專利名稱:高純度蛋白質(zhì)的制備及其應(yīng)用的制作方法
本發(fā)明是一種人白細(xì)胞介素-2及一種應(yīng)用遺傳工程學(xué)技術(shù)制備的方法白細(xì)胞介素-2(也稱為T細(xì)胞因子，簡(jiǎn)稱為IL-2)，是用同種異體抗原或外源凝集素刺激T細(xì)胞而產(chǎn)生的一種淋巴因子?！部茖W(xué)science，193，1007(1976);免疫學(xué)評(píng)論Immunological Reviews，51，257(1980)〕。IL-2可使該細(xì)胞在體外生長(zhǎng)，并重新獲得它們的生物功能，因而有利于T細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)。另外，據(jù)報(bào)道IL-2可促進(jìn)胸腺細(xì)胞的促細(xì)胞分裂素的活性，促使裸鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生T細(xì)胞依賴抗原(T細(xì)胞取代因子)，或促進(jìn)殺傷細(xì)胞的分化和增殖〔免疫學(xué)雜志The Journal OF Immunology，123，2928(1979);免疫學(xué)評(píng)論Immunological Reviews，51，257(1980)〕。
由于IL-2的應(yīng)用已經(jīng)使殺傷T細(xì)胞，輔助T細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞克隆化?！沧匀籒atural，268，154(1977)，免疫學(xué)雜志The Journal OF Immunology，130，981(1983)〕。除了直接用于T細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞克隆化外，IL-2還可用于選擇某種抗原的特異性活的殺傷T細(xì)胞。例如在體外殺傷T細(xì)胞可以識(shí)別腫瘤抗原，并破壞腫瘤細(xì)胞。將IL-2誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性腫瘤殺傷細(xì)胞注射到動(dòng)物體內(nèi)，則可能抑制和防止腫瘤的生長(zhǎng)〔免疫學(xué)雜志The Journal OF Immunology，125，1904(1980)〕。此外，IL-2還可以誘導(dǎo)IFN-Y的產(chǎn)生〔免疫學(xué)雜志-The Journal OF Immunology，130，1784(1983)〕以及活化自然殺傷細(xì)胞〔免疫學(xué)雜志The Journal OF Immunology，130，1970(1983)〕。
上述實(shí)驗(yàn)資料提示IL-2是一種有前途的抗腫瘤因子。已知IL-2在缺乏胸腺細(xì)胞功能的裸鼠體內(nèi)可使輔助T細(xì)胞的功能得以恢復(fù)〔歐州免疫學(xué)雜志European Jourual OF Immunology，10，719(1980)〕或恢復(fù)抗腫瘤細(xì)胞的殺傷T細(xì)胞的產(chǎn)生?！沧匀籒ature，284，278(1980)〕，因此IL-2對(duì)治療免疫損傷疾病是很有前途的。
大規(guī)模生產(chǎn)IL-2的方法迄今尚未成功。由于缺乏純的IL-2，臨床應(yīng)用受到阻礙。人們急切盼望著能研制出一種簡(jiǎn)便、廉價(jià)、大規(guī)模生產(chǎn)高純度IL-2的新技術(shù)。
塔尼格其(Taniguchi)等人以人T細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat作為原材料或起始物分離到IL-2mRNA。通過使用IL-2mRNA克隆了人IL-2基因。據(jù)報(bào)道，由此可推斷出人IL-2蛋白的氨基酸序列，并可在cos-7細(xì)胞中表達(dá)了這個(gè)基因〔自然Nature302，305(1983)〕。以后萊特(Later)等人報(bào)告說(shuō)人類脾細(xì)胞誘導(dǎo)的IL-2基因已經(jīng)被克隆，并可在大腸桿菌Escherichia coli中表達(dá)〔核酸研究Nucleic Acids Resarch，11，4307(1983)〕。然而到目前為止IL-2樣物質(zhì)的存在也僅是在TCGF活性測(cè)定的基礎(chǔ)上而進(jìn)行判斷的。還沒有報(bào)告說(shuō)經(jīng)過人IL-2的DNA密碼的轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生的人IL-2蛋白被提純成純凈的形式。
