相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2014年11月25日提交的美國臨時申請no.62/084,257的優(yōu)先權(quán)，將該申請的內(nèi)容通過參考以其整體并入本文中。

本發(fā)明涉及核酸的診斷和檢測方法，其用于使用直接擴增來檢測生物樣品中的有機體和基因檢測。

背景技術(shù)：

提供以下對本發(fā)明的背景的探討僅為幫助閱讀者理解本發(fā)明，不能視為描述或構(gòu)成本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。

在生物樣品如全血中的核酸檢測，通常需要在實施pcr之前從所述樣品提取和純化所述核酸。這是因為成分(例如血液樣品中的血紅蛋白)和保存劑(例如抗凝劑)能夠干擾pcr擴增(wang,j-t.,etal.,1992,j.clin.microbiol.30:750)。靶核酸特別難以檢測，因為所述核酸通常以比內(nèi)源性核酸如基因組dna或其轉(zhuǎn)錄的rna低得多的水平存在。從生物樣品提取有機體的核酸耗費時間，并涉及污染的高風(fēng)險。

考慮到分離和檢測生物樣品中的核酸分子涉及的高度的復(fù)雜性，日益期望不用任何上游核酸提取或大量的預(yù)處理步驟，直接檢測生物樣品中的核酸。已經(jīng)報道了用于對來自血液樣本的致病核酸直接pcr的幾種方法，如微波照射(ihhara,m.,etal.,1994,biotechniques17(4):726)，過氧化氫處理(rudbeck,l.anddissing,j.,1998,biotechniques25(4):588)，和氫氧化鈉處理(queipo-ortuna,m.,etal.,1999,biotechniques27(2):248)。然而，在尋求快速診斷的情況下，需要只涉及少數(shù)步驟和最小的技術(shù)要求，并仍然達到對生物樣品中的核酸的穩(wěn)定而成功的擴增的快速方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是基于允許直接擴增全血樣品中的核酸，而不用首先從樣品中提取所述核酸的方法的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的方法包括以下步驟：將全血樣品以高速旋轉(zhuǎn)，以除去在pcr擴增期間干擾或猝滅熒光發(fā)射的細胞碎片和物質(zhì)，直接擴增和檢測所述核酸分子的步驟。

因此，本發(fā)明提供用于鑒定所述靶核酸的存在或不存在的方法，其用于基因檢測或檢測生物樣品中的有機體。其中所述方法包括：(a)以足以使存在于所述樣品中的細胞碎片和熒光抑制劑沉淀的旋轉(zhuǎn)速度旋轉(zhuǎn)包含全血的生物樣品，降低所述樣品中的熒光干擾或猝滅；和(b)直接擴增和檢測所述樣品中的靶核酸。優(yōu)選所述旋轉(zhuǎn)速度在大于140×g至1500×g的范圍內(nèi)，并且所述生物樣品放置在離心式微流控盤(centrifugalmicrofluidicdisc)中。

在本發(fā)明的一個方面中，所述檢測步驟包括檢測在所述沉淀樣品中通過光路發(fā)射的可見信號。優(yōu)選所述可檢測信號為熒光發(fā)射。在本發(fā)明的另一個方面中，所述擴增步驟包括實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析。在優(yōu)選的實施方式中，所述靶核酸為dna。在另一個優(yōu)選的實施方式中，所述靶核酸為rna。

在本發(fā)明優(yōu)選的一個方面中，所述生物樣品為全血，而所述靶核酸來自血液中發(fā)現(xiàn)的一種或多種有機體。在一個方面，所述靶核酸為人類核酸。在另一個方面，所述靶核酸來自微生物。所述微生物可以為病毒，例如埃博拉病毒(ebolavirus)、馬爾堡病毒(marburgvirus)、流感病毒(influenzavirus)、呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus)、水痘帶狀皰疹病毒(varicellazostervirus)、單純皰疹病毒(herpessimplexvirus)、腸道病毒(enterovirus)、登革病毒(denguevirus)或它們的任何組合。在另一方面，所述微生物為革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌。在優(yōu)選的實施方案中，所述細菌為選自芽孢桿菌(bacillus)、博德特氏菌(bordetella)、疏螺旋體(borrelia)、李斯特菌(listeria)、埃希氏桿菌(escherichia)、沙門氏菌(salmonella)、彎曲桿菌(campylobacter)、梭狀芽胞桿菌(clostridium)、幽門螺桿菌(helicobacter)、分枝桿菌(mycobacterium)、葡萄球菌(staphylococcus)、彎曲菌(camplobacter)、腸球菌(enterococcus)、奈瑟氏菌(neisseria)、志賀氏菌(shigella)、鏈球菌(streptococcus)、弧菌(vibrio)、耶爾森菌(yersinia)和假單胞菌(pseudomonas)或它們的任何組合中的一種或多種。優(yōu)選所述細菌為炭疽桿菌。在再一個實施方案中，所述微生物為真菌。所述細胞碎片可以包括裂解的和完整的紅細胞。上述一般描述和詳細描述為示例性和說明性的，旨在提供對要求保護的本發(fā)明的進一步說明。為了詳細理解本發(fā)明，結(jié)合附圖參考對優(yōu)選實施方式的以下詳細描述。其他對象、優(yōu)點和新穎特征基于本發(fā)明的以下詳細描述對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。

附圖說明

圖1示出了高速旋轉(zhuǎn)對檢測人工產(chǎn)物的影響。從收集在edta管中的全血樣品(反應(yīng)體積的10％)擴增炭疽桿菌(bacillusanthracis)染色體靶標(biāo)，每個反應(yīng)50個拷貝(copy)。上圖中的樣品表示未處理的樣品，而下圖表示如實施例1所述的在23℃以約900×g旋轉(zhuǎn)off-board10分鐘的樣品。圖1示出在旋轉(zhuǎn)的樣品中，在5-30之間的循環(huán)所述人工產(chǎn)物消失。

