Cs的蛋白質(zhì)組成。用萬珂和NH4Cl處理增加了泛素化蛋白和短壽抗原的相對(duì)含量。例如，通過處理后的細(xì)胞產(chǎn)生的AAECs中泛素蛋白對(duì)β-肌動(dòng)蛋白的比率增加。與由未處理細(xì)胞產(chǎn)生的AAECs相比，NPMl、ρ62、ρ53和生存素都存在更高的對(duì)β -肌動(dòng)蛋白的比率
[0066]所述AAECs代表一個(gè)有前途的癌癥治療劑，因?yàn)樗鼈兛珊兄辽?個(gè)國家癌癥研究所(NCI)的優(yōu)先癌抗原。圖3Α顯示了在Affymetrix Human Gene 1.0 ST陣列上完成的用萬珂和NH4Cl以及正常肺RNA處理的UbLT3&UbLT6細(xì)胞的基因分析。將表達(dá)與NCI的頂端癌抗原優(yōu)先列表進(jìn)行比較。對(duì)每種條件來說，在3個(gè)獨(dú)立的RNA樣本上進(jìn)行基因分析。所有示出的基因的表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)差小于5%。圖3B表示在Dribbles中通過免疫印跡證實(shí)了具有在UbLT3或UbLT6細(xì)胞中的基因表達(dá)的6種抗原(WTl，p53，生存素(Survivin)，EphA2，細(xì)胞周期蛋白BI，和XAGE1)的蛋白表達(dá)。圖3C示出額外證實(shí)了在UbLT3和UbLT6衍生的AAECs中存在NCI優(yōu)先抗原?？乖╓T1，EGFRvIII，HER-2/neu，p53，生存素，EphA2，細(xì)胞周期蛋白BI，XAGE 1，和TOGFR-β。圖3D顯示如免疫印跡所證明的，在UbLT3和UbLT6衍生的AAECs中存在四個(gè)NSCLC靶。靶蛋白包括PKM2，LDHB, EIF4A1和ENOl0圖3E中示于了表明抗原包括在所述UbLT3和UbLT6 AAECs中的匯總表。
[0067]此外，DAMPs可以在處理的UbLT3和UbLT6細(xì)胞(如通過微陣列數(shù)據(jù)指明的那樣)和AAECs (如通過SDS-PAGE凝膠電泳顯示的)中高度表達(dá)。DAMPs能夠通過非感染性炎癥反應(yīng)來引發(fā)并延續(xù)免疫反應(yīng)，本質(zhì)上向免疫系統(tǒng)發(fā)送“危險(xiǎn)”信號(hào)。圖4A-圖4B顯示了這一數(shù)據(jù)。圖4A顯示了在Affymetrix Human Gene 1.0 ST陣列上完成的用萬河和NH4Cl以及正常肺RNA處理的UbLT3&UbLT6細(xì)胞的基因分析。將表達(dá)與NCI的頂端癌抗原優(yōu)先列表(Cheever,等人Clin Cancer Res.2009:5323-5337)進(jìn)行比較。對(duì)每種條件來說，在3個(gè)獨(dú)立的RNA樣本上進(jìn)行基因分析。所有示出的基因的表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)差小于5%。圖1OB表示在AAECs中通過免疫印跡證實(shí)的具有在UbLT3或UbLT6細(xì)胞中的基因表達(dá)的6種抗原(WT1，P53，生存素，EphA2，細(xì)胞周期蛋白BLjPXAGEl)的蛋白表達(dá)。了 6抗原蛋白的表達(dá)(WT1，P53，生存素，EphA2的，細(xì)胞周期蛋白BI，與XAGE1)，在UbLT3與UbLT6細(xì)胞AAECs通過免疫印跡確認(rèn)基因表達(dá)。
