本發(fā)明提供治療、防御人乳頭瘤病毒相關(guān)腫瘤或癌癥以及誘導(dǎo)對人乳頭瘤病毒相關(guān)腫瘤或癌癥的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向受試者施用表達人乳頭瘤病毒抗原的重組李斯特菌的步驟。

背景技術(shù)：

人乳頭瘤病毒(hpv)相關(guān)口咽癌(hpvopc)在美國日益流行(從1988年到2004年增加225％)。hpvopc患者傾向于年輕化并且預(yù)后良好，與hpv陰性患者相比，死亡風險低69％。然而，大多數(shù)hpvopc患者都已是晚期，而標準的化療方案可導(dǎo)致嚴重的毒性。因此，具有良好預(yù)后的患者自相矛盾地處于更高的治療相關(guān)長期不良生活質(zhì)量結(jié)局的風險中。免疫療法通過逐漸減弱化療方案而具有降低毒性的潛力，并可能增強長期疾病控制。

hr-hpve6和e7蛋白在發(fā)育異常和癌中一致表達，分別破壞細胞周期調(diào)控蛋白p53和prb。發(fā)育異常和浸潤性惡性病變對e6和e7的強制性表達以及這些蛋白的病毒性來源使得它們成為hpv治療性疫苗的優(yōu)異靶標。

單核細胞增多性李斯特菌(listeriamonocytogenes)(lm)是一種食源性革蘭氏陽性菌，偶爾會在人類尤其是老年人、新生兒、孕婦和免疫低下個體中導(dǎo)致疾病。除了強烈激活先天免疫并誘導(dǎo)增強抗原呈遞細胞(apc)功能的細胞因子應(yīng)答外，lm還能夠在從吞噬溶酶體逃離后在apc的胞質(zhì)溶膠中復(fù)制，這主要是通過李斯特菌溶血素o(llo)蛋白的作用。這種獨特的胞內(nèi)生命周期使得由lm分泌的抗原可在mhci類和ii類分子的背景下加工和呈遞，從而導(dǎo)致強效的細胞毒性cd8⁺和th1cd4⁺t細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。

本發(fā)明通過提供綜合療法來解決具有人乳頭瘤病毒(hpv)相關(guān)口咽癌的患者中與治療相關(guān)的長期不良生活質(zhì)量結(jié)局這一問題，該療法包括單核細胞增多性李斯特菌免疫療法，從而通過逐漸減弱化療方案而降低毒性，并可能增強長期疾病控制。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在一個方面，本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)人受試者中的抗腫瘤或抗癌癥免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向所述受試者施用包含重組李斯特菌菌株的組合物的步驟，所述重組李斯特菌菌株包含重組核酸，所述核酸包含第一開放閱讀框，所述第一開放閱讀框編碼重組多肽，所述重組多肽包含融合至異源性抗原或其片段的llo蛋白的n末端片段，其中所述重組核酸還包含第二開放閱讀框，所述第二開放閱讀框編碼突變體prfa基因或代謝酶，從而誘導(dǎo)對腫瘤或癌癥的免疫應(yīng)答。在另一個實施例中，該免疫應(yīng)答降低所述受試者接受化療或放療的需要。在另一個實施例中，所述免疫應(yīng)答消除所述受試者接受化療或放療的需要。在另一個實施例中，所述免疫應(yīng)答通過允許用較低劑量的化療或放療治療患者而降低與向所述受試者施用化療或放療相關(guān)的副作用的嚴重性。

在另一方面，所述免疫應(yīng)答使得疾病的分期能夠下降，以使得更保守的治療選擇變得可用。

本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將由于以下詳細描述的實例和附圖而變得顯而易見。但是，應(yīng)當理解，該詳細描述和具體實例盡管指出了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，但是僅僅通過例證給出，因為本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改對閱讀了該詳細描述的本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。

附圖說明

以下附圖形成了本說明書的一部分，將它們包括進來以進一步說明本公開的某些方面，通過參考一個或多個這些附圖并結(jié)合本文提供的對具體實施例的描述可更好地理解本發(fā)明。本專利或申請文件包含至少一個用彩色表現(xiàn)的附圖。根據(jù)請求并支付必要的費用后，專利局將提供帶有彩色附圖的本專利或?qū)＠暾埞_的副本。

圖1.lm-e7和lm-llo-e7使用不同的表達系統(tǒng)來表達和分泌e7。通過將基因盒引入單核細胞增多性李斯特菌基因組的orfz域中來產(chǎn)生lm-e7(a)。hly啟動子驅(qū)動hly信號序列和llo的前五個氨基酸(aa)以及隨后的hpv-16e7的表達。b)通過以質(zhì)粒pgg-55轉(zhuǎn)化prfa-菌株xfl-7來產(chǎn)生lm-llo-e7。pgg-55具有驅(qū)動llo-e7非溶血性融合體的表達的hly啟動子。pgg-55也含有prfa基因，以選擇xfl-7在體內(nèi)對質(zhì)粒的保留。

圖2.lm-e7和lm-llo-e7分泌e7。使lm-gag(泳道1)、lm-e7(泳道2)、lm-llo-np(泳道3)、lm-llo-e7(泳道4)、xfl-7(泳道5)和10403s(泳道6)在luria-bertoni液體培養(yǎng)基中于37℃生長過夜。沉淀相等數(shù)目的細菌(通過600nm處吸光度od確定)，并將18ml的每種上清液進行tca沉淀。通過western印跡分析e7表達。用抗e7mab、隨后用hrp-偶聯(lián)的抗小鼠(amersham)探測該印跡，接著使用ecl檢測試劑顯影。

圖3.llo-e7融合體的腫瘤免疫抑制功效。顯示了腫瘤接種后第7、第14、第21、第28和第56天小鼠中以毫米計的腫瘤大小。未暴露的小鼠：空心圓圈；lm-llo-e7：實心圓圈；lm-e7：正方形；lm-gag：空心菱形；和lm-llo-np：實心三角形。

圖4.來自lm-llo-e7-免疫的小鼠的脾細胞在暴露于tc-1細胞時增殖。將c57bl/6小鼠用lm-llo-e7、lm-e7或?qū)φ誶lm菌株免疫和強化。在強化后6天收獲脾細胞，并以顯示的比率與經(jīng)照射的tc-1細胞一起鋪板。將細胞用³h胸苷脈沖處理并收獲。將cpm定義為(實驗cpm)-(無tc-1對照)。

圖5.a.在施用tc-1腫瘤細胞并隨后施用lm-e7、lm-llo-e7、lm-acta-e7或無疫苗(未暴露的)的小鼠中，脾中e7特異性的分泌ifn-γ的cd8⁺t細胞的誘導(dǎo)和浸潤腫瘤的數(shù)目。b.針對(a)描述的小鼠的脾和腫瘤中e7特異性的cd8⁺細胞的誘導(dǎo)和浸潤。

圖6.含有pest區(qū)域的李斯特菌構(gòu)建體在腫瘤中誘導(dǎo)更高百分比的e7特異性淋巴細胞。a.來自1個實驗的代表性數(shù)據(jù)。b.來自所有3個實驗的數(shù)據(jù)的平均值和se。

圖7a.傳代對重組李斯特菌疫苗載體的細菌負荷(毒力)的作用。上圖：lm-gag下圖：lm-llo-e7圖7b.傳代對脾臟中重組lm-e7的細菌負荷的作用。描繪了來自四只小鼠的每毫升脾勻漿的平均活細菌cfu。

圖8顯示了在施用經(jīng)傳代的lm-gag與未傳代的lm-gag后對于hiv-gag和llo而言的抗原特異性cd8⁺t細胞的誘導(dǎo)。將小鼠用10³個(a、b、e、f)或10⁵個(c、d、g、h)cfu的經(jīng)傳代的李斯特菌疫苗載體免疫，并分析抗原特異性t細胞。b、d、f、h：未傳代的李斯特菌疫苗載體。a-d：對mhci類hiv-gag肽的免疫應(yīng)答。e-h：對llo肽的免疫應(yīng)答。i：來自用10⁵個cfu經(jīng)傳代的lm-gag免疫的小鼠的脾細胞用來自hpve7的對照肽刺激。

圖9a顯示了在整個lb穩(wěn)定性研究中的質(zhì)粒分離。圖9b顯示了在整個tb穩(wěn)定性研究中的質(zhì)粒分離。圖9c顯示了tb穩(wěn)定性研究的定量。

圖10顯示了來自在lb中生長的細菌的活細菌氯霉素(cap)抗性和cap敏感性集落形成單位(cfu)的數(shù)量。深色條：cap⁺；白色條：cap^-。每個時間點的兩個深色條和兩個白色條代表重復(fù)樣。

圖11顯示了來自在tb中生長的細菌的活細菌cap抗性和cap敏感性cfu的數(shù)量。深色條：cap⁺；白色條：cap。每個時間點的兩個深色條和兩個白色條代表重復(fù)樣。

圖12.顯示了d133v突變區(qū)(箭頭)的實際色譜圖?；旌衔锉嚷试诶ㄌ栔惺境?。

圖13.adv451、452和453引物以及在反應(yīng)中擴增的prfa基因片段的位置的表示。

圖14.使用引物adv451和adv453的pcr反應(yīng)的特異性。

圖15.使用引物adv452和adv453的pcr反應(yīng)的特異性。

圖16.使用引物adv452和1ng初始量的dna進行pcr反應(yīng)來檢測野生型prfa序列的靈敏度。

圖17.使用引物adv452和5ng初始量的dna進行pcr反應(yīng)來檢測野生型prfa序列的靈敏度。

圖18.來自圖16中描繪的pcr的條帶的平均密度。

圖19.來自圖17中描繪的pcr的條帶的平均密度。

圖20.對使用引物adv452進行pcr反應(yīng)來檢測野生型prfa序列進行的驗證。

圖21.來自圖16中描繪的pcr的條帶的平均密度。

圖22.對lm-llo-e7中的d133vprfa突變的分析。a，用于密度測量技術(shù)的原始圖像；b，對圖像進行數(shù)字增強以有利于觀察低密度條帶。

圖23.顯示了用于施用lm-llo-e7疫苗(adxs-hpv)、用于樣品(腫瘤組織或血液)采集以及用于執(zhí)行各種測定的試驗方案。

圖24.對腫瘤樣品的蘇木精和伊紅(h&e)染色，顯示了嗜堿性淋巴細胞樣浸潤巢(白色箭頭)。

圖25.adxs-hpv疫苗接種后的腫瘤樣品的多重免疫熒光，顯示了致密的瘤內(nèi)cd8浸潤和基質(zhì)cd4浸潤。綠色＝cd4、粉色＝cd8、紫色＝cd68、黃色＝cd20。

圖26.elispot–直接分析(無再刺激和培養(yǎng))，顯示了adxs-hpv疫苗接種后hpv-e7應(yīng)答的增加>3倍。

圖27.elispot–直接分析(無再刺激和培養(yǎng))，顯示了采用非疫苗抗原h(huán)pv-e6和hpv-e2的情況下不存在疫苗接種后的應(yīng)答增加。

圖28a-b.ii期臨床試驗設(shè)計。圖28a顯示了研究中的各流程和樣品采集的總體時間軸(mo，月；pbmc，外周血單核細胞；tors，經(jīng)口腔機器人手術(shù)；wk，周)。圖28b顯示了各個hpvopc患者的流程和樣品采集計劃。第一列中的數(shù)字表示各個患者。v1和v2樣品在疫苗接種前抽取，v3在第一與第二疫苗施用之間抽取，而v4樣品在手術(shù)當天抽取。樣品v5-v9在指定的術(shù)后時間的隨訪從患者抽取。

圖29.elispot-直接分析，顯示了adxs-hpv疫苗接種后系統(tǒng)性hpv-e6和hpve7應(yīng)答增加。第一列指定elispot目標?？眨簾o肽刺激，e2：hpve2肽刺激(證實總體而言對hpv的t細胞應(yīng)答)，e6和e7：hpve6和e7肽分別刺激(與hpv發(fā)育異常相關(guān)的早期肽基因)；p/i：陽性對照。

圖30a-d.ifn-γ細胞內(nèi)細胞因子染色(ics)測定的概要，顯示了在adxs-hpv疫苗接種后e6和e7特異性ifn-γ分泌性cd4+和cd8+t細胞的誘導(dǎo)。圖30a顯示了e7特異性ifn-γ分泌性cd4+t細胞的誘導(dǎo)。圖30b顯示了e7特異性ifn-γ分泌性cd8+t細胞的誘導(dǎo)。圖30c顯示了e6特異性ifn-γ分泌性cd4+t細胞的誘導(dǎo)。圖30d顯示了e6特異性ifn-γ分泌性cd8+t細胞的誘導(dǎo)。

圖31a-d.ifn-α細胞內(nèi)細胞因子染色(ics)測定的概要，顯示了在adxs-hpv疫苗接種后e6-和e7特異性ifn-α分泌性cd4+和cd8+t細胞的誘導(dǎo)。圖31a顯示了e7特異性tnf-α分泌性cd4+t細胞的誘導(dǎo)。圖31b顯示了e7特異性tnf-α分泌性cd8+t細胞的誘導(dǎo)。圖31c顯示了e6特異性tnf-α分泌性cd4+t細胞的誘導(dǎo)。圖31d顯示了e6特異性tnf-α分泌性cd8+t細胞的誘導(dǎo)。

圖32a-c.hpv特異性應(yīng)答的概要。各表格第一列中的數(shù)字表示各個患者。圖32a顯示了在adxs-hpv疫苗接種后對e6或e7有響應(yīng)的患者。圖32b顯示了顯示出e7應(yīng)答的患者。圖32c顯示了顯示出e6應(yīng)答的患者。使用以下測試來測量應(yīng)答：exvivoeli、ifngeli、ifn-γelispot、ifngics、ifn-γ細胞內(nèi)細胞因子染色、tnfaics、tnf-α細胞內(nèi)細胞因子染色。

圖33.患者腫瘤的多重免疫熒光。圖33a顯示了疫苗接種前的腫瘤環(huán)境(tumormilieu)。圖33b顯示了疫苗接種前的腫瘤。圖33c顯示了adxs-hpv疫苗接種后腫瘤環(huán)境的致密的瘤內(nèi)cd8浸潤。圖33d顯示了adxs-hpv疫苗接種后減小的腫瘤大小。紅色＝cd8、黃色＝cd3、品紅色＝pd-1、綠色＝pd-l1。

圖34a-f.患者腫瘤的多重免疫熒光。圖34a-c顯示了疫苗接種前腫瘤環(huán)境的三個獨立樣品。圖34d-f顯示了在adxs-hpv疫苗接種前后在腫瘤環(huán)境中pd-l1表達的抑制和pd-1表達性細胞的浸潤。紅色＝cd8、黃色＝cd4、品紅色＝pd-1、綠色＝pd-l1。

圖35a-h.免疫熒光結(jié)果的初步定量，顯示了adxs-hpv疫苗接種前后cd4、cd8、pd-1和pd-l1的水平。圖35a顯示了在七個單獨的樣品中觀測到的cd4水平的變化。圖35b顯示了在七個單獨的樣品中觀測到的cd8水平的變化。圖35c顯示了在七個單獨的樣品中觀測到的pd-1水平的變化。圖35c顯示了在七個單獨的樣品中觀測到的pd-l1水平的變化。圖35e顯示了圖35a中的樣品隊列的cd4的平均變化。圖35f顯示了圖35b中的樣品隊列的cd8的平均變化。圖35g顯示了圖35c中的樣品隊列的pd-1的平均變化。圖35h顯示了圖35d中的樣品隊列的pd-l1的平均變化。

圖36.疫苗接種后在adxs-hpv疫苗接種患者的樣品中pd-1和pd-l1的相對水平。pd-1的水平沿x軸繪圖。pd-l1的水平沿y軸繪圖。

圖37.疫苗接種前后在adxs-hpv疫苗接種患者的樣品中cd8+細胞水平的相對變化。疫苗接種后的cd8+細胞水平沿x軸繪圖。疫苗接種前的cd8+細胞水平沿y軸繪圖。

應(yīng)當理解，為了闡述的簡潔和清楚，顯示在圖中的要素未必是按比率繪制的。例如，為了清楚，一些要素的尺寸可以是相對其他要素而放大的。另外，在認為適合時，附圖標記可以在附圖之間重復(fù)，以指出對應(yīng)的或類似的要素。

具體實施方式

本發(fā)明提供治療疾病、防御疾病以及誘導(dǎo)對疾病的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向受試者施用重組李斯特菌菌株的步驟，所述菌株包含融合肽，所述融合肽包含李斯特菌溶血素o(llo)片段和所述疾病表達的異源性抗原或其片斷。

在一個實施例中，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)人受試者中的抗腫瘤或抗癌癥免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向所述受試者施用包含重組李斯特菌菌株的組合物的步驟，所述重組李斯特菌菌株包含重組核酸，所述核酸包含第一開放閱讀框，所述第一開放閱讀框編碼重組多肽，所述重組多肽包含融合至異源性抗原或其片段的llo蛋白的n末端片段，其中所述重組核酸還包含第二開放閱讀框，所述第二開放閱讀框編碼突變體prfa基因或代謝酶，從而誘導(dǎo)對腫瘤或癌癥的免疫應(yīng)答。在另一個實施例中，所述免疫應(yīng)答降低所述受試者接受化療或放療的需要。在另一個實施例中，所述免疫應(yīng)答消除所述受試者接受化療或放療的需要。在另一個實施例中，所述免疫應(yīng)答通過允許用較低劑量的化療或放療治療患者而降低與向所述受試者施用化療或放療相關(guān)的副作用的嚴重性。

在一個實施例中，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)人受試者中的抗腫瘤或抗癌癥免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向所述受試者施用包含重組李斯特菌菌株的組合物的步驟，所述重組李斯特菌菌株包含重組核酸，所述核酸包含第一開放閱讀框，所述第一開放閱讀框編碼重組多肽，所述重組多肽包含融合至異源性抗原或其片段的llo蛋白的n末端片段，其中所述重組核酸還包含第二開放閱讀框，所述第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述免疫應(yīng)答降低所述受試者接受化療或放療的需要，從而誘導(dǎo)對腫瘤或癌癥的免疫應(yīng)答。在另一個實施例中，所述李斯特菌在內(nèi)源性dal/dat和acta基因中包含突變。

在一個實施例中，本文所公開的核酸分子包含編碼重組多肽的第一開放閱讀框，該重組多肽包含異源性抗原或其片段。在另一個實施例中，該重組多肽還包含融合至異源性抗原的n末端llo。在另一個實施例中，本文所公開的核酸分子還包含編碼代謝酶的第二開放閱讀框。在另一個實施例中，該代謝酶補充重組李斯特菌菌株的染色體中缺乏的內(nèi)源性基因。在另一個實施例中，由該第二開放閱讀框編碼的代謝酶為丙氨酸消旋酶(dal)。在另一個實施例中，由該第二開放閱讀框編碼的代謝酶為d-氨基酸轉(zhuǎn)移酶(dat)。在另一個實施例中，本文所公開的李斯特菌菌株在基因組dal、dat或acta基因中包含突變、缺失或失活。在另一個實施例中，本文所公開的李斯特菌菌株在基因組dal、dat和acta基因中包含突變、缺失或失活。在另一個實施例中，該李斯特菌缺乏基因組dal、dat或acta基因。在另一個實施例中，該李斯特菌缺乏基因組dal、dat和acta基因。

在另一個實施例中，施用本文所公開的李斯特菌或本文所公開的基于李斯特菌的免疫療法能夠降低具有腫瘤或癌癥的受試者接受化療或放療的需要。在另一個實施例中，施用本文所公開的李斯特菌或本文所公開的基于李斯特菌的免疫療法能夠消除具有腫瘤或癌癥的受試者接受化療或放療的需要。在另一個實施例中，施用本文所公開的李斯特菌或本文所公開的基于李斯特菌的免疫療法能夠減輕具有腫瘤或癌癥的受試者中與放療或放療相關(guān)的副作用的嚴重性。本發(fā)明還提供誘導(dǎo)人受試者中的抗疾病細胞毒性t細胞(ctl)應(yīng)答并治療與所述疾病相關(guān)的障礙和癥狀的方法，該方法包括施用重組李斯特菌菌株。在一個實施例中，本文公開一種重組李斯特菌菌株，所述重組李斯特菌菌株包含重組核酸，所述核酸包含第一開放閱讀框，所述第一開放閱讀框編碼重組多肽，所述重組多肽包含融合至異源性抗原或其片段的llo蛋白的第一n末端片段，并且其中所述重組核酸還包含第二開放閱讀框，所述第二開放閱讀框編碼突變體prfa基因。在一個實施例中，突變體prfa基因是編碼氨基酸位置133處從氨基酸d(也稱為“asp”、“天冬氨酸鹽”或“天冬氨酸”)到氨基酸v(也稱為“val”或“纈氨酸”)的點突變的基因。在一個實施例中，本文所公開的重組李斯特菌菌株在內(nèi)源性prfa基因中包含突變或缺失。在另一個實施例中，在本文所公開的李斯特菌的prfa基因中的染色體突變或缺失經(jīng)由質(zhì)粒來補充，所述質(zhì)粒包含編碼突變體prfa基因的核酸序列，所述基因編碼包含d133v氨基酸置換的突變體prfa蛋白。在另一個實施例中，包含d133v氨基酸置換的突變體prfa蛋白補充本文所公開的李斯特菌中的內(nèi)源性prfa突變。

