本發(fā)明屬于生物醫(yī)用敷料領(lǐng)域，具體涉及一種具有生物活性的復(fù)合敷料及其制備方法。

背景技術(shù)：

隨著對皮膚損傷治療研究的進展，組織工程皮膚是近年來研究的熱點，有著廣闊的臨床應(yīng)用前景。皮膚在面臨大面積燒傷或損壞時急需獲得大量的表皮覆蓋以促進皮膚組織的再生與修復(fù)。天然真皮替代物具有完整的膠原三維結(jié)構(gòu)，生物相容性好，在組織成分上與自體皮膚最接近，在皮膚重建中具有較高的應(yīng)用價值。天然真皮替代物取材于同種異體皮或異種皮，通過化學和生化等手段，去除了皮膚中的表皮層及含抗原成分的細胞僅保留真皮中含膠原網(wǎng)架的細胞外基質(zhì)，具有抵抗原性、良好的生物學性能和力學性能，是一種理想的皮膚修復(fù)材料。異種(豬)脫細胞真皮基質(zhì)相比于異體脫細胞真皮基質(zhì)具有來源廣泛，價廉質(zhì)優(yōu)等優(yōu)點，并且在膠原含量、結(jié)構(gòu)上與人體皮膚具有很高的組織同源性并且高度相似，已在臨床上取得廣泛應(yīng)用。但是這類脫細胞真皮基質(zhì)由于缺乏活的成纖維細胞，延緩真皮重建，只是達到真皮替代的效果，而沒有達到表皮重建的效果，不能促進傷口的愈合。因此如何制備出具有生物活性的脫細胞真皮基質(zhì)是克服脫細胞真皮基質(zhì)真皮修復(fù)緩慢的有效方法。

在人體傷口愈合的過程中，成纖維細胞分泌膠原是傷口皮膚愈合的根本原因。所以，凡是促進皮膚成纖維細胞生長和分泌作用的因素均為備選的有利因素。成纖維細胞生長因子(FGF)不但可以有力的促進成纖維細胞的生長和分泌作用，同時，對肌肉等組織也有很強的促損傷修復(fù)功能。但是FGF在體內(nèi)的半衰期很短，全身應(yīng)用后容易失活而難以發(fā)揮其生理活性，而且FGF在溶液中的穩(wěn)定性較差，極易受溫度、pH、有機溶劑、酶等因素影響而失活，局部穿刺分次給藥也難以產(chǎn)生有效作用，不適合長期供藥。因此如何有效地保護和釋放生長因子是目前亟待解決的問題。而利用緩釋載體負載生長因子，既能保護生長因子的生物活性，又可以使生長因子平穩(wěn)緩慢釋放，從而持續(xù)促進組織再生修復(fù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種具有生物活性的復(fù)合敷料及其制備方法，該復(fù)合敷料中具有生物活性的復(fù)合豬脫細胞真皮基質(zhì)免疫原性低，來源豐富，價格低廉，其制備方法簡單；該復(fù)合敷料保質(zhì)期長，在保存及運輸過程中以干物質(zhì)形態(tài)存在，使成纖維細胞生長因子(FGF)的生物活性可以長期保持；該復(fù)合敷料在使用時，復(fù)合敷料與傷口接觸表面能產(chǎn)生水凝膠層，產(chǎn)生的水凝膠層可以使成纖維細胞生長因子(FGF)達到緩慢釋放的效果。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種具有生物活性的復(fù)合敷料，所述的復(fù)合敷料由具有生物活性的復(fù)合豬脫細胞真皮基質(zhì)構(gòu)成，所述的復(fù)合敷料為單層結(jié)構(gòu)；所述的復(fù)合豬脫細胞真皮基質(zhì)由豬脫細胞真皮基質(zhì)、絲素蛋白、成纖維細胞生長因子和慶大霉素構(gòu)成。絲素蛋白材料具有良好的透氧性、無毒性、無刺激性，可生物降解，具有優(yōu)良的生物相容性等特性；同時，絲素蛋白作為緩釋載體負載成纖維細胞生長因子與豬脫細胞真皮基質(zhì)，既能保護生長因子的生物活性，又可以使生長因子平穩(wěn)緩慢釋放，從而持續(xù)促進組織再生修復(fù)。