本發(fā)明人已經(jīng)研制出一種新技術(shù)，即利用基因控制方法對(duì)人IL-2進(jìn)行克隆化，從而得到真正純凈的非糖基化的IL-2蛋白。由于使重組的DNA分子進(jìn)入宿主并在其中表達(dá)人IL-2基因，而建立了生產(chǎn)真正純凈的、非糖基化的，人IL-2蛋白的方法并完成了目前的發(fā)明。
本發(fā)明提供了真正純凈的非糖基化的人IL-2蛋白以及生產(chǎn)上述人IL-2蛋白的方法，它包括培養(yǎng)一種帶有DNA的轉(zhuǎn)化物，該DNA帶有編碼人IL-2的堿基序列，以及從培養(yǎng)液中提取該蛋白。
本實(shí)驗(yàn)中所用的，編碼人IL-2的DNA，是由圖2中1-133密碼子規(guī)定的，如DNA(Ⅰ)，該DNA(1)堿基序列在5′端可具有ATG或如圖2中描述的S1-S20密碼子所代表的信號(hào)序列，在3′端可能是TAA、TGA或TAG，更可能是TGA。
DNA(1)傾向于連接在啟動(dòng)子的下方，例如色氨酸起動(dòng)因子，rec A起動(dòng)因子或λPL起動(dòng)因子。更可能的是色氨酸起動(dòng)因子和λPL起動(dòng)因子。按照本發(fā)明，編碼人IL-2的mRNA是從用刀豆球蛋白A刺激的人外周白細(xì)胞培養(yǎng)中分離到的。例如單鏈cDNA是用逆轉(zhuǎn)錄酶合成的，然后再合成雙鏈DNA，隨后將雙鏈DNA插入到質(zhì)體中，重新化合的質(zhì)體可用于如大腸桿菌或芽胞桿菌屬的枯草桿菌的轉(zhuǎn)化，含有cDNA A的質(zhì)體已被克隆。用這種方法可以產(chǎn)生編碼人IL-2的雙股DNA，本發(fā)明中所使用的編碼IL-2的mRNA可用欣優(yōu)曼HINUMA等人的方法得到?！采蜕硌芯客ㄓ岯iochemical and Biophscal Research Communications，109，363(1982)〕，以由此得到的人IL-2的m RNA作為模板加入已知的逆轉(zhuǎn)錄酶來(lái)合成cDNA，然后再將cDNA轉(zhuǎn)化成雙股DNA?！猜~爾泰斯等人，細(xì)胞Cell，8，163(1981)，蘭德H等人，核酸研究Nucleic Acids Research，9，2251(1981)〕。用dG-dc同聚物連接法在限制性核酸內(nèi)切酶切開的位置即PSTI將雙股DNA插入到PBR322質(zhì)體中?！材釥柹琋elsonTS酶學(xué)方法Methods in Enzymology，68，41(1970)〕。此外，一個(gè)與人IL-2的部分氨基酸序列相應(yīng)的低聚核苷酸可通過化學(xué)合成得到，然后以32p標(biāo)記。用它作為示蹤物，按照已知的克隆雜交技術(shù)在抗四環(huán)素或抗氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化物中挑選出所期待的克隆?！哺裉m斯特恩Grunstein，M和霍格尼斯Hogness，D、S，Proc Natl Acad Sci USA 72 3961(1975);阿爾文Alwine，J、C等人，酶學(xué)方法Methods in Enzymology，68，220(1979)〕。按照馬克西姆·吉爾伯特(Maxam-Eilbert)的方法即上述的克隆雜交法，選擇出單一的克隆并分析DNA的基本序列，從而證實(shí)了人IL-2基因的存在。〔馬克西姆Maxam·A·M等人，Proc·Natl·Acad·sci，USA，74，560(1977)〕。或采用噬菌體M13的二核苷酸合成鏈測(cè)定法〔美星Messing·G等人，核酸研究Nucleic Acids Research。9，309(1981)〕。然后從所選擇的克隆中挑出完整的或部分的人IL-2基因，在適宜的起動(dòng)因子和SD〔Shine和Dalgarno)序列的下方插入到質(zhì)粒中，再放入一定的宿主中。
在起動(dòng)因子中色氨酸起動(dòng)因子比較合適，而大腸桿菌(E·Coli)則適于作為宿主(例如294株，DHI株·N4 830株)。據(jù)報(bào)道E·Coli 294株〔貝克曼(Beckman)等人Proc·Natl Acad·Sci USA，73，4179(1976)〕E.Coli DHI〔賽爾森Selson M.E等人，自然Nature 217 1110(1968)〕和E.Coli.N4830〔細(xì)胞Cell，25，713(1981)〕是合適的宿主。