在另一個實施例中，該重組李斯特菌是減毒的李斯特菌。將認識到，術(shù)語“減毒”或“減毒的”可涵蓋經(jīng)過修飾以降低對宿主毒性的細菌、病毒、寄生蟲、感染性生物體、朊病毒、腫瘤細胞、感染性生物體中的基因等。宿主可以是人或動物，或器官、組織或細胞。以非限制性方式舉例，細菌可被減毒以減少與宿主細胞的結(jié)合，減少從一個宿主細胞向另一宿主細胞的傳播，減少胞外生長，或減少在宿主細胞中的細胞內(nèi)生長。在一個實施例中，減毒可通過測量例如毒性的一個或多個指標、ld50、從器官中的清除率或競爭指數(shù)而評估(參見例如auerbuch等人(2001)infect.immunity69:5953-5957)。通常，減毒導(dǎo)致ld50增加和/或清除率增加至少25％；更通常增加至少50％；最通常增加至少100％(2倍)；正常增加至少5倍；更正常增加至少10倍；最正常增加至少50倍；經(jīng)常增加至少100倍；更經(jīng)常增加至少500倍；并且最經(jīng)常增加至少1000倍；一般增加至少5000倍；更一般增加至少10,000倍；并且最一般增加至少50,000倍；并且最經(jīng)常增加至少100,000倍。在另一個實施例中，減毒導(dǎo)致ld50增加和/或清除率增加至少25％。在另一個實施例中，減毒導(dǎo)致ld50增加和/或清除率增加3-5倍。在其他實施例中，減毒導(dǎo)致ld50增加和/或清除率增加5-10倍、11-20倍、21-30倍、31-40倍、41-50倍、51-100倍、101-500倍、501-1,000倍、1001-10,000倍或10,001-100,000倍。

技術(shù)人員將容易認識到，術(shù)語“減毒基因”可涵蓋介導(dǎo)對宿主的毒性、病理或毒力、在宿主內(nèi)生長或在宿主內(nèi)存活的基因，其中該基因以減輕、降低或消除毒性、病理或毒力的方式突變?？赏ㄟ^比較由突變基因介導(dǎo)的毒力或毒性與由非突變(或親本)基因介導(dǎo)的毒力或毒性來評估所述降低或消除?！巴蛔兓颉焙w基因調(diào)控區(qū)、基因編碼區(qū)、基因非編碼區(qū)或其任意組合中的缺失、點突變、倒位、截短和移碼突變。

在一個實施例中，本文公開一種誘導(dǎo)人受試者中對腫瘤或癌癥的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向所述受試者施用包含重組核酸的重組李斯特菌菌株的步驟，所述核酸包含第一開放閱讀框，所述第一開放閱讀框編碼重組多肽，所述重組多肽包含融合至異源性抗原或其片段的llo蛋白的n末端片段，其中所述重組核酸還包含第二開放閱讀框，所述第二開放閱讀框編碼突變體prfa蛋白，從而誘導(dǎo)對腫瘤或癌癥的免疫應(yīng)答。在一個實施例中，本發(fā)明提供一種治療人受試者中的癌癥的方法，該方法包括向所述受試者施用本文所公開的重組李斯特菌菌株的步驟。在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種避免人受試者罹患宮頸癌的方法，該方法包括向所述受試者施用本文所公開的重組李斯特菌菌株的步驟。在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株表達重組多肽。在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株包含編碼重組多肽的質(zhì)粒。在另一個實施例中，該方法還包括用本發(fā)明的重組李斯特菌菌株強化人受試者的步驟。在另一個實施例中，該方法還包括用包含本文所公開的異源性抗原或其片段的免疫原性組合物強化人受試者的步驟。在另一個實施例中，該方法還包括用免疫原性組合物強化人受試者的步驟，該組合物引導(dǎo)受試者的細胞表達該異源性抗原。在另一個實施例中，細胞是腫瘤細胞。在另一個實施例中，該方法還包括用本發(fā)明的疫苗強化人受試者的步驟。

在一個實施例中，在本文所公開的llo蛋白和acta蛋白的背景下的片段是指包含llo或acta蛋白的至少5個連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列的肽或多肽。在另一個實施例中，該術(shù)語是指包含llo或acta蛋白或多肽的至少10個連續(xù)氨基酸殘基、至少15個連續(xù)氨基酸殘基、至少20個連續(xù)氨基酸殘基、至少25個連續(xù)氨基酸殘基、至少40個連續(xù)氨基酸殘基、至少50個連續(xù)氨基酸殘基、至少60個連續(xù)氨基酸殘基、至少70個連續(xù)氨基酸殘基、至少80個連續(xù)氨基酸殘基、至少90個連續(xù)氨基酸殘基、至少100個連續(xù)氨基酸殘基、至少125個連續(xù)氨基酸殘基、至少150個連續(xù)氨基酸殘基、至少175個連續(xù)氨基酸殘基、至少200個連續(xù)氨基酸殘基、至少250個連續(xù)氨基酸殘基、至少300個連續(xù)氨基酸殘基、至少350個連續(xù)氨基酸殘基、至少400個連續(xù)氨基酸殘基或至少450個連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列的肽或多肽。

在另一個實施例中，該片段是如本發(fā)明的預(yù)期而發(fā)揮作用的功能性片段(例如，當呈n末端llo/異源性抗原融合蛋白或n末端acta/異源性抗原融合蛋白形式時引起對疾病相關(guān)抗原的免疫應(yīng)答)。在另一個實施例中，該片段為功能性的，形式為非融合的。在另一個實施例中，片段為免疫原性片段。

本發(fā)明在某些實施例中提供李斯特菌異源性核酸或李斯特菌內(nèi)源性核酸的密碼子優(yōu)化。針對每種氨基酸由單核細胞增多性李斯特菌使用的最佳密碼子在美國專利公開2007/0207170中示出，該專利據(jù)此以引用方式并入本文。如果核酸中的至少一個密碼子被下述密碼子替換，則核酸為密碼子優(yōu)化的：單核細胞增多性李斯特菌將該密碼子比原始序列中的密碼子更頻繁地用于所述氨基酸。

n末端llo蛋白片段和異源性抗原在另一個實施例中直接互相融合。在另一個實施例中，編碼n末端llo蛋白片段和異源性抗原的基因直接互相融合。在另一個實施例中，n末端llo蛋白片段和異源性抗原通過接頭肽連接。在另一個實施例中，n末端llo蛋白片段和異源性抗原通過異源性肽連接。在另一個實施例中，n末端llo蛋白片段是異源性抗原的n末端。在另一個實施例中，n末端llo蛋白片段是融合蛋白的最n末端部分。

如本文所公開，表達llo-抗原融合體的重組李斯特菌菌株誘導(dǎo)抗腫瘤免疫(實例1)、引起抗原特異性t細胞增殖(實例2)、產(chǎn)生抗原特異性和腫瘤浸潤性t細胞(實例3)。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種治療人受試者中的宮頸癌的方法，該方法包括向受試者施用重組李斯特菌菌株的步驟，該重組李斯特菌菌株包含含有l(wèi)lo蛋白的n末端片段和hpve7抗原的重組多肽，由此重組李斯特菌菌株誘導(dǎo)對e7抗原的免疫應(yīng)答，從而治療人受試者中的宮頸癌。在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株表達重組多肽。在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株包含編碼重組多肽的質(zhì)粒。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種避免人受試者罹患宮頸癌的方法，該方法包括向受試者施用重組李斯特菌菌株的步驟，該重組李斯特菌菌株包含含有l(wèi)lo蛋白的n末端片段和hpve7抗原的重組多肽，由此重組李斯特菌菌株誘導(dǎo)對e7抗原的免疫應(yīng)答，從而避免人受試者罹患宮頸癌。在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株表達重組多肽。在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株包含編碼重組多肽的質(zhì)粒。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)人受試者中對宮頸癌的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向受試者施用重組李斯特菌菌株的步驟，該重組李斯特菌菌株包含含有l(wèi)lo蛋白的n末端片段和hpve7抗原的重組多肽，從而誘導(dǎo)人受試者中對宮頸癌的免疫應(yīng)答。在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株表達重組多肽。在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株包含編碼重組多肽的質(zhì)粒。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種治療人受試者中的宮頸癌的方法，該方法包括向受試者施用重組李斯特菌菌株的步驟，該重組李斯特菌菌株包含含有acta蛋白的n末端片段和異源性抗原的重組多肽，由此重組李斯特菌菌株誘導(dǎo)對異源性抗原的免疫應(yīng)答，從而治療人受試者中的宮頸癌。在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株表達重組多肽。在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株包含編碼重組多肽的質(zhì)粒。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種避免人受試者罹患宮頸癌的方法，該方法包括向受試者施用重組李斯特菌菌株的步驟，該重組李斯特菌菌株包含含有acta蛋白的n末端片段和異源性抗原的重組多肽，由此重組李斯特菌菌株誘導(dǎo)對異源性抗原的免疫應(yīng)答，從而避免人受試者罹患宮頸癌。在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株表達重組多肽。在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株包含編碼重組多肽的質(zhì)粒。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)人受試者中對宮頸癌的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向受試者施用重組李斯特菌菌株的步驟，該重組李斯特菌菌株包含含有acta蛋白的n末端片段和異源性抗原的重組多肽，從而誘導(dǎo)人受試者中對宮頸癌的免疫應(yīng)答。在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株表達重組多肽。在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株包含編碼重組多肽的質(zhì)粒。

n末端acta蛋白片段和異源性抗原在另一個實施例中直接互相融合。在另一個實施例中，編碼n末端acta蛋白片段和異源性抗原的基因直接互相融合。在另一個實施例中，n末端acta蛋白片段和異源性抗原通過接頭肽連接。在另一個實施例中，n末端acta蛋白片段和異源性抗原通過異源性肽連接。在另一個實施例中，n末端acta蛋白片段是異源性抗原的n末端。在另一個實施例中，n末端acta蛋白片段是融合蛋白的最n末端部分。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)人受試者中對宮頸癌的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向受試者施用重組李斯特菌菌株的步驟，該重組李斯特菌菌株包含重組多肽，該重組多肽包含含pest氨基酸序列的肽和異源性抗原，由此重組李斯特菌菌株誘導(dǎo)對異源性抗原的免疫應(yīng)答，從而治療人受試者中的宮頸癌。在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株表達重組多肽。在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株包含編碼重組多肽的質(zhì)粒。在另一個實施例中，該方法避免人受試者罹患宮頸癌。在另一個實施例中，該方法治療所述人受試者中的宮頸癌。

含pest氨基酸序列的肽和異源性抗原在另一個實施例中直接互相融合。在另一個實施例中，編碼含pest氨基酸序列的肽和異源性抗原的基因直接互相融合。在另一個實施例中，含pest氨基酸序列的肽和異源性抗原通過接頭肽連接。在另一個實施例中，含pest氨基酸序列的肽和異源性抗原通過異源性肽連接。在另一個實施例中，含pest氨基酸序列的肽是異源性抗原的n末端。在另一個實施例中，含pest氨基酸序列的肽是融合蛋白的最n末端部分。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種對人受試者進行疫苗接種以防hpv的方法，該方法包括向受試者施用本文所公開的重組李斯特菌菌株的步驟，其中該李斯特菌表達hpve7抗原并且其中該李斯特菌表達突變體prfa蛋白。在另一個實施例中，該突變體prfa基因編碼prfa蛋白中的d133v突變。在另一個實施例中，該突變體prfa基因在所述重組李斯特菌中的質(zhì)粒中。在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株表達重組多肽。在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株包含編碼重組多肽的質(zhì)粒。

在一個實施例中，如本文所用的術(shù)語“可操作地連接”意味著將轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控核酸相對于任何編碼序列以使得引發(fā)轉(zhuǎn)錄的方式定位。一般來講，這意味著將啟動子和轉(zhuǎn)錄引發(fā)或起始序列定位在編碼區(qū)的5'。在另一個實施例中，如本文所用的術(shù)語“可操作地連接”意味著若干開放閱讀框的融合方式使得形成單個連續(xù)閱讀框，其導(dǎo)致包括接連地布置的原始蛋白的序列的蛋白得以表達。

在一個實施例中，“融合”是指通過共價鍵合可操作地連接。在一個實施例中，該術(shù)語包括(核酸序列或其開放讀框的)重組融合。在另一個實施例中，該術(shù)語包括化學偶聯(lián)。

在一個實施例中，本文所公開的融合蛋白由本文所公開的重組李斯特菌表達和分泌。

在另一個實施例中，受試者處于發(fā)生hpv介導(dǎo)的癌變(例如，宮頸癌)風險中。在另一個實施例中，受試者為hpv陽性的。在另一個實施例中，受試者表現(xiàn)出宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變。在另一個實施例中，受試者表現(xiàn)出鱗狀上皮內(nèi)病變。在另一個實施例中，受試者表現(xiàn)出宮頸發(fā)育異常。

在一個實施例中，該異源性抗原是本領(lǐng)域已知的且本文所公開的任何腫瘤相關(guān)抗原。在另一個實施例中，該異源性抗原是自身免疫抗原。在另一個實施例中，該異源性抗原是感染性疾病抗原。在另一個實施例中，該異源性抗原是hpv相關(guān)抗原。

為本發(fā)明的方法的靶標的hpv在另一個實施例中為hpv16。在另一個實施例中，該hpv為hpv-18。在另一個實施例中，該hpv選自hpv-16和hpv-18。在另一個實施例中，該hpv為hpv-31。在另一個實施例中，該hpv為hpv-35。在另一個實施例中，該hpv為hpv-39。在另一個實施例中，該hpv為hpv-45。在另一個實施例中，該hpv為hpv-51。在另一個實施例中，該hpv為hpv-52。在另一個實施例中，該hpv為hpv-58。在另一個實施例中，該hpv為高風險hpv型。在另一個實施例中，該hpv為粘膜hpv型。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種針對目的抗原對人受試者進行疫苗接種的方法，該方法包括向人受試者靜脈內(nèi)施用包含或表達該目的抗原的重組李斯特菌菌株的步驟，其中第一肽選自(a)llo蛋白的n末端片段、(b)acta蛋白或其n末端片段和(c)含pest氨基酸序列的肽，從而針對目的抗原對人受試者進行疫苗接種。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種針對目的抗原對人受試者進行疫苗接種的方法，該方法包括向人受試者靜脈內(nèi)施用免疫原性組合物的步驟，該組合物包含第一肽與目的抗原的融合體，其中該第一肽選自(a)llo蛋白的n末端片段、(b)acta蛋白或其n末端片段和(c)含pest氨基酸序列的肽，從而針對目的抗原對人受試者進行疫苗接種。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種針對目的抗原對人受試者進行疫苗接種的方法，該方法包括向人受試者靜脈內(nèi)施用包含重組多肽的重組李斯特菌菌株的步驟，該重組多肽包含融合至目的抗原的第一肽，其中該第一肽選自(a)llo蛋白的n末端片段、(b)acta蛋白或其n末端片段和(c)含pest氨基酸序列的肽，從而針對目的抗原對人受試者進行疫苗接種。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)人受試者中針對目的抗原的ctl應(yīng)答的方法，該方法包括向人受試者施用包含或表達目的抗原的重組李斯特菌菌株的步驟，從而誘導(dǎo)人受試者中針對目的抗原的ctl應(yīng)答。在另一個實施例中，施用步驟為靜脈內(nèi)施用。

如本文所公開，表達llo-抗原融合體的重組李斯特菌菌株誘導(dǎo)抗腫瘤免疫(實例1)、引起抗原特異性t細胞增殖(實例2)、產(chǎn)生抗原特異性和腫瘤浸潤性t細胞(實例3)。因此，本發(fā)明的疫苗有效誘導(dǎo)對e7和e6的免疫應(yīng)答。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)受試者中的癌癥消退的方法，該方法包括向受試者施用本文所公開的重組李斯特菌菌株的步驟。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種降低受試者中的癌癥的發(fā)生率或復(fù)發(fā)率的方法，該方法包括向受試者施用本文所公開的重組李斯特菌菌株的步驟。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種抑制受試者中的腫瘤形成的方法，該方法包括向受試者施用本文所公開的重組李斯特菌菌株的步驟。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)受試者中的癌癥緩解的方法，該方法包括向受試者施用本文所公開的重組李斯特菌菌株的步驟。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種阻遏人受試者中的腫瘤生長的方法，該方法包括向受試者施用本文所公開的重組李斯特菌菌株的步驟。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種減小受試者中的腫瘤大小的方法，該方法包括向受試者施用本文所公開的重組李斯特菌菌株的步驟。

在一個實施例中，疾病為感染性疾病、自身免疫疾病、呼吸疾病、癌前病癥或癌癥。

技術(shù)人員將容易認識到，術(shù)語“癌前病癥”可涵蓋發(fā)育異常、腫瘤發(fā)生前結(jié)節(jié)；大再生結(jié)節(jié)(mrn)；低級別異型增生結(jié)節(jié)(lg-dn)；高級別異型增生結(jié)節(jié)(hg-dn)；膽管上皮發(fā)育異常；變異肝細胞病灶(fah)；變異肝細胞結(jié)節(jié)(nah)；染色體失衡；端粒酶異?；罨欢肆Ｃ复呋瘉唵挝辉俦磉_；內(nèi)皮細胞標記物諸如cd31、cd34和bnh9的表達(參見例如terracciano和tomillo(2003)pathologica95:71-82；su和bannasch(2003)toxicol.pathol.31:126-133；rocken和carl-mcgrath(2001)dig.dis.19:269-278；kotoula等人(2002)liver22:57-69；frachon等人(2001)j.hepatol.34:850-857；shimonishi等人(2000)j.hepatobiliarypancreat.surg.7:542-550；nakanuma等人(2003)j.hepatobiliarypancreat.surg.10:265-281)。診斷癌癥和發(fā)育異常的方法已有公開(參見例如riegler(1996)semin.gastrointest.dis.7:74-87；benvegnu等人(1992)liver12:80-83；giannini等人(1987)hepatogastroenterol.34:95-97；anthony(1976)cancerres.36:2579-2583)。

在一個實施例中，感染性疾病為由以下病原體的任一種但并不限于它們所引起的感染性疾?。篵cg/結(jié)核病、瘧疾、惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲、間日瘧原蟲、輪狀病毒、霍亂、白喉-破傷風、百日咳、流感嗜血桿菌、乙型肝炎、人乳頭瘤病毒、季節(jié)性流感)、a型流感(h1n1)流行病、麻疹和風疹、腮腺炎、腦膜炎球菌a+c、口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗(單價、二價和三價)、肺炎球菌、狂犬病、破傷風類毒素、黃熱病、炭疽芽孢桿菌(炭疽)、肉毒棱狀芽孢桿菌毒素(肉毒中毒)、鼠疫耶爾森菌(瘟疫)、重型天花(天花)和其他有關(guān)的痘病毒、土拉熱弗朗西絲菌(土拉菌病)、病毒性出血熱、沙粒病毒(lcm、胡寧病毒、馬丘波病毒、瓜納瑞托病毒、拉沙熱)、布尼亞病毒(漢坦病毒屬、裂谷熱)、黃病毒屬(登革熱)、線狀病毒(埃博拉病毒、馬爾堡病毒)、假鼻疽伯克霍爾德菌、伯內(nèi)特考克斯體(q熱)、布魯桿菌屬種(布魯桿菌病)、鼻疽伯克霍爾德菌(鼻疽)、鸚鵡衣原體(鸚鵡熱)、蓖麻蛋白毒素(來自蓖麻)、產(chǎn)氣莢膜梭菌的ε毒素、葡萄球菌腸毒素b、斑疹傷寒熱(普氏立克次體)、其他立克次體、食品和水傳播的病原體、細菌(致腹瀉性的大腸桿菌、致病性的弧菌屬、志賀氏菌屬種、沙門氏菌屬bcg/、空腸彎曲桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌)、病毒(杯狀病毒、甲型肝炎、西尼羅病毒、lacrosse、加利福尼亞腦炎、vee、eee、wee、日本腦炎病毒、科薩努爾森林病毒、尼帕病毒、漢坦病毒屬、蜱傳出血熱病毒、切昆貢亞病毒、克里米亞-剛果出血熱病毒、蜱傳腦炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、單純皰疹病毒(hsv)、人免疫缺陷病毒(hiv)、人乳頭狀瘤病毒(hpv)、原生動物(小隱孢子蟲、卡晏環(huán)孢子蟲、蘭伯賈第蟲、溶組織內(nèi)阿米巴、弓形蟲屬)、真菌(微孢子目)、黃熱病、結(jié)核病(包括耐藥的tb)、狂犬病、朊病毒、嚴重急性呼吸綜合征相關(guān)的冠狀病毒(sars-cov)、coccidioidesposadasii、粗球孢子菌、細菌性陰道病、沙眼衣原體、巨細胞病毒、腹股溝肉芽腫、杜克雷嗜血桿菌、淋病奈瑟球菌、蒼白密螺旋體、陰道毛滴蟲或本領(lǐng)域已知的在本文中沒有列出的任何其他感染性疾病。

