用于治療疾病的同種異體自噬體富集組合物的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于治療疾病的同種異體自噬體富集組合物
[0001]相關(guān)申請(qǐng)交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2012年10月23日提交的名為“用于治療疾病的自噬體富集組合物(AUTOPHAGOSOME-ENRICHED COMPOSIT1N FOR THE TREATMENT OF DISEASE) ”的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)第61/717，585號(hào)的優(yōu)先權(quán)，在此通過(guò)引用將所述申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容并入本文用于所有目的。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003]本申請(qǐng)涉及自噬體富集組合物以及通過(guò)施用自噬體富集產(chǎn)物本身或與互補(bǔ)治療聯(lián)合來(lái)刺激、增強(qiáng)或促進(jìn)免疫應(yīng)答的方法。
【背景技術(shù)】
[0004]宿主專(zhuān)職抗原遞呈細(xì)胞(APC)對(duì)外源性抗原的交叉遞呈在針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原(包括由腫瘤細(xì)胞衍生的自體抗原或突變的自體抗原，以及由感染因子衍生的外來(lái)抗原)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答的發(fā)生和發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。已經(jīng)在開(kāi)發(fā)的有前景的癌癥疫苗試圖利用外源性抗原的交叉遞呈來(lái)引發(fā)(illicit)針對(duì)腫瘤的特異性免疫應(yīng)答。
[0005]然而，使用癌癥疫苗的特異性主動(dòng)免疫在動(dòng)物模型或臨床試驗(yàn)中并不非常有效(Rosenberg等人，Nat.Med.10:909-15，2004)。癌癥免疫療法成功的主要障礙是疫苗不能誘導(dǎo)大的初始膨脹以及隨后的腫瘤-反應(yīng)性CTL的持續(xù)(Rosenberg等人，Nat.Med.10:909-15, 2004)。癌癥免疫療法現(xiàn)有方法的另一個(gè)障礙是，除了黑色素瘤以外，對(duì)于大多數(shù)癌癥而言，潛在的腫瘤排斥抗原是未知的，而且主要的腫瘤排斥抗原很可能是腫瘤或患者特異性的。
[0006]以前，發(fā)明人已確定用蛋白酶體抑制劑降低或抑制細(xì)胞蛋白降解可以導(dǎo)致缺陷型核糖體產(chǎn)物(DRiPs)和短壽蛋白(SLiPs)(及其免疫原性片段)的細(xì)胞積累并分泌到“小泡(blebs)”中。這里表明，在蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)的自噬之后，從細(xì)胞(例如腫瘤或病原體感染的細(xì)胞)釋放或被包含在所述細(xì)胞中的DRibbles可以將DRiPs和SLiPs (及其片段)積累在自噬體中，并通過(guò)交叉激活而誘導(dǎo)強(qiáng)免疫性(例如抗腫瘤或抗病原體)。例如，腫瘤衍生的Dribbles以及負(fù)載有腫瘤衍生的Dribbles的抗原遞呈細(xì)胞(APCs)(例如樹(shù)突細(xì)胞)，與用活的或死的腫瘤細(xì)胞溫育的APCs相比，在體外或體內(nèi)都可以更有效地激活腫瘤反應(yīng)性細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞(CTL)和輔助性T-淋巴細(xì)胞(HTL)。在具體的實(shí)施例中，對(duì)受試者施用Dribbles (例如分離的Dribble群，如產(chǎn)生Dribbles的細(xì)胞群，或如負(fù)載有Dribble的樹(shù)突細(xì)胞)增加CD4和CD8細(xì)胞的生成并促進(jìn)炎性細(xì)胞因子或趨化因子例如IL-6、IL-12和TNF-α中的一種或多種的產(chǎn)生。
