或TRL9拮抗劑或?qū)φ?后用介質(zhì)、UbLT3 DRibbles (75 μ g/ml)進(jìn)行培養(yǎng)。圖9A顯示的直方圖表明BDCA3表達(dá)(開(kāi)放)和FMO對(duì)照(陰影)，使用了抗TLR抗體的最高濃度(對(duì)于T LR2/4來(lái)說(shuō)為7.5 μ g/ml，對(duì)于TLR9來(lái)說(shuō)為13.8 μ M)。圖9Β顯示兩個(gè)供體的在抗TLR9抗體和對(duì)照ODN滴定后的BDCA3+⑶14+細(xì)胞％。圖9C示出了由CBA測(cè)定到的在PBMC AAEC接觸培養(yǎng)物+/-TLR拮抗劑中的IL-8的分泌。圖9D顯示了在各種TLR拮抗劑中溫育的PBMC對(duì)AAEC的攝取。將UbLT3 AAECs用0.5 μ M遠(yuǎn)紅外脂質(zhì)染料裝載(3分鐘RT)后，然后洗滌并與用TLR拮抗劑預(yù)溫育的2 X 105個(gè)PBMC共培養(yǎng)2小時(shí)。在4°C下用UbLT3 AAEC培養(yǎng)的PBMC作為主動(dòng)攝取的對(duì)照(N = 1，一式兩份)。
[0081 ] 圖9E表明UbLT3衍生的AAECs添加到來(lái)自3個(gè)供體的PBMC增加能表達(dá)⑶80 (與這些抗原遞呈細(xì)胞的成熟有關(guān)的共刺激分子)的單核細(xì)胞的百分比。這種效果可以通過(guò)阻斷經(jīng)由TLR9的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)抑制，但不是通過(guò)添加TLR9的模擬抑制劑來(lái)抑制。
[0082]圖10示出了響應(yīng)于對(duì)來(lái)自四個(gè)健康供體的PBMC的CD14+單核細(xì)胞的各種處理而發(fā)生的BDCA3+細(xì)胞的誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)在PBMC(500萬(wàn)/ml，48-孔板，IMDM+10% FBS)中進(jìn)行，所述 PBMC 在無(wú)刺激(無(wú) stim)、5 μ g/ml CpG-A (0DN-2216)、5 μ g/ml CpG-B (0DN-7909)或CpG-+1000IU/ml GM-CSF(CpG+GM)的條件下培養(yǎng)48小時(shí)。CD14+單核細(xì)胞上的BDCA3+表達(dá)由四色流式細(xì)胞儀(VUmc)評(píng)估。
[0083]AAEC接觸的單核細(xì)胞，BDCA3-和BDCA3+兩者，產(chǎn)生高水平的IL-8，并與次優(yōu)抗CD3抗體刺激組合而刺激T細(xì)胞增殖。T細(xì)胞增殖的刺激被用作免疫應(yīng)答誘導(dǎo)的指示。CD4在AAEC存在下的增殖增加是有益的，因?yàn)樵摻M合物可以施用于患者以刺激對(duì)靶向癌抗原、感染或其他疾病(其中靶向免疫應(yīng)答是有益的)的免疫應(yīng)答。圖1lA-圖1lB示出的數(shù)據(jù)指示IL-8上調(diào)和T細(xì)胞增殖。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，將兩個(gè)健康供體的PBMC與介質(zhì)或75 μ g/ml UbLT3 AAEC共培養(yǎng)20小時(shí)。CD4+CD25-和CD8+T細(xì)胞和CD14+(BDCA3-)單核細(xì)胞從介質(zhì)處理的樣本中分選。⑶14+BDCA3-和⑶14+BDCA3+細(xì)胞從AAEC-處理的樣本中分選。將從供體I分選的CD14+細(xì)胞與從供體2分選的T細(xì)胞共培養(yǎng)，反之亦然。圖1lA示出了來(lái)自在RPMI+10% FBS中培養(yǎng)過(guò)夜的5000個(gè)分選的⑶14+細(xì)胞的IL-8的濃度。在20小時(shí)(每個(gè)樣品一式三份)后收集上清液(2個(gè)實(shí)驗(yàn)得到相似的結(jié)果)。圖1lB顯示了在分選的介質(zhì)或AAEC-處理的⑶14+的存在下用2 μ g板結(jié)合的0KT3 (抗⑶3抗體)刺激的⑶4T細(xì)胞的增殖。在圖1lC中，第3天和第5天時(shí)TNF-α的濃度與⑶4的增殖相關(guān)。