在另一個實施例中，該感染性疾病是家畜感染性疾病。在另一個實施例中，家畜疾病可傳播給人，并被稱作“人畜共患病”。在另一個實施例中，這些疾病包括但不限于口蹄疫、西尼羅病毒、狂犬病、犬細小病毒、貓白血病病毒、馬流感病毒、傳染性牛鼻氣管炎(ibr)、偽狂犬病、古典豬瘟(csf)、由牛1型牛皰疹病毒(bhv-1)感染造成的ibr以及豬偽狂犬病(奧爾斯基病)、弓形蟲病、炭疽、水皰性口炎病毒、馬紅球菌、土拉菌病、瘟疫(鼠疫耶爾森菌)、毛滴蟲。

在另一個實施例中，本文所公開的疾病為呼吸道疾病或炎癥性疾病。在另一個實施例中，該呼吸道疾病或炎癥性疾病為慢性阻塞性肺病(copd)。在另一個實施例中，該疾病為哮喘。

在一個實施例中，活的減毒李斯特菌菌株能夠緩解哮喘癥狀，無需其他治療劑的共施用，例如抗炎劑或支氣管擴張劑。在另一個實施例中，本文所公開的方法還包括向受試者共同施用活的減毒李斯特菌菌株和一種或多種治療劑的步驟。在另一個實施例中，該治療劑為平喘藥。在另一個實施例中，該治療劑為抗炎劑、非甾體抗炎劑、抗生素、抗膽堿能藥、支氣管擴張藥、皮質(zhì)類固醇、短效β受體激動劑、長效β受體激動劑、組合吸入劑、抗組織胺藥或它們的組合。

在一個實施例中，本文所公開的疾病為癌癥或腫瘤。在一個實施例中，該腫瘤為癌性的。在另一個實施例中，該癌癥為乳腺癌。在另一個實施例中，該癌癥為宮頸癌。在另一個實施例中，該癌癥為含her2癌癥。在另一個實施例中，該癌癥為黑素瘤。在另一個實施例中，該癌癥為胰腺癌。在另一個實施例中，該癌癥為卵巢癌。在另一個實施例中，該癌癥為胃癌。在另一個實施例中，該癌癥為胰腺的癌性病變。在另一個實施例中，該癌癥為肺腺癌。在另一個實施例中，其為多形性膠質(zhì)母細胞瘤。在另一個實施例中，該癌癥為結(jié)直腸腺癌。在另一個實施例中，該癌癥為肺鱗癌。在另一個實施例中，該癌癥為胃腺癌。在另一個實施例中，該癌癥為卵巢表面上皮腫瘤(例如其良性的、增生性的或惡性的種類)。在另一個實施例中，該癌癥為口腔鱗狀細胞癌。在另一個實施例中，該癌癥為非小細胞肺癌。在另一個實施例中，該癌癥為子宮內(nèi)膜癌。在另一個實施例中，該癌癥為膀胱癌。在另一個實施例中，該癌癥為頭頸癌。在另一個實施例中，該癌癥為前列腺癌。在另一個實施例中，該癌癥為口咽癌。在另一個實施例中，該癌癥為肺癌。在另一個實施例中，該癌癥為肛門癌。在另一個實施例中，該癌癥為結(jié)腸直腸癌。在另一個實施例中，該癌癥為食道癌。本發(fā)明的方法靶向的宮頸腫瘤在另一個實施例中為鱗狀細胞癌。在另一個實施例中，該宮頸腫瘤為腺癌。在另一個實施例中，該宮頸腫瘤為腺鱗癌。在另一個實施例中，該宮頸腫瘤為小細胞癌。在另一個實施例中，該宮頸腫瘤為本領(lǐng)域已知的任何其他類型的宮頸腫瘤。

本發(fā)明的方法靶向的宮頸腫瘤在另一個實施例中為鱗狀細胞癌。在另一個實施例中，該宮頸腫瘤為腺癌。在另一個實施例中，該宮頸腫瘤為腺鱗癌。在另一個實施例中，該宮頸腫瘤為小細胞癌。在另一個實施例中，該宮頸腫瘤為本領(lǐng)域已知的任何其他類型的宮頸腫瘤。

在一個實施例中，本文所公開的抗原為異源性腫瘤抗原，其在本文也稱為“腫瘤抗原、“抗原性多肽”或“外源抗原”。在另一個實施例中，該抗原為人類乳頭瘤病毒e7(hpv-e7)抗原，其在一個實施例中來自hpv16(在一個實施例中，genbank登錄號aad33253)，在另一個實施例中來自hpv18(在一個實施例中，genbank登錄號p06788)。在另一個實施例中，該抗原性多肽為hpv-e6，其在一個實施例中來自hpv16(在一個實施例中，genbank登錄號aad33252、aam51854、aam51853或aab67615)，在另一個實施例中來自hpv18(在一個實施例中，genbank登錄號p06463)。在另一個實施例中，該抗原性多肽為her/2-neu抗原。在另一個實施例中，該抗原性多肽為前列腺特異性抗原(psa)(在一個實施例中g(shù)enbank登錄號cad30844、cad54617、aaa58802或np—001639)。在另一個實施例中，該抗原性多肽為角質(zhì)層胰凝乳蛋白酶(scce)抗原(在一個實施例中，genbank登錄號aak69652、aak69624、aag33360、aaf01139或aac37551)。在另一個實施例中，該抗原性多肽為wilms腫瘤抗原1，其在另一個實施例中為wt-1端粒酶(genbank登錄號p49952、p22561、np—659032、cac39220.2或eaw68222.1)。在另一個實施例中，該抗原性多肽為htert或端粒酶(genbank登錄號nm003219(變體1)、nm198255(變體2)、nm198253(變體3)或nm198254(變體4)。在另一個實施例中，該抗原性多肽為蛋白酶3(在一個實施例中，genbank登錄號m29142、m75154、m96839、x55668、nm00277、m96628或x56606)。在另一個實施例中，該抗原性多肽為酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(trp2)(在一個實施例中，genbank登錄號np—001913、abi73976、aap33051或q95119)。在另一個實施例中，該抗原性多肽為高分子量黑素瘤相關(guān)抗原(hmw-maa)(在一個實施例中，genbank登錄號np—001888、aai28111或aaq62842)。在另一個實施例中，該抗原性多肽為testisin(在一個實施例中，genbank登錄號aaf79020、aaf79019、aag02255、aak29360、aad41588或np—659206)。在另一個實施例中，該抗原性多肽為ny-eso-1抗原(在一個實施例中，genbank登錄號caa05908、p78358、aab49693或np—640343)。在另一個實施例中，該抗原性多肽為psca(在一個實施例中，genbank登錄號aah65183、np—005663、np—082492、o43653或cab97347)。在另一個實施例中，該抗原性多肽為白介素(il)13受體α(在一個實施例中，genbank登錄號np—000631、np—001551、np—032382、np—598751、np—001003075或np—999506)。在另一個實施例中，該抗原性多肽為碳酸酐酶ix(caix)(在一個實施例中，genbank登錄號cai13455、cai10985、eaw58359、np—001207、np—647466或np—001101426)。在另一個實施例中，該抗原性多肽為癌胚抗原(cea)(在一個實施例中，genbank登錄號aaa66186、caa79884、caa66955、aaa51966、aad15250或aaa51970)。在另一個實施例中，該抗原性多肽為mage-a(在一個實施例中，genbank登錄號np—786885、np—786884、np—005352、np—004979、np—005358或np—005353)。在另一個實施例中，該抗原性多肽為存活素(在一個實施例中，genbank登錄號aac51660、aay15202、abf60110、np—001003019或np—001082350)。在另一個實施例中，該抗原性多肽為gp100(在一個實施例中，genbank登錄號aac60634、yp—655861或aab31176)。在另一個實施例中，該抗原性多肽為本領(lǐng)域已知的任何其他抗原性多肽。在另一個實施例中，本發(fā)明的組合物和方法的抗原性肽包含所述抗原性多肽的免疫原性部分。

在另一個實施例中，該抗原為hpv-e6。在另一個實施例中，該抗原為hpv16-e6。在另一個實施例中，該抗原為hpv18-e6。在另一個實施例中，抗原為hpv-e7。在另一個實施例中，該抗原為hpv16-e7。在另一個實施例中，該抗原為hpv18-e7。在另一個實施例中，該抗原為端粒酶(tert)。在另一個實施例中，該抗原為lmp-1。在另一個實施例中，該抗原為p53。在另一個實施例中，該抗原為間皮素。在另一個實施例中，該抗原為egfrviii。在另一個實施例中，該抗原為碳酸酐酶ix(caix)。在另一個實施例中，該抗原為psma。在另一個實施例中，該抗原為hmw-maa。在另一個實施例中，該抗原為hiv-1gag。在另一個實施例中，該抗原為酪氨酸酶相關(guān)蛋白2。在另一個實施例中，該抗原選自hpv-e7、hpv-e6、her-2、hiv-1gag、lmp-1、p53、psma、癌胚抗原(cea)、lmp-1、激肽釋放酶相關(guān)肽酶3(klk3)、klk9、muc、酪氨酸酶相關(guān)蛋白2、muc1、fap、il-13rα2、psa(前列腺特異性抗原)、gp-100、熱休克蛋白70(hsp-70)、β-hcg、egfr-iii、粒細胞集落刺激因子(g-csf)、血管生成素、促血管生成素-1、del-1、成纖維細胞生長因子：酸性(afgf)或堿性(bfgf)、卵泡抑素、粒細胞集落刺激因子(g-csf)、肝細胞生長因子(hgf)/分散因子(sf)、白細胞介素-8(il-8)、痩素、中期因子、胎盤生長因子、血小板衍生內(nèi)皮細胞生長因子(pd-ecgf)、血小板衍生生長因子-bb(pdgf-bb)、多效生長因子(ptn)、顆粒蛋白前體、增殖素、轉(zhuǎn)化生長因子-α(tgf-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(tgf-β)、腫瘤壞死因子-α(tnf-α)、血管內(nèi)皮生長因子(vegf)/血管滲透因子(vpf)、vegfr、vegfr2(kdr/flk-1)或其片段、flk-1或其表位、flk-e1、flk-e2、flk-i1、內(nèi)皮因子或其片段、神經(jīng)菌毛素1(nrp-1)、促血管生成素-1(ang1)、tie2、血小板衍生生長因子(pdgf)、血小板衍生生長因子受體(pdgfr)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(tgf-β)、內(nèi)皮因子、tgf-β受體、單核細胞趨化蛋白-1(mcp-1)、ve-鈣粘蛋白、cd31、ephrin、icam-1、v-cam-1、vap-1、e-選擇素、纖溶酶原激活物、纖溶酶原激活物抑制劑-1、一氧化氮合酶(nos)、cox-2、ac133或id1/id3、促血管生成素3、促血管生成素4、促血管生成素6、cd105、edg、hht1、orw、orw1或tgfβ共受體或它們的組合。在另一個實施例中，所述抗原為美國專利申請公開no.2011/0142791中公開的嵌合her2抗原，通過引用將該專利全文并入本文。對本文所公開的抗原的片段的使用也涵蓋在本發(fā)明中。

在另一個實施例中，本文所公開的異源性腫瘤抗原為腫瘤相關(guān)抗原，其在一個實施例中為以下腫瘤抗原之一：mage(黑素瘤相關(guān)抗原e)蛋白，例如mage1、mage2、mage3、mage4、酪氨酸酶；突變體ras蛋白；突變體p53蛋白；p97黑素瘤抗原、與晚期癌癥相關(guān)的ras肽或p53肽；與宮頸癌相關(guān)的hpv16/18抗原、與乳腺癌相關(guān)的klh抗原、與結(jié)腸直腸癌相關(guān)的cea(癌胚抗原)、與黑素瘤相關(guān)的mart1抗原或與前列腺癌相關(guān)的psa抗原。在另一個實施例中，用于本文所公開的組合物和方法的抗原為黑素瘤相關(guān)抗原，其在一個實施例中為trp-2、mage-1、mage-3、gp-100、酪氨酸酶、hsp-70、β-hcg或它們的組合。應(yīng)當理解，技術(shù)人員能夠?qū)⒈疚奈刺岬降绢I(lǐng)域已知的任何異源抗原用在本文所公開的方法和組合物中。還應(yīng)當理解的是，本發(fā)明提供但不限于編碼本文所公開的至少一種抗原的核酸的減毒李斯特菌。本發(fā)明涵蓋編碼所公開的抗原的突變體、突變蛋白、剪接變體、片段、截短的變體、可溶性變體、胞外域、胞內(nèi)域、成熟序列等的核酸。公開了編碼這些抗原的表位、寡肽和多肽的核酸。還公開了密碼子優(yōu)化的實施例，這些實施例針對在李斯特菌中的表達而優(yōu)化。所引用的參考文獻、genbank登錄號以及本文所公開的核酸、肽和多肽均整體以引用方式并入本文。在另一個實施例中，所選的核酸序列可編碼全長或截短的基因、融合或標記的基因，并且可以是cdna、基因組dna或dna片段，優(yōu)選cdna。其根據(jù)需要可以突變或以其他方式修飾。這些修飾包括密碼子優(yōu)化以優(yōu)化密碼子在所選宿主細胞或細菌即李斯特菌中的使用。所選的序列也可以編碼分泌的、細胞質(zhì)的、細胞核的、膜結(jié)合的或細胞表面的多肽。

在一個實施例中，血管內(nèi)皮生長因子(vegf)為重要的參與血管發(fā)生(胚胎循環(huán)系統(tǒng)的形成)和血管生成(從現(xiàn)存脈管系統(tǒng)生長血管)的信號蛋白。在一個實施例中，vegf活性主要限于血管內(nèi)皮的細胞，盡管其對有限數(shù)量的其他細胞類型有作用(例如刺激單核細胞/巨噬細胞遷移)。vegf在體外已顯示出刺激內(nèi)皮細胞有絲分裂和細胞遷移。vegf還增強微血管滲透性，并且有時也被稱為血管通透性因子。

在一個實施例中，vegf家族的所有成員都刺激細胞應(yīng)答，這通過結(jié)合細胞表面上的酪氨酸激酶受體(vegfr)，導(dǎo)致它們二聚化并經(jīng)由轉(zhuǎn)磷酸作用而被活化來實現(xiàn)。該vegf受體具有由7個免疫球蛋白樣域組成的胞外部分、單個跨膜區(qū)和含有分開的酪氨酸激酶域的胞內(nèi)部分。

在一個實施例中，vegf-a為vegfr-2(kdr/flk-1)配體以及vegfr-1(flt-1)配體。在一個實施例中，vegfr介導(dǎo)幾乎全部已知的對vegf的細胞應(yīng)答。vegfr-1的功能不太明確，盡管在一個實施例中認為其通過隔離vegf與vegfr-2結(jié)合而調(diào)節(jié)vegfr-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在一個實施例中，這在胚胎的血管發(fā)生期間是尤其重要的。在一個實施例中，vegf-c和vegf-d為vegfr-3受體的配體，該vegfr-3受體在一個實施例中介導(dǎo)淋巴管生成。

在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包含vegf受體或其片段，其在一個實施例中為vegfr-2，在另一個實施例中為vegfr-1，以及在另一個實施例中為vegfr-3。

在一個實施例中，血管內(nèi)皮生長因子受體2(vegfr2)在活化的內(nèi)皮細胞(ec)上高表達并參與新血管的形成。在一個實施例中，vegfr2結(jié)合vegf的全部5個同種型。在一個實施例中，vegf經(jīng)由vegfr2在ec上的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)增殖、遷移和最終的分化。在一個實施例中，vegfr2的小鼠同源物為胎兒肝激酶基因-1(flk-1)，其為強治療靶標，并在腫瘤生長、入侵和轉(zhuǎn)移中起重要作用。在一個實施例中，vegfr2也稱為激酶插入?yún)^(qū)受體(iii型受體酪氨酸激酶)(kdr)、分化群309(cd309)、flk1、ly73、krd-1、vegfr、vegfr-2或6130401c07。

在一個實施例中，抗原源自真菌病原體、細菌、寄生蟲、蠕蟲或病毒。在另一個實施例中，該抗原選自破傷風類毒素、來自流感病毒的血凝素分子、白喉類毒素、hivgp120、hivgag蛋白、iga蛋白酶、胰島素肽b、馬鈴薯粉痂病菌(spongosporasubterranea)抗原、弧菌抗原、沙門氏菌(salmonella)抗原、肺炎球菌抗原、呼吸道合胞體病毒抗原、流感嗜血桿菌(haemophilusinfluenza)外膜蛋白、幽門螺桿菌(helicobacterpylori)脲酶、腦膜炎奈瑟球菌(neisseriameningitidis)菌毛蛋白、淋病奈瑟菌(n.gonorrhoeae)菌毛蛋白、黑素瘤相關(guān)抗原(trp-2、mage-1、mage-3、gp-100、酪氨酸酶、mart-1、hsp-70、β-hcg)、來自hpv-16、hpv-18、hpv-31、hpv-33、hpv-35或hpv-45型人類乳頭瘤病毒的人類乳頭瘤病毒抗原e1和e2、腫瘤抗原cea、突變或者其他形式的ras蛋白、突變或者其他形式的p53蛋白、muc1或psa。

在其他實施例中，抗原與以下疾病之一相關(guān)：霍亂、白喉、嗜血桿菌、甲型肝炎、乙型肝炎、流感、麻疹、腦膜炎、腮腺炎、百日咳、天花、肺炎球菌肺炎、腦灰質(zhì)炎、狂犬病、風疹、破傷風、肺結(jié)核、傷寒、水痘-帶狀皰疹、百日咳、黃熱病、來自愛迪生氏病的免疫原和抗原、過敏癥、過敏反應(yīng)、布魯頓綜合征、癌癥、包括實體和血源性腫瘤、濕疹、橋本氏甲狀腺炎、多肌炎、皮肌炎、1型糖尿病、獲得性免疫缺陷綜合征、移植排斥、例如腎、心臟、胰腺、肺、骨骼和肝臟移植物、格雷夫斯病、多內(nèi)分泌自身免疫病、肝炎、顯微鏡下多動脈炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎、天皰瘡、原發(fā)性膽汁性肝硬化、惡性貧血、乳糜瀉、抗體介導(dǎo)的腎炎、血管球性腎炎、風濕病、全身性紅斑狼瘡、類風濕性關(guān)節(jié)炎、血清陰性脊椎關(guān)節(jié)病、鼻炎、sjogren綜合征、全身性硬化癥、硬化性膽管炎、韋格納氏肉芽腫、皰疹樣皮炎、牛皮癬、白癜風、多發(fā)性硬化癥、腦脊髓炎、吉蘭-巴雷綜合征、重癥肌無力、蘭伯特-伊頓綜合征、鞏膜、鞏膜外層、色素層炎、慢性粘膜皮膚念珠菌病、風疹、嬰兒短暫性低丙種球蛋白血癥、骨髓瘤、x-連鎖高igm綜合征、斯科特-奧爾德里奇綜合征、共濟失調(diào)性毛細血管擴張癥、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少癥、自身免疫性中性粒細胞減少癥、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血、淀粉樣變性、慢性淋巴細胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、惡性瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白、微生物抗原、病毒抗原、自身抗原以及李斯特菌病。

在另一個實施例中，在用于治療宮頸癌、防御宮頸癌或誘導(dǎo)對宮頸癌的免疫應(yīng)答的本發(fā)明的方法中，代替e7抗原或作為其補充，使用hpve6抗原。