進一步的，所述復(fù)合豬脫細胞真皮基質(zhì)中各成分按重量份數(shù)計：由豬脫細胞真皮基質(zhì)5~8份、絲素蛋白50~100份、成纖維細胞生長因子0.2~0.5份和慶大霉素2份構(gòu)成。

更進一步的，所述的豬脫細胞真皮基質(zhì)為參考申請?zhí)枮?00410022506.9所公開的脫細胞真皮基質(zhì)材料的制備方法所制得。

更進一步的，所述的絲素蛋白為家蠶后部絲腺來源的絲素蛋白。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的另一個技術(shù)方案為：一種具有生物活性的復(fù)合敷料的制備方法，所述制備方法的具體步驟如下：

（1）將絲素蛋白加入200ml去離子水中，攪拌至全部溶解，然后加入成纖維細胞生長因子和慶大霉素，溫度為4-10℃，轉(zhuǎn)速為1000-1500 r/min，攪拌1~2h，形成具有生物活性的混合液，置于4℃冰箱中，備用；

（2）將豬脫細胞真皮基質(zhì)用75-95%的乙醇進行梯度脫水，然后置于無水乙醇中進行超聲處理，超聲時間為60~120min，在無菌環(huán)境下將豬脫細胞真皮基質(zhì)取出，紫外照射滅菌，紫外照射時間為3h；

（3）將經(jīng)步驟（2）處理的豬脫細胞真皮浸泡于步驟（1）制備的具有生物活性的混合液中，在溫度為2~6℃，轉(zhuǎn)速為1000 r/min下攪拌1-2h，然后再用無水乙醇浸泡30min，取出、-80℃冷凍干燥，得到具有生物活性的復(fù)合豬脫細胞真皮基質(zhì)；

（4）將步驟（3）制備的具有生物活性的復(fù)合豬脫細胞真皮基質(zhì)在無菌環(huán)境下用分切機裁剪分切、包裝、滅菌，得到具有生物活性的復(fù)合敷料。

進一步的，所述步驟（1）中具有生物活性的混合液中絲素蛋白的質(zhì)量濃度為0.25~0.5g/mL。

更進一步的，所述步驟（1）中具有生物活性的混合液中成纖維細胞生長因子的質(zhì)量濃度為0.01~0.05ug/ml。

更進一步的，所述步驟（1）中每100ml具有生物活性的混合液中含有慶大霉素2~3萬個活性單位。

更進一步的，所述步驟（2）中梯度脫水的具體步驟為：將豬脫細胞真皮基質(zhì)浸泡于75%的乙醇中5h，取出后置于85%的乙醇5h，取出后再置于95%的乙醇中5h，再置于無水乙醇中進行超聲處理。

優(yōu)選的，所述步驟（3）中具有生物活性的混合液與豬脫細胞真皮基質(zhì)的質(zhì)量比為50:1。

本發(fā)明的有益效果為：

（1）本發(fā)明公開的復(fù)合敷料及其制備方法，具有生物活性的脫細胞真皮基質(zhì)敷料免疫原性低，來源豐富，價格低廉，其制備方法簡單。

（2）本發(fā)明以絲素蛋白作為緩釋載體通過將成纖維細生長因子胞（FGF）復(fù)合到豬脫細胞真皮當中，不僅克服了豬脫細胞真皮基質(zhì)缺乏生物活性，真皮修復(fù)緩慢的缺點；同時，也保護了生長因子的生物活性，使生長因子平穩(wěn)緩慢釋放，從而持續(xù)促進組織再生修復(fù)。

（3）本發(fā)明制備的復(fù)合敷料添加的絲素蛋白，使復(fù)合敷料在用生理鹽水浸潤時表面能產(chǎn)生水凝膠層，與傷口接觸時能舒緩傷口痛楚減少創(chuàng)面的水分流失，且凝膠層可以使成纖維細胞生長因子(FGF)和慶大霉素達到緩慢釋放的效果，長時間作用于患處，能達到持續(xù)抗菌，促進傷口愈合的效果，減少換藥次數(shù)，減輕病人換藥的痛苦。