[0068]使用本文描述的方法處理(例如用蛋白酶體抑制劑和NH4Cl處理)時(shí)，UbLT3AAECs表達(dá)高水平的TLR配體和DAMPs。Toll樣受體包括一類在細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞)表面表達(dá)的蛋白質(zhì)，并且能夠識(shí)別和結(jié)合與細(xì)胞應(yīng)激和/或病原體相關(guān)的分子。在結(jié)合到TLR激動(dòng)劑時(shí)，所述TLR被激活并引發(fā)導(dǎo)致產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子和/或I型干擾素的信號(hào)級(jí)聯(lián)。圖5A和圖5B示出關(guān)于TLR配體在AAECs中表達(dá)的數(shù)據(jù)。在圖5A中，使用被轉(zhuǎn)導(dǎo)成表達(dá)單個(gè)人類TLR的HEK-293細(xì)胞(Invitrogen)對(duì)UbLT3 AAEC中的TLR-2，TLR-4或TLR-9激動(dòng)劑的存在和效力進(jìn)行評(píng)估。將效力與陽性和陰性(無配體)對(duì)照組進(jìn)行比較。圖5B顯示了免疫印跡，其表明DAMPs在3個(gè)不同批次的UbLT3 AAEC中的蛋白表達(dá)。
[0069]此外，AAECs可以包含多個(gè)TLR配體。這些TLR配體模擬微生物抗原并刺激先天免疫應(yīng)答，這在對(duì)患者施用AAEC時(shí)是有利的。圖6表示通過可見光光譜術(shù)根據(jù)各種TLR配體在HEK-Blue細(xì)胞中的活性證實(shí)了所述配體的存在。單個(gè)人TLR轉(zhuǎn)染的HEK-Blue細(xì)胞被用于測定在AAECs (Invitrogen)中的TLR激動(dòng)劑。UbLT3和UbLT6 AAECs包含用于TLR 2、3、4、7和9的激動(dòng)劑。加入50ug/ml的AAECs。以105/ml加入全細(xì)胞照射的腫瘤。陽性對(duì)照是:TLR2 (LTA) 500ng/ml、TLR3 (poly (1:C)、LMff) 10 μ g/mU TLR4(LPS) 500pg/ml、TLR7(CL097)50 μg/ml、TLR9(ODN 2006) 10 μg/ml、NULLl(TNFa lOOOng/ml)。.
[0070]本文中參考圖1-圖6描述的數(shù)據(jù)使下述成為可能:一種或多種組合物和一種或多種用于篩選產(chǎn)生這些組合物的細(xì)胞的方法。組合物包括由非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系衍生的自噬體的富集群，并且其中所述自噬體的富集群包括:一種或多種Toll樣受體激動(dòng)劑；一種或多種腫瘤抗原；和一種或多種損傷相關(guān)分子模式分子。一種或多種Toll樣受體激動(dòng)劑可包括用于Toll樣受體2、Toll樣受體3、Toll樣受體4、Toll樣受體7和/或Toll樣受體9或其組合的激動(dòng)劑。一種或多種腫瘤抗原可包括WTl、p53、生存素、EphA2、細(xì)胞周期蛋白BI和/SXAGEl或其組合。一種或多種損傷相關(guān)分子模式分子可包括鈣網(wǎng)蛋白、HMGBUHSP70、HSP90和/或Grp94或其組合。在一些實(shí)施例中，自噬體的富集群可衍生自UbLT3細(xì)胞系。在一些實(shí)施例中，自噬體的富集群可衍生自UbLT6細(xì)胞系。該組合物可進(jìn)一步包含構(gòu)造為提高對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的分子，包括自噬體的富集群。所述分子可以是聚肌胞苷酸。該組合物可進(jìn)一步包括非特異性佐劑。
[0071]在另一個(gè)實(shí)施例中，用于篩選能產(chǎn)生同種異體自噬體富集組合物的細(xì)胞的方法，所述組合物能在外周血單核細(xì)胞亞群上誘導(dǎo)選擇性標(biāo)記的表達(dá)，所述方法包括:使細(xì)胞與蛋白酶體抑制劑接觸；使細(xì)胞與溶酶體抑制劑接觸；收集所得自噬體；確定所得自噬體的分子特征物；和選擇將一種或多種Toll樣受體激動(dòng)劑和/或一種或多種分子伴侶轉(zhuǎn)移到自噬體的細(xì)胞。所述選擇性標(biāo)記可以是BDCA3，且所述外周血單核細(xì)胞的亞群可包括樹突細(xì)胞。所述選擇性標(biāo)記可以是CD80，并且所述外周血單核細(xì)胞的亞群可包括單核細(xì)胞。