用已知的方法將宿主的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化〔科恩Cohen.S.N等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972)〕被轉(zhuǎn)化的宿主在已知的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，例如含葡萄糖和凱氏氨基酸〔Casamino〕的M9培養(yǎng)液〔米勒Miller J分子遺傳學(xué)試驗(yàn)Experiments in Molecular Genetics，431-433頁(yè)(Cold Spring Harbor實(shí)驗(yàn)室，紐約1972)〕。當(dāng)使用色氨酸起動(dòng)因子時(shí)可加入3-β-吲哚丙烯酸脂來(lái)加強(qiáng)起動(dòng)因子的作用。培養(yǎng)通常是在15～43℃，10～30小時(shí)，最好為18～24小時(shí)，根據(jù)需要進(jìn)行通氣或攪拌。
如果使用λPL起動(dòng)因子，轉(zhuǎn)化物的培養(yǎng)，則適于在相對(duì)低一點(diǎn)的溫度約30-36℃下進(jìn)行，接著在37-42℃的條件下，使轉(zhuǎn)化物中的阻遏物滅活，并有效地進(jìn)行編碼人IL-2的DNA的表達(dá)。
由此得到的人IL-2可用IL-2依賴細(xì)胞系進(jìn)行分析。已知IL-2可以促進(jìn)大鼠小鼠和其它IL-2依賴細(xì)胞的生長(zhǎng)，正如可促進(jìn)人IL-2依賴細(xì)胞生長(zhǎng)一樣?！裁庖咴u(píng)論Immunological Reviews，51，257(1980)〕。因此，不僅人的IL-2依賴細(xì)胞系，而且小鼠、大鼠的IL-2依賴細(xì)胞系都可用于分析實(shí)驗(yàn)?！裁庖唠s志Journal oF Immunology 130，981和988(1983)〕。由此得到的IL-2可用來(lái)維持所需的IL-2依賴細(xì)胞系的生長(zhǎng)。
特別是鼠的IL-2依賴細(xì)胞系通過傳代培養(yǎng)可以穩(wěn)定的維持很長(zhǎng)一段時(shí)間，從而得到有價(jià)值的研究結(jié)果。
培養(yǎng)后，本發(fā)明采用已知的方法從培養(yǎng)的 細(xì)胞中提取人IL-2蛋白，將細(xì)胞懸浮于蛋白變性劑如胍的無(wú)機(jī)酸鹽溶液(鹽酸、硝酸、硫酸)之一中，再將懸液于低溫下攪拌，然后離心，從而得到含有IL-2的上清液，或?qū)⑵鋺腋∮诰彌_液中，用超聲波破碎，溶菌酶處理或凍溶后融解并離心，得到含有IL-2的上清液。其它任何可提取IL-2的方法也都可使用。
可以采用各種適當(dāng)分離提純方法從上述的上清液中提取IL-2蛋白并進(jìn)行純化。已知的分離提純方法包括利用溶解度的不同進(jìn)行提取，如鹽析法、溶劑沉淀法;利用分子量的不同進(jìn)行提取，如透析法、超濾法、凝膠過濾法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法;利用電荷不同，例如離子交換層析;利用特異性親和力的不同，如親和層析法;利用疏水性的不同，如反向高效液相色層析;利用等電點(diǎn)不同，如等電點(diǎn)聚焦電泳法。由于人IL-2蛋白具有較高的疏水性，因此使用疏水性柱層析，特別是反向高效液相色層析可提純?cè)摰鞍住?br>例如，從帶有編碼人IL-2的基因的E.Coli培養(yǎng)中得到的細(xì)胞可懸浮于溶液中，最好是含有蛋白變性劑的緩沖液中，如胍鹽酸鹽(2M-8M，最好為6M-8M)，將懸液攪拌，最好放于0-5℃攪拌0.5-3小時(shí)，然后離心，如此收集的上清液如果合適，用超濾器或類似儀器進(jìn)行濃縮。如若發(fā)現(xiàn)沉淀可通過離心除去，上清液用＝乙胺乙基纖維素裝的陽(yáng)離子交換柱層析提取，〔DE 52纖維素(華特曼Whatnan Gt英國(guó))〕，這樣就可收集到具有IL-2活性的部分。
使用超濾裝置進(jìn)行濃縮后，再將活性部分通過裝有N，N′-亞甲基偶聯(lián)丙烯酰葡聚糖凝膠如Sephacryl S-200(瑞典藥廠Pharmacia Sweden)或其它類似物質(zhì)的柱進(jìn)行過濾。收集到的活性部分再經(jīng)過高效液相色層析。按照這種方法就可以得非糖基化的人IL-2蛋白。
如采用反向高效液相色層析時(shí)選用烷基化(C1-18)硅烷包裹的樹脂效果最好。作為洗滌脫劑C1-6低烷醇(如乙醇丙醇)或乙晴較為適宜。洗脫劑的PH為1.5-8，最好為1.5-4。洗脫速率為0.1-100毫升/分鐘，最好是0.5-10毫升/分鐘。
按上述方法提取的人IL-2蛋白可用冷凍干燥制成粉末。在冷凍干燥時(shí)，可加入穩(wěn)定劑如山梨醇、甘露糖醇、右旋葡萄糖、麥芽糖、甘油或人血清白蛋白。
在測(cè)定IL-2活性時(shí)可利用放射性標(biāo)記法。IL-2依賴鼠細(xì)胞可吸收放射性胸腺嘧啶核苷，通過測(cè)定其放射性而計(jì)算出IL-2蛋白的活性。按照本發(fā)明得到的人IL-2蛋白的特異性活性單位不少于1×104單位/毫克，以大約為2×104單位/毫克-4×104單位/毫克的為較好。