[0084]據(jù)發(fā)現(xiàn)，UbLT3 AAECs可以誘導(dǎo)在人黑色素瘤LN樣本中的⑶llc+HLA_DR+細(xì)胞上表達(dá)BDCA3。誘導(dǎo)的水平與這些樣本中⑶14+細(xì)胞的存在相關(guān)。與LN樣本類似，AAECs誘導(dǎo)在健康供者的單核細(xì)胞上表達(dá)BDCA3。TLR4激動(dòng)劑MPL不誘導(dǎo)在人單核細(xì)胞上表達(dá)BDCA3，這暗示了 TRL4非依賴性機(jī)制。據(jù)發(fā)現(xiàn)，UbiLT3 AAECs可以高水平地表達(dá)配體，刺激各種TLRs。TLR2、TLR4或TLR9活化的抑制表明TLR9在AAEC誘導(dǎo)的BDCA3誘導(dǎo)中的貢獻(xiàn)(在2個(gè)供體中觀察到的)。有趣的是，用CpG或CpG+GM-CSF皮內(nèi)注射治療的黑色素瘤患者在其前哨(sentinel) LNs中表現(xiàn)出BDCA3+DC亞組的頻率增加(Sluijter等人，論文準(zhǔn)備中)。用CpG或CpG+GM-CSF體外刺激PBMC誘導(dǎo)CD14+單核細(xì)胞上的BDCA3表達(dá)，證實(shí)了 TLR9刺激與單核細(xì)胞上BDCA3表達(dá)之間的聯(lián)系。除了 BDCA3誘導(dǎo)，AAECs可誘導(dǎo)在黑色素瘤LN與健康供體的PBMC培養(yǎng)物中產(chǎn)生IL-8。在2/2PBMC供體中，TLR9的抑制減少IL-8的產(chǎn)生，而在1/2供體(I個(gè)實(shí)驗(yàn))中TLR4抑制降低IL-8水平。分選的AAEC誘導(dǎo)的BDCA3+細(xì)胞產(chǎn)生比對(duì)照單核細(xì)胞顯著更高水平的IL-8 (2個(gè)實(shí)驗(yàn)，各兩個(gè)供體)。與未處理的單核細(xì)胞相比，從AAEC-處理的PBMC中分選出的BDCA3+和BDCA3-單核細(xì)胞可刺激CD4+T細(xì)胞增殖(+0KT3)和IFN- γ的產(chǎn)生(未示出)。另外，AAEC誘導(dǎo)的BDCA3+單核細(xì)胞刺激CD8 T細(xì)胞增殖(未示出)和TNF-a產(chǎn)生。這些數(shù)據(jù)表明，AAECs可誘導(dǎo)人單核細(xì)胞中的促炎性變化。
[0085]圖12A示出的圖證實(shí)AAECs用于檢測(cè)治療后某些患者的抗癌免疫應(yīng)答的治療性免疫監(jiān)測(cè)用途，并記錄腫瘤引流淋巴結(jié)包含由癌癥引發(fā)的并且可以使用AAECs檢測(cè)到的細(xì)胞。從癌癥患者中分離的PBMC被分離并用在實(shí)驗(yàn)中測(cè)定響應(yīng)于AAECs治療而產(chǎn)生的IFN-γ。IFN-γ的產(chǎn)生增加可有利于用癌癥疫苗治療，因?yàn)镮FN-γ是重要的免疫功能增強(qiáng)劑。IFN-γ刺激自然殺傷(NK)細(xì)胞的活性，增加了抗原遞呈，并導(dǎo)致對(duì)激活免疫應(yīng)答而言非常重要的大量轉(zhuǎn)錄改變?；加蠬NSCC、黑色素瘤和前列腺癌的患者在用由NSCLC細(xì)胞衍生的AAECs刺激時(shí)產(chǎn)生IFN- γ。圖12Α示出了從來(lái)自患有HNSCC (η = 4)、黑色素瘤(η = 4)或前列腺癌(η = 4)的患者的PBMC或(淋巴結(jié))LNs直接離體產(chǎn)生的IFN- γ。以5xl06/ml將細(xì)胞重新懸浮于含有5%人白蛋白的完全培養(yǎng)基，并暴露于UbLT3或UbLT6 AAECs 36-40小時(shí)。