圖2為實施例2中所述的離心式微流控盤的照片。顯示了示例的單獨孔(頂部)和所述盤(底部)的俯視圖。左側(cè)的盤使用測定定義運行，所述測定定義為在整個測定期間以約1500rpm(約140×g)旋轉(zhuǎn)所述樣品的標(biāo)準(zhǔn)化的方法，而右側(cè)的盤使用高速定義運行，所述高速定義為除了在以約1500rpm(約140×g)的標(biāo)準(zhǔn)速度旋轉(zhuǎn)樣品的光學(xué)讀取步驟以外，在整個測定中以約5000rpm(1500×g)旋轉(zhuǎn)樣品。在所述標(biāo)準(zhǔn)速度盤中，在整個孔可以觀察到血液顆粒，而在所述高速盤中，所述血液顆粒被沉淀于孔的周邊，留下清晰的在孔的中央的光路。

圖3示出了在優(yōu)化高速旋轉(zhuǎn)測定參數(shù)期間，從全血中檢測來自炭疽桿菌的細菌染色體靶標(biāo)的結(jié)果。樣品使用兩種不同的高速和持續(xù)時間運行。在運行的開始，樣品以2500rpm(780×g)旋轉(zhuǎn)6分鐘(a)或以3500rpm(1500×g)旋轉(zhuǎn)2分鐘(b)，接著在運行的剩余時間以約1500rpm(約140×g)的標(biāo)準(zhǔn)速度旋轉(zhuǎn)。示出了通過改變初始旋轉(zhuǎn)速度和持續(xù)時間的擴增曲線和平均ct值。

圖4示出了使用vhf高速旋轉(zhuǎn)測定參數(shù)進行的、來自全血的rna病毒埃博拉萊斯頓(rnavirusebolareston)的擴增。

圖5示出了在對來自全血的mthfr1298雜合子樣品進行的遺傳測定中，高速旋轉(zhuǎn)對熔點曲線下的面積值的影響。

使用包括引物和用于亞甲基四氫葉酸還原酶(mthfr)基因中的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms)的hybeacon^tm探針的反應(yīng)混合物，制備了兩個相同的通常盤(universaldisc)。所述反應(yīng)包括8μl的反應(yīng)混合物加上2μl的全血或者緩沖液作為樣品，或者9μl的反應(yīng)混合物加上1μl的全血或緩沖液。兩個盤使用獨立參數(shù)運行：一個進行所述標(biāo)準(zhǔn)pcr然后是熔融分析程序(灰條)[meltanalysisprotocol(greybars)]，而另一個進行所述標(biāo)準(zhǔn)程序，但在所述pcr循環(huán)和所述熔融分析步驟之間添加了高速旋轉(zhuǎn)步驟(黑條)。在大多數(shù)血液樣品中所述高速旋轉(zhuǎn)提高了所述熔點曲線下的面積值，導(dǎo)致陽性樣品和陰性樣品之間的熒光強度差異增大。

圖6示出了全血中的mthfr1298雜合子樣品檢測的熔點曲線。使用了標(biāo)準(zhǔn)速度旋轉(zhuǎn)(上圖)和高速旋轉(zhuǎn)(下圖)參數(shù)。與標(biāo)準(zhǔn)速度相比，高速旋轉(zhuǎn)導(dǎo)致雜合子測定的尖峰分離(sharppeakdifferentiation)。

發(fā)明詳述

本文公開涉及用于鑒定生物樣品中靶核酸的存在或不存在的方法，其不用先從所述生物樣品中分離、提取和純化所述核酸。本文公開的方法基于以下意想不到的發(fā)現(xiàn)：對全血樣品施用高離心力，導(dǎo)致所述樣品中存在的可能干擾所述pcr反應(yīng)化學(xué)或熒光的發(fā)射的細胞碎片和物質(zhì)發(fā)生沉淀，使得可以成功實現(xiàn)對所述全血樣品的實時pcr擴增。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)樣品進行旋轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)速度，可以使那些可能(i)抑制來自所述樣品的可檢測信號的發(fā)射和/或檢測，(ii)干擾或猝滅聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)化學(xué)本身，和/或(iii)阻塞可檢測信號在實時pcr測定期間傳播通過的光路，的細胞碎片在樣品內(nèi)沉淀，從而允許對靶核酸有效擴增并清晰樣品通過的光路，使得可以檢測到可見擴增信號。結(jié)果，本文公開的方法允許在全血樣品中檢測核酸，而不用從所述樣品提取所述核酸。

在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明利用配備有消耗性的直接擴增盤(directamplificationdisc)的3mintegratedcycler。通過將所述消耗性盤整合到3mintegratedcycler中實現(xiàn)的高旋轉(zhuǎn)速度，導(dǎo)致全血樣品中的細胞碎片進行移動并沉淀在所述消耗性盤的周邊，從而使得分離細胞碎片并對所述全血樣品成功實時pcr擴增，所述細胞碎片包括通常會導(dǎo)致所述pcr反應(yīng)猝滅或干擾熒光發(fā)射的裂解的和完整的紅細胞和熒光抑制劑。優(yōu)選所述相對離心力為約0×g～約1500×g。

在其他實施方案中，將高離心力施用到在其上放置所述全血樣品用于測試的復(fù)合緊密盤平臺(multiplexedcompactdiscplatform)，并通過以高角速度例如1500×g進行旋轉(zhuǎn)而分離所述細胞碎片。

定義

本文所用的術(shù)語“dna”意指包含與在rna中發(fā)現(xiàn)的核糖相反(opposeto)的脫氧核糖的核酸分子。

本文所用的術(shù)語“rna”意指包含與在dna中發(fā)現(xiàn)的脫氧核糖相反的核糖的核酸分子。本文所用的rna意指所有種類，或包括信使rna(mrna)、核糖體rna(rrna)、轉(zhuǎn)移rna(trna)以及具有調(diào)節(jié)功能的smallrna類的rna。所述“smallrna類”具有特定含義，指在細菌中具有管家或調(diào)節(jié)作用的非翻譯rna?！皊mallrna類”不是rrna或trna。

本文所用的術(shù)語“靶核酸”意指作為樣品中檢測的靶的任何核酸分子或片段。在一些實施方案中，靶核酸為病毒、細菌或真菌來源。在其他實施方案中，所述靶核酸分子為人源。靶核酸可以是dna或rna分子。

本文所用的術(shù)語“循環(huán)”或“熱循環(huán)”意指，使用實驗室設(shè)備，利用使用預(yù)編程的升高和降低的溫度循環(huán)的引物延伸反應(yīng)來擴增核酸序列的片段的任何技術(shù)。熱循環(huán)的實例包括但不限于：pcr、實時pcr和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-pcr)。