（4）本發(fā)明公開的制備方法中對豬脫細胞真皮基質(zhì)進行反復(fù)梯度脫水及超聲處理，能有效地去除原有細胞等成份，從而降低排異反應(yīng)，并能使得豬脫細胞真皮基質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，使得絲素蛋白和成纖維細生長因子胞（FGF）能更加均勻地復(fù)合在豬脫細胞真皮基質(zhì)當中。

（5）本發(fā)明通過將豬脫細胞真皮基質(zhì)、絲素蛋白、成纖維細胞生長因子（FGF）和慶大霉素進行復(fù)合制備的具有生物活性的復(fù)合敷料，相比于普通的豬脫細胞真皮基質(zhì)敷料具有更好地促傷口愈合的作用，而慶大霉素的添加能使復(fù)合敷料局用抗菌的效果。

附圖說明

圖1為實驗組1~3制備的具有生物活性的復(fù)合敷料與對比例2進行成纖維細胞生長因子(FGF)釋放效果分析對比圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的說明。

實施例1

一種具有生物活性的復(fù)合敷料由具有生物活性的復(fù)合豬脫細胞真皮基質(zhì)構(gòu)成，為單層結(jié)構(gòu)；所述復(fù)合豬脫細胞真皮基質(zhì)由以下成分按重量份數(shù)計構(gòu)成：豬脫細胞真皮基質(zhì)5份、絲素蛋白50份、成纖維細胞生長因子0.2份和慶大霉素2份；所述的豬脫細胞真皮基質(zhì)為參考申請?zhí)枮?00410022506.9所公開的脫細胞真皮基質(zhì)材料的制備方法所制得，所述的絲素蛋白為家蠶后部絲腺來源的絲素蛋白。

實施例2

一種具有生物活性的復(fù)合敷料由具有生物活性的復(fù)合豬脫細胞真皮基質(zhì)構(gòu)成，為單層結(jié)構(gòu)；所述復(fù)合豬脫細胞真皮基質(zhì)由以下成分按重量份數(shù)計構(gòu)成：豬脫細胞真皮基質(zhì)6份、絲素蛋白80份、成纖維細胞生長因子0.3份和慶大霉素2份；所述的豬脫細胞真皮基質(zhì)為參考申請?zhí)枮?00410022506.9所公開的脫細胞真皮基質(zhì)材料的制備方法所制得，所述的絲素蛋白為家蠶后部絲腺來源的絲素蛋白。

實施例3

一種具有生物活性的復(fù)合敷料由具有生物活性的復(fù)合豬脫細胞真皮基質(zhì)構(gòu)成，為單層結(jié)構(gòu)；所述復(fù)合豬脫細胞真皮基質(zhì)由以下成分按重量份數(shù)計構(gòu)成：豬脫細胞真皮基質(zhì)8份、絲素蛋白100份、成纖維細胞生長因子0.5份和慶大霉素2份；所述的豬脫細胞真皮基質(zhì)為參考申請?zhí)枮?00410022506.9所公開的脫細胞真皮基質(zhì)材料的制備方法所制得，所述的絲素蛋白為家蠶后部絲腺來源的絲素蛋白。

實施例4

實施例1～實施例3任一例具有生物活性的復(fù)合敷料，其制備方法的具體步驟如下：

（1）將絲素蛋白加入200ml去離子水中，攪拌至全部溶解，然后加入成纖維細胞生長因子和慶大霉素，溫度為4-10℃，轉(zhuǎn)速為1000-1500 r/min，攪拌1~2h，形成具有生物活性的混合液，置于4℃冰箱中，備用；所述的具有生物活性的混合液中絲素蛋白的質(zhì)量濃度為0.25~0.5g/mL，成纖維細胞生長因子的質(zhì)量濃度為0.01~0.05ug/ml， 每100ml具有生物活性的混合液中含有慶大霉素2~3萬個活性單位；