[0007]發(fā)明人之前公開(kāi)了用于產(chǎn)生和分離Dribbles的方法(US2009/0220530)。該方法包括使靶細(xì)胞與足量的蛋白酶體抑制劑在足以產(chǎn)生Dribbles的條件例如基本上抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白降解的條件下接觸。在某些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括使靶細(xì)胞在與蛋白酶體抑制劑接觸之前、之中或之后，與足量的自噬誘導(dǎo)劑接觸。該細(xì)胞也可以與一種或多種減少蛋白糖基化的試劑接觸。在一個(gè)實(shí)施例中，該細(xì)胞與足量的蛋白酶體抑制劑(如20nM萬(wàn)珂(Velcade))、自噬誘導(dǎo)劑(如雷帕霉素或HBSS)和NH4Cl在足以刺激細(xì)胞產(chǎn)生Dribbles的條件下接觸。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)從細(xì)胞中分離所述Dribbles來(lái)收獲在所述條件下生成的DribbIes。在一個(gè)示例性方法中，細(xì)胞可與足量的可包括蛋白酶體抑制劑的組合物在足以基本上抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的條件下接觸，例如溫育6?24小時(shí)。隨后可以將所述細(xì)胞在足以在細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬的條件下溫育，例如用自噬誘導(dǎo)劑溫育6?24小時(shí)。隨后，所得細(xì)胞和Dribbles可在使細(xì)胞成團(tuán)、同時(shí)Dribbles保留在溶液中的條件下離心。隨后可以將包含Dribbles的上清液移除，然后可以在足以使Dribbles成團(tuán)的條件下離心。
[0008]然而，發(fā)明人在此已經(jīng)認(rèn)識(shí)到現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)的用于產(chǎn)生和分離Dribbles的方法不足以產(chǎn)生和分離出自噬體的富集群及其被進(jìn)一步用作有效疫苗的組分物質(zhì)。本公開(kāi)描述了用于篩選可以產(chǎn)生有效疫苗的細(xì)胞系(包括癌細(xì)胞系和非癌細(xì)胞系兩者)的新方法。該細(xì)胞系的特征在于在用蛋白酶體抑制劑和NH4Cl處理時(shí)產(chǎn)生自噬體，所述自噬體除了包含DRiPs、SLiPs和其他腫瘤抗原之外，還可以含有Toll樣受體(TLR)配體、損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)和分子伴侶。另外，在被遞呈到APCs的普通群體時(shí)，Dribbles所含的腫瘤抗原的交叉遞呈可能不足以產(chǎn)生對(duì)抗腫瘤的有效的免疫應(yīng)答。本公開(kāi)描述了用于包含在富集的自噬體中的抗原的有效交叉遞呈的方法，其通過(guò)將富集的自噬體組合物遞呈到表達(dá)CLEC9A的樹(shù)突細(xì)胞(DCs)的特定亞組以產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0009]發(fā)明人在此已經(jīng)認(rèn)識(shí)到上述問(wèn)題，并開(kāi)發(fā)了至少部分解決這些問(wèn)題的組合物和方法。在一個(gè)實(shí)施例中，組合物包括由非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系衍生的自噬體富集群，并且其中所述自噬體富集群包括:一種或多種Toll樣受體激動(dòng)劑；一種或多種腫瘤抗原；和一種或多種損傷相關(guān)分子模式分子。如此，可對(duì)具有不同腫瘤類(lèi)型的患者施用現(xiàn)成的疫苗以刺激目標(biāo)免疫應(yīng)答。