本文所用的術(shù)語“逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”或“rt-pcr”意指，用于利用作為rna序列的拷貝的序列合成和擴增dna分子的任何技術(shù)。rt-pcr在檢測rna種類如在基因表達的定量分析中有用，也在生產(chǎn)用于在克隆、拷貝dna文庫構(gòu)建、探針合成、原位雜交中的信號擴增中使用的rna的dna拷貝中有用。

本文所用的術(shù)語“試劑混合物”或“反應(yīng)混合劑”或“反應(yīng)混合物”意指，具有進行逆轉(zhuǎn)錄和/或逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、或?qū)崟r聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)需要的所有要素的組合物，包括但不限于聚合酶和分別具有針對診斷靶rna或dna的序列的特異性的引物。

本文所用的術(shù)語“擴增混合物”是用于核酸擴增反應(yīng)的試劑的混合物，但不含引物或樣品。擴增混合物包括緩沖液、dntp、和dna聚合酶。擴增混合物還可以進一步包含mgcl2、kcl、非離子型和離子型去污劑中的至少一種。

本文所用的術(shù)語“擴增主混合物”包括擴增混合物和用于擴增靶核酸的引物，但不包含要擴增的樣品。

本文所用的術(shù)語“試劑-樣品混合物”意指含有試劑混合物加樣品的混合物。

本文所用的“引物”意指合成或天然存在的寡核苷酸，當(dāng)置于互補鏈的合成由聚合酶進行催化的條件下時，所述寡核苷酸能夠作為沿著模板鏈的核酸合成或復(fù)制的起始點發(fā)揮作用。在逆轉(zhuǎn)錄的情況下，引物由核酸組成并基于rna模板引導(dǎo)。在pcr的情況下，引物由核酸組成并基于dna模板引導(dǎo)。

本文所用的術(shù)語“dna聚合酶”意指在脫氧核糖核苷酸聚合成dna鏈中幫助催化的任何酶。dna聚合酶作用為向新形成的鏈的3'末端添加游離核苷酸，導(dǎo)致所述新鏈在5'-3'方向延長。

本文使用的“”意指一種用于實時pcr的方法。在該方法中，在所述pcr反應(yīng)混合物中包括與擴增的所述核酸區(qū)域進行雜交的探針。所述探針包括供體和猝滅熒光團，所述供體和猝滅熒光團在所述探針的任一端并且彼此足夠接近，以使所述供體的熒光被所述猝滅劑吸收。然而，當(dāng)所述探針與所述擴增片段雜交時，所述taq聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性對所述探針切割，從而允許所述供體熒光團發(fā)射可被檢測的熒光。

本文所用的“裂解”意指促進獲取或釋放所述細胞rna或dna的、對細胞壁或病毒顆粒的擾動或改變。完全破壞或細胞壁的破裂都不是裂解的本質(zhì)要求。

本文所用的術(shù)語“循環(huán)閾值”或“ct”意指，在熱循環(huán)期間，由產(chǎn)物形成導(dǎo)致的熒光的增加達到了高于背景信號的顯著和可檢測的水平的循環(huán)。

本文所用的術(shù)語“直接擴增”意指，不用事先純化、提取或濃縮，從所述樣品中擴增靶核酸的核酸擴增反應(yīng)?！把h(huán)閾值”或“ct”是在pcr反應(yīng)中靶的濃度的相對量度。除所述靶的濃度外，有多種因素影響ct的絕對值。然而，來自反應(yīng)混合物或儀器的、會改變與ct計算相關(guān)聯(lián)的熒光測量的人工產(chǎn)物，將導(dǎo)致所述ct值發(fā)生與模板無關(guān)的變化。

本文所用的術(shù)語“提取”意指從在樣品中存在的其他(非核酸)材料中除去核酸的任何操作。這樣的操作包括但不限于：機械或化學(xué)裂解、添加去污劑或蛋白酶、或沉淀和除去非核酸如蛋白質(zhì)。

本文所用的術(shù)語“干擾物質(zhì)”意指樣品中不是靶核酸的任何物質(zhì)。這樣的干擾物質(zhì)包括合成物質(zhì)和生物物質(zhì)。這樣的合成物質(zhì)包括化學(xué)品和藥品。這樣的生物物質(zhì)包括血液、尿液、蛋白質(zhì)和其他生物分子。

本文所用的術(shù)語“熒光抑制劑”意指可以實質(zhì)上干擾或猝滅熒光發(fā)射的細胞成分、細胞碎片和物質(zhì)。

本文所用的術(shù)語“旋轉(zhuǎn)速度”或“旋轉(zhuǎn)速”或“旋轉(zhuǎn)速”或“旋轉(zhuǎn)速”意指，在每個時間單位中完整旋轉(zhuǎn)、轉(zhuǎn)動、循環(huán)或繞中心點轉(zhuǎn)動的次數(shù)。優(yōu)選所述相對離心力為約140×g～約1500×。

本文所用的術(shù)語"擴增"或"進行擴增"包括用于復(fù)制靶核酸、由此增加所選核酸序列的拷貝數(shù)的方法。擴增可以是指數(shù)性的或線性的。靶核酸可以是dna或rna。以此方式擴增的序列形成“擴增子”。雖然下文描述了示例性的涉及用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)來擴增的方法，本領(lǐng)域還已知大量其他方法用于擴增核酸(例如等溫方法、滾環(huán)方法等)。技術(shù)人員會理解，這些其他方法可以用于代替pcr方法或與其一起使用。參見例如saiki,"amplificationofgenomicdna"inpcrprotocols,innis等,eds.,academicpress,sandiego,ca1990,pp13-20；wharam等,nucleicacidsres.2001jun1；29(11):e54-e54；hafner等,biotechniques2001apr；30(4):852-860；zhong,etal.,biotechniques2001,30(4):852-6,858,860.zhong,等,biotechniques2001,30(4):852-6,858,860。