[0072]實(shí)施例2:在人PBMC中誘導(dǎo)表達(dá)促炎性BDCA3的單核細(xì)胞。
[0073]第二個(gè)實(shí)施例描述了一種方法，所述方法可以利用AAECs在人PBMC和來自淋巴結(jié)(LN)的單細(xì)胞懸液中誘導(dǎo)表達(dá)BDCA3的單核細(xì)胞的增加。
[0074]表達(dá)BDCA3的樹突細(xì)胞(DCs)在被Toll樣受體3(TLR3)刺激時(shí)產(chǎn)白生細(xì)胞介素-12(IL-12)和干擾素β、它們是已知能增強(qiáng)I型T輔助細(xì)胞(THl)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)響應(yīng)的細(xì)胞因子。BDCA3+DC對(duì)向⑶8+細(xì)胞交叉遞呈也很重要。因?yàn)檫@些活性，BDCA3+DCS對(duì)于刺激抗腫瘤免疫應(yīng)答可能是重要的。
[0075]如上所述，所述AAECs可由腫瘤細(xì)胞在組合抑制蛋白酶體降解和溶酶體-介導(dǎo)的蛋白水解后產(chǎn)生，并且可以包含多種腫瘤抗原以及DAMPs和TLR配體。AAECs被鼠CLEC9A+交叉遞呈樹突細(xì)胞有效攝取，并能夠引發(fā)對(duì)既定鼠腫瘤的治療性免疫。此處，本發(fā)明人利用PBMC和來自淋巴結(jié)的單細(xì)胞懸液描述了 AAECs可能具有的對(duì)人類骨髓細(xì)胞的相互作用和效果。
[0076]圖7表示AAECs被血液⑶14+BDCA3-單核細(xì)胞有效攝取的實(shí)施例。與AAECs相互作用導(dǎo)致在單核細(xì)胞上劑量依賴性誘導(dǎo)血液DC標(biāo)記物BDCA3 ο可以通過使用阻斷性寡脫氧核苷酸(ODN)進(jìn)行TLR9阻斷來部分地阻斷單核細(xì)胞上BDCA3的上調(diào)。
[0077]在臨床樣品中，接種了 GM-CSF和CpG的組合的黑色素瘤患者表現(xiàn)出在他們的腫瘤引流LN中⑶14+BDCA3+細(xì)胞水平增加。類似于AAECs，用GM-CSF和CpG或單獨(dú)使用CpG進(jìn)行體外刺激導(dǎo)致在單核細(xì)胞和CDllc+CD14-DC兩者上誘導(dǎo)BDCA3。除了血液單核細(xì)胞，AAECs還可提高BDCA3在黑色素瘤患者LN單細(xì)胞懸液中存在的⑶14+⑶IIc+細(xì)胞上的表達(dá)。在這些樣品中，BDCA3誘導(dǎo)與分泌的IL-8在上清液中的水平增加相關(guān)(r = 0.76，P〈0.01)。的確，與來自相同培養(yǎng)物的CD14+BDCA3-細(xì)胞或分選的介質(zhì)處理的BDCA3-單核細(xì)胞相比，來自PBMC的分選的AAEC誘導(dǎo)的⑶14+BDCA3+細(xì)胞產(chǎn)生更高水平的IL-8。雖然ILlO誘導(dǎo)的⑶14+BDCA3+組織DC已被描述為致耐受性的并抑制T細(xì)胞響應(yīng)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)AAEC誘導(dǎo)的CD14+BDCA3+單核細(xì)胞可以在次優(yōu)劑量的抗CD3抗體存在下以濃度依賴性方式刺激CD4和⑶8 T細(xì)胞增殖。⑶4和⑶8 T細(xì)胞在這些共培養(yǎng)物中可產(chǎn)生高水平的Thl細(xì)胞因子、IFNy和TNFa，后者與增殖相關(guān)(r = 0.97，P〈0.001)，暗示了 AAEC-激活的單核細(xì)胞可能具有促炎作用。