在另一個實施例中，在用于治療宮頸癌、防御宮頸癌或誘導(dǎo)對宮頸癌的免疫應(yīng)答的本發(fā)明的方法中，代替llo片段或作為其補充，使用acta蛋白片段。

在另一個實施例中，在用于治療宮頸癌、防御宮頸癌或誘導(dǎo)對宮頸癌的免疫應(yīng)答的本發(fā)明的方法中，代替llo片段或作為其補充，使用含pest氨基酸序列的蛋白片段。

在另一個實施例中，本文提供了包含本發(fā)明的重組李斯特菌的免疫原性組合物。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的免疫原性組合物包含本發(fā)明的重組疫苗載體。在另一個實施例中，免疫原性組合物包含本發(fā)明的質(zhì)粒。在另一個實施例中，免疫原性組合物包含佐劑。在一個實施例中，本發(fā)明的載體可作為疫苗組合物的一部分施用。

在另一個實施例中，本發(fā)明的疫苗與佐劑一起遞送。在一個實施例中，佐劑有利于主要由th1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在另一個實施例中，佐劑有利于th1型免疫應(yīng)答。在另一個實施例中，佐劑有利于th1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在另一個實施例中，佐劑有利于細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答超過抗體介導(dǎo)的應(yīng)答。在另一個實施例中，佐劑是本領(lǐng)域已知的任何其他類型的佐劑。在另一個實施例中，免疫原性組合物誘導(dǎo)針對靶蛋白的t細胞免疫應(yīng)答的形成。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)誘導(dǎo)人受試者中的抗e7細胞毒性t細胞(ctl)應(yīng)答的方法，該方法包括向受試者施用重組李斯特菌菌株的步驟，該重組李斯特菌菌株包含含有l(wèi)lo蛋白的n末端片段和hpve7抗原的重組多肽，從而誘導(dǎo)人受試者中的抗e7ctl應(yīng)答。在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株包含編碼重組多肽的質(zhì)粒。在另一個實施例中，該方法還包括用本發(fā)明的重組李斯特菌菌株強化受試者的步驟。在另一個實施例中，該方法還包括用包含e7抗原的免疫原性組合物強化受試者的步驟。在另一個實施例中，該方法還包括用免疫原性組合物強化受試者的步驟，該組合物引導(dǎo)受試者的細胞表達e7抗原。在另一個實施例中，ctl應(yīng)答能夠?qū)pv介導(dǎo)的疾病、障礙或癥狀產(chǎn)生治療性功效。在另一個實施例中，ctl應(yīng)答能夠?qū)pv介導(dǎo)的疾病、障礙或癥狀產(chǎn)生預(yù)防性功效。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供治療或改善受試者中的hpv介導(dǎo)的疾病、障礙或癥狀的方法，該方法包括向受試者施用重組李斯特菌菌株的步驟，該重組李斯特菌菌株包含含有l(wèi)lo蛋白的n末端片段和hpve7抗原的重組多肽，由此重組李斯特菌菌株誘導(dǎo)對e7抗原的免疫應(yīng)答，從而治療或改善受試者中的hpv介導(dǎo)的疾病、障礙或癥狀。在另一個實施例中，受試者是人受試者。在另一個實施例中，受試者是非人受試者。在另一個實施例中，受試者是本領(lǐng)域已知的任何其他類型的受試者。

導(dǎo)致疾病、障礙或癥狀的hpv在另一個實施例中為hpv16。在另一個實施例中，該hpv為hpv-18。在另一個實施例中，該hpv為hpv-31。在另一個實施例中，該hpv為hpv-35。在另一個實施例中，該hpv為hpv-39。在另一個實施例中，該hpv為hpv-45。在另一個實施例中，該hpv為hpv-51。在另一個實施例中，該hpv為hpv-52。在另一個實施例中，該hpv為hpv-58。在另一個實施例中，該hpv為高風險hpv型。在另一個實施例中，該hpv為粘膜hpv型。

在另一個實施例中，hpv介導(dǎo)的疾病、障礙或癥狀為生殖器疣。在另一個實施例中，hpv介導(dǎo)的疾病、障礙或癥狀為非生殖器疣。在另一個實施例中，hpv介導(dǎo)的疾病、障礙或癥狀為呼吸道乳頭瘤。在另一個實施例中，hpv介導(dǎo)的疾病、障礙或癥狀為本領(lǐng)域已知的任何其他hpv介導(dǎo)的疾病、障礙或癥狀。

在另一個實施例中，在用于治療或改善hpv介導(dǎo)的疾病、障礙或癥狀的本發(fā)明的方法中，代替e7抗原或作為其補充，使用hpve6抗原。

在另一個實施例中，在用于治療或改善hpv介導(dǎo)的疾病、障礙或癥狀的本發(fā)明的方法中，代替llo片段或作為其補充，使用acta蛋白片段。

在另一個實施例中，在用于治療或改善hpv介導(dǎo)的疾病、障礙或癥狀的本發(fā)明的方法中，代替llo片段或作為其補充，使用含pest氨基酸序列的蛋白片段。

在另一個實施例中，在用于治療或改善hpv介導(dǎo)的疾病、障礙或癥狀的本發(fā)明的方法中，代替e7抗原或作為其補充，使用hpve6抗原。

在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的抗原是hpve7蛋白。在另一個實施例中，該抗原是hpve6蛋白。在另一個實施例中，該抗原是本領(lǐng)域已知的任何其他hpv蛋白。

“e7抗原”在另一個實施例中是指e7蛋白。在另一個實施例中，該術(shù)語是指e7片段。在另一個實施例中，該術(shù)語是指e7肽。在另一個實施例中，該術(shù)語是指本領(lǐng)域已知的任何其他類型的e7抗原。

本發(fā)明的方法和組合物的e7蛋白在另一個實施例中為hpv16e7蛋白。在另一個實施例中，該e7蛋白為hpv-18e7蛋白。在另一個實施例中，該e7蛋白為hpv-31e7蛋白。在另一個實施例中，該e7蛋白為hpv-35e7蛋白。在另一個實施例中，該e7蛋白為hpv-39e7蛋白。在另一個實施例中，該e7蛋白為hpv-45e7蛋白。在另一個實施例中，該e7蛋白為hpv-51e7蛋白。在另一個實施例中，該e7蛋白為hpv-52e7蛋白。在另一個實施例中，該e7蛋白為hpv-58e7蛋白。在另一個實施例中，該e7蛋白為高風險hpv型e7蛋白。在另一個實施例中，該e7蛋白為粘膜hpv型e7蛋白。

“e6抗原”在另一個實施例中是指e6蛋白。在另一個實施例中，該術(shù)語是指e6片段。在另一個實施例中，該術(shù)語是指e6肽。在另一個實施例中，該術(shù)語是指本領(lǐng)域已知的任何其他類型的e6抗原。

本發(fā)明的方法和組合物的e6蛋白在另一個實施例中為hpv16e6蛋白。在另一個實施例中，該e6蛋白為hpv-18e6蛋白。在另一個實施例中，該e6蛋白為hpv-31e6蛋白。在另一個實施例中，該e6蛋白為hpv-35e6蛋白。在另一個實施例中，該e6蛋白為hpv-39e6蛋白。在另一個實施例中，該e6蛋白為hpv-45e6蛋白。在另一個實施例中，該e6蛋白為hpv-51e6蛋白。在另一個實施例中，該e6蛋白為hpv-52e6蛋白。在另一個實施例中，該e6蛋白為hpv-58e6蛋白。在另一個實施例中，該e6蛋白為高風險hpv型e6蛋白。在另一個實施例中，該e6蛋白為粘膜hpv型e6蛋白。

本發(fā)明的方法和組合物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答在另一個實施例中為t細胞應(yīng)答。在另一個實施例中，免疫應(yīng)答包括t細胞應(yīng)答。在另一個實施例中，該應(yīng)答為cd8⁺t細胞應(yīng)答。在另一個實施例中，該應(yīng)答包括cd8⁺t細胞應(yīng)答。

在一個實施例中，本發(fā)明的組合物誘導(dǎo)強烈的干擾素-γ先天刺激，該干擾素-γ在一個實施例中具有抗血管新生性質(zhì)。在一個實施例中，本發(fā)明的李斯特菌誘導(dǎo)強烈的干擾素-γ先天刺激，該干擾素-γ在一個實施例中具有抗血管新生性質(zhì)(dominiecki等人,cancerimmunolimmunother.2005年5月；54(5):477-88.2004年10月6日電子版，以引用方式全文并入本文；beatty和paterson,jimmunol.2001年2月15日；166(4):2276-82，以引用方式全文并入本文)。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法增加產(chǎn)干擾素γ細胞的水平。在一個實施例中，李斯特菌的抗血管新生性質(zhì)通過cd4⁺t細胞介導(dǎo)(beatty和paterson，2001)。在另一個實施例中，李斯特菌的抗血管新生性質(zhì)通過cd8⁺t細胞介導(dǎo)。在另一個實施例中，因李斯特菌疫苗接種導(dǎo)致的ifn-γ分泌由nk細胞、nkt細胞、th1cd4⁺t細胞、tc1cd8⁺t細胞或它們的組合介導(dǎo)。

在另一個實施例中，本發(fā)明的組合物誘導(dǎo)一種或多種抗血管新生蛋白或因子的生成。在一個實施例中，該抗血管新生蛋白為ifn-γ。在另一個實施例中，該抗血管新生蛋白為色素上皮衍生因子(pedf)、血管新生抑制素、內(nèi)皮抑素、fms樣酪氨酸激酶(sflt)-1或可溶性內(nèi)皮因子(seng)。在一個實施例中，本發(fā)明的李斯特菌參與抗血管新生因子的釋放，由此，在一個實施例中，除了作為用于將抗原引入受試者的載體之外還具有治療作用。每個李斯特菌菌株及其類型代表了本發(fā)明的獨立實施例。

在另一個實施例中，由本發(fā)明的方法和組合物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是抑制目標腫瘤細胞中程序性細胞死亡受體1-配體1(pd-l1)表達。在另一個實施例中，免疫應(yīng)答包括腫瘤內(nèi)表達程序性細胞死亡受體-1(pd-1)的免疫細胞的水平升高。在另一個實施例中，免疫應(yīng)答包括pd-1表達水平與pd-l1表達水平的比率升高。在另一個實施例中，免疫應(yīng)答包括抑制腫瘤pd-l1介導(dǎo)的免疫抑制。

在另一個實施例中，施用本發(fā)明的組合物誘導(dǎo)穩(wěn)健的系統(tǒng)性抗原特異性免疫。在另一個實施例中，施用本發(fā)明的組合物誘導(dǎo)表位擴展。在另一個實施例中，施用本發(fā)明的組合物誘導(dǎo)對自身來源的腫瘤抗原的廣泛應(yīng)答。在另一個實施例中，由本發(fā)明的方法和組合物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答包括改善腫瘤微環(huán)境(tme)中抑制性與效應(yīng)免疫細胞的總體平衡。在另一個實施例中，由本發(fā)明的方法和組合物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答包括改善抑制性與效應(yīng)免疫細胞的系統(tǒng)平衡。

在一個實施例中，如本文所公開的組合物及其使用方法生成能夠浸潤腫瘤、破壞腫瘤細胞并根除疾病的效應(yīng)t細胞。在另一個實施例中，本發(fā)明的使用方法增加效應(yīng)t細胞產(chǎn)生的浸潤。在另一個實施例中，效應(yīng)t細胞包括cd8+t細胞。在另一個實施例中，效應(yīng)t細胞包括cd4+t細胞。

在一個實施例中，腫瘤浸潤性淋巴細胞(til)與多種腫瘤諸如結(jié)腸癌、卵巢癌和黑素瘤中更好的預(yù)后相關(guān)。在結(jié)腸癌中，不具有微轉(zhuǎn)移信號的腫瘤具有增加的免疫細胞浸潤和th1表達譜，這與改善的患者存活相關(guān)。此外，t細胞對腫瘤的浸潤在臨床前和臨床試驗中都已與免疫療法的成功相關(guān)。在一個實施例中，淋巴細胞浸潤到腫瘤部位中依賴于腫瘤血管的內(nèi)皮細胞中粘附分子的上調(diào)，這種上調(diào)通常通過促炎性細胞因子諸如ifn-γ、tnf-α和il-1進行。若干粘附分子已在淋巴細胞浸潤到腫瘤中的過程中牽涉，包括細胞間粘附分子1(icam-1)、血管內(nèi)皮細胞粘附分子1(v-cam-1)、血管粘附蛋白1(vap-1)和e-選擇素。然而，這些細胞粘附分子通常在腫瘤血管中下調(diào)。因此，在一個實施例中，如本文所公開的癌癥疫苗增加til，上調(diào)粘附分子(在一個實施例中，icam-1、v-cam-1、vap-1、e-選擇素或它們的組合)，上調(diào)促炎性細胞因子(在一個實施例中，ifn-γ、tnf-α、il-1或它們的組合)或它們的組合。

本發(fā)明的方法和組合物的n末端llo蛋白片段在另一個實施例中包含seqidno:2。在另一個實施例中，該片段包含llo信號肽。在另一個實施例中，該片段包含seqidno:2。在另一個實施例中，該片段大約由seqidno:2組成。在另一個實施例中，該片段基本上由seqidno:2組成。在另一個實施例中，該片段對應(yīng)于seqidno:2。在另一個實施例中，該片段與seqidno:2同源。在另一個實施例中，該片段與seqidno:2的片段同源。用于一些實例的δllo的長度為416個aa(不包括信號序列)，因為包括含有半胱氨酸484的激活域在內(nèi)的氨基末端的88個殘基被截短。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會知道，無激活域具體地講無半胱氨酸484的任何δllo均適用于本發(fā)明的方法和組合物。在另一個實施例中，e7或e6抗原與任何δllo(包括pest氨基酸序列，seqidno:1)的融合增強抗原的細胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫性。

在另一個實施例中，用于構(gòu)建本發(fā)明的疫苗的llo蛋白具有以下序列：

mkkimlvfitlilvslpiaqqteakdasafnkensissmappasppaspktpiekkhadeidkyiqgldynknnvlvyhgdavtnvpprkgykdgneyivvekkkksinqnnadiqvvnaissltypgalvkanselvenqpdvlpvkrdsltlsidlpgmtnqdnkivvknatksnvnnavntlverwnekyaqaypnvsakidyddemaysesqliakfgtafkavnnslnvnfgaisegkmqeevisfkqiyynvnvneptrpsrffgkavtkeqlqalgvnaenppayissvaygrqvylklstnshstkvkaafdaavsgksvsgdveltniiknssfkaviyggsakdevqiidgnlgdlrdilkkgatfnretpgvpiayttnflkdnelaviknnseyiettskaytdgkinidhsggyvaqfniswdevnydpegneivqhknwsennksklahftssiylpgnarninvyakectglawewwrtviddrnlplvknrnisiwgttlypkysnkvdnpie(genbank登錄號p13128；seqidno:3；核酸序列在genbank登錄號x15127中示出)。對應(yīng)于該序列的前蛋白的前25個aa為信號序列，并在由細菌分泌時從llo切除。因此，在本實施例中，全長的活性llo蛋白為504個殘基長。在另一個實施例中，將以上llo片段用作并入本發(fā)明的疫苗中的llo片段的來源。

在另一個實施例中，用于本發(fā)明的組合物和方法的llo蛋白的n末端片段具有以下序列：

mkkimlvfitlilvslpiaqqteakdasafnkensissvappasppaspktpiekkhadeidkyiqgldynknnvlvyhgdavtnvpprkgykdgneyivvekkkksinqnnadiqvvnaissltypgalvkanselvenqpdvlpvkrdsltlsidlpgmtnqdnkivvknatksnvnnavntlverwnekyaqaysnvsakidyddemaysesqliakfgtafkavnnslnvnfgaisegkmqeevisfkqiyynvnvneptrpsrffgkavtkeqlqalgvnaenppayissvaygrqvylklstnshstkvkaafdaavsgksvsgdveltniiknssfkaviyggsakdevqiidgnlgdlrdilkkgatfnretpgvpiayttnflkdnelaviknnseyiettskaytdgkinidhsggyvaqfniswdevnyd(seqidno:2)。

在另一個實施例中，該llo片段對應(yīng)于本文所用的llo蛋白的約aa20-442。

在另一個實施例中，llo片段具有以下序列：

mkkimlvfitlilvslpiaqqteakdasafnkensissvappasppaspktpiekkhadeidkyiqgldynknnvlvyhgdavtnvpprkgykdgneyivvekkkksinqnnadiqvvnaissltypgalvkanselvenqpdvlpvkrdsltlsidlpgmtnqdnkivvknatksnvnnavntlverwnekyaqaysnvsakidyddemaysesqliakfgtafkavnnslnvnfgaisegkmqeevisfkqiyynvnvneptrpsrffgkavtkeqlqalgvnaenppayissvaygrqvylklstnshstkvkaafdaavsgksvsgdveltniiknssfkaviyggsakdevqiidgnlgdlrdilkkgatfnretpgvpiayttnflkdnelaviknnseyiettskaytd(seqidno:4)。

在另一個實施例中，“截短的llo”或“δllo”是指包含pest氨基酸域的llo片段。在另一個實施例中，該術(shù)語是指包含pest序列的llo片段。

在另一個實施例中，該術(shù)語是指不包含氨基末端的活化域并且不包含胱氨酸484的llo片段。在另一個實施例中，該術(shù)語是指非溶血性llo片段。在另一個實施例中，llo片段因活化域的缺失或突變而成為非溶血的。在另一個實施例中，llo片段因半胱氨酸484的缺失或突變而成為非溶血的。在另一個實施例中，llo片段因另一位置的缺失或突變而成為非溶血的。

在另一個實施例中，llo片段由llo蛋白的大約前441個aa構(gòu)成。在另一個實施例中，llo片段由llo的大約前420個aa構(gòu)成。在另一個實施例中，該llo片段為llo蛋白的非溶血形式。

在另一個實施例中，llo片段包含對應(yīng)于以上aa范圍之一的同源llo蛋白的殘基。殘基編號在另一個實施例中不必精確對應(yīng)以上列舉的殘基編號；例如，如果該同源llo蛋白相對于本文所用的llo蛋白具有插入或缺失，則可因此而調(diào)整該殘基編號。

在另一個實施例中，該llo片段為本領(lǐng)域已知的任何其他llo片段。

在另一個實施例中，將重組李斯特菌菌株以1×10⁹-3.31×10¹⁰個cfu的劑量施用給人受試者。在另一個實施例中，劑量為5-500×10⁸個cfu。在另一個實施例中，劑量為7-500×10⁸個cfu。在另一個實施例中，劑量為10-500×10⁸個cfu。在另一個實施例中，劑量為20-500×10⁸個cfu。在另一個實施例中，劑量為30-500×10⁸個cfu。在另一個實施例中，劑量為50-500×10⁸個cfu。在另一個實施例中，劑量為70-500×10⁸個cfu。在另一個實施例中，劑量為100-500×10⁸個cfu。在另一個實施例中，劑量為150-500×10⁸個cfu。在另一個實施例中，劑量為5-300×10⁸個cfu。在另一個實施例中，劑量為5-200×10⁸個cfu。在另一個實施例中，劑量為5-150×10⁸個cfu。在另一個實施例中，劑量為5-100×10⁸個cfu。在另一個實施例中，劑量為5-70×10⁸個cfu。在另一個實施例中，劑量為5-50×10⁸個cfu。在另一個實施例中，劑量為5-30×10⁸個cfu。在另一個實施例中，劑量為5-20×10⁸個cfu。在另一個實施例中，劑量為1-30×10⁹個cfu。在另一個實施例中，劑量為1-20×10⁹個cfu。在另一個實施例中，劑量為2-30×10⁹個cfu。在另一個實施例中，劑量為1-10×10⁹個cfu。在另一個實施例中，劑量為2-10×10⁹個cfu。在另一個實施例中，劑量為3-10×10⁹個cfu。在另一個實施例中，劑量為2-7×10⁹個cfu。在另一個實施例中，劑量為2-5×10⁹個cfu。在另一個實施例中，劑量為3-5×10⁹個cfu。