如本文所用的，在檢測來自可檢測標(biāo)記的信號以確定樣品中靶核酸存在的內(nèi)容中，所有術(shù)語“檢測”不需要該方法提供100％靈敏度和/或100％特異性。眾所周知的是，“靈敏度”是當(dāng)人具有靶核酸時測試為陽性的概率，而“特異性”是當(dāng)人不具有靶核酸時測試為陰性的概率。優(yōu)選為至少50％的靈敏度，而至少60％、至少70％、至少80％、至少90％和至少99％明顯是更優(yōu)選的。優(yōu)選為至少50％的特異性，而至少60％、至少70％、至少80％、至少90％和至少99％明顯是更優(yōu)選的。檢測還涵蓋了具有假陽性和假陰性的測定。假陰性率(falsenegativerates)可以是1％、5％、10％、15％、20％或甚至更高。假陽性率(falsepositiverates)可以是1％、5％、10％、15％、20％或甚至更高。

本文所用的術(shù)語“樣品”或“測試樣品”可以包含臨床樣品、分離的核酸、或分離的微生物。在優(yōu)選的實施方案中，從生物來源獲取樣品(即“生物樣品”)，所述生物來源如收集自受試者的組織、體液、或微生物。樣品來源包括但不限于痰(經(jīng)處理的或未經(jīng)處理的)、支氣管肺泡灌洗液(bal)、支氣管洗滌液(bw)、血液、全血、體液、腦脊液(csf)、尿液、血漿、血清、或組織(例如活檢材料)。優(yōu)選的樣品來源包括鼻咽拭子(nasopharyngealswabs)、傷口拭子(woundswabs)、和鼻洗滌液(nasalwash)。本文所用的術(shù)語“患者樣品”意指獲取自尋求疾病的診斷和/或治療的人的樣品。

本文所用的術(shù)語“引物-探針檢測系統(tǒng)”意指用于實時pcr的方法。該方法利用雙功能性分子(此處稱為引物-探針)，其含有通過聚合酶阻斷基團共價連接至探針元件的pcr引物元件。此外，每個引物-探針分子含有熒光團，其與猝滅劑相互作用以降低背景熒光。本文所用的引物-探針可以包含帶有5’延長探針尾(其包含發(fā)夾結(jié)構(gòu))的3'引物，其具有熒光團/猝滅劑對。在pcr過程中，通過包含六甘醇(hexethlyeneglycol)(heg)，阻斷了聚合酶延伸至探針尾中。在第一輪擴增過程中，3’靶標(biāo)特異性引物與靶核酸退火，并延伸，從而使引物-探針整合至新合成的鏈中，其具有新合成的針對5'探針的靶區(qū)域。在下一輪變性和退火過程中，引物-探針發(fā)夾環(huán)的探針區(qū)會與靶標(biāo)雜交，從而將熒光團和猝滅劑分離并產(chǎn)生可測量的信號。此類引物-探針描述于whitcombe等,naturebiotech17:804-807(1999)中。探針是示例性的引物-探針。

生物樣品

可以使用本文公開的方法檢測其中的靶核酸的生物樣品可以來自無菌和/或非無菌部位，并包括體液如全血、血漿、血清、無細胞血漿、尿液、腦脊液(csf)、滑液、胸膜液、心包液、眼內(nèi)填充液和可能含有核酸的糞便樣品。在一個實施方案中，所述生物樣品為全血。本文所用的“無細胞血漿”意指含有按體積低于1％細胞的血漿。

生物樣品可能被懷疑含有靶核酸。靶核酸可以是rna和/或dna。在一些實施方案中，靶核酸來自微生物如細菌、真菌或病毒。在其它實施方案中，所述靶核酸來自人。此外，可以從疑似被微生物如細菌、真菌或病毒感染的個體獲得生物樣品。在一些實施方案中，靶核酸可以是內(nèi)源核酸，例如基因或轉(zhuǎn)錄物(rna)。在一些實施方案中，靶核酸是基因或轉(zhuǎn)錄物或特定單核苷酸多態(tài)性(snp)的突變形式。

本文公開的方法優(yōu)選使用未處理的生物樣品(即，含有內(nèi)源性核酸的生物樣品；和/或未提取過核酸的生物樣品)，由此導(dǎo)致直接的、簡化的從樣品到答案的工藝。不過，如果將本文公開的檢測方法用于按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何方法從生物樣品純化的已分離的核酸(dna和/或rna)，也是有效的。

靶核酸

靶核酸可以是dna(包括基因組dna)或rna。此外，靶核酸可以是在微生物或人宿主中發(fā)現(xiàn)的任何核酸。dna包括例如來源于人、細菌種類、真菌和dna病毒的dna。適用于評價的病毒dna包括直接從所述病毒衣殼獲得的dna以及整合到宿主基因組中的dna。

可以作為靶核酸測定的rna類型包括rrna、mrna、轉(zhuǎn)移rna(trna)或其他的rna多核苷酸。rrna的種類包括5s、16s和23s多核苷酸，其可以含有一種或多種一組相關(guān)細菌特有的子序列。對特征序列的檢測能力是可變的，取決于要利用所述測定檢測的所述病毒或細菌的相關(guān)性水平。其他rna多核苷酸可用作靶rna。引物可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員設(shè)計，以在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用所述靶rna作為模板來引導(dǎo)拷貝dna的合成。

本領(lǐng)域技術(shù)人員也會知道，如何設(shè)計用于在pcr中使用所述拷貝dna作為模板擴增所述靶dna或靶rna的一對引物。在本領(lǐng)域中眾所周知的是，在pcr中同時使用的引物應(yīng)具有相似的雜交熔解溫度。

逆轉(zhuǎn)錄和實時pcr

核酸的擴增

生物樣品中的靶核酸可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法擴增。優(yōu)選使用pcr對感興趣的靶核酸進行擴增。在該方法中，將兩個以上相接或包括于感興趣的核酸的相反鏈、并與其退火的寡核苷酸引物，與其互補序列重復(fù)退火，由dna聚合酶(例如amplitaqgold聚合酶)進行延伸，并熱變性，使得所述靶核酸序列指數(shù)擴增。循環(huán)參數(shù)可以根據(jù)待延伸的所述核酸的長度而改變。根據(jù)本發(fā)明內(nèi)容，技術(shù)人員能夠設(shè)計和制備適于擴增靶序列的引物。在本發(fā)明中使用的所述擴增引物的長度取決于幾個因素，所述因素包括：所述核苷酸序列一致性和所述核酸在體外核酸擴增期間雜交或使用的溫度。為了確定特定序列同一性的擴增引物的優(yōu)選長度所需的考慮因素，為普通技術(shù)人員所熟知。例如，短核酸或寡核苷酸的長度可以與其雜交特異性或選擇性相關(guān)。