上清液通過(guò)細(xì)胞因子珠陣列(BD B1science公司)進(jìn)行分析?；诨蜿嚵械臄?shù)據(jù)，來(lái)自腎細(xì)胞癌患者的AAECs被用作陰性對(duì)照。對(duì)來(lái)自2個(gè)健康供體的PBMC進(jìn)行了測(cè)試，兩者對(duì)于IFN-γ的產(chǎn)生來(lái)說(shuō)都為陰性。免疫印跡檢測(cè)出AAECs不包括MHC I類分子。這些結(jié)果表明，AAECs可用于鑒定抗癌免疫應(yīng)答的發(fā)生，并可以用作抗癌免疫的生物標(biāo)記。
[0086]在一些實(shí)施方式中，AAEC可衍生自NSCLC。然而，AAEC可以衍生自任何數(shù)量或種類的癌細(xì)胞或非癌細(xì)胞。這可包括來(lái)自于以下的細(xì)胞系:乳腺癌如BRCA-152，MDA-MB-231，MDA-MB-361，或MDA-MB-468 ;結(jié)腸癌，如HCT 116或T84 ;淋巴瘤，如EL4 ;黑色素瘤，如MEL-30，MEL-68，和/或MEL-40，等等。此外，AAECs可以衍生自同基因組織，包括通過(guò)本文描述的方法衍生自患者的腫瘤。如上所述，衍生和施用AAECs的方法不一定僅適用于癌癥疫苗，并且可適用于可發(fā)包含細(xì)菌、真菌、病毒或原生動(dòng)物的抗原的自噬體富集的組合物。
[0087]圖12B顯示的測(cè)定證明了在接種后發(fā)展出免疫應(yīng)答的患者可用AAECs進(jìn)行檢測(cè)。這種測(cè)定描述了用于評(píng)估針對(duì)廣泛未知的由許多癌癥共享的癌抗原的免疫應(yīng)答的方法。在一些實(shí)施例中，該測(cè)定可用于對(duì)血液中的抗癌免疫應(yīng)答進(jìn)行評(píng)估或評(píng)分。
[0088]圖12C還示出了在接種疫苗的患者中的免疫應(yīng)答可以用AAECs來(lái)檢測(cè)。來(lái)自正常腎的AAECs是非刺激性的。
[0089]圖12D是一個(gè)直方圖，展示針對(duì)pp65的免疫應(yīng)答的特異性并且在具有針對(duì)CMV的免疫的患者中不與不含PP65構(gòu)建體的UbLT3 AAECs交叉反應(yīng)。AAECs被用來(lái)檢測(cè)在接種后發(fā)展出免疫應(yīng)答的患者中的免疫應(yīng)答。來(lái)自正常腎的AAECs是非刺激性的。檢測(cè)到針對(duì)UbiLT3 (LT3.pp65DRb) Dribbles (AAECs)中的 pp65 但不針對(duì) UbLT3 AAECs (LT3DRb)或正常腎AAECs (NK DRB)的免疫應(yīng)答。
[0090]來(lái)自上述實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明，BDCA3表達(dá)單核細(xì)胞可在患者分離的PBMC以及LNs中被誘導(dǎo)。如上所述，這些細(xì)胞可具有促炎性應(yīng)答，這有利于在臨床環(huán)境下施用同種異體自噬體富集組合物。對(duì)這些細(xì)胞和細(xì)胞因子的存在的促炎性應(yīng)答可有助于恢復(fù)患者的免疫系統(tǒng)，所述患者具有因年齡或之前的抗癌治療而降低的免疫功能。此外，此促炎性應(yīng)答暗示了能夠靶向特定癌癥或感染因子的先天免疫應(yīng)答的快速擴(kuò)張。該應(yīng)答可在AAECs體內(nèi)施用(經(jīng)皮內(nèi)，皮下，靜脈內(nèi)，或鼻腔內(nèi)途徑)之后發(fā)生。此外，因?yàn)槠淇赡艿拇傺谆钚?，BDCA3+DCS可以從患者衍生的PBMC分離并用作疫苗接種的佐劑。