[0010]在另一個(gè)實(shí)施例中，在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的方法，其包括:提供組合物，所述組合物包括由細(xì)胞系衍生的自噬體富集群，所述自噬體富集群包括:一種或多種Toll樣受體激動(dòng)劑；一種或多種腫瘤抗原；和一種或多種損傷相關(guān)分子模式分子。如此，可對(duì)具有不同腫瘤類(lèi)型的患者施用現(xiàn)成的疫苗，同時(shí)用衍生自患者自身血細(xì)胞的炎癥誘導(dǎo)佐劑來(lái)補(bǔ)充。
[0011]在又一個(gè)實(shí)施例中，用于篩選能產(chǎn)生同種異體自噬體富集組合物的細(xì)胞的方法，所述組合物能誘導(dǎo)選擇性標(biāo)記在外周血單核細(xì)胞亞群上的表達(dá)，所述方法包括:使細(xì)胞與蛋白酶體抑制劑接觸；使細(xì)胞與溶酶體抑制劑接觸；收集所得自噬體；確定所得自噬體的分子特征物(signature);和選擇將一種或多種Toll樣受體激動(dòng)劑和/或一種或多種分子伴侶轉(zhuǎn)移到自噬體的細(xì)胞。如此，Toll樣受體激動(dòng)劑、腫瘤抗原和損傷相關(guān)分子模式分子可被包裹在能引發(fā)針對(duì)眾多癌癥類(lèi)型的特異性免疫應(yīng)答的同種異體自噬體富集組合物中。進(jìn)而，當(dāng)用外周血單核細(xì)胞(PBMCs)、單核細(xì)胞、或樹(shù)突細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，所得同種異體自噬體富集組合物可誘導(dǎo)或上調(diào)BDCA3和/或⑶80的表達(dá)，且進(jìn)一步誘導(dǎo)PBMC分泌IL-8或其他細(xì)胞因子。
【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為表不患有各種類(lèi)型的癌癥的患者的百分比的圖，所述癌癥具有在UbLT3和UbLT6 NSCLC細(xì)胞系中上調(diào)最多的500個(gè)基因的上調(diào)。
[0013]圖2A是示出了 SDS-page凝膠的數(shù)字圖像，指明NH4Cl的存在保護(hù)蛋白GAPDH和EEFlAl以免降解。
[0014]圖2B是示出了 SDS-page凝膠的數(shù)字圖像，指明萬(wàn)珂處理增加了泛素化蛋白和短壽抗原在從處理的細(xì)胞中產(chǎn)生的AAECs中的比率。
[0015]圖3A為以表格形式列出AAECs中存在NCI優(yōu)先癌抗原的圖。
[0016]圖3B是示出了 SDS-PAGE凝膠的數(shù)字圖像，指明AAECs中存在NCI優(yōu)先癌抗原。
[0017]圖3C為以表格形式列出AAECs中存在NCI優(yōu)先癌抗原的另一圖。
[0018]圖3D示出其他抗原和多個(gè)批次隨時(shí)間變化的檢測(cè)一致性。
[0019]圖3E為被包含在AAECs中的潛在非突變抗原的匯總表。
[0020]圖4A為以表格形式列出AAECs中存在DAMPs的圖。
[0021]圖4B是示出了 SDS-page凝膠的數(shù)字圖像，指明在由兩種不同的細(xì)胞系衍生的AAECs中存在各種DAMPS。
[0022]圖5A為顯示數(shù)據(jù)的圖，指明AAECs含有高水平的TLR配體。
[0023]圖5B為顯示數(shù)據(jù)的數(shù)字圖像，指明AAECs含有DAMPs。
[0024]圖6為指明AAECs中存在TLR配體的圖。
[0025]圖7A為顯示數(shù)據(jù)的圖，指明在用AAECs處理后BDCA3+細(xì)胞的百分比呈劑量依賴(lài)性增加。
[0026]圖7B為顯示數(shù)據(jù)的圖，指明⑶14+細(xì)胞和BDCA3+細(xì)胞的誘導(dǎo)是相關(guān)的。
[0027]圖7C為顯示數(shù)據(jù)的圖，指明在用AAECs處理后IL_8的濃度呈劑量依賴(lài)性增加。