這里提到的IL-2活性單位可按下列方法計(jì)算。將IL-2樣品加到含有鼠細(xì)胞的培養(yǎng)液中，鼠細(xì)胞的生長(zhǎng)取決于IL-2的濃度，整個(gè)混合液在37℃5%二氧化碳濃度下培養(yǎng)過夜。該細(xì)胞的生長(zhǎng)可用標(biāo)記的胸腺嘧啶核成進(jìn)行測(cè)定，為了測(cè)定標(biāo)本中IL-2的活性單位需用標(biāo)準(zhǔn)的IL-2(1單位/毫升)作為比較。通過標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)單位的IL-2的比率可計(jì)算出標(biāo)本中IL-2的活性單位。
IL-2依賴鼠細(xì)胞系的細(xì)胞(NKC3)〔辛紐曼Hinuma等人，生理生化研究通訊Biochem Biophys Res Commun，109，363(1982)〕可以在含20%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中在37℃5%Co2濃度中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用不含牛血清的1640培養(yǎng)液洗兩次，再將細(xì)胞懸浮于含20%小牛血清的1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)大約為6×105細(xì)胞/毫升。
在96孔平底微量培養(yǎng)板上的第一排孔中各加一滴(50μl)IL-2的標(biāo)本，再用含20%小牛血清的1640培養(yǎng)液進(jìn)行倍比稀釋，直至第十二排。每孔再加入50微升NKC3細(xì)胞懸液，然后37℃5%Co2濃度下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)20小時(shí)后，每孔加入一微居氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后將細(xì)胞放入細(xì)胞收集器中(Flow USA)，用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷的含量。在測(cè)定含有IL-2蛋白的標(biāo)本時(shí)要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的IL-2標(biāo)本進(jìn)行與含有IL-2樣品分析相同的步驟，才能計(jì)算出所測(cè)標(biāo)本的活性單位，并測(cè)定胸腺嘧啶氚標(biāo)記吸收。計(jì)算方法可參照免疫學(xué)雜志120 2027(1978)介紹的概率法計(jì)算。在標(biāo)準(zhǔn)的IL-2標(biāo)本稀釋系列中，最大吸收率為100%，然后再計(jì)算每一稀釋度的吸收百分率，并將得到的數(shù)值標(biāo)在概率曲線紙上。通過圖解可確定吸收率為50%的稀釋因子。用含有10%小牛血清，40微克/毫升刀豆球蛋白A和15毫微克/毫升12-氧-14酰波醇-13-乙酸(TPA)的RPMT1640培養(yǎng)液在37℃5%Co2濃度下培養(yǎng)人外周血淋巴細(xì)胞，經(jīng)過48小時(shí)后在上清培養(yǎng)液中IL-2的活性被確定為1單位/毫升。
標(biāo)本中IL-2的濃度(U/ml)可用下列公式計(jì)算(標(biāo)本的稀釋系數(shù)(50%吸收率))/(標(biāo)準(zhǔn)IL-2標(biāo)本的稀釋系數(shù)(50%吸收率))正像上述檢測(cè)方法確定的，從人類外周血獲得的天然IL-2具有20，000～70，000l/mg(單位/毫克)的特異性活性。天然IL-2的活性與現(xiàn)在發(fā)明的非糖基化的人類IL-2蛋白質(zhì)的活性幾乎相等。
按照這個(gè)發(fā)明，非糖基化的人類IL-2蛋白質(zhì)更為好的是含有氨基酸序列的多肽(Ⅱ)，見圖3，在X點(diǎn)上是蛋氨酸(Met)或氫。根據(jù)該發(fā)明生產(chǎn)的人類IL-2蛋白質(zhì)具有以下特征1)在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳內(nèi)，非糖基化人類IL-2是均質(zhì)的，通過電泳確定，分子量為15，000±1，000道爾頓。
2)在氨基酸(鏈)的氨基末端，含有丙氨酸或甲硫氨基酸。
3)在氨基酸序列的羧基末端，含有蘇氨酸。
4)促進(jìn)T-細(xì)胞或天然殺傷細(xì)胞的生長(zhǎng)并同時(shí)維持他們的功能。