在檢測擴增的核酸產(chǎn)物之前不需要分離步驟的方法，通常稱為實時pcr或均相檢測。大多數(shù)實時方法是通過監(jiān)測熱循環(huán)期間的熒光變化來檢測擴增產(chǎn)物的形成。這些方法包括但不限于：duallabeled探針(appliedbiosystems,fostercity,calif.94404)、molecularbeacons(tyagis和kramerfr(1996)natbiotechnoi14:303-308)、greendye(molecularprobes,inc.eugene,oreg.97402-0469)。這些相同方法中的一些也可以用于擴增產(chǎn)物的終點檢測。這類方法的一個例子是greendye解離曲線分析。在解離曲線分析中，通過溫度以終段緩慢的方式升高并結(jié)合熒光監(jiān)測，可以檢測熔點，從而檢測到擴增產(chǎn)物的存在(ririe等,1997,anal.biochem.245:154-60)。

在本文方法中，靶核酸的存在可以通過逆轉(zhuǎn)錄(rt)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)來檢測。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一起使用時，可以在兩個步驟中連續(xù)進行，或者利用加至所述樣品的所有反應(yīng)組合物試劑一個步驟中一起進行。

在兩步法中，溫育逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)組合物中的樣品，以允許合成來自所述靶rna的dna拷貝。所述試劑混合物包含：與所述靶rna雜交來引發(fā)拷貝dna的合成的引物。此外，所述試劑混合物包含dntp、mgcl2、kcl、逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液。如果需要從多于一種靶rna制備dna拷貝，所述試劑混合物可以包含一個以上的引物。然后將所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到另一測定管，在其中根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方案進行pcr。pcr組合物通常包括一對引物，其從所述反轉(zhuǎn)錄模板起始合成dna的所需片段。此外，所述pcr混合物通常包含dntps、mgcl2、kcl、熱穩(wěn)定性dna聚合酶如taq聚合酶、聚合酶緩沖液。如果期望合成dna的多重片段，則可以包括多于一對的引物。也可以添加一條新引物，新引物會作為所述對的第二引物與原始rt引物進行擴增dna片段?？捎糜诓《緲悠返牧硗獾哪孓D(zhuǎn)錄酶包括但不限于：hiv逆轉(zhuǎn)錄酶(ambion)、transcriptor逆轉(zhuǎn)錄酶(roche)、thermoscript逆轉(zhuǎn)錄酶(invitrogen)?？梢允褂玫牧硗獾膁na聚合酶包括但不限于：pfu、vent和sequithermdna聚合酶(epicentre)。

在本發(fā)明的一個實施方案中，將生物樣品與rt-擴增混合物組合，使得rt和pcr可以在單次測定中進行。

無論所述rt-pcr是以兩個步驟還是一個步驟進行，rt步驟首先運行，并通常包括在約37℃～約70℃之間的溫度下的單溫度溫育。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，不同的溫度適合不同的rt酶和不同的引物。隨后的pcr反應(yīng)通常包括在約94℃～約97℃的初始溫育，約2～約15分鐘。此步驟用于使拷貝dna變性并激活熱活化的taq聚合酶。然后接著進行所述拷貝dna靶的多次循環(huán)擴增。在每個循環(huán)期間進行三個操作：靶標(biāo)變性、引物退火和引物延伸。靶標(biāo)變性通常發(fā)生于大于約90℃。引物退火溫度由反應(yīng)中使用的所述特異性引物的熔解溫度決定，引物延伸在取決于使用的所述熱穩(wěn)定聚合酶的約50℃～約72℃的溫度范圍下進行。當(dāng)引物的退火和延伸在相同溫度下進行時為雙溫度pcr，與此相比，在三個溫度pcr中，三個步驟的每一個在不同的溫度下發(fā)生。在擴增階段完成后，通常加上最終延伸時間以確保所有擴增產(chǎn)物的合成。

不經(jīng)單獨的前端試樣制備，將所述生物樣品直接裝入離心式微流控盤孔或室、或基因轉(zhuǎn)子盤室中，隨后在同一盤中進行逆轉(zhuǎn)錄和實時pcr擴增以及靶核酸的檢測(如果樣品中存在)。在樣品中，可以包含利用寡核苷酸引物和探針的內(nèi)部陽性擴增對照(ipc)。

在一些實施方案中，所述pcr為多重pcr反應(yīng)。所述集成熱循環(huán)儀可以以每秒＞5℃的速度加熱，以每秒＞4℃的速度冷卻，并且允許根據(jù)要延伸的擴增產(chǎn)物的長度改變循環(huán)參數(shù)。

旋轉(zhuǎn)平臺(rotaryplatform)技術(shù)

本文公開的方法可以使用任何具有旋轉(zhuǎn)平臺的熱循環(huán)儀進行，所述旋轉(zhuǎn)平臺能夠以高旋轉(zhuǎn)速度沿著繞中心點的彎曲路徑離心或旋轉(zhuǎn)樣品。所述旋轉(zhuǎn)速度必須足以將所述生物樣品或所述試劑-樣品混合物中的細胞碎片移動到樣品室內(nèi)的部分(優(yōu)選形成沉淀)，從而隔絕會抑制來自所述樣品的可檢測信號的發(fā)射和/或檢測、會干擾或猝滅聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)化學(xué)本身、和/或會阻礙可檢測信號在實時pcr測定期間傳播通過的光路的碎片。所述“高旋轉(zhuǎn)速度”意指大于140g的轉(zhuǎn)速。優(yōu)選所述相對離心力為約140×g～約1500×g。