[0078]在存在于LNs中的HLA-DR+CDllc+細(xì)胞上BDCA3表達(dá)的誘導(dǎo)和增加的IL-8分泌，與培養(yǎng)物中存在的CD14+細(xì)胞的頻率相關(guān)。CD14+細(xì)胞是單核細(xì)胞，能夠分化成多種不同細(xì)胞類型。其與誘導(dǎo)BDCA3表達(dá)相關(guān)的增加的頻率暗示了 BDCA3表達(dá)的促炎反應(yīng)。圖7A?圖7C描繪的數(shù)據(jù)表示對(duì)AAEC有特異性的BDCA3的劑量依賴性誘導(dǎo)，且這種誘導(dǎo)與增加CD14+細(xì)胞相關(guān)(R2 = 0.99，P〈0.001)。該相關(guān)性表明AAEC可能參與⑶14+細(xì)胞的上調(diào)，這可能有利于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。將凍存的黑色素瘤LN單細(xì)胞懸液解凍，并在x-vivo 15培養(yǎng)基中與未添加(無Ag)，羥乙基淀粉(介質(zhì))，6yg或12yg UbLT3 AAEC (DRB)共培養(yǎng)20小時(shí)(I百萬個(gè)細(xì)胞/ml，在48孔板中)。圖7A和圖7B示出用12色流式細(xì)胞儀表征的收獲的細(xì)胞，參見 CDllc、CD14、CDla、HLA-DR、CDllb、CD80、CD86、CD103、BDCA3/CD141 和 CD83。通過活/死細(xì)胞染色排除死細(xì)胞，并基于焚光扣除(Fluorescence Minus One) (FMO)對(duì)照設(shè)定門。圖7B顯示了⑶llb+DR+細(xì)胞上的AAEC誘導(dǎo)的BDCA3表達(dá)與⑶14+細(xì)胞的頻率之間的Pearson相關(guān)性。圖7C示出了在相同的實(shí)驗(yàn)測定上清液(在收獲前除去的)中IL-8的表達(dá)。分泌的細(xì)胞因子通過細(xì)胞因子微球陣列進(jìn)行評(píng)估。
[0079]AAECs可誘導(dǎo)BDCA3在⑶14+人單核細(xì)胞上表達(dá)。圖8A-圖8B描述的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明BDCA3的表達(dá)在CD14+人單核細(xì)胞上是增加的。對(duì)于該實(shí)驗(yàn)，將健康供體的PBMCdOO萬/ml)與羥乙基淀粉(介質(zhì))共培養(yǎng)，并用濃度增加的UbLT3 AAEC或TLR4激動(dòng)劑MPL(500ng/ml)處理。然后在20小時(shí)后將細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行表型分析。圖8A顯示來自代表性的供體的直方圖。陰影圖表示樣本-特異性熒光扣除(FMO)對(duì)照。開放式圖形顯示在HLA-DR+CDllc+CD14+單核細(xì)胞上的BDCA3-FITC的表達(dá)。圖8B描繪了代表2個(gè)健康供體的3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)并使用75 μ gAAEC(DRb)的圖。***P〈0.0001單向Anova，使用Tukey多重比較檢驗(yàn)(Prism)。
[0080]TLR-9抑制降低AAEC介導(dǎo)的BDCA3在⑶14+單核細(xì)胞上的表達(dá)，且減少在AAEC接觸的PBMC培養(yǎng)物中IL-8的分泌。TLR-9可被特異性O(shè)DNs阻斷，該受體的阻斷抑制TLR-9表達(dá)細(xì)胞中總的來說導(dǎo)致免疫應(yīng)答活化的胞內(nèi)通路的活化。圖9A?圖9D中顯示的實(shí)驗(yàn)在人PBMC中進(jìn)行(2X 105個(gè)，200 μ 1，在96孔板在)，所述人PBMC在37°C溫育20分鐘(用或不用TRL2、TRL4