[0028]圖8A為顯示數(shù)據(jù)的流式細(xì)胞術(shù)圖，指明在用AAEC衍生的UbLT3處理后人⑶14+細(xì)胞中BDCA3+細(xì)胞的百分比呈劑量依賴(lài)性增加。
[0029]圖8B為顯示數(shù)據(jù)的圖，指明與介質(zhì)或TLR4激動(dòng)劑MPL相比，AAECs是BDCA3+細(xì)胞更好的誘導(dǎo)劑。
[0030]圖9A為顯示數(shù)據(jù)的流式細(xì)胞術(shù)圖，指明AAEC誘導(dǎo)的BDCA3+細(xì)胞上調(diào)被TLR拮抗劑抑制。
[0031 ] 圖9B為顯示來(lái)自?xún)蓚€(gè)供體的數(shù)據(jù)的圖，指明在TLR9拮抗劑和對(duì)照ODN滴定之后BDCA3+CD14+細(xì)胞的百分比。
[0032]圖9C為顯示數(shù)據(jù)的圖，指明多次處理后供體PBMC中IL_8的濃度。
[0033]圖9D為顯示數(shù)據(jù)的圖，指明各種共培養(yǎng)處理的AAEC攝取效率。
[0034]圖9E為顯示數(shù)據(jù)的圖，指明上調(diào)⑶80在單核細(xì)胞上的表達(dá)的AAECs至少部分通過(guò)TLR9通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0035]圖10為指明對(duì)不同處理方法作出響應(yīng)的BDCA3+細(xì)胞誘導(dǎo)百分比的圖。
[0036]圖1lA為指明來(lái)自對(duì)不同處理方法作出響應(yīng)的兩個(gè)供體患者的細(xì)胞中IL-8的濃度的圖。
[0037]圖1lB為指明在AAEC接觸的⑶14+細(xì)胞存在的情況下⑶4+細(xì)胞的增殖的圖。
[0038]圖1lC為指明作為⑶4+細(xì)胞增殖的函數(shù)的TNF- α分泌的圖。
[0039]圖12Α為示出AAECs用于檢測(cè)治療后某些患者的抗癌免疫應(yīng)答的免疫監(jiān)測(cè)用途的圖。
[0040]圖12B為示出AAECs用于檢測(cè)治療后某些患者的抗癌免疫應(yīng)答的免疫監(jiān)測(cè)用途的直方圖。
[0041]圖12C為直方圖，顯示免疫應(yīng)答的特異性。
[0042]圖12D為直方圖，顯示針對(duì)pp65的免疫應(yīng)答的特異性。
[0043]圖13為描述對(duì)AAEC處理作出響應(yīng)而在來(lái)自患有各種癌癥的患者的細(xì)胞中誘導(dǎo)IFN-γ的圖。
[0044]圖14Α-圖141為流式細(xì)胞術(shù)圖，表示來(lái)自用MDA-⑶80 AAECs的各種組合溫育的供體細(xì)胞的⑶80表達(dá)的LSR分析。紅圈強(qiáng)調(diào)AAECs在膜轉(zhuǎn)移方面更有效。
[0045]圖15Α-圖15Ε為流式細(xì)胞術(shù)圖，表示來(lái)自用有或沒(méi)有外來(lái)體的MDA-⑶80 AAECs的各種片段溫育的供體細(xì)胞的CD80表達(dá)的LSR分析。紅圈強(qiáng)調(diào)外來(lái)體似乎沒(méi)有參與CD80的膜轉(zhuǎn)移。
[0046]圖16Α-圖161表示AAEC的aria分析，表明⑶80在自噬體上表達(dá)。
[0047]圖17A表示條形圖，表明⑶80從AAEC轉(zhuǎn)移到各種細(xì)胞類(lèi)型。
[0048]圖17B示出了流式細(xì)胞術(shù)圖，表明來(lái)自被基因工程化以表達(dá)⑶80或⑶40L的HEK-293細(xì)胞的AAECs也能參與膜蛋白轉(zhuǎn)移。
【具體實(shí)施方式】
[0049]本公開(kāi)描述了由用于I期/11期臨床試驗(yàn)的兩個(gè)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)腫瘤細(xì)胞系衍生的同種異體自噬體富集組合物(AAECs)。這些細(xì)胞系在本文中稱(chēng)為UbLT3(非特異性組織病理學(xué))和UbLT6 (腺癌樣)。下文提供這些組合物的實(shí)