（2）將豬脫細胞真皮基質(zhì)用75-95%的乙醇進行梯度脫水，具體步驟為：將豬脫細胞真皮基質(zhì)浸泡于75%的乙醇中5h，取出后置于85%的乙醇5h，取出后再置于95%的乙醇中5h；然后置于無水乙醇中進行超聲處理，超聲時間為60~120min，在無菌環(huán)境下將豬脫細胞真皮基質(zhì)取出，紫外照射滅菌，紫外照射時間為3h；

（3）將經(jīng)步驟（2）處理的豬脫細胞真皮浸泡于步驟（1）制備的具有生物活性的混合液中，所述具有生物活性的混合液與豬脫細胞真皮基質(zhì)的質(zhì)量比為50:1，在溫度為2~6℃，轉(zhuǎn)速為1000 r/min下攪拌1-2h，然后再用無水乙醇浸泡30min，取出、-80℃冷凍干燥，得到具有生物活性的復(fù)合豬脫細胞真皮基質(zhì)；

（4）將步驟（3）制備的具有生物活性的復(fù)合豬脫細胞真皮基質(zhì)在無菌環(huán)境下用分切機裁剪分切、包裝、滅菌，得到具有生物活性的復(fù)合敷料。

實施例5

對比例1：為單獨的豬脫細胞真皮基質(zhì)（參考申請?zhí)枮?00410022506.9所公開的脫細胞真皮基質(zhì)材料的制備方法所制得）。

對比例2：為成纖維細胞生長因子與豬脫細胞真皮基質(zhì)復(fù)合的敷料（參考申請?zhí)枮?00410022506.9所公開的脫細胞真皮基質(zhì)材料的制備方法所制得）。

實驗組1~3：為實施例1～3，采用實施例4的方法制備而成。

將上述實施例1～3所制備的具有生物活性的復(fù)合敷料與對比例2進行成纖維細胞生長因子(FGF)釋放效果分析對比，結(jié)果如圖1所示。

從圖1結(jié)果所示，本發(fā)明實施例1～3所制備的具有生物活性的復(fù)合敷料具有長效持續(xù)釋放成纖維細胞生長因子FGF的效果，而對比例2則在第四天有一個明顯的突釋過程，到14天時以基本釋放完全，無長效持續(xù)釋放的效果。

實施例6

對比例1：為單獨的豬脫細胞真皮基質(zhì)（參考申請?zhí)枮?00410022506.9所公開的脫細胞真皮基質(zhì)材料的制備方法所制得）。

對比例2：為成纖維細胞生長因子與豬脫細胞真皮基質(zhì)復(fù)合的敷料（參考申請?zhí)枮?00410022506.9所公開的脫細胞真皮基質(zhì)材料的制備方法所制得）。

實驗組1~3：為實施例1～3，采用實施例4的方法制備而成。

將上述實施例1～3所制備的具有生物活性的復(fù)合敷料與對比例1~2進行抗菌試驗分析，結(jié)果如下表所示：

從上表可以看出，本發(fā)明實施例1～3所制備的具有生物活性的復(fù)合敷料具有很好的殺菌、抗菌效果，而對比例1和2基本沒有抗菌效果。

實施例7

對比例1：為單獨的豬脫細胞真皮基質(zhì)（參考申請?zhí)枮?00410022506.9所公開的脫細胞真皮基質(zhì)材料的制備方法所制得）。

對比例2：為成纖維細胞生長因子與豬脫細胞真皮基質(zhì)復(fù)合的敷料（參考申請?zhí)枮?00410022506.9所公開的脫細胞真皮基質(zhì)材料的制備方法所制得）。

實驗組1~3：為實施例1～3，采用實施例4的方法制備而成。

將上述實施例1～3所制備的具有生物活性的復(fù)合敷料、對比例1與成纖維細胞L929進行共培養(yǎng)對細胞的相對增長率進行分析，結(jié)果如下表所示：

從上表可以看出，本發(fā)明實施例1～3所制備的具有生物活性的復(fù)合敷料具有明顯的促細胞生長效果，而對比例1則沒有促細胞生長的效果，顯然通過將豬脫細胞真皮基質(zhì)、絲素蛋白和成纖維細胞生長因子復(fù)合而成的具有生物活性的復(fù)合敷料具有明顯的促細胞生長作用。

顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定；對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉；凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍之內(nèi)。