在另一個實施例中，劑量為1×10⁹個生物體。在另一個實施例中，劑量為1.5×10⁹個生物體。在另一個實施例中，劑量為2×10⁹個生物體。在另一個實施例中，劑量為3×10⁹個生物體。在另一個實施例中，劑量為4×10⁹個生物體。在另一個實施例中，劑量為5×10⁹個生物體。在另一個實施例中，劑量為6×10⁹個生物體。在另一個實施例中，劑量為7×10⁹個生物體。在另一個實施例中，劑量為8×10⁹個生物體。在另一個實施例中，劑量為10×10⁹個生物體。在另一個實施例中，劑量為1.5×10¹⁰個生物體。在另一個實施例中，劑量為2×10¹⁰個生物體。在另一個實施例中，劑量為2.5×10¹⁰個生物體。在另一個實施例中，劑量為3×10¹⁰個生物體。在另一個實施例中，劑量為3.3×10¹⁰個生物體。在另一個實施例中，劑量為4×10¹⁰個生物體。在另一個實施例中，劑量為5×10¹⁰個生物體。

在另一個實施例中，本發(fā)明的方法的重組多肽由重組李斯特菌菌株表達。在另一個實施例中，該表達由重組李斯特菌菌株攜帶的核苷酸分子介導(dǎo)。

在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株通過編碼重組多肽的質(zhì)粒表達重組多肽。在另一個實施例中，該質(zhì)粒包含編碼細菌轉(zhuǎn)錄因子的基因。在另一個實施例中，該質(zhì)粒編碼李斯特菌轉(zhuǎn)錄因子。在另一個實施例中，該轉(zhuǎn)錄因子為prfa。在另一個實施例中，該prfa為突變體prfa。在另一個實施例中，該prfa包含d133v氨基酸突變。在另一個實施例中，轉(zhuǎn)錄因子是本領(lǐng)域已知的任何其他轉(zhuǎn)錄因子。

在另一個實施例中，該質(zhì)粒包含編碼代謝酶的基因。在另一個實施例中，該代謝酶為細菌代謝酶。在另一個實施例中，該代謝酶為李斯特菌代謝酶。在另一個實施例中，該代謝酶為氨基酸代謝酶。在另一個實施例中，該氨基酸代謝酶涉及細胞壁合成途徑。在另一個實施例中，該代謝酶是d-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因(dat)的產(chǎn)物。在另一個實施例中，該代謝酶是丙氨酸消旋酶基因(dal)的產(chǎn)物。在另一個實施例中，該代謝酶是本領(lǐng)域已知的任何其他代謝酶。

在另一個實施例中，本發(fā)明的方法還包括用本發(fā)明的重組李斯特菌菌株強化人受試者的步驟。在另一個實施例中，用于強化接種的重組李斯特菌菌株與用于初始的“初免”接種的菌株相同。在另一個實施例中，強化菌株不同于初免菌株。在另一個實施例中，將相同的劑量用于初免和強化接種。在另一個實施例中，將大劑量用于強化。在另一個實施例中，將小劑量用于強化。

在另一個實施例中，本發(fā)明的方法還包括用包含e7抗原的免疫原性組合物接種人受試者的步驟。在另一個實施例中，免疫原性組合物包含重組e7蛋白或其片段。在另一個實施例中，免疫原性組合物包含表達重組e7蛋白或其片段的核苷酸分子。在另一個實施例中，在李斯特菌接種之后施用非李斯特菌接種。在另一個實施例中，在李斯特菌接種之前施用非李斯特菌接種。

在另一個實施例中，“強化”是指給受試者施用另外的疫苗劑量。在本發(fā)明方法的另一個實施例中，施用2次強化(或總共3次接種)。在另一個實施例中，施用3次強化。在另一個實施例中，施用4次強化。在另一個實施例中，施用5次強化。在另一個實施例中，施用6次強化。在另一個實施例中，施用超過6次強化。

本發(fā)明的方法和組合物的重組李斯特菌菌株在另一個實施例中是重組單核細胞增多性李斯特菌菌株。在另一個實施例中，李斯特菌菌株是重組西爾李斯特菌(listeriaseeligeri)菌株。在另一個實施例中，李斯特菌菌株是重組格雷李斯特菌(listeriagrayi)菌株。在另一個實施例中，李斯特菌菌株是重組伊萬諾夫李斯特菌(listeriaivanovii)菌株。在另一個實施例中，李斯特菌菌株是重組默里李斯特菌(listeriamurrayi)菌株。在另一個實施例中，李斯特菌菌株是重組威耳遜李斯特菌(listeriawelshimeri)菌株。在另一個實施例中，該李斯特菌菌株是本領(lǐng)域已知的任何其他李斯特菌屬菌種的重組菌株。

本發(fā)明提供多種用于制備或工程化本發(fā)明的減毒李斯特菌的李斯特菌屬菌種和菌株。在一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌10403s野生型(參見bishop和hinrichs(1987)j.immunol.139:2005–2009；lauer等人(2002)j.bact.184:4177–4186)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌dp-l4056(噬菌體解離的)(參見lauer等人(2002)j.bact.184:4177–4186)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌dp-l4027，其為噬菌體解離的并為hly基因缺失的(參見lauer等人(2002)j.bact.184:4177–4186；jones和portnoy(1994)infect.immunity65:5608–5613)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌dp-l4029，其為噬菌體解離的、acta缺失的(參見lauer等人(2002)j.bact.184:4177–4186；skoble等人(2000)j.cellbiol.150:527–538)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌dp-l4042(δpest)(參見brockstedt等人(2004)proc.natl.acad.sci.usa101:13832–13837；支持信息)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌dp-l4097(llo-s44a)(參見brockstedt等人(2004)proc.natl.acad.sci.usa101:13832–13837；支持信息)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌dp-l4364(δlpla；脂蛋白連接酶(lipoateproteinligase))(參見brockstedt等人(2004)proc.natl.acad.sci.usa101:13832–13837；支持信息)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌dp-l4405(δinla)(參見brockstedt等人(2004)proc.natl.acad.sci.usa101:13832–13837；支持信息)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌dp-l4406(δinlb)(參見brockstedt等人(2004)proc.natl.acad.sci.usa101:13832–13837；支持信息)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌cs-l0001(δacta-deltainlb)(參見brockstedt等人(2004)proc.natl.acad.sci.usa101:13832–13837；支持信息)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌cs-l0002(δacta-deltalpla)(參見brockstedt等人(2004)proc.natl.acad.sci.usa101:13832–13837；支持信息)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌cs-l0003(l461t-δlpla)(參見brockstedt等人(2004)proc.natl.acad.sci.usa101:13832–13837；支持信息)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌dp-l4038(δacta-llol461t)(參見brockstedt等人(2004)proc.natl.acad.sci.usa101:13832–13837；支持信息)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌dp-l4384(s44a-llol461t)(參見brockstedt等人(2004)proc.natl.acad.sci.usa101:13832–13837；支持信息)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌。脂蛋白中的突變(參見o'riordan等人(2003)science302:462–464)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌dp-l4017(10403shly(l461t)，其在溶血素基因中具有點突變(參見美國臨時專利申請no.60/490,089，2003年7月24日提交)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌egd(參見genbank登錄號al591824)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌egd-e(參見genbank登錄號nc_003210，atcc登錄號baa-679)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為uvrab缺失的單核細胞增多性李斯特菌dp-l4029(參見2004年2月2日提交的美國臨時專利申請no.60/541,515、2003年7月24日提交的美國臨時專利申請no.60/490,080)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌acta-/inlb-雙突變體(參見atcc登錄號pta-5562)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌lpla突變體或hly突變體(參見授予portnoy等人的美國專利申請no.20040013690)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌dal/dat雙突變體。(參見授予frankel和portnoy的美國專利申請no.20050048081)。本發(fā)明涵蓋包含上述李斯特菌菌株的試劑和方法，以及例如通過質(zhì)粒和/或通過基因組整合進行修飾以包含以下核酸的這些菌株，即編碼以下基因之一或其任意組合的核酸：hly(llo，李斯特菌溶血素)、iap(p60)、inla、inlb、inlc、dal(丙氨酸消旋酶)、dat(d-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、plca、plcb、acta；或介導(dǎo)以下方面的核酸：單壁囊泡的生長、傳播、破裂，雙壁囊泡的破裂，與宿主細胞的結(jié)合，由宿主細胞攝取。本發(fā)明不受上文公開的特定菌株的限制。

在另一個實施例中，本發(fā)明的重組李斯特菌菌株已在動物宿主中傳代。在另一個實施例中，該傳代讓該菌株作為疫苗載體的效能最佳化。在另一個實施例中，該傳代穩(wěn)定李斯特菌菌株的免疫原性。在另一個實施例中，該傳代穩(wěn)定李斯特菌菌株的毒力。在另一個實施例中，該傳代增強李斯特菌菌株的免疫原性。在另一個實施例中，該傳代增強李斯特菌菌株的毒力。在另一個實施例中，該傳代除去李斯特菌菌株的不穩(wěn)定亞株。在另一個實施例中，該傳代降低李斯特菌菌株的不穩(wěn)定亞株的普遍性。在另一個實施例中，李斯特菌菌株包含編碼含抗原重組肽的基因的基因組插入。在另一個實施例中，李斯特菌菌株攜帶包含編碼含抗原重組肽的基因的質(zhì)粒。在另一個實施例中，該傳代如本文所述進行(例如，在實例12中)。在另一個實施例中，該傳代通過本領(lǐng)域已知的任何其他方法進行。

在另一個實施例中，用于本發(fā)明的方法中的重組李斯特菌菌株已儲存在冷凍細胞庫中。在另一個實施例中，重組李斯特菌菌株已儲存在凍干細胞庫中。

在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的細胞庫為主細胞庫。在另一個實施例中，細胞庫為工作細胞庫。在另一個實施例中，細胞庫為良好生產(chǎn)規(guī)范(gmp)細胞庫。在另一個實施例中，細胞庫旨在用于制備臨床級材料。在另一個實施例中，細胞庫符合人用監(jiān)管規(guī)范。在另一個實施例中，細胞庫是本領(lǐng)域已知的任何其他類型的細胞庫。

“良好生產(chǎn)規(guī)范”在另一個實施例中由美國聯(lián)邦法規(guī)(unitedstatescodeoffederalregulations)的(21cfr210–211)定義。在另一個實施例中，“良好生產(chǎn)規(guī)范”由生產(chǎn)臨床級材料或供人類消耗的其他標準定義，例如美國之外的國家/地區(qū)的標準。

在另一個實施例中，本發(fā)明的方法中所用的重組李斯特菌菌株來自一批疫苗劑量。

在另一個實施例中，本發(fā)明的方法中所用的重組李斯特菌菌株來自由美國專利no.8,114,414中所公開的方法制備的冷凍或凍干儲備品，該專利以引用方式并入本文。

在另一個實施例中，本發(fā)明的肽為融合肽。在另一個實施例中，“融合肽”是指包含2個或更多個通過肽鍵或其他化學鍵連接在一起的蛋白的肽或多肽。在另一個實施例中，蛋白通過肽或其他化學鍵直接連接在一起。在另一個實施例中，蛋白通過2個或更多個蛋白之間的1個或更多個氨基酸(例如，“間隔物”)連接在一起。

在另一個實施例中，本發(fā)明的疫苗還包含佐劑。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物所用的佐劑是粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)蛋白。在另一個實施例中，該佐劑包含gm-csf蛋白。在另一個實施例中，該佐劑為編碼gm-csf的核苷酸分子。在另一個實施例中，該佐劑為包含編碼gm-csf的核苷酸分子。在另一個實施例中，該佐劑為皂苷qs21。在另一個實施例中，該佐劑包含皂苷qs21。在另一個實施例中，該佐劑為單磷酰脂質(zhì)a。在另一個實施例中，該佐劑包含單磷酰脂質(zhì)a。在另一個實施例中，該佐劑為sbas2。在另一個實施例中，該佐劑包含sbas2。在另一個實施例中，該佐劑為含有未甲基化的cpg的寡核苷酸。在另一個實施例中，該佐劑包含含有未甲基化的cpg的寡核苷酸。在另一個實施例中，該佐劑為免疫刺激性細胞因子。在另一個實施例中，該佐劑包含免疫刺激性細胞因子。在另一個實施例中，該佐劑為編碼免疫刺激性細胞因子的核苷酸分子。在另一個實施例中，該佐劑包含編碼免疫刺激性細胞因子的核苷酸分子。在另一個實施例中，該佐劑為或包含刺糖苷(quillglycoside)。在另一個實施例中，該佐劑為或包含細菌有絲分裂原。在另一個實施例中，該佐劑為或包含細菌毒素。在另一個實施例中，該佐劑為或包含本領(lǐng)域已知的任何其他佐劑。

在另一個實施例中，本發(fā)明的核苷酸可操作地連接至驅(qū)動編碼肽在李斯特菌菌株中表達的啟動子/調(diào)控序列。可用于驅(qū)動基因的組成型表達的啟動子/調(diào)控序列是本領(lǐng)域熟知的，并且包括但不限于例如李斯特菌的phlya、pacta和p60啟動子，鏈球菌(streptococcus)bac啟動子，灰色鏈霉菌(streptomycesgriseus)sgia啟動子以及蘇云金芽孢桿菌(b.thuringiensis)phaz啟動子。在另一個實施例中，編碼本發(fā)明的肽的核酸的誘導(dǎo)型和組織特異性表達通過將編碼該肽的核酸置于誘導(dǎo)型或組織特異性啟動子/調(diào)控序列的調(diào)控下實現(xiàn)。可用于此目的的組織特異性或誘導(dǎo)型啟動子/調(diào)控序列的例子包括但不限于mmtvltr誘導(dǎo)型啟動子和sv40晚期增強子/啟動子。在另一個實施例中，采用響應(yīng)于誘導(dǎo)劑(諸如金屬、糖皮質(zhì)素等等)而誘導(dǎo)的啟動子。因此，應(yīng)當理解，本發(fā)明包括使用任何已知或未知的并且能夠驅(qū)動與其可操作地連接的所需蛋白的表達的啟動子/調(diào)控序列。

本發(fā)明的方法和組合物中使用的acta蛋白的n末端片段在另一個實施例中具有seqidno:5:

mrammvvfitancitinpdiifaatdsedsslntdeweeekteeqpsevntgpryetarevssrdikeleksnkvrntnkadliamlkekaekgpninnnnseqtenaaineeasgadrpaiqverrhpglpsdsaaeikkrrkaiassdselesltypdkptkvnkkkvakesvadasesdldssmqsadesspqplkanqqpffpkvfkkikdagkwvrdkidenpevkkaivdksaglidqlltkkkseevnasdfpppptdeelrlalpetpmllgfnapatsepssfefpppptdeelrlalpetpmllgfnapatsepssfefpppptedeleiiretassldssftrgdlaslrnainrhsqnfsdfppipteeelngrggrp。在另一個實施例中，acta片段包含seqidno:5.在另一個實施例中，acta片段為本領(lǐng)域已知的任何其他acta片段。

在另一個實施例中，編碼acta蛋白的片段的重組核苷酸包含seqidno:6:

atgcgtgcgatgatggtggttttcattactgccaattgcattacgattaaccccgacataatatttgcagcgacagatagcgaagattctagtctaaacacagatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcaaccaagcgaggtaaatacgggaccaagatacgaaactgcacgtgaagtaagttcacgtgatattaaagaactagaaaaatcgaataaagtgagaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagaaaaagcagaaaaaggtccaaatatcaataataacaacagtgaacaaactgagaatgcggctataaatgaagaggcttcaggagccgaccgaccagctatacaagtggagcgtcgtcatccaggattgccatcggatagcgcagcggaaattaaaaaaagaaggaaagccatagcatcatcggatagtgagcttgaaagccttacttatccggataaaccaacaaaagtaaataagaaaaaagtggcgaaagagtcagttgcggatgcttctgaaagtgacttagattctagcatgcagtcagcagatgagtcttcaccacaacctttaaaagcaaaccaacaaccatttttccctaaagtatttaaaaaaataaaagatgcggggaaatgggtacgtgataaaatcgacgaaaatcctgaagtaaagaaagcgattgttgataaaagtgcagggttaattgaccaattattaaccaaaaagaaaagtgaagaggtaaatgcttcggacttcccgccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacaccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcagaaccgagctcattcgaatttccaccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacgccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcggaaccgagctcgttcgaatttccaccgcctccaacagaagatgaactagaaatcatccgggaaacagcatcctcgctagattctagttttacaagaggggatttagctagtttgagaaatgctattaatcgccatagtcaaaatttctctgatttcccaccaatcccaacagaagaagagttgaacgggagaggcggtagacca中示出的序列。在另一個實施例中，重組核苷酸具有seqidno:6中示出的序列。在另一個實施例中，重組核苷酸包含任何其他的編碼acta蛋白的片段的序列。

在本發(fā)明的方法和組合物的另一個實施例中，pest氨基酸序列融合至e7或e6抗原。如本文所公開，表達pest氨基酸序列-抗原融合體的重組李斯特菌菌株誘導(dǎo)抗腫瘤免疫(實例3)并產(chǎn)生抗原特異性、腫瘤浸潤性t細胞(實例4)。另外，證實了包含抗原和含pest氨基酸序列kensissmappasppaspktpiekkhadeidk(seqidno:1)的llo的融合蛋白增強的細胞介導(dǎo)的免疫。

因此，抗原融合至來源于其他原核生物體的其他lmpest氨基酸序列和pest氨基酸序列也將增強抗原的免疫原性。在另一個實施例中，pest氨基酸序列具有選自seqidno:7-12的序列。在另一個實施例中，pest氨基酸序列為來自lmacta蛋白的pest氨基酸序列。在另一個實施例中，pest氨基酸序列為kteeqpsevntgpr(seqidno:7)、kasvtdtsegdldssmqsadestpqplk(seqidno:8)、kneevnasdfpppptdeelr(seqidno:9)或rggiptseefsslnsgdftddensetteeeidr(seqidno:10)。在另一個實施例中，該pest氨基酸序列來自鏈球菌屬菌種(streptococcussp)的鏈球菌溶血素o蛋白。在另一個實施例中，pest氨基酸序列來自釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)的鏈球菌溶血素o，例如aa35-51處的kqntastettttneqpk(seqidno:11)。在另一個實施例中，pest氨基酸序列來自類馬鏈球菌(streptococcusequisimilis)的鏈球菌溶血素o，例如aa38-54處的kqntantettttneqpk(seqidno:12)。在另一個實施例中，該pest氨基酸序列為源自原核生物體的另一pest氨基酸序列。在另一個實施例中，該pest氨基酸序列為本領(lǐng)域已知的任何其他pest氨基酸序列。

可根據(jù)諸如由例如rechsteiner和rogers(1996,trendsbiochem.sci.21:267-271)針對lm所述的方法來鑒定其他原核生物體的pest氨基酸序列?；蛘?，來自其他原核生物體的pest氨基酸序列也可基于這種方法來鑒定?？深A(yù)期其中pest氨基酸序列的其他原核生物體包括但不限于其他的李斯特菌菌種。在另一個實施例中，pest氨基酸序列嵌入抗原性蛋白內(nèi)。因此，在另一個實施例中，“融合體”是指既包含抗原也包含連接在抗原的一端或嵌入抗原內(nèi)的pest氨基酸序列的抗原性蛋白。

在另一個實施例中，使用本領(lǐng)域已知的任何其他方法或算法，例如caspredictor(garay-malpartidahm,occhiuccijm,alvesj,belizarioje.bioinformatics.2005年6月；21增刊1:i169-76)來鑒定pest氨基酸序列。在另一個實施例中，采用以下方法：

通過將1的值分配給氨基酸ser、thr、pro、glu、asp、asn或gln，計算每30-35個氨基酸的段的pest指數(shù)。每個pest殘基的系數(shù)值(cv)為1，每個其他氨基酸(非-pest)的系數(shù)值為0。

在另一個實施例中，本發(fā)明的llo蛋白、acta蛋白或其片段不需要精確地如本文所示的序列那樣，而是可以作出其他保持如本文其他地方所示的融合至抗原的llo或acta蛋白的功能特性的改變、修飾或變化。在另一個實施例中本發(fā)明利用llo蛋白、acta蛋白或其片段的類似物。類似物在另一個實施例中與天然存在的蛋白或肽的不同之處在于保守氨基酸序列差異或不對序列產(chǎn)生影響的修飾或以上兩者。

在另一個實施例中，整個e7蛋白或其片段融合至llo蛋白、acta蛋白或含pest氨基酸序列的肽以生成本發(fā)明的方法的重組肽。所用的e7蛋白(作為整體或作為片段的來源)在另一個實施例中具有序列

mhgdtptlheymldlqpettdlycyeqlndsseeedeidgpagqaepdrahynivtfcckcdstlrlcvqsthvdirtledllmgtlgivcpicsqkp(seqidno:13)。在另一個實施例中，該e7蛋白為seqidno:13的同源物。在另一個實施例中，該e7蛋白為seqidno:13的變體。在另一個實施例中，該e7蛋白為seqidno:13的異構(gòu)體。在另一個實施例中，該e7蛋白為seqidno:13的片段。在另一個實施例中，該e7蛋白為seqidno:13的同源物的片段。在另一個實施例中，該e7蛋白為seqidno:13的變體的片段。在另一個實施例中，該e7蛋白為seqidno:13的異構(gòu)體的片段。