根據(jù)發(fā)明生產(chǎn)的人類IL-2蛋白質(zhì)在
屬細(xì)胞溶解實(shí)驗(yàn)中所反應(yīng)陰性，〔黑莫斯塔斯Haemostasis7、183(1978)〕并且雜蛋白質(zhì)和熱原物質(zhì)的含量很低，因此能夠安全地應(yīng)用，如制成注射劑等等。
根據(jù)目前發(fā)明而獲得的非糖基化人類IL-2蛋白質(zhì)有促進(jìn)正常T-細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞生長(zhǎng)而同時(shí)又維持他們功能的能力。本發(fā)明的IL-2蛋白質(zhì)可用于T細(xì)胞在體外的長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)或自然殺傷細(xì)胞或用在它們的克隆化中。因此，在測(cè)量人類IL-2活性時(shí)，可利用該技能。
此外，人類IL-2蛋白質(zhì)的發(fā)明，使得選擇性地增加特異性抗原的殺傷T細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞成為可能。殺傷T細(xì)胞可識(shí)別和破壞腫瘤抗原。在體外，不論敏感性的抗原存在與否，自然殺傷細(xì)胞都具有殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。當(dāng)與上述的殺傷細(xì)胞同時(shí)接種到活的生物體內(nèi)時(shí)，本發(fā)明的IL-2可增加殺傷T細(xì)胞的抗腫瘤作用。因此，上述的IL-2對(duì)于腫瘤的預(yù)防或治療是有用的，或是對(duì)于溫血哺乳動(dòng)物(如小鼠、老鼠(耗子)、兔子、狗、貓、豬、馬、羊、牛、人)的各種免疫缺陷疾病的治療是有用的。
本發(fā)明的人類IL-2蛋白質(zhì)是一個(gè)高度純化的產(chǎn)品，對(duì)人來(lái)說(shuō)，它幾乎沒有抗原性，毒性也很低。
為了預(yù)防和治療腫瘤，本發(fā)明的人類IL-2能夠作為一種藥品被應(yīng)用，或是經(jīng)過腸道外的途徑，或是以口服的形式，例如適當(dāng)?shù)呐c已知的媒介物混合或稀釋制備成注射劑或膠束。如上所述，這些藥品制劑能夠單獨(dú)應(yīng)用，也能與體外培養(yǎng)的殺傷T細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞聯(lián)合使用。
本發(fā)明的人類IL-2蛋白質(zhì)基本上具有像天然人類IL-2一樣的生物學(xué)活性，因此能像上述的自然IL-2以相同的方式使用。本發(fā)明的IL-2的應(yīng)答細(xì)胞受體的解離常數(shù)非常小，以致于在大多數(shù)病例中，非常小的劑量就足以了。
為了使T細(xì)胞在體外能夠生長(zhǎng)，把本發(fā)明的人類IL-2以大約0.01～1單位/毫升的濃度加入到培養(yǎng)基內(nèi)，濃度范圍最好在0.1～0.5單位/毫升。
以在體外培養(yǎng)T細(xì)胞為例，以0.1～0.5單位/每毫升的濃度，把本發(fā)明的IL-2蛋白質(zhì)加入到細(xì)胞懸液中，該細(xì)胞懸液是從人類外周血獲得的T細(xì)胞(1×106細(xì)胞/毫升)與淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)3天，而獲得的對(duì)特異抗原敏感的T細(xì)胞與B細(xì)胞，在含有20%的小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中增加X線照射進(jìn)行轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)持續(xù)約1個(gè)月，在此期間，約每隔一周換一次培養(yǎng)液。
以下展現(xiàn)出的樣本，即是大腸桿菌DHI/PTF4，已存放在大阪發(fā)酵所(IFO)，存放的號(hào)碼是IFO-14299，并且也存放在發(fā)酵研究所，工業(yè)科學(xué)技術(shù)代理處，日本國(guó)際工業(yè)貿(mào)易部(FRI)，登記號(hào)碼是FERM、BP-628，存放在布達(dá)佩斯條約之下。
在本發(fā)明的說(shuō)明書，附圖中，當(dāng)以縮寫代表堿基、氨基酸時(shí)，都是按照國(guó)際理論和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)-國(guó)際生物聯(lián)合會(huì)(IUB)委員會(huì)的規(guī)定及有關(guān)該領(lǐng)域的生物學(xué)的術(shù)語(yǔ)或貫例的。如表1，在這里設(shè)及到了光學(xué)異構(gòu)現(xiàn)象，除了其它方面的特殊說(shuō)明外，所提到的氨基酸是以左旋(L)形式(存在)。