在一些實施方案中，在擴增循環(huán)期間樣品被包含在離心式微流控盤的室中。本文所用的“離心式微流控盤”為圓盤，所述圓盤在熱循環(huán)儀內(nèi)在其軸上旋轉(zhuǎn)，并包括可以沉積生物樣品的室。示例性的離心式微流控盤為來自focusdiagnostics的直接擴增盤(8孔)和所述通常盤(96孔)，其與3m(st.paul，mn，usa)出售的3m^tmintegratedcycler熱循環(huán)儀一起使用。所述3m^tmintegratedcycler可以接收直接擴增盤，并對每個盤進行多測定。在一些實施方案中，生物樣品沉積在基因轉(zhuǎn)子盤中。優(yōu)選所述生物樣品為全血樣品。本文所用的“基因轉(zhuǎn)子盤”為離心機轉(zhuǎn)子插入件，其將管或其它能夠容納樣品和/或樣品擴增混合物的室保持于均勻溫度?；蜣D(zhuǎn)子盤的例子為與qiagenrotor-geneq熱循環(huán)儀一起使用的qiagenrotordiscs和/或genediscs。

在一些實施方案中，將全血樣品沉積在與沉積有試劑混合物的盤室分離的盤室(或孔)中。在該實施方案中，所述樣品和試劑混合物可以隨后在所述盤中組合，以允許擴增靶核酸(如果存在)。在一些實施方案中，將試劑混合物和樣品在沉積在離心式微流控盤或基因轉(zhuǎn)子盤中之前進行組合。在一些實施方案中，實時pcr擴增和檢測使用simplexadirect測定在直接擴增盤中進行，并在熱循環(huán)儀如3m^tmintegratedcycler中進行。另外，pcr擴增和檢測可以使用pall或genepoc診斷系統(tǒng)進行。

使用離心式微流控盤和相關(guān)聯(lián)的熱循環(huán)儀、基因轉(zhuǎn)子盤和相關(guān)聯(lián)的熱循環(huán)儀，或具有能夠產(chǎn)生這樣的旋轉(zhuǎn)速度的旋轉(zhuǎn)平臺的任何其它熱循環(huán)儀實現(xiàn)的旋轉(zhuǎn)速度，可用于從生物樣品沉淀細胞碎片。細胞碎片被隔離(優(yōu)選被沉淀)到樣品室的周邊。來自生物樣品的所述細胞碎片包括但不限于：裂解和完整的紅細胞、熒光抑制劑、和試劑，它們可以干擾或猝滅所述pcr反應(yīng)化學(xué)本身，或干擾在實時pcr測定期間讀取熒光發(fā)射所需的光學(xué)路徑。

為了直接檢測和擴增全血樣品中的靶核酸，需要增加離心式微流控盤或基因轉(zhuǎn)子盤的旋轉(zhuǎn)速度或轉(zhuǎn)速。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在正常操作條件下以由制造商設(shè)定的旋轉(zhuǎn)速使用3m^tmintegratedcycler時，不允許對來自全血患者樣品的成功的實時pcr擴增。

本發(fā)明涉及對系統(tǒng)參數(shù)的修改，其允許將所述碎片的沉淀用于成功擴增核酸，而不用從所述全血樣品中提取所述核酸。本發(fā)明還涉及在所述實時pcr測定的某些步驟期間的旋轉(zhuǎn)速，其經(jīng)過優(yōu)化和修飾以允許在每個循環(huán)確定實時pcr熒光發(fā)射之前清理所述光路。下表示出了實時pcr步驟中用于每個步驟的旋轉(zhuǎn)速?？梢栽趐cr循環(huán)參數(shù)的任何階段引入旋轉(zhuǎn)速(表1)。對快速旋轉(zhuǎn)而言，除了在讀取熒光之前，可以在每個循環(huán)中的整個運行期間進行(表1)，或者在所述退火/延伸步驟期間讀取熒光之前的pcr循環(huán)的任何階段進行(表2-4)。

表1:閥(valving)和旋轉(zhuǎn)(spinning)參數(shù)

*在混合前首先選擇閥門(valve)反應(yīng)混合物或樣品。優(yōu)先閥門可以改善穩(wěn)定的結(jié)果，特別是在檢測限度附近。

**旋轉(zhuǎn)速設(shè)置可以在pcr循環(huán)參數(shù)的各個階段引入。

表2:最終的用于炭疽桿菌(bacillusanthracis)的測定定義

表3:最終的病毒性出血熱(viralhemorrhagicfever)的測定定義

表4:最終用于凝血熔融測定的測定定義

本發(fā)明是用于直接pcr反應(yīng)的、能夠使用高旋轉(zhuǎn)速度去除細胞碎片和抑制劑的實時pcr系統(tǒng)的第一個報告。本文公開的方法證明，如實施例3所示，使用從全血直接擴增的人dna進行的熔融曲線分析，改善了檢測和一致性。

所述高速旋轉(zhuǎn)測定通過將離心式微流控盤，例如直接擴增盤的相對離心力從大約140×g增加到大約1500×g來執(zhí)行。對于具有不同半徑的離心式微流控盤或基因轉(zhuǎn)子盤，足以將細胞碎片充分沉淀/隔離所需的旋轉(zhuǎn)速度可能不同。一旦發(fā)現(xiàn)所述工藝有利，則可以在每個測定的基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化所述旋轉(zhuǎn)速參數(shù)。本發(fā)明公開的方法可以直接從任何生物樣品擴增核酸，而不用另外的提取和純化所述核酸的步驟。所述軟件控制了旋轉(zhuǎn)的速度，使得來自不同有機體的核酸可以在全血樣品中分離和檢測。旋轉(zhuǎn)的持續(xù)時間隨著所述旋轉(zhuǎn)的速度而變化。更高的轉(zhuǎn)速需要更短的旋轉(zhuǎn)周期。因此，以1500×g旋轉(zhuǎn)導(dǎo)致碎片在兩分鐘內(nèi)從所述樣品中完全分離?？梢栽诿總€測定基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化所述旋轉(zhuǎn)速參數(shù)。本發(fā)明人已成功應(yīng)用該方法來直接從全血中擴增核酸，從而用于炭疽桿菌的檢測、病毒性出血熱panel、登革熱血清分型測定，以及用來檢測單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,snp)。

在一些實施方案中，將所述3m^tmintegratedcycler或相當(dāng)?shù)膬x器，與直接擴增盤消耗品或相當(dāng)?shù)南钠芳爸苯踊瘜W(xué)(directchemistry)一起使用，來產(chǎn)生允許直接從生物樣品(例如全血試樣)中檢測dna和rna的提高的旋轉(zhuǎn)速度。成功檢測的實例包括但不限于：細菌病原體炭疽桿菌中的dna靶標(biāo)，以及rna病毒埃博拉和馬爾堡(marburg)。