在另一個實施例中，e7蛋白的序列為：

mhgpkatlqdivlhlepqneipvdllcheqlsdseeendeidgvnhqhlparraepqrhtmlcmcckcearielvvessaddlrafqqlflntlsfvcpwcasqq(seqidno:14)。在另一個實施例中，該e7蛋白為seqidno:14的同源物。在另一個實施例中，該e7蛋白為seqidno:14的變體。在另一個實施例中，該e7蛋白為seqidno:14的異構(gòu)體。在另一個實施例中，該e7蛋白為seqidno:14的片段。在另一個實施例中，該e7蛋白為seqidno:14的同源物的片段。在另一個實施例中，該e7蛋白為seqidno:14的變體的片段。在另一個實施例中，該e7蛋白為seqidno:14的異構(gòu)體的片段。

在另一個實施例中，該e7蛋白具有以下genbank條目之一中示出的序列：m24215、nc_004500、v01116、x62843或m14119。在另一個實施例中，該e7蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的同源物。在另一個實施例中，該e7蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的變體。在另一個實施例中，該e7蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的異構(gòu)體。在另一個實施例中，該e7蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的片段。在另一個實施例中，該e7蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的同源物的片段。在另一個實施例中，該e7蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的變體的片段。在另一個實施例中，該e7蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的異構(gòu)體的片段。

在另一個實施例中，整個e6蛋白或其片段融合至llo蛋白、acta蛋白或含pest氨基酸序列的肽以生成本發(fā)明的方法的重組肽。所用的e6蛋白(作為整體或作為片段的來源)在另一個實施例中具有序列

mhqkrtamfqdpqerprklpqlctelqttihdiilecvyckqqllrrevydfafrdlcivyrdgnpyavcdkclkfyskiseyrhycyslygttleqqynkplcdllircincqkplcpeekqrhldkkqrfhnirgrwtgrcmsccrssrtrretql(seqidno:15)。在另一個實施例中，該e6蛋白為seqidno:15的同源物。在另一個實施例中，該e6蛋白為seqidno:15的變體。在另一個實施例中，該e6蛋白為seqidno:15的異構(gòu)體。在另一個實施例中，該e6蛋白為seqidno:15的片段。在另一個實施例中，該e6蛋白為seqidno:15的同源物的片段。在另一個實施例中，該e6蛋白為seqidno:15的變體的片段。在另一個實施例中，該e6蛋白為seqidno:15的異構(gòu)體的片段。

在另一個實施例中，e6蛋白的序列為：

marfedptrrpyklpdlctelntslqdieitcvycktvleltevfefafkdlfvvyrdsiphaachkcidfysrirelrhysdsvygdtlekltntglynllirclrcqkplnpaeklrhlnekrrfhniaghyrgqchsccnrarqerlqrrretqv(seqidno:16)。在另一個實施例中，該e6蛋白為seqidno:16的同源物。在另一個實施例中，該e6蛋白為seqidno:16的變體。在另一個實施例中，該e6蛋白為seqidno:16的異構(gòu)體。在另一個實施例中，該e6蛋白為seqidno:16的片段。在另一個實施例中，該e6蛋白為seqidno:16的同源物的片段。在另一個實施例中，該e6蛋白為seqidno:16的變體的片段。在另一個實施例中，該e6蛋白為seqidno:16的異構(gòu)體的片段。

在另一個實施例中，該e6蛋白具有以下genbank條目之一中示出的序列：m24215、m14119、nc_004500、v01116、x62843或m14119。在另一個實施例中，該e6蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的同源物。在另一個實施例中，該e6蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的變體。在另一個實施例中，該e6蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的異構(gòu)體。在另一個實施例中，該e6蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的片段。在另一個實施例中，該e6蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的同源物的片段。在另一個實施例中，該e6蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的變體的片段。在另一個實施例中，該e6蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的異構(gòu)體的片段。

在另一個實施例中，“同源性”是指與llo序列(如，與seqidno:2-4之一)的同一性大于70％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:2-4之一的同一性大于64％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:2-4之一的同一性大于68％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:2-4之一的同一性大于72％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:2-4之一的同一性大于75％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:2-4之一的同一性大于78％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:2-4之一的同一性大于80％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:2-4之一的同一性大于82％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:2-4之一的同一性大于83％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:2-4之一的同一性大于85％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:2-4之一的同一性大于87％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:2-4之一的同一性大于88％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:2-4之一的同一性大于90％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:2-4之一的同一性大于92％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:2-4之一的同一性大于93％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:2-4之一的同一性大于95％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:2-4之一的同一性大于96％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:2-4之一的同一性大于97％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:2-4之一的同一性大于98％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:2-4之一的同一性大于99％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:2-4之一的同一性為100％。

在另一個實施例中，“同源性”是指與e7序列(如，與seqidno:13-14之一)的同一性大于70％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性大于62％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性大于64％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性大于68％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性大于72％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性大于75％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性大于78％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性大于80％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性大于82％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性大于83％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性大于85％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性大于87％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性大于88％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性大于90％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性大于92％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性大于93％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性大于95％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性大于96％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性大于97％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性大于98％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性大于99％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:13-14之一的同一性為100％。

在另一個實施例中，“同源性”是指與e6序列(如，與seqidno:15-16之一)的同一性大于70％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:15-16之一的同一性大于64％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:15-16之一的同一性大于68％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:15-16之一的同一性大于72％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:15-16之一的同一性大于75％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:15-16之一的同一性大于78％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:15-16之一的同一性大于80％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:15-16之一的同一性大于82％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:15-16之一的同一性大于83％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:15-16之一的同一性大于85％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:15-16之一的同一性大于87％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:15-16之一的同一性大于88％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:15-16之一的同一性大于90％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:15-16之一的同一性大于92％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:15-16之一的同一性大于93％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:15-16之一的同一性大于95％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:15-16之一的同一性大于96％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:15-16之一的同一性大于97％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:15-16之一的同一性大于98％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:15-16之一的同一性大于99％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:15-16之一的同一性為100％。

在另一個實施例中，“同源性”是指與pest氨基酸序列(如，與seqidno:1和7-12之一)或與acta序列(如，與seqidno:5-6之一)的同一性大于70％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性大于60％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性大于64％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性大于68％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性大于72％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性大于75％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性大于78％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性大于80％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性大于82％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性大于83％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性大于85％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性大于87％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性大于88％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性大于90％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性大于92％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性大于93％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性大于95％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性大于96％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性大于97％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性大于98％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性大于99％。在另一個實施例中，“同源性”是指與seqidno:1和7-12或seqidno:5-6之一的同一性為100％。

在一個實施例中，通過本領(lǐng)域充分描述的方法確定蛋白和/或肽對本文列出的任何氨基酸序列的同源性，包括免疫印跡分析，或通過建立的方法采用多種可用軟件包中的任一種通過氨基酸序列的計算機算法分析進行。這些軟件包中的一些例如包括fasta、blast、mpsrch或scanps軟件包，并且在其他實施例中采用smith和waterman算法，和/或整體/局部或blocks比對用于分析。

在另一個實施例中，llo蛋白、acta蛋白或其片段通過化學偶聯(lián)連接到抗原。在另一個實施例中，將戊二醛用于偶聯(lián)。在另一個實施例中，偶聯(lián)采用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法進行。

在另一個實施例中，本發(fā)明的融合蛋白通過任何合適的方法制備，這些方法包括例如克隆和適當序列的限制或通過下文討論的方法直接化學合成。在另一個實施例中，克隆子序列，并使用適當?shù)南拗菩悦盖懈钸m當?shù)淖有蛄小Ｔ诹硪粋€實施例中，然后連接片段生成所需的dna序列。在另一個實施例中，編碼融合蛋白的dna使用dna擴增法例如聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr)制備。首先，在天然dna片段的新末端的任一側(cè)單獨擴增。一個擴增的序列的5'末端編碼肽接頭，而另一個擴增的序列的3'末端也編碼肽接頭。由于第一片段的5'末端與第二片段的3'末端互補，兩個片段(在部分純化后，如在lmp瓊脂糖上)可在第三pcr反應(yīng)中用作重疊模板。擴增的序列將包含密碼子、開口位點羧基側(cè)上的片段(現(xiàn)在形成氨基序列)、接頭和開口位點氨基側(cè)上的序列(現(xiàn)在形成羧基序列)。然后將插入片段連接進質(zhì)粒。

在另一個實施例中，llo蛋白、acta蛋白或其片段以及抗原或其片段通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式偶聯(lián)。在另一個實施例中，抗原或其片段直接地或通過接頭(間隔物)偶聯(lián)到acta蛋白或llo蛋白。在另一個實施例中，嵌合分子作為單鏈融合蛋白以重組方式表達。

在另一個實施例中，本發(fā)明的融合肽使用標準化學肽合成技術(shù)而合成。在另一個實施例中，嵌合分子作為單個連續(xù)多肽合成。在另一個實施例中，llo蛋白、acta蛋白或其片段以及抗原或其片段單獨地合成，然后通過一個分子的氨基末端與另一個分子的羧基末端的縮合而融合，從而形成肽鍵。在另一個實施例中，acta蛋白或llo蛋白和抗原各自與肽間隔分子的一端縮合，從而形成連續(xù)的融合蛋白。

在另一個實施例中，本發(fā)明的肽和蛋白通過固相肽合成(spps)而制備，如由stewart等人在solidphasepeptidesynthesis,第2版,1984,piercechemicalcompany,rockford,ill.中所述，或由bodanszky和bodanszky(thepracticeofpeptidesynthesis,1984,springer-verlag,newyork)所述。在另一個實施例中，適當保護的氨基酸殘基通過其羧基基團連接到衍生化的不溶性聚合物支持物，諸如交聯(lián)的聚苯乙烯或聚酰胺樹脂?！斑m當保護的”是指在氨基酸的α-氨基基團和任何側(cè)鏈官能團上均存在保護基團。側(cè)鏈保護基團通常是對整個合成過程中所用的溶劑、試劑和反應(yīng)條件穩(wěn)定的，并且可在不會影響最終肽產(chǎn)物的條件下移除。寡肽的逐步合成通過以下方式進行：從初始氨基酸移除n保護基團，然后將所需肽的序列中的下一個氨基酸的羧基端偶合到其上。該氨基酸也加以適當保護。可使新來的氨基酸的羧基失活以與支持物結(jié)合的氨基酸的n末端反應(yīng)，反應(yīng)方式是通過形成反應(yīng)性基團，諸如形成碳二亞胺、對稱酸酐或“活性酯”基團，諸如羥基苯并三唑或五氟苯基酯。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種試劑盒，該試劑盒包括本發(fā)明的疫苗、施用裝置和描述本發(fā)明的使用方法的說明性材料。雖然下文描述了模型試劑盒，但是其他可用試劑盒的內(nèi)容物根據(jù)本公開對技術(shù)人員而言將是顯而易見的。這些試劑盒中的每一個代表了本發(fā)明的獨立實施例。

如本文所用，術(shù)語“約”是數(shù)量術(shù)語，意指加或減5％，或在另一個實施例中，加或減10％，或在另一個實施例中，加或減15％，或在另一個實施例中，加或減20％。

在一個實施例中，術(shù)語“受試者”是指需要治療病癥或其后遺癥或易受該病癥或其后遺癥影響的哺乳動物(包括人)。受試者可包括狗、貓、豬、牛、綿羊、山羊、馬、大鼠和寵物小鼠以及人。受試者還可包括家畜。在一個實施例中，術(shù)語“受試者”不排除在所有方面都健康并且不具有或顯示出疾病或病癥的體征的個體。

為了更充分地舉例說明本發(fā)明的優(yōu)選實施例，提供了以下實例。然而，它們絕不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的廣泛范圍。

實驗細節(jié)章節(jié)

(a)實例1：llo-抗原融合蛋白誘導(dǎo)抗腫瘤免疫

材料和實驗方法(實例1-2)

細胞系

c57bl/6同基因tc-1腫瘤經(jīng)hpv-16e6和e7永生化并以c-ha-ras癌基因轉(zhuǎn)化。t.c.wu(johnshopkinsuniversityschoolofmedicine,baltimore,md)所公開的tc-1為高度致瘤的肺上皮細胞，該細胞表達低水平的hpv-16e6和e7，并被c-ha-ras癌基因轉(zhuǎn)化。讓tc-1于37℃及10％co2下生長在rpmi1640、10％fcs、2mml-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、100μm非必需氨基酸、1mm丙酮酸鈉、50微摩爾(mcm)2-me、400微克(mcg)/mlg418以及10％國家典型菌種保藏中心-109培養(yǎng)基(nationalcollectiontypeculture-109medium)中。c3為來自c57bl/6小鼠的小鼠胚胎細胞，該細胞經(jīng)完整hpv16基因組永生化并經(jīng)pej-ras轉(zhuǎn)化。el-4/e7為經(jīng)e7逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的胸腺瘤el-4。

單核細胞增多性李斯特菌菌株和繁殖

所用的李斯特菌菌株為lm-llo-e7(在游離型表達系統(tǒng)中的hly-e7融合基因；圖1a)、lm-e7(整合進李斯特菌基因組中的單拷貝e7基因盒)、lm-llo-np(“dp-l2028”；在游離型表達系統(tǒng)中的hly-np融合基因)和lm-gag(“zy-18”；整合進染色體中的單拷貝hiv-1gag基因盒)。將e7用引物5'-ggctcgagcatggagatacacc-3'(seqidno:17；xhoi位點標有下劃線)和5'-ggggactagtttatggtttctgagaaca-3'(seqidno:18；spei位點標有下劃線)通過pcr擴增并連接進pcr2.1(invitrogen,sandiego,ca)。通過xhoi/spei消化從pcr2.1切離e7，并將其連接進pgg-55。將hly-e7融合基因和多能轉(zhuǎn)錄因子prfa克隆進pam401，即一種多拷貝穿梭質(zhì)粒(wirthr等人,jbacteriol,165:831,1986)，從而生成pgg-55。hly啟動子驅(qū)動hly基因產(chǎn)物的前441個氨基酸(缺乏溶血性c-端，在下文中被稱作“δllo”，并具有seqidno:25中示出的序列)的表達，其通過xhoi位點連接至e7基因，從而產(chǎn)生hly-e7融合基因，該基因被轉(zhuǎn)錄和分泌成llo-e7。用為了在體內(nèi)保留質(zhì)粒而選擇的pgg-55轉(zhuǎn)化prfa陰性李斯特菌菌株xfl-7(由haoshen博士所公開，universityofpennsylvania)(圖1a-b)。使用引物5'-gggggctagccctcctttgattagtatattc-3'(seqidno:19；nhei位點標有下劃線)和5'-ctccctcgagatcataatttacttcatc-3'(seqidno:20；xhoi位點標有下劃線)生成hly啟動子和基因片段。將prfa基因用引物5'-gactacaaggacgatgaccgacaagtgataacccgggatctaaataaatccgttt-3'(seqidno:27；xbai位點標有下劃線)和5'-cccgtcgaccagctcttcttggtgaag-3'(seqidno:21；sali位點標有下劃線)進行pcr擴增。通過將含有驅(qū)動e7的表達和分泌的hly啟動子和信號序列的表達盒引入lm基因組的orfz域中，產(chǎn)生lm-e7。將e7用引物5'-gcggatcccatggagatacacctac-3'(seqidno:22；bamhi位點標有下劃線)和5'-gctctagattatggtttctgag-3'(seqidno:23；xbai位點標有下劃線)通過pcr擴增。然后將e7連接進pzy-21穿梭載體。用得到的質(zhì)粒pzy-21-e7轉(zhuǎn)化lm菌株10403s，該質(zhì)粒包括插入在與lm基因組的orfx、y、z域?qū)?yīng)的1.6-kb序列的中央的表達盒。該同源域允許e7基因盒通過同源重組插入orfz域中。針對e7基因盒在orfz域中的整合，篩選克隆。在含有(lm-llo-e7和lm-llo-np)或不含(lm-e7和zy-18)氯霉素(20μg/ml)的腦心浸液培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌。在-80℃以等分試樣冷凍細菌。通過western印跡法驗證表達(圖2)。

western印跡法

使李斯特菌菌株在luria-bertoni培養(yǎng)基中于37℃生長，并在600nm處測得的相同光密度下收獲。將上清液tca沉淀，并重懸于補充了0.1nnaoh的1x樣品緩沖液中。將相同量的每種細胞沉淀物或每種經(jīng)tca沉淀的上清液上樣至4-20％tris-甘氨酸sds-page凝膠(novex,sandiego,ca)。將凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯，并用抗-e7單克隆抗體(mab)(zymedlaboratories,southsanfrancisco,ca)探測，然后與hrp-偶聯(lián)的抗小鼠二抗(amershampharmaciabiotech,littlechalfont,u.k.)一起溫育，用amershamecl檢測試劑顯影，并暴露于hyperfilm(amershampharmaciabiotech)。

腫瘤生長的測量

每隔一天用卡尺跨最短和最長表面直徑測量腫瘤。將這兩個測量結(jié)果的平均值作為平均腫瘤直徑(以毫米計)相對于不同時間點作圖。當腫瘤直徑達到20mm時，處死小鼠。僅顯示存活小鼠在每個時間點的腫瘤測量結(jié)果。

李斯特菌重組體對建立的腫瘤生長的影響

6-8周齡c57bl/6小鼠(charlesriver)在左脅腹皮下接受2×10⁵個tc-1細胞。腫瘤接種后一周，腫瘤已經(jīng)達到直徑為4-5mm的可觸知大小。然后在第7和14天用0.1ld50腹膜內(nèi)lm-llo-e7(10⁷個cfu)、lm-e7(10⁶個cfu)、lm-llo-np(10⁷個cfu)或lm-gag(5×10⁵個cfu)處理8只小鼠的組。

⁵¹cr釋放測定

以0.1ld50lm-llo-e7、lm-e7、lm-llo-np或lm-gag腹膜內(nèi)免疫6-8周齡c57bl/6小鼠。免疫接種后十天，收獲脾。將經(jīng)照射的tc-1細胞作為飼養(yǎng)細胞，在培養(yǎng)物中建立脾細胞(100:1，脾細胞:tc-1)；在體外刺激5天，然后用在標準⁵¹cr釋放測定中，其中使用下述靶標：el-4、el-4/e7或經(jīng)e7h-2b肽(rahynivtf)脈沖處理的el-4。一式三份地進行的e:t細胞比率為：80:1、40:1、20:1、10:1、5:1和2.5:1。在37℃溫育4h以后，將細胞沉淀，并從每個孔取出50μl上清液。以wallac1450閃爍計數(shù)器(gaithersburg,md)測定樣品。將特異性裂解百分比確定為[(每分鐘的實驗計數(shù)(cpm)-自發(fā)cpm)/(總cpm-自發(fā)cpm)]×100。

tc-1特異性增殖

將c57bl/6小鼠用0.1ld50免疫，并在20天后通過腹膜內(nèi)注射1ld50lm-llo-e7、lm-e7、lm-llo-np或lm-gag進行強化。強化后六天，從經(jīng)免疫的小鼠和未暴露的小鼠收獲脾。以2.5×10⁴、1.25×10⁴、6×10³或3×10³個經(jīng)照射的tc-1細胞/孔作為e7ag的來源，或不用tc-1細胞或用10μg/mlcona，在平底96孔平板中以5×10⁵個/孔在培養(yǎng)物中建立脾細胞。45h后以0.5μci[³h]胸苷/孔脈沖處理細胞。18h以后，采用tomtec采集器96(orange,ct)收獲平板，并用wallac1450閃爍計數(shù)器評估增殖。將以cpm計的變化計算為實驗cpm–無agcpm。

流式細胞術(shù)分析

將c57bl/6小鼠用0.1ld50lm-llo-e7或lm-e7靜脈內(nèi)(i.v.)免疫，并在30天后強化。采用帶軟件(bectondickinson,mountainview,ca)的流式細胞計對cd8(53-6.7，pe偶聯(lián)的)、cd62配體(cd62l；mel-14，apc偶聯(lián)的)和e7h-2db四聚體進行三色流式細胞術(shù)。將強化后第5天收獲的脾細胞在室溫(rt)用負載了e7肽(rahynivtf)或?qū)φ?hiv-gag)肽的h-2db四聚體染色。以1/200稀釋度使用四聚體，其由larryr.pease博士(mayoclinic,rochester,mn)以及由niaidtetramercorefacility和nihaidsresearchandreferencereagentprogram所公開。分析了四聚體⁺、cd8⁺、cd62l^低細胞。

b16f0-ova實驗

給24只c57bl/6小鼠接種5×10⁵個b16f0-ova細胞。在第3、10和17天，將8只小鼠的組用0.1ld50lm-ova(10⁶個cfu)、lm-llo-ova(10⁸個cfu)免疫，另八只動物保持不處理。

