關(guān)的光學(xué)器件以及嵌入式計(jì)算機(jī))的裝置放置在流動(dòng)池上，流動(dòng)池具有光學(xué)窗口以允許激發(fā)激光和所產(chǎn)生的SERS信號(hào)穿過，然后該信號(hào)被拉曼檢測器(3)檢測、在嵌入(3)中的板載計(jì)算機(jī)中得到處理、并在監(jiān)視器(4)上實(shí)時(shí)顯示。當(dāng)二異丙酚結(jié)合了抗二異丙酚適體時(shí)，適體的構(gòu)象發(fā)生變化。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測適體-二異丙酚復(fù)合物的SERS信號(hào)并將信號(hào)強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，可以高度準(zhǔn)確地確定血液中的二異丙酚濃度。對(duì)于這種應(yīng)用，適體-SAM分隔層必須可逆地結(jié)合二異丙酚，以使得接近AgFON表面的二異丙酚濃度在任何給定時(shí)間均通過建立動(dòng)態(tài)平衡而反映出當(dāng)時(shí)流經(jīng)傳感器流動(dòng)池的血樣中的分析物濃度。此外，將所測得的SERS光譜與參比SERS光譜數(shù)據(jù)庫比較，可以確認(rèn)所測量的分析物的身份。圖13示出了在上述麻醉劑實(shí)時(shí)檢測系統(tǒng)實(shí)例中提到的流動(dòng)池和封裝的SERS生物傳感器的細(xì)節(jié)。通過流動(dòng)池上的光學(xué)窗口，單光路將激光激發(fā)與生物傳感器偶接，并將來自生物傳感器的SERS信號(hào)與檢測器偶接。位于激發(fā)激光波長中心的陷波濾波器可以減少背散射的激光激發(fā)。還可以采用“正面(head-on)”設(shè)置，其中激發(fā)路徑來自流動(dòng)池底部，并且從頂部檢測SERS。這樣的設(shè)置的靈敏度將更高。常見的便攜式拉曼光譜儀系統(tǒng)將激光激發(fā)、相關(guān)光學(xué)器件和檢測器整合成單一裝置16。可以使用微流控系統(tǒng)代替流動(dòng)池，在微流控系統(tǒng)中，微流控芯片貼附在SERS生物傳感器上。如圖14所示，微流控系統(tǒng)以所需流速(例如20μl分鐘-1)將少量血液泵送到SERS生物傳感器上。另一種可能的設(shè)置是如圖15所示將SERS生物傳感器貼附至光纖電纜上。通過將這樣的光纖探針直接放入介質(zhì)(例如血液)中，可用該探針來檢測SERS，從而檢測所關(guān)注的分析物。參考文獻(xiàn)1.DhedaK,DavidsV,LendersL,等(2010)PLoSONE5,e9848。2.Beeton-KempenN,ShokoA&BlackburnJ(2008)Pure&AppliedChemistry80,1793–1802。3.DieringerJA,McFarlandAD,ShahNC,等(2006)FaradayDiscuss.132,9-26。4.HaynesCL&VanDuyne,RP(2003)J.Phys.Chem.B107,7426-7433。5.WuD-Y,RenB&TianZ-Q(2006)IsraelJ.Chem.46,317-327。6.BarbillonG,BijeonJ-L,BouillardJ-S,等(2008)J.Microscopy229,270-274。7.WeiW,LiS,MillstoneJE等(2009)Angew.Chem.121,4274-4276。8.MeinhartCD,PiorekB,LeeSJ,MoskovitsM,BanerjeeS&SantiagoJG(2009)WO/2009/020479。9.Shafer-PeltierKE,HaynesCL,GlucksbergMR&VanDuyneRP(2003)J.Am.Chem.Soc.125,588-593。10.LyandresO,YuenJM,ShahNC,等(2008)DiabetesTechnol.Ther.10,257-265。11.ChoH,BakerBR,Wachsmann-HogiuS,等(2008)Nanoletters8,4386-4390。12.HuhYS&EricksonD(2010)BiosensorsandBioelectronics25,1240–1243。13.KhatiM(2010)J.Clin.Pathol.63,480-487。14.NeumannO,ZhangD等(2009)Anal.Chem.81,10002-10006。15.LoveJC,EstroffLA,KriebelJK,NuzzoRG&WhitesidesGM(2005)Chem.Rev.105,1103-1169。16.DeltaNuRamansystems,www.deltanu.com。17.LeeS,SongK-M,JeonW,JoH,ShimY-B,BanC(2012)BiosensorsandBioelectronics35,291–296。18.ZhouJ,SwiderskiP,LiH,ZhangJ,NeffCP,AkkinaR,&RossiJJ(2009)NucleicAcidsRes.37,3094–3109。19.RotherhamLS,MaserumuleC,DhedaK,TheronJ&KhatiM(2012)PlosOne7,e46862。