可檢測信號

在本文公開的方法中，通過檢測通過擴增所述靶核酸(如果存在于樣品中)的信號產(chǎn)生來確定在全血樣品中靶核酸的存在或不存在。在核酸擴增過程中的可檢測信號發(fā)射是實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的標(biāo)志。因此，在一個實施方案中，對樣品進行實時pcr反應(yīng)，如果靶核酸存在于樣品中，則靶核酸的存在通過檢測可檢測標(biāo)簽來檢測。

實時pcr的一種通用方法是使用熒光探針，如探針、分子信標(biāo)和scorpions。在一些實施方案中，所述實時pcr反應(yīng)包括使用猝滅劑/供體探針檢測系統(tǒng)，例如pcr檢測系統(tǒng)。本文所用的“猝滅劑/供體探針檢測系統(tǒng)”意指用于實時pcr的方法，其中所述試劑主混合物包含與要擴增的靶核酸雜交的猝滅劑/供體探針。猝滅劑/供體探針(例如探針)包括在所述探針的任一端上的供體和猝滅劑熒光團，并且彼此足夠接近，使得所述供體的熒光被所述猝滅劑吸收。然而，當(dāng)所述探針與所述擴增片段雜交時，所述taq聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性對所述探針切割，從而允許所述供體熒光團發(fā)射可被檢測的熒光。

與檢測最終擴增產(chǎn)物的量的其他形式的定量逆轉(zhuǎn)錄酶pcr相比，實時pcr定量至所述模板的初始量，具有更多的特異性、靈敏度和可重現(xiàn)性。實時rt-pcr檢測不到所述擴增子的大小。采用的探針和分子信標(biāo)技術(shù)基于熒光猝滅原理，包括供體熒光團和猝滅部分。

在一些實施方案中，所述可檢測標(biāo)簽為熒光團。本文所用的術(shù)語“熒光團”意指吸收特定波長(激發(fā)頻率)的光并隨后發(fā)射更長的波長(發(fā)射頻率)的光的分子。本文所用的術(shù)語“供體熒光團”意指當(dāng)與猝滅劑部分非常接近時，向猝滅劑貢獻或轉(zhuǎn)移發(fā)射能量的熒光團。作為向所述猝滅劑部分貢獻能量的結(jié)果，所述供體熒光團本身將以特定發(fā)射頻率發(fā)射光，所述光少于在定位于附近的猝滅劑部分不存在時其所具有的光。

引物-探針如scorpions、或taqman和hybeacon探針可以用于根據(jù)本發(fā)明進行所述方法。也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員施用其他實時pcr熒光擴增技術(shù)。

可以使用本領(lǐng)域已知的方法可探測地標(biāo)記探針。其他有用的標(biāo)記包括，例如：在所述可見光譜的紅光區(qū)發(fā)出熒光的，并可以被猝滅劑如blackholequencher^tm(bhq^tm)、bhq-1、bhq-2和bhq-3有效地猝滅的熒光染料例如cy5α、cy3α、fitc、羅丹明、鑭(lanthamide)磷光體、德克薩斯紅、羧基熒光素?zé)晒鈭F如羥基熒光素(fam)、joe、呫噸染料如calfluorred(“cfr610”)和quasar所述標(biāo)簽可以連接到與要檢測的靶核酸雜交或結(jié)合的寡核苷酸探針。

在一些實施方案中，當(dāng)所述樣品在熱循環(huán)儀中旋轉(zhuǎn)時，讀取來自所述樣品的可檢測信號。所述可檢測信號在所述細胞碎片已經(jīng)沉淀或隔離之后通過清除的光路進行讀取，從而降低可能導(dǎo)致誤讀和/或屏蔽擴增曲線的背景熒光和不期望的擴增曲線變化。參見美國專利申請公開號2011/0117656和2012/0171677，其內(nèi)容全部并入本文。在一些實施方案中，來自沉淀樣品的所述可檢測信號在樣品旋轉(zhuǎn)降低之后不久進行讀取。優(yōu)選為，高速旋轉(zhuǎn)僅在熱循環(huán)之前進行，并且所述樣品在最佳讀取期間以低速(約140×g)旋轉(zhuǎn)，以允許在高速旋轉(zhuǎn)重新開始之前進行光學(xué)讀取。在供選擇的實施方案中，在整個測定期間，所述樣品以高速(1500×g)旋轉(zhuǎn)。

測定靈敏度

通過向所述測定中使用的所述緩沖液中加入一種或多種增加靈敏度的成分，可以增加若干使用未處理樣品的擴增測定的靈敏度。這些成分包括但不限于kcl、表面活性劑和白蛋白。在一些實施方案中，所述白蛋白為牛血清白蛋白。在一些實施方案中，所述表面活性劑為陽離子表面活性劑。通過提供額外的加熱，例如在添加所述試劑之前預(yù)熱樣品，也可以增加所述直接擴增測定的靈敏度。在一些實施方案中，可以通過將增加靈敏度的成分和額外的加熱組合來增加所述靈敏度。

實施例

大略描述的本文的方法通過參考以下實施例將更容易地理解，這些實施例僅為了說明而提供，本發(fā)明的方法和試劑盒不受其限制。

實施例1：全血的off-board旋轉(zhuǎn)試驗

進行了包括全血樣品的off-board離心的試驗。所述樣品在23℃，以900×g離心10分鐘。結(jié)果顯示，利用預(yù)旋轉(zhuǎn)的血液樣品的離心降低了背景熒光和不期望的擴增曲線的變化，而沒有預(yù)旋轉(zhuǎn)的血液樣品中，所述熒光背景沒有降低的變化(圖1)。