[0091]本文中參考圖7?圖12描述的數(shù)據(jù)使下述成為可能:一種或多種用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的方法，包括:提供組合物，所述組合物包括:從細(xì)胞系衍生的自噬體的富集群，所述自噬體的富集群包含:一種或多種Toll樣受體激動(dòng)劑；一種或多種腫瘤抗原；和一種或多種損傷相關(guān)分子模式分子。
[0092]該方法可以進(jìn)一步包括:從所述哺乳動(dòng)物的外周血中分離外周血單核細(xì)胞；使外周血單核細(xì)胞的亞群與自噬體的富集群接觸；和將接觸的外周血單核細(xì)胞注入回哺乳動(dòng)物。外周血單核細(xì)胞的亞群可包括專職的抗原遞呈細(xì)胞和非專職的抗原遞呈細(xì)胞。所述外周血單核細(xì)胞可以在施用GM-CSF、FLT3L和/或CpG后從哺乳動(dòng)物分離。該細(xì)胞系已被工程化以表達(dá)⑶80。該細(xì)胞系可能已經(jīng)被工程化以表達(dá)巨細(xì)胞病毒蛋白pp65。該方法還可以包括通過(guò)檢測(cè)對(duì)一種或多種腫瘤抗原特異性的一種或多種細(xì)胞因子的分泌來(lái)篩選對(duì)包括在所述自噬體的富集群中的一種或多種腫瘤抗原的特異性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。特異性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)的篩選可包括ELISA、ELISP0T和/或細(xì)胞內(nèi)染色測(cè)定。
[0093]實(shí)施例3:用非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系衍生的AAEC治療其他癌癥。
[0094]在另一實(shí)施例中，類似于上面在實(shí)施例1中描述的方法利用細(xì)胞系衍生的同種異體自噬體富集組合物作為其他癌癥的可能的治療，因?yàn)橐呙缈梢园S多已知的癌抗原以及免疫刺激因子。
[0095]如本文所述，腫瘤衍生的AAECs可螯合蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物，包括相關(guān)的癌抗原和DAMPs。在臨床前研究中，使用良好定義的MCA肉瘤模型(其中獨(dú)有的主要腫瘤抗原的特異性僅針對(duì)同源腫瘤挑戰(zhàn)提供保護(hù))表明，AAECs可提供對(duì)同基因腫瘤的交叉保護(hù)，而完整的腫瘤細(xì)胞疫苗不能(Twitty等人，Clin Cancer Res.2011:6467-6481)。此外，不同于AAECs可從中衍生的完整腫瘤，AAECs即使是從同種異體腫瘤細(xì)胞衍生時(shí)，也可提供對(duì)既定鼠乳腺腫瘤的治療免疫。這就提出了單一 NSCLC腫瘤細(xì)胞系可用作用于各類NSCLC組織學(xué)和其他可能的癌癥類型的疫苗的可能性。本發(fā)明人已從兩個(gè)NSCLC腫瘤細(xì)胞系UbLT3和UbLT6中制造出用于I期和II期臨床試驗(yàn)的AAECs。盡管它們的基因表達(dá)圖譜不同(19935個(gè)基因中有8213個(gè)基因在這兩種細(xì)胞系之間差異表達(dá))，本發(fā)明人描述了 UbLT3和UbLT6具有在其他類型的癌癥中發(fā)現(xiàn)的共有的上調(diào)基因。
[0096]將用硼替佐米和NH4Cl (對(duì)Dribble疫苗的產(chǎn)生很重要的兩種蛋白降解抑制劑)處理之前和之后的UbLT3和UbLT6腫瘤細(xì)胞的微陣列分析與正常肺組織比較。與癌癥基因組圖譜(TCGA)的數(shù)據(jù)集的比較顯示，許多在疫苗細(xì)胞系中上調(diào)的基因在其他癌癥中也上調(diào)(圖8)。此外，免疫印跡分析表明，在國(guó)家癌癥研究所(NCI)的優(yōu)先癌抗原列表(Cheever等人Clin Cancer Res.2009:5323-5337)上的至少六種癌抗原可被包含在AAECs中(圖3A?圖3E)。雖然幾種癌癥的TCGA數(shù)據(jù)顯示UbLT3和Ub