統(tǒng)計

為了對比腫瘤直徑，確定每個組的腫瘤大小的平均值和sd，并通過學生t檢驗確定統(tǒng)計顯著性。p≤0.05視作顯著的。

結(jié)果

對比了lm-e7和lm-llo-e7影響tc-1生長的能力。在c57bl/6小鼠的左脅腹上建立皮下腫瘤。七天后，腫瘤已經(jīng)達到可觸知的大小(4-5mm)。在第7和14天，給小鼠接種0.1ld50lm-e7、lm-llo-e7或作為對照的lm-gag和lm-llo-np。lm-llo-e7誘導(dǎo)75％的建立的tc-1腫瘤的完全消退，而在該組中的其他2只小鼠中控制了腫瘤生長(圖3)。相反，使用lm-e7和lm-gag的免疫接種沒有誘導(dǎo)腫瘤消退。該實驗重復(fù)多次，總是得到非常類似的結(jié)果。另外，在不同的免疫方案下，lm-llo-e7也得到了類似的結(jié)果。在另一實驗中，單次免疫能夠治愈小鼠建立的5mmtc-1腫瘤。

在其他實驗中，用另外2個表達e7的腫瘤細胞系得到了類似的結(jié)果：c3和el-4/e7。為了確認以lm-llo-e7接種的效力，分別在第60天或第40天用tc-1或el-4/e7腫瘤細胞重新挑戰(zhàn)已經(jīng)消除了它們的腫瘤的動物。經(jīng)lm-llo-e7免疫的動物保持無腫瘤直到實驗終止(就tc-1而言，第124天；就el-4/e7而言，第54天)。

因此，抗原作為與δllo的融合蛋白的表達會增強所述抗原的免疫原性。

實例2：lm-llo-e7處理引起tc-1特異性脾細胞增殖

為了用lm-llo-e7測量lm-e7對t細胞的誘導(dǎo)，在經(jīng)免疫的小鼠中測量了tc-1特異性增殖性應(yīng)答(抗原特異性免疫活性的度量)。來自經(jīng)lm-llo-e7免疫的小鼠的脾細胞當以20:1、40:1、80:1和160:1的脾細胞:tc-1比率暴露于經(jīng)照射的tc-1細胞(作為e7的來源)時發(fā)生增殖(圖4)。反之，來自經(jīng)lm-e7和rlm對照免疫的小鼠的脾細胞僅表現(xiàn)出背景水平的增殖。

實例3：e7與llo、acta或pest氨基酸序列的融合增強e7特異性免疫并產(chǎn)生浸潤腫瘤的e7特異性cd8⁺細胞

材料和實驗方法

在12只c57bl/6小鼠(n＝3)的左脅腹皮下植入500mcl(微升)其包含100微升的在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中的2×10⁵個tc-1腫瘤細胞和400微升的(bdbiosciences,franklinlakes,n.j.)。在第7、14和21天腹膜內(nèi)免疫小鼠，并在第28天收獲脾和腫瘤。將腫瘤matrigel從小鼠取出，并在含有2毫升(ml)rp10培養(yǎng)基的試管中在冰上4℃溫育過夜。將腫瘤用鑷子切碎，切成2mm塊，并與3ml酶混合物(pbs中0.2mg/ml膠原酶p、1mg/mldnase-1)一起在37℃溫育1小時。將組織懸液穿過尼龍網(wǎng)過濾，并用5％胎牛血清+0.05％的nan3在pbs中的溶液洗滌，以用于四聚體和ifn-γ染色。

在存在布雷菲德菌素a的情況下以10⁷個細胞/ml將脾細胞和腫瘤細胞與1微摩爾(mcm)e7肽一起溫育5小時。將細胞洗滌兩次，并在50微升的抗小鼠fc受體上清液(2.4g2)中4℃溫育1小時或過夜。針對表面分子cd8和cd62l將細胞染色，滲透化，使用滲透化試劑盒或(pharmingen,sandiego,calif.)固定，并針對ifn-γ染色。使用雙激光流式細胞計facscalibur獲取500,000個事件，并使用cellquest軟件(bectondickinson,franklinlakes,nj)分析。計算活化的(cd62l^低)cd8⁺t細胞內(nèi)的ifn-γ分泌細胞的百分比。

對于四聚體染色，讓h-2d^b四聚體負載藻紅蛋白(pe)偶聯(lián)的e7肽(rahynivtf,seqidno:24)，在室溫染色1小時，并用抗別藻藍蛋白(apc)偶聯(lián)的mel-14(cd62l)和fitc偶聯(lián)的cd84℃染色30min。通過對比脾中和腫瘤中的四聚體⁺cd8⁺cd62l^低細胞來分析細胞。

結(jié)果

為了分析lm-acta-e7增強抗原特異性免疫的能力，給小鼠植入tc-1腫瘤細胞，并用lm-llo-e7(1×10⁷個cfu)、lm-e7(1×10⁶個cfu)或lm-acta-e7(2×10⁸個cfu)免疫，或者不處理(未暴露的)。來自lm-llo-e7和lm-acta-e7組的小鼠腫瘤含有比在lm-e7或未暴露的小鼠中更高百分比的分泌ifn-γ的cd8⁺細胞(圖5a)和四聚體特異性cd8⁺細胞(圖5b)。

在另一個實驗中，給荷瘤小鼠施用lm-llo-e7、lm-pest-e7、lm-δpest-e7或lm-e7epi，并測量腫瘤內(nèi)的e7特異性淋巴細胞的水平。在第7和14天用0.1ld50的4種疫苗處理小鼠。在第21天收獲腫瘤，并用針對cd62l、cd8的抗體和用e7/db四聚體染色。在接種lm-llo-e7和lm-pest-e7的小鼠中觀察到四聚體陽性的淋巴細胞在腫瘤內(nèi)增加的百分比(圖6a)。該結(jié)果在三個實驗中是可再現(xiàn)的(圖6b)。

因而，lm-llo-e7、lm-acta-e7和lm-pest-e7各自有效地誘導(dǎo)浸潤腫瘤的cd8⁺t細胞和腫瘤消退。

實例4：李斯特菌疫苗載體通過小鼠傳代引起對異源性和內(nèi)源性抗原的增強的免疫應(yīng)答

材料和實驗方法

細菌菌株

單核細胞增多性李斯特菌菌株10403s血清型1(atcc,manassas,va.)是用于這些研究的野生型生物體和下述構(gòu)建體的親本菌株。菌株10403s在腹膜內(nèi)注入balb/c小鼠時具有大約5×10⁴個cfu的ld50?！發(fā)m-gag”是包含hiv-1菌株hxb(具有形成合胞體的表型的b亞型實驗室菌株)gag基因的拷貝的重組lm菌株，該基因使用經(jīng)修飾的穿梭載體pksv7穩(wěn)定整合進李斯特菌染色體。gag蛋白由該菌株表達和分泌，如通過western印跡所測定。所有菌株均在腦心浸液(bhi)肉湯或瓊脂板(difcolabs,detroit,mich)中生長。

細菌培養(yǎng)

選擇來自表達過客抗原(passengerantigen)和/或融合蛋白的單個克隆的細菌并在bhi肉湯中培養(yǎng)過夜。將該培養(yǎng)物的等分試樣在-70℃下冷凍，不添加添加劑。通過該儲備液，使培養(yǎng)物生長到600nm下0.1-0.2的o.d.，并將等分試樣在-70℃下再次冷凍，不添加添加劑。為了制備克隆的細菌庫，使用以上程序，但在每次傳代后，選擇多個細菌克隆，并檢查靶抗原的表達，如本文所述。將在其中確認了異源抗原的表達的克隆用于下一次傳代。

細菌在小鼠中傳代

6-8周齡雌性balb/c(h-2d)小鼠購自jacksonlaboratories(barharbor,me)并維持在無病原體的微隔離環(huán)境中。冷凍儲存在-70℃下的儲備培養(yǎng)物的等分試樣中的活細菌滴度通過在解凍后且在使用前在bhi瓊脂板上鋪板而測定?？傆?，將5×10⁵個細菌靜脈內(nèi)注射進balb/c小鼠。3天后，收獲脾臟，勻化，并將脾臟勻漿的系列稀釋樣在bhi肉湯中溫育過夜，然后在bhi瓊脂板上鋪板。對于進一步傳代，再次使等分試樣生長到0.1-0.2o.d.，在-70℃下冷凍，并再次通過系列稀釋來測定細菌滴度。在初始傳代(0次傳代)后，將該過程總共重復(fù)4次。

針對ifn-γ的胞內(nèi)細胞因子染色

將淋巴細胞在補充了50u/ml人重組il-2和1微升/mlbrefeldina(golgistop^tm；pharmingen,sandiego,ca)的完全rpmi-10培養(yǎng)基中在存在或不存在hiv-gag的細胞毒性t細胞培(ctl)表位(amqmlketi；seqidno:25)、李斯特菌llo(gykdgneyi；seqidno:26)或hpv病毒基因e7(rahynivtf；seqidno:24)的情況下以1微摩爾的濃度培養(yǎng)5小時。首先對細胞進行表面染色，然后洗滌并接受使用cytofix/cytoperm試劑盒根據(jù)制造商建議(pharmingen,sandiego,ca)進行的胞內(nèi)細胞因子染色。對于胞內(nèi)ifn-γ染色，使用了fitc偶聯(lián)的大鼠抗小鼠ifn-γ單克隆抗體(克隆xmg1.2)及其同種型對照ab(大鼠igg1；均得自pharmingen)?？傆?，在4℃下將10⁶個細胞在含有1％牛血清白蛋白和0.02％疊氮化鈉的pbs(facs緩沖液)中染色30分鐘，然后在facs緩沖液中洗滌3次。在facscan^tm流式細胞儀或facscalibur^tm儀器(bectondickinson,sanjose,ca)上采集樣品數(shù)據(jù)。使用facscalibur^tm流式細胞儀進行cd8(percp偶聯(lián)的，大鼠抗小鼠，克隆53-6.7pharmingen,sandiego,calif.)、cd62l(apc偶聯(lián)的，大鼠抗小鼠，克隆mel-14)和胞內(nèi)ifn-γ的三色流式細胞術(shù)，并通過cellquestsoftware(bectondickinson,mountainview,ca)對數(shù)據(jù)進行進一步分析。將細胞進行cd8高和cd62l^低設(shè)門，然后分析它們的cd8⁺和胞內(nèi)ifn-γ染色。

結(jié)果

在小鼠中傳代增強重組單核細胞增多性李斯特菌的毒力

將三個不同的構(gòu)建體用于確定傳代對重組李斯特菌疫苗載體的影響。這些構(gòu)建體中的兩個攜帶過客抗原的基因組插入：第一個包含hivgag基因(lm-gag)，而第二個包含hpve7基因(lm-e7)。第三個(lm-llo-e7)包含的質(zhì)粒具有與截短形式的llo融合的過客抗原(hpve7)的融合基因和編碼prfa的基因，prfa是控制李斯特菌毒力因子的正調(diào)控因子。該質(zhì)粒用于補充prfa陰性突變體，以使得在活的宿主中，選擇壓力將有利于質(zhì)粒保種，因為沒有質(zhì)粒細菌則無毒性。所有3個構(gòu)建體均已在體外在細菌中廣泛繁殖了許多代。

細菌傳代導(dǎo)致了細菌毒力的增加，如通過脾臟中的存活細菌數(shù)所測量，每一者都是前2代。對于lm-gag和lm-llo-e7，毒力隨著每次傳代而增加，直至第2代(圖7a)。含質(zhì)粒的構(gòu)建體lm-llo-e7展現(xiàn)出最顯著的毒力增加。在傳代前，lm-llo-e7的初始免疫劑量必須增至10⁷個細菌，并且脾臟必須在第2天收獲以便回收細菌(而對于lm-gag的10⁵個細菌的初始劑量則在第3天收獲)。在初始傳代后，lm-llo-e7的標準劑量足以使得可以在第3天收獲。對于lm-e7，經(jīng)未傳代的細菌，毒力增加1.5個數(shù)量級(圖7b)。

因此，通過小鼠傳代增加了李斯特菌疫苗菌株的毒力。

傳代增加單核細胞增多性李斯特菌誘導(dǎo)cd8⁺t細胞的能力

接下來，使用hiv-gag肽amqmlketi(seqidno:25)和llo91-99(gykdgneyi；seqidno:26)，通過用mhci類特異性免疫顯性表位進行細胞內(nèi)細胞因子染色，而確定傳代對抗原特異性cd8⁺t細胞的作用。將10³個cfu的傳代細菌(lm-gag)注射進小鼠產(chǎn)生了大量的hiv-gag特異性cd8⁺t細胞，而相同劑量的未傳代lm-gag未誘導(dǎo)可檢測的gag特異性cd8⁺t細胞。甚至將未傳代細菌的劑量增加100倍也未補償它們的相對毒力；事實上，甚至在更高的劑量下也未引起可檢測的gag特異性cd8⁺t細胞。采用傳代細菌的相同劑量將gag特異性t細胞誘導(dǎo)增加了50％(圖8)。采用llo特異性cd8⁺t細胞，觀察到了相同的抗原特異性cd8⁺t細胞誘導(dǎo)模式，表明這些結(jié)果不是由過客抗原的性質(zhì)導(dǎo)致的，因為它們在用內(nèi)源性李斯特菌抗原llo時觀察到。

因此，通過小鼠傳代增加了李斯特菌疫苗菌株的免疫原性。

實例5：含prfa的質(zhì)粒在不存在抗生素的情況下在具有prfa缺失的lm菌株中是穩(wěn)定的

材料和實驗方法

細菌

單核細胞增多性李斯特菌菌株xfl7在prfa基因中包含300個堿基對缺失。xfl7攜帶部分地恢復(fù)毒力并賦予cap抗性的pgg55，并在美國專利申請公開no.200500118184中有所描述。

從李斯特菌提取質(zhì)粒的方案開發(fā)

將1ml單核細胞增多性李斯特菌lm-llo-e7研究工作細胞庫病毒接種到含有34μg/mlcap的27mlbh1培養(yǎng)基中，并在37℃和200rpm下生長24小時。

使七個2.5ml的培養(yǎng)物樣品沉淀(15000rpm持續(xù)5分鐘)，并將沉淀物在37℃下與50μl溶菌酶溶液溫育從0-60分鐘的不同時長。

溶菌酶溶液：

-29μl1m磷酸氫二鉀

-21μl1m磷酸二氫鉀

-500μl40％蔗糖(通過0.45μm過濾器除菌過濾)

-450μl水

-60μl溶菌酶(50mg/ml)

在與溶菌酶溫育后，將懸浮液如前所述離心，并丟棄上清液。然后使各沉淀接受通過經(jīng)修改版本的qiaprepspinminiprep(qiagen,germantown,maryland)方案進行的質(zhì)粒提取。方案的修改如下：

1.緩沖液pi、p2和n3的體積均提高三倍，以使得增加的生物質(zhì)可被完全裂解。

2.將2mg/ml的溶菌酶加入重懸的細胞中，然后添加p2。然后將裂解溶液在37℃下溫育15分鐘，再進行中和。

3.將質(zhì)粒dna重懸在30μl而不是50μl中以提高濃度。

在其他實驗中，將細胞在p1緩沖液+溶菌酶中溫育15分鐘，然后在室溫下用p2(裂解緩沖液)和p3(中和緩沖液)溫育。

將相等體積的得自各繼代培養(yǎng)的分離的質(zhì)粒dna在0.8％瓊脂糖凝膠上運行，用溴化乙錠染色并觀察結(jié)構(gòu)或分離不穩(wěn)定性的跡象。

結(jié)果表明從單核細胞增多性李斯特菌lm-llo-e7的質(zhì)粒提取效率隨著溶菌酶溫育時間的延長而提高，在大約50分鐘溫育時達到最佳水平。

這些結(jié)果提供從李斯特菌疫苗菌株提取質(zhì)粒的有效方法。

影印培養(yǎng)法

將原始培養(yǎng)物的稀釋樣在不存在或存在34μg/mlcap的情況下在含lb或tb瓊脂的板上鋪板。將選擇性與非選擇性瓊脂之間的計數(shù)差異用于確定是否存在質(zhì)粒任何明顯的分離不穩(wěn)定性。

結(jié)果

在不存在抗生素的情況下pgg55質(zhì)粒在單核細胞增多性李斯特菌菌株xfl7中的遺傳穩(wěn)定性(即，在不存在選擇壓力例如抗生素選擇壓力的情況下質(zhì)粒被細菌保持的程度或質(zhì)粒保持與細菌穩(wěn)定相關(guān)聯(lián)的程度)通過在luria-bertani培養(yǎng)基(lb：5g/lnacl、10g/ml大豆蛋白胨、5g/l酵母提取物)和terrificbroth培養(yǎng)基(tb：10g/l葡萄糖、11.8g/l大豆蛋白胨、23.6g/l酵母提取物、2.2g/lkh2po4、9.4g/lk2hpo4)兩者中以一式兩份培養(yǎng)的方式通過系列傳代培養(yǎng)而評估。將250ml帶擋板的搖瓶中的50ml新鮮培養(yǎng)基用固定數(shù)量的細胞(1odml)接種，然后以24小時的間隔傳代培養(yǎng)。將培養(yǎng)物在定軌搖床中在37℃和200rpm下溫育。在每次傳代培養(yǎng)時，測量od600，并將其用于計算已經(jīng)過的細胞倍增時間(或代數(shù))，直到在lb和tb中分別達到30代和42代。通過離心法沉淀每個傳代培養(yǎng)階段(大約每4代)的已知數(shù)量的細胞(15odml)，然后使用上述qiagenqiaprepspin方案提取質(zhì)粒dna。純化后，使質(zhì)粒dna接受瓊脂糖凝膠電泳，然后進行溴化乙錠染色。雖然制備物中的質(zhì)粒的量在樣品之間略有變化，但是相對于細菌的代數(shù)而言總體趨勢是質(zhì)粒的量恒定(圖9a-b)。因此，pgg55在菌株xfl7中表現(xiàn)出穩(wěn)定性，甚至在不存在抗生素的情況下。

還通過在每個傳代培養(yǎng)階段在瓊脂板上的影印培養(yǎng)而在穩(wěn)定性研究期間監(jiān)測質(zhì)粒穩(wěn)定性。與得自瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果一致，在lb或tb液體培養(yǎng)(分別為圖10和圖11)中在整個研究期間含質(zhì)粒的細胞的數(shù)量均無整體變化。

這些發(fā)現(xiàn)證明編碼prfa的質(zhì)粒在不存在抗生素的情況下在含prfa突變的李斯特菌菌株中表現(xiàn)出穩(wěn)定性。

材料與方法(實例6-10)

pcr試劑：

用于擴增prfa基因及辨別d133v突變的引物在表1中示出。通過將引物在te緩沖液中稀釋到400μm而制備了引物adv451、452和453的儲備溶液。將儲備溶液的等分試樣在水(pcr級)中進一步稀釋到20μm以制備工作溶液。將引物儲存在-20℃。pcr中所用的試劑在表2中示出。

表1.引物adv451、452和453。

表2.pcr試劑。

質(zhì)粒dna制備

使用purelink^tmhipure質(zhì)粒中量提取試劑盒(invitrogen,k2100-05)根據(jù)制造商的說明從大腸桿菌或單核細胞增多性李斯特菌通過中量制備而提取并純化具有(pgg55d133v)和不具有(pgg55wt)prfa突變的pgg55質(zhì)粒。對于從李斯特菌的質(zhì)粒純化，將攜帶pgg55d133v或wt質(zhì)粒的細菌菌株從冷凍的儲備品劃線接種到補充了氯霉素(25μg/ml)的bhi瓊脂板中。使來自每個菌株的單個集落在5ml選擇性培養(yǎng)基(具有25μg/ml氯霉素的bhi肉湯)中在37℃和劇烈搖晃下生長6小時，然后以1:500傳代接種在100ml選擇性培養(yǎng)基中在相似的條件下生長過夜。將來自過夜培養(yǎng)的細菌通過在4,000xg下離心10分鐘而收獲，然后重懸在含有2mg/ml溶菌酶(sigma,l7001)的緩沖液r3(重懸緩沖液)中。將細菌懸液在37℃下溫育至少1小時，然后轉(zhuǎn)到常規(guī)方案。在分光光度計中在260nm和280nm下測量經(jīng)稀釋的質(zhì)粒的濃度和純度。為了制備模板dna，從中量制備儲備溶液將pgg55d133v和wt質(zhì)粒重懸在水中達到1ng/μl的最終濃度。對于pgg55wt質(zhì)粒，從1ng/μl溶液制備了系列10倍稀釋樣，對應(yīng)于從10^-1至10^-7的稀釋。