實施例2：離心式微流控盤高速旋轉(zhuǎn)對全血中病毒rna或細菌dna的檢測的影響

提高3mintegratedcycler系統(tǒng)上的離心式微流控盤的旋轉(zhuǎn)速度或旋轉(zhuǎn)速產(chǎn)生了意想不到的結(jié)果。使用專門設(shè)計的軟件，將所述旋轉(zhuǎn)速度或旋轉(zhuǎn)速控制于約140×g至約1500×g的范圍內(nèi)。如下所示，以每個測定為基礎(chǔ)進一步優(yōu)化了所述旋轉(zhuǎn)速參數(shù)。如下所示，本方法已成功應(yīng)用于在測定中直接從全血中擴增核酸來檢測炭疽桿菌、病毒性出血熱病毒panel，以及登革熱血清分型測定。

a.摻有登革病毒的血

將滅活的登革熱病毒稀釋在全血或pbs緩沖液中。相同的樣品，一種測定運行為在整個測定期間以約1500rpm(約140×g)旋轉(zhuǎn)所述樣品的標(biāo)準(zhǔn)化的方法，另一種測定運行為除了在以約1500rpm(約140×g)的標(biāo)準(zhǔn)速度旋轉(zhuǎn)樣品的光學(xué)讀取步驟以外，在整個測定中以約5000rpm(1500×g)旋轉(zhuǎn)樣品。

表5：旋轉(zhuǎn)速對所述登革熱病毒靶標(biāo)的ct值的影響

b.炭疽桿菌

將炭疽桿菌稀釋在全血中。相同的樣品，一種測定運行為在所述運行開始時將所述樣品以780×g旋轉(zhuǎn)6分鐘(較慢旋轉(zhuǎn))，另一種測定運行為在所述運行開始時將所述樣品以約5000rpm(1500×g)旋轉(zhuǎn)2分鐘(高速旋轉(zhuǎn))。在兩種情況下，在所述運行的剩余時間，樣品均以約1500rpm(約140×g)的標(biāo)準(zhǔn)速度旋轉(zhuǎn)。圖3示出了初始旋轉(zhuǎn)速對用于炭疽桿菌檢測的熒光強度和ct值的優(yōu)化的影響。

c.病毒性出血熱panel

將滅活的埃博拉萊斯頓病毒(ebolarestonvirus)稀釋在全血或pbs緩沖液中。相同的樣品使用能夠檢測埃博拉病毒和馬爾堡病毒并且區(qū)分埃博拉萊斯頓(ebolareston)病毒和埃博拉扎伊爾病毒(ebolazaireviruses)的試劑運行。將結(jié)果對于下述測定定義的運行進行比較，一種測定定義為在整個測定期間以約1500rpm(約140×g)旋轉(zhuǎn)所述樣品的標(biāo)準(zhǔn)化的方法，另一種的測定定義為除了在以約1500rpm(約140×g)的標(biāo)準(zhǔn)速度旋轉(zhuǎn)樣品的光學(xué)讀取步驟以外，在整個測定中以約5000rpm(1500×g)旋轉(zhuǎn)樣品。圖4示出了使用5000rpm的高旋轉(zhuǎn)速，來從所述埃博拉萊斯頓病毒中檢測病毒性出血熱的擴增曲線。

上述結(jié)果證明，直接從炭疽桿菌、病毒性出血熱panel和登革熱血清型的全血成功地擴增和檢測核酸。

實施例3：通常盤高速旋轉(zhuǎn)對全血中的人dna的擴增和熔融分析的影響

進行對與血栓形成相關(guān)的負責(zé)凝血的基因(如因子v、因子ii和mthfr基因)的突變的分子檢測，以確定高速旋轉(zhuǎn)對全血中的人類dna的檢測和擴增的影響。

使用包括引物和用于所述亞甲基四氫葉酸還原酶(mthfr)基因的單核苷酸多態(tài)性的hybeacon^tm探針的反應(yīng)混合物，制備了兩個相同的通常盤。所述反應(yīng)包括8μl的反應(yīng)混合物加上2μl的全血或者緩沖液作為樣品，或者9μl的反應(yīng)混合物加上1μl的全血或緩沖液。兩個盤使用獨立參數(shù)運行：一個進行所述標(biāo)準(zhǔn)pcr然后是熔融分析程序，而另一個進行所述標(biāo)準(zhǔn)程序，但在所述pcr循環(huán)和所述熔融分析步驟之間添加了高速旋轉(zhuǎn)步驟。如圖5所示，結(jié)果表明，所述高速旋轉(zhuǎn)在大多數(shù)血液樣品中增加了熔點曲線值下的面積，從而增加了陽性和無模板樣品之間的差異。在觀察從全血患者樣本中檢測mthfr1298雜合子的相似的實驗中，與標(biāo)準(zhǔn)速度相比，高旋轉(zhuǎn)的引入導(dǎo)致雜合子測定的尖峰分離(圖6)。

這些結(jié)果證明，改善了在全血中的任何微生物的核酸(包括但不限于：細菌、病毒和真菌)以及人類核酸的檢測和擴增。這些結(jié)果還顯示，高速離心全血樣品可降低背景熒光，消除細胞碎片例如裂解和完整的紅細胞，和降低熒光干擾和猝滅，并防止導(dǎo)致誤讀和/或屏蔽擴增曲線的不期望的擴增曲線變化。

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本文說明性地描述的發(fā)明，可以適當(dāng)?shù)卦谌鄙偃我灰鼗蛉我舛鄠€要素、任一限定或任意多個限定的條件的情況下實施，這些要素或限定條件的省略沒有在本文中具體公開。此外，本文采用的術(shù)語和表達方式用作描述性術(shù)語而非限定性術(shù)語，并且在對這些術(shù)語和表達方式的使用中并不意在將顯示和描述的特征及其部分的任何等效物排除在外，而是公認在本發(fā)明要求保護的范圍內(nèi)多種修改都是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本發(fā)明通過優(yōu)選的實施方案和最優(yōu)的特征來進行了具體公開，但在其中體現(xiàn)的對于本文公開的發(fā)明修改、改進和變化是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采取的，并且這些修改、改進和變化視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本文廣泛地且一般性地描述了本發(fā)明。落在一般性地公開內(nèi)的每個較窄的種類和亞類分組也形成本發(fā)明的一部分。這包括對本發(fā)明的一般性描述，以及附帶條件或從該類屬去除任何主題的否定性限制，無論切離的(excised)材料是否在本文具體記載。其他實施方案示于所附的權(quán)利要求書中。此外，當(dāng)本發(fā)明的特征或方面以馬庫什組群來描述時，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到本發(fā)明還由此以馬庫什組群的任何單個成員或成員亞組得以描述。