表1DNADeoxyribonucleic acid 脫氧核糖核酸cDNAComplementary deoxyribo nucleic acid互補(bǔ)脫氧核糖核酸AAdenine 腺嘌呤TThymine 胸腺嘧啶
GGuanine 鳥嘌呤CCytosine 胞嘧啶RNARlbonucleic acid 核糖核酸mRNAMessenger ribonucleic acid信息核糖核酸dATPDeoxyadenosine triphosphate脫氧三磷酸腺苷dTTPDeoxythymidine triphosphate脫氧三磷酸胸dGTPDeoxyguanosine triphosphate脫氧三磷酸鳥苷dCTPDeoxycytidine triphosphate脫氧三磷酸胞苷ATPAdenosine triphosphate三磷酸腺苷EDTAEthylenediaminete triphosphate acid乙二胺四乙酸SDSSodium dodecyl Sul fate十二烷基硫酸鈉鹽GlyGlycine 甘氨酸AlaAlanine 丙氨酸ValValine 纈氨酸LeuLeu Cine 亮氨酸IleIsoleucine 異亮氨酸SerSerine 絲氨酸ThrThreomine 蘇氨酸
CysCysteine 胱氨酸1/2 CysHalf Cystine 半胱氨酸MetMethionine 蛋氨酸GluGlutamic acid 谷氨酸AspAspartic acid 天冬氨酸LysLysine 賴氨酸ArgArginine 精氨酸His Histidine 組氨酸PhePhenylalamine 苯丙氨酸TyrTyrosine 酪氨酸ProProline 脯氨酸AsnAsparagine 天冬酰胺GlnGlutamine 谷氨酰胺圖1和圖2分別說(shuō)明由參考例1(Ⅶ)獲得的質(zhì)粒PILOT 135-8內(nèi)切酶圖譜(說(shuō)明信號(hào)肽的部分編碼，說(shuō)明IL-2的部分編碼)和上述質(zhì)粒的初級(jí)結(jié)構(gòu)(堿基序列)。圖3顯示的為本發(fā)明的，非糖基化的氨基酸序列，在X點(diǎn)上，是蛋氨酸或是一個(gè)氫原子。圖4說(shuō)明了參考例2給出的質(zhì)粒PTF 4的表達(dá)制造圖解。圖5說(shuō)明做的十二烷基硫酸鈉鹽(SDS)一聚丙烯酰胺凝膠板電泳，在例1(V)、(1)和(2)中，圖6說(shuō)明在例1(V)(6)，講到的胰酶消化肽的圖譜。圖7和圖8說(shuō)明本發(fā)明的人類IL-2蛋白質(zhì)分別通過NKC 3細(xì)胞系和人類細(xì)胞系吸收標(biāo)記的胸腺嘧啶的作用。如例1(V)(7)所揭示的那樣。圖9說(shuō)明在例1(V)(7)內(nèi)長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)的NKC3細(xì)胞系的結(jié)果。
圖10和11，說(shuō)明參考例4所給出的表達(dá)質(zhì)粒PTF 1和PTB 285的制造圖解。
參考例1
(Ⅰ)分離編碼人類IL-2的mRNA來(lái)源于人類外周血的淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)在含有10%的小牛血清，12氧14烷佛波醇-13乙酸(TPA)(15毫微克/毫微升，15ng/nl)和刀豆球蛋白A(40微克/毫升、ng/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基內(nèi)，溫度為37℃，從而引起IL-2的產(chǎn)生。孵育24小時(shí)以后，在含有5M硫氰胍，5%巰基乙醇、50mM三羥甲基氨基甲烷、鹽酸(Tris HCl)(pH7.6)和10mM乙二胺四乙酸(EDTA)的一種溶液內(nèi)，把1×1010人類淋巴細(xì)胞放入含有上述溶液的Teflon勻漿器中使其破碎并變性，然后加入4%的十二酰甲基甘氨酸鈉，勻漿后的混合物被放置到6毫升(ml)5.7M氯化銫溶液(5.7M氯化銫、1M EDTA)中，用Beckman Sw 28離心機(jī)以24，000轉(zhuǎn)/分，在15℃離心48小時(shí)，得到RNA沉淀。該沉淀再溶解在0.25%的十二酰甲基甘氨酸鈉內(nèi)并用乙醇沉淀，得到10mg(毫克)的RNA。該RNA在一寡(dT)纖維素柱中，在高濃度鹽溶液內(nèi)〔0.5M氯化鈉(NaCl)10mM Tris HCl PH7.6，1mM EDTA、0.3%SDS)吸附。再用低鹽溶液(10mM Tris HCl PH7.6mM EDTA 0.3% SDS)洗提，得到300微克(μg)含有聚A的mRNA。