測試臨床級材料的prfa特異性pcr方案

反應(yīng)混合物包含1xpcr緩沖液、1.5mmmgcl2、0.8mmdntp、0.4μm的各引物、0.05u/μltaqdna聚合酶和0.04ng/μlpgg55d133v模板質(zhì)粒。對于各測試，需要10根管，在25μl反應(yīng)中每根管的關(guān)鍵組分在表3中示出。對于pcr反應(yīng)，用如表4所示的足夠11次反應(yīng)的試劑制備主混合物，然后將24μl該pcr混合物加入各管中。隨后，將總共1μl系列稀釋的pgg55wt質(zhì)粒加入對應(yīng)的管中：管3中1ng；管4中100pg；管5中10pg；管6中1pg；管7中100fg；管8中10fg；管9中1fg；管10中0.1fg。將該系列稀釋樣用于校準標準曲線以確定方法靈敏度。另外，將0.5μl水和0.5μl引物adv451(20μm儲備液)加入管1中，并將1μl水加入管2中，達到25μl的最終體積。對于25μl反應(yīng)，每根管的每種試劑的量在表5中示出。用在反應(yīng)中的pcr循環(huán)條件在表6中示出。

在pcr反應(yīng)結(jié)束后，將5μl凝膠上樣緩沖液(6x，具有溴酚藍)加到每個樣品中，并通過在tbe緩沖液中的1.2％瓊脂糖凝膠上電泳分析10μl。凝膠尺寸為7cm×7cm×1cm，具有15個樣品孔(1mm×2mm)的梳。凝膠在100v下運行約30分鐘，直到溴酚藍染料到達凝膠的中間。將凝膠在溴化乙錠(0.5μg/ml)中染色20分鐘，在水中脫色10分鐘。通過用紫外光照射而觀察凝膠，并拍照。使用條帶密度測量軟件(quantityone4.5.1版，biorad)分析圖像。

表3.一套單獨的pcr反應(yīng)對方法進行驗證以檢測野生型prfa序列在lm-llo-e7樣品中的存在性。

表4.主pcr混合物制備。

表5.使用引物adv451、452和453對方法進行驗證以檢測野生型prfa序列的存在性的pcr方案。

^apgg55wt(管3中1ng；管4中100pg；管5中10pg；管6中1pg；管7中100fg；管8中10fg；管9中1fg；管10中0.1fg)。

^b在管1中，添加0.5μl水和0.5μl引物adv451(20μm儲備液)；在管2中添加1μl水。

表6.使用引物adv451、452和453檢測野生型prfa序列的存在性的pcr循環(huán)條件。

測序：

使用雙脫氧測序法進行了質(zhì)粒的測序。將質(zhì)粒pgg55d133v和pgg55wt以不同的比率(1:1、1:10、1:100、1:1,000和1:10,000)混合。將混合物中質(zhì)粒的總量保持恒定(500μg)，并將包含野生型序列的質(zhì)粒關(guān)于d133v質(zhì)粒進行10倍系列稀釋以確定方法的靈敏度。

結(jié)果

實例6：測序不是檢測d133v突變的回復(fù)的靈敏方法。

為了估計測序在檢測野生型prfa序列中的靈敏度，將pgg55d133v和wt質(zhì)粒以不同的比率混合并測序。結(jié)果在圖12中示出，并揭示測序在辨別prfad133v突變中具有高度特異性(圖12)。在另一方面，靈敏度較低，并且在序列中具有可檢測峰的野生型prfapgg55質(zhì)粒的最大稀釋度是1/10(圖12)?？傊m然測序具有非常高的特異性，但是該方法的靈敏度較低，且不適于篩選罕見事件(諸如prfad133v突變在lm-llo-e7樣品中的回復(fù)體)的存在性。

實例7：開發(fā)高度特異性且靈敏的pcr方法來檢測d133v突變的回復(fù)。

鑒于用測序來檢測罕見事件的低靈敏度，有必要開發(fā)具有類似特異性的更靈敏的方法來檢測野生型d133v突變的回復(fù)。為了實現(xiàn)該目標，我們設(shè)計了一種基于pcr的方法，該方法特異性擴增野生型序列并且足夠靈敏檢測10,000,000個d133v突變序列拷貝中的至少1個野生型prfa拷貝。我們設(shè)計了3個引物用于該方法：adv451、adv452和adv453(表1)。adv451和adv452均為正向引物，且差異在于3’位置的最后一個核苷酸以區(qū)分prfa基因的位置398處的a→t(d133v)突變。adv453引物是位于adv451和adv452引物的退火位點下游大約300bp處的反向引物(圖13)。引物adv451或adv452和adv453所得的預(yù)期pcr條帶為326bp。在嚴格條件下，adv451引物不應(yīng)擴增pgg55d133v質(zhì)粒，而adv452將為野生型prfa序列特異性的。

實例8：pcr方法的特異性。

使用引物adv451的反應(yīng)具有非常高的特異性，并擴增了突變的d133vprfa序列(泳道1至3)，但未擴增野生型序列(泳道4至6)。然而，當使用5ng的模板dna而不是使用1ng時，可在泳道4中檢測到非常弱的條帶(圖14)。

如圖15中所示，使用adv452引物的反應(yīng)僅擴增了野生型prfa序列(泳道4、5和6)，當將攜帶d133vprfa突變的pgg55用作模板時未檢測到條帶(泳道1、2和3)，甚至當在反應(yīng)中使用5ng質(zhì)粒時也是如此(圖16)?？傊?，使用引物adv451和adv452的pcr反應(yīng)具有非常高的特異性，并且能夠辨別在pgg55質(zhì)粒中的prfa基因的位置398處的(d133v)突變?；谶@些結(jié)果，我們選擇1ng的量作為將用在反應(yīng)中的模板dna的標準量。

實例9：pcr方法的靈敏度。

使用1ng的模板dna測試了反應(yīng)的靈敏度。對于攜帶野生型prfa序列的質(zhì)粒，還將降低的dna量(對應(yīng)于從10^-1至10^-7的10倍稀釋)包括在反應(yīng)中以估計靈敏度。在這些反應(yīng)中，僅使用了引物adv452和adv453。在具有30個循環(huán)(10個循環(huán)的退火溫度為53℃，另20個循環(huán)的退火溫度為50℃)的pcr反應(yīng)中，方法的靈敏度為1/100,000(數(shù)據(jù)未示出)。如圖5中所示，對于d133v回復(fù)體的檢測，將pcr循環(huán)數(shù)增至37將方法的視覺靈敏度提高至10^-6，而不明顯損害特異性。當將1ng質(zhì)粒用作初始dna量時，在10^-6稀釋下可見明顯的條帶，這對應(yīng)于一百萬個d133v突變體中1個野生型序列拷貝的檢測水平。在較長的暴露后在泳道1和9中僅可觀察到非常弱的條帶，再次確保了方法可靠的特異性。在另一方面，當以5ngdna開始時，在10^-7稀釋下可容易地檢測到條帶，從而提高了pcr的靈敏度。然而，使用pgg55d133v質(zhì)粒也可檢測到類似強度的條帶，從而表明方法的特異性限度(圖17)。通過pgg55d133v質(zhì)粒觀察到的該條帶可能是由于用引物adv452對d133v突變的非特異性擴增，通過增加的循環(huán)數(shù)，該突變可以明顯蓄積。這些結(jié)果表明在不明顯損害特異性的情況下該方法的靈敏度限度位于1:1,000,000與1:10,000,000之間。

實例10：表達llo與e7的融合蛋白(lm-llo-e7)的重組李斯特菌

該菌株的減毒程度比野生型親本菌株10403s高大約4-5個數(shù)量級，并分泌融合蛋白tllo-e7。該免疫療法基于骨架xfl7，其通過毒力基因轉(zhuǎn)錄激活因子prfa中的不可逆缺失而衍生自10403s。prfa調(diào)控若干毒力基因諸如李斯特菌溶血素o(llo)、acta、plca(磷脂酶a)、plcb(磷脂酶b)等的轉(zhuǎn)錄，這些基因是單核細胞增多性李斯特菌的體內(nèi)胞內(nèi)生長和存活所需的。質(zhì)粒pgg55借助“氯霉素”的選擇而由lm-llo-e7在體外保持。然而，對于lm-llo-e7對質(zhì)粒的體內(nèi)保持而言，其攜帶突變的prfa(d133v)的拷貝，已證實其在dna結(jié)合和激活毒力基因的轉(zhuǎn)錄方面的活性不如野生型prfa。我們已觀察到，與突變的prfa的互補作用導(dǎo)致與野生型菌株10403s相比從lm-llo-e7分泌的llo的量降低大約40倍。這暗示：菌株lm-llo-e7可能表現(xiàn)出降低的受prfa調(diào)控的毒力基因諸如acta、inla、inlb、inlc、plcb等的表達。在lm-llo-e7中，與突變的prfa拷貝的互補作用可能導(dǎo)致受prfa調(diào)控的不同毒力基因的表達降低，從而導(dǎo)致總體減毒大約4-5個數(shù)量級。

實例11：抗e7腫瘤應(yīng)答

招募

–6名具有ii–iv期hpvopc的患者入選

–5名患者用adxs-hpv治療

–5名患者采集疫苗前和初始疫苗后腫瘤及血液樣品。

測定

在疫苗施用前后執(zhí)行組織測定

–h&e組織病理學

–多重免疫熒光

–基因表達簽名的nanostring分析

血液

–通過流式細胞術(shù)進行的免疫表型分型

–hpv抗原特異性t細胞應(yīng)答

–hpv血清學

–癌-睪丸抗原血清學

結(jié)果

在用lm-llo-e7(adxs-hpv)進行疫苗接種前后，從5名患者獲取人腫瘤組織樣品。結(jié)果顯示出嗜堿性淋巴細胞樣浸潤巢(參見圖24)和致密的瘤內(nèi)cd8浸潤和基質(zhì)cd4浸潤(圖25)。

在用lm-llo-e7(adxs-hpv)進行疫苗接種前后，從5名患者獲取人血液樣品，并執(zhí)行elispot-直接分析測定(無再刺激和培養(yǎng))。在疫苗接種后觀測到hpv-e7應(yīng)答的平均增加>3倍，并在5名患者的3名中觀測到應(yīng)答增加(圖26)。相比之下，相比非疫苗抗原(hpv-e6和e2)，不存在疫苗治療后的應(yīng)答增加，證實了hpv-e7應(yīng)答是抗原特異性的(圖27)。

實例12：adxs-hpv腫瘤應(yīng)答的ii期臨床研究

招募和治療

-11名具有ii–iv期hpvopc的患者入選

–8名患者在第1和15天用1×10⁹個集落形成單位的lm-llo-e7(adxs-hpv)治療

-9名患者采集疫苗前和初始疫苗后腫瘤及血液樣品。

–之前未進行adxs-hpv治療的接受了經(jīng)口腔機器人手術(shù)(tors)的3名患者的觀察組也入選。

關(guān)鍵納入標準

–具有新診斷的、經(jīng)活檢證實的ii–iv期hpvopc的成年患者(-18歲)。

–能進行tors，接受或未接受頸清掃術(shù)。

–美國東部腫瘤協(xié)作組(easterncooperativeoncologygroup)體能狀態(tài)≤2。

–能夠理解并作出知情同意

關(guān)鍵排除標準

–另一部位有活動癌，或在過去3年內(nèi)有癌癥史。

–之前接受過全身化療或放療。

–處于免疫抑制狀態(tài)或在使用免疫抑制藥物。

–患有肝病或其他對研究藥物的醫(yī)療禁忌癥。

測定

在疫苗施用前后執(zhí)行組織測定

–在研究開始時以及在手術(shù)時采集腫瘤活檢樣品

–h&e組織病理學

–多重免疫熒光

血液

–hpv抗原特異性t細胞應(yīng)答

–hpv血清學

–癌-睪丸抗原血清學

分析

–將基于組織的變化與對外周血中免疫變化的綜合分析相關(guān)聯(lián)。

表7.實驗室研究

elispot，酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)；hnscca，人頭頸鱗狀細胞癌抗原；hpv，人乳頭瘤病毒；

if，免疫熒光；ihc，免疫組織化學；tcr，t細胞受體；tme，腫瘤微環(huán)境。

結(jié)果

研究的總體設(shè)計在圖28a中示出?？偣?1名具有ii–iv期hpvopc的患者入選試驗。在開始研究前從每名患者采集腫瘤活檢樣品。八名患者用1×10⁹個集落形成單位的lm-llo-e7(adxs-hpv)進行疫苗接種，在第一次注射后14天接受加強注射。未接受疫苗接種的具有ii–iv期hpvopc的3名患者的觀察組也入選。在輸注adxs-hpv前給予布洛芬、苯海拉明和止吐劑，在輸注后還施用布洛芬；在每次adxs-hpv給藥后72小時施用一個療程的阿莫西林(或替代性抗生素)。所有患者均在加強注射后10-14天接受醫(yī)護標準的經(jīng)口腔機器人手術(shù)(tors)以取出腫瘤樣品。根據(jù)醫(yī)護標準向所有患者施用輔助放療/放化療(tors后4–6周)。在疫苗接種前1-10天，從除了接受疫苗的兩名患者外的所有患者采集外周血單核細胞(pbmc)樣品。在每次疫苗注射前以及在手術(shù)前，從所有患者采集另外的pbmc樣品。在不同的時間點直至初次疫苗接種后12個月，抽取另外的pbmc樣品(圖28b)。樣品的elispot測定顯示在一些患者中在疫苗接種后e6和e7應(yīng)答均增加(圖29)，以及e6和e7特異性ifn-γ分泌性cd4⁺和cd8⁺t細胞水平增加(圖30)。此外，一些患者在手術(shù)時表現(xiàn)出甚至更穩(wěn)健的e6和e7特異性ifn-γ分泌性cd4⁺和cd8⁺t細胞誘導(dǎo)(圖31)?？傮w而言，8名患者中的5名對e7或e6具有ifn-γ應(yīng)答，并且8名患者中的7名對e7或e6具有tnf-α應(yīng)答(圖32)。多重免疫熒光測定顯示出在adxs-hpv疫苗接種后腫瘤環(huán)境的致密的瘤內(nèi)cd8浸潤(對比圖33a和33c)和減小的腫瘤大小(對比圖33b和33d)，以及疫苗接種后腫瘤中cd8和pd-1的增加(對比圖34a-c和34d-f)。這些觀測結(jié)果在定量分析中得以證實(圖35)，定量分析另外顯示出相對于pd-l1而言pd1表達水平升高(圖36)，以及在adxs-hpv疫苗接種后cd8表達水平升高(圖37)，從而證明了在癌癥患者中adxs-hpv成功激活了抗e6和e7應(yīng)答。

結(jié)論：

在研究結(jié)束時，外周血中的hpv特異性cd8+ctl應(yīng)答從手術(shù)時的基線發(fā)生變化。這種變化可在手術(shù)后的各個時間點觀測到。此外，腫瘤浸潤性效應(yīng)(自然殺傷[nk]細胞、cd4+和cd8+t細胞)和抑制性(treg和mdsc)免疫細胞的概況在研究過程中變化。通過美國國立癌癥研究院常見不良事件評價標準4.0版(nationalcancerinstitutecommonterminologycriteriaforadverseeventsversion4.0)評估了不良事件。

已參考附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行了描述，應(yīng)當理解，本發(fā)明不限于精確的實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在不脫離所附權(quán)利要求書中定義的本發(fā)明范圍和精神的情況下對其進行各種改動和修飾。

序列表

<110>賓夕法尼亞大學理事會

y·佩特森

<120>重組李斯特菌疫苗菌株及其用于癌癥免疫療法的方法

<130>p-78581-pc

<140>pct/us15/999999

<141>2015-10-14

<150>62/065,973

<151>2014-10-20

<150>62/063,828

<151>2014-10-14

<160>30

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>32

<212>prt

<213>單核細胞增多性李斯特菌

<400>1

lysgluasnserilesersermetalaproproalaserproproala

151015

serprolysthrproileglulyslyshisalaaspgluileasplys

202530

<210>2

<211>441

<212>prt

<213>單核細胞增多性李斯特菌

<400>2

metlyslysilemetleuvalpheilethrleuileleuvalserleu

151015

proilealaglnglnthrglualalysaspalaseralapheasnlys

202530

gluasnserileserservalalaproproalaserproproalaser

354045

prolysthrproileglulyslyshisalaaspgluileasplystyr

505560

ileglnglyleuasptyrasnlysasnasnvalleuvaltyrhisgly

65707580

aspalavalthrasnvalproproarglysglytyrlysaspglyasn

859095

glutyrilevalvalglulyslyslyslysserileasnglnasnasn

100105110

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115120125

alaleuvallysalaasnsergluleuvalgluasnglnproaspval

130135140

leuprovallysargaspserleuthrleuserileaspleuprogly

145150155160

metthrasnglnaspasnlysilevalvallysasnalathrlysser

165170175

asnvalasnasnalavalasnthrleuvalgluargtrpasnglulys

180185190

tyralaglnalatyrserasnvalseralalysileasptyraspasp

195200205

glumetalatyrsergluserglnleuilealalyspheglythrala

210215220

phelysalavalasnasnserleuasnvalasnpheglyalaileser

225230235240

gluglylysmetglnglugluvalileserphelysglniletyrtyr

245250255

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260265270

alavalthrlysgluglnleuglnalaleuglyvalasnalagluasn

275280285

proproalatyrileserservalalatyrglyargglnvaltyrleu

290295300

lysleuserthrasnserhisserthrlysvallysalaalapheasp

305310315320

alaalavalserglylysservalserglyaspvalgluleuthrasn

325330335

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340345350

lysaspgluvalglnileileaspglyasnleuglyaspleuargasp

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370375380

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385390395400

lysasnasnserglutyrilegluthrthrserlysalatyrthrasp

405410415

glylysileasnileasphisserglyglytyrvalalaglnpheasn

420425430

ilesertrpaspgluvalasntyrasp

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<210>3

<211>529

<212>prt

<213>單核細胞增多性李斯特菌

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115120125

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145150155160

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165170175

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180185190

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195200205

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325330335

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370375380

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385390395400

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465470475480

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485490495

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500505510

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glu

<210>4

<211>416

<212>prt

<213>單核細胞增多性李斯特菌

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202530

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prolysthrproileglulyslyshisalaaspgluileasplystyr

505560

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65707580

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100105110

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115120125

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195200205

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<212>prt

<213>單核細胞增多性李斯特菌

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<212>dna

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tttaatgctcctgctacatcagaaccgagctcattcgaatttccaccaccacctacggat900

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<213>單核細胞增多性李斯特菌

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2025

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<213>單核細胞增多性李斯特菌

<400>9

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20

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<213>單核細胞增多性李斯特菌

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<213>鏈球菌屬菌種g148

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lys

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<213>類馬鏈球菌

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lys

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<213>人乳頭瘤病毒16型

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<213>人乳頭瘤病毒16型

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<213>人工序列

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cccgtcgaccagctcttcttggtgaag27

<210>22

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>22

gcggatcccatggagatacacctac25

<210>23

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>23

gctctagattatggtttctgag22

<210>24

<211>9

<212>prt

<213>人乳頭瘤病毒16型

<400>24

argalahistyrasnilevalthrphe

15

<210>25

<211>9

<212>prt

<213>人免疫缺陷病毒

<400>25

alametglnmetleulysgluthrile

15

<210>26

<211>9

<212>prt

<213>單核細胞增多性李斯特菌

<400>26

glytyrlysaspglyasnglutyrile

15

<210>27

<211>55

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>27

glyalacysthralacysalaalaglyglyalacysglyalathrgly

151015

alacyscysglyalacysalaalaglythrglyalathralaalacys

202530

cyscysglyglyglyalathrcysthralaalaalathralaalaala

354045

thrcyscysglythrthrthr

5055

<210>28

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>adv451正向引物

<400>28

cctagctaaatttaatgt18

<210>29

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>adv452正向引物

<400>29

cctagctaaatttaatga18

<210>30

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>adv453反向引物

<400>30

taattttccccaagtagcagg21