該mRNA進(jìn)一步用乙醇沉淀，然后再溶解在0.2ml溶液內(nèi)(10mM Tris HCl PH7.6，2mM EDTA 0.3% SDS)，65℃處理2分鐘，經(jīng)10～35%的蔗糖梯度密度離心(使用Beckmem SW 28轉(zhuǎn)子，在20℃ 25，000轉(zhuǎn)/分，21小時(shí))分為22個(gè)部分。每個(gè)部分注入到爪蟾屬laevis的卵母細(xì)胞內(nèi)，便可測(cè)量這樣合成的蛋白質(zhì)中的IL-2活性。發(fā)現(xiàn)NOs 11-15部分(沉降系數(shù)85-15S)具有IL-2活性，在這些部分里，大約含有25μg(微克)的IL-2信息核糖核酸(mRNA)。
(Ⅱ)單鏈脫氧核糖核酸(DNA)的合成。
用上述獲得的信息核糖核酸(mRNA)和逆轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)是在100微升的反應(yīng)溶液里(5微克的mRNA，50μg的oliogo(dT)，100單位的逆轉(zhuǎn)錄酶，1mM的脫氧三磷酸腺苷(dATP)，1mM脫氧三磷酸胞苷(dCTP)1mMe脫氧三磷酸鳥苷(dGTP)，1mM脫氧三磷酸胸苷(dTTP)8mM氯化鎂MgCl250mM氯化鉀KCl 10mM二硫蘇糖醇(DTT)、50mM三羥甲基氨基甲烷鹽Tris，PH8.3)在42℃，持續(xù)1小時(shí)的條件下完成的，再用苯酚去除蛋白質(zhì)並用0.1N的氫氧化鈉處理在70℃，20分鐘以分解RNA。
(Ⅲ)雙鏈DNA的合成在以上(Ⅱ)獲得的單鏈互補(bǔ)DNA，在50微升的反應(yīng)溶液里(除了缺乏mRNA和oligo(dT)與上述(Ⅱ)階段的反應(yīng)溶液相同)，在42℃持續(xù)2小時(shí)合成編碼IL-2的雙鏈DNA，詳見馬尼塔斯Maniatis等。
(Ⅳ)dc末端的增加在50微升反應(yīng)溶液內(nèi)(雙鏈DNA、0.1M醋酸鈉鹽、PH4.5、0.25M NaCl 1.5mM的硫酸鋅，60單位SI核酸酶)，用核酸酶SI處理由第三步來(lái)的雙鏈DNA條件為室溫30分鐘，再用苯酚去除蛋白質(zhì)和用乙醇沉淀DNA。沉淀的DNA在50微升的反應(yīng)溶液(雙鏈DNA，0.14M卡可基酸鉀，0.3M Tris(堿性)PH7.6，2mM二硫蘇糖醇，1mM CoCl2，0.15mM三磷酸脫氧胞苷，30單位的終端轉(zhuǎn)移酶)內(nèi)，用終端轉(zhuǎn)移酶處理，37℃，3分鐘，從而引起雙鏈DNA的延伸，在兩條鏈的兩個(gè)3′末端約有15個(gè)脫氧胞嘧啶。以上一系列的反應(yīng)，得到300毫微克(ng)含有脫氧胞嘧啶鏈的雙鏈DNA。
(Ⅴ)大腸桿菌質(zhì)粒的裂解和dc末端的增加在50微升反應(yīng)溶液內(nèi)(10μg上述DNA，50mM NaCl，6mM Tris HCl、PH7.4 6mM MgCl2，6mM2-巰基乙醇，100微克(μg)/毫升(ml)小牛血清，20單位的PstI)用限制性內(nèi)切酶處理，10微克的大腸桿菌質(zhì)粒PBR 322 DNA 37℃，3小時(shí)，從而裂解了一個(gè)在質(zhì)粒PBR 322 DNA上的PstI識(shí)別位點(diǎn)，接著用苯酚去除蛋白質(zhì)，對(duì)在50微升反應(yīng)溶液內(nèi)(10微克DNA、0.14M卡可基酸鉀、0.3M Tris(堿性)PH7.6、2mM二硫蘇糖醇，1mM CoCl2，0.15M三磷酸鳥嘌呤和30單位的終端轉(zhuǎn)移酶)37℃，用終端轉(zhuǎn)移酶對(duì)所述的DNA處理30分鐘，延伸裂解的質(zhì)粒PBR 322 DNA，在它的兩個(gè)3′末端都增加了約17個(gè)脫氧鳥嘌呤。
(Ⅵ)cDNA的對(duì)合及大腸桿菌的轉(zhuǎn)化以上(Ⅳ)內(nèi)獲得的編碼IL-2的DNA(0.1μg)和(Ⅴ)內(nèi)所得的0.5μg(微克)的DNA質(zhì)粒，在含有0.1M氯化鈉，50mM Tris、HCl、PH7.6和1mM EDTA的溶液中，65℃熱處理2分鐘后，接著在45℃處理2小時(shí)，使它們對(duì)合以后逐漸冷卻，根據(jù)埃尼(Enea)等人的方法IJ，M01分子生物學(xué)雜志Biot.96.495(1975)〕，該產(chǎn)物用于大腸桿菌MM294的轉(zhuǎn)化。
(Ⅶ)分離含有互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)的質(zhì)粒按照這種方法，大約分離到20，000抗四環(huán)素的轉(zhuǎn)化物。每一個(gè)DNAs固定在一個(gè)硝酸纖維素濾器上。在IL-2氨基酸序列的基礎(chǔ)上，由坦科奇(Taniguchi)等人報(bào)告的〔自然，Nature，302，305(1983)〕，該互補(bǔ)寡核苷酸的堿基順序(5′AAA，CAT、CTT、CAG、TGT3和5′ACA、TTC、ATG、TGT、GAA3)分別與氨基酸NOs 74-78(賴-組-亮-谷氨酰胺-胱氨酸)及氨基酸NOs，122-126(蘇-苯丙-蛋-胱氨酸-谷氨酸)相對(duì)應(yīng)，互補(bǔ)寡核苷酸是用Phosphotriester方法〔科瑞等人Crea R，et al Proc、Natl、Acad、Sci USA 75，5765(1978)〕化學(xué)合成的。
這些寡核苷酸在50微升的反應(yīng)溶液內(nèi)(0.20微克的寡核苷酸、50mM Tris、HCl、PH8.0、10mM MgCl2、10mM2-巰基乙醇、50微居(μci)的γ-32P ATP(三磷酸腺苷)、3個(gè)單位的T4多核苷酸激酶)處理，37℃1小時(shí)，使其被32P在5′末端標(biāo)記，按照勞恩(Laun)等人的方法〔核酸研究Nucleic Acids Res，9，6103(1981)〕用這些標(biāo)記的寡核苷酸作為探針，與上述固定硝酸纖維素濾膜上的DNAs對(duì)合。與上述兩個(gè)標(biāo)記的寡核苷酸探針有反應(yīng)的4個(gè)轉(zhuǎn)化物便可通過自動(dòng)放射法檢測(cè)。采用伯恩貝-多里，堿性(Birnboim-Doly alkali)方法〔伯恩貝-多里Birnboim.H.C Doly、J.核酸研究Nucleic Acids Res 7，1513(1979)〕，從這些轉(zhuǎn)化物的每一個(gè)細(xì)胞分離質(zhì)粒DNA，然后用限制性內(nèi)切酶在Pst1位置切除質(zhì)粒DNA上的插入體。在分離的質(zhì)粒中，挑選了一個(gè)含有最長(zhǎng)的編碼IL-2的插入體的質(zhì)粒，稱為PILOT 135-8，圖1表示了該質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶的圖譜。
插入在該P(yáng)ILOT 135-8的cDNA的初級(jí)結(jié)構(gòu)(堿基序列)，通過2脫氧核苷酸方法和馬克斯-吉爾伯特(Maxam-Gilbert)方法確定了，所確定的初級(jí)結(jié)構(gòu)見圖2，由這個(gè)堿基序列確定的肽，由153個(gè)氨基酸組成，首先合成起始信號(hào)(NOs、64-66、ATG)另一方面，N-末端的20個(gè)氨基酸被認(rèn)為是組成一個(gè)信號(hào)肽。以上初級(jí)結(jié)構(gòu)說(shuō)明PILOT 135-8具有編碼人類IL-2蛋白質(zhì)的堿基序列。這一事實(shí)說(shuō)明，把由(Ⅳ)得到的編碼IL-2的基因插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)質(zhì)粒內(nèi)，則能導(dǎo)致產(chǎn)生IL-2蛋白質(zhì)。
參考例2從參考例1中得到的Pilot 135-8質(zhì)粒用Hgial限制性內(nèi)切酶切開，由此得到的含有IL-2基因的1294個(gè)堿基對(duì)的DNA碎片，含有一個(gè)IL-2基因，再采用T4DNA多聚酶處理，與ClaI連接于CGATA ATG GCA連接起來(lái)，它含有丙氨酸密碼子GCA和蛋氨酸的密碼子ATG，連接后的產(chǎn)物用ClaI和PstI處理，接著在ClaI-PstI的位置上插入PtrP 771，由此得到的質(zhì)粒被命名為PTF4(圖4)。
參考例3E.Coli，DH1可用參考例2中得到的PTF4質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其方法與科恩Cohen等人的方法一致，〔Proc，Natl Acad，Sci USA 69，2110，(1972)〕，從而得到帶有上述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化物。
例1E.Coli、DH1/PTF4(在參考例3中獲得)被接種到PH7.0含有1%Bacto胰蛋白胨(美國(guó)Difco實(shí)驗(yàn)室)，0.5% Bacto酵母提取液(美國(guó)Difco實(shí)驗(yàn)室)0.5%氯化鈉和7ng/ml四環(huán)素的培養(yǎng)液中，然后放入250毫升的愛倫美氏燒瓶中，在轉(zhuǎn)鼓上37℃過夜，再將培養(yǎng)液放入5升的發(fā)酵桶內(nèi)，桶內(nèi)裝有2.5升的M9培養(yǎng)液，其中含有0.5%酪蛋白氨基酸，0.5%葡萄糖和7μg/ml四環(huán)素，然后通氣攪拌培養(yǎng)4小時(shí)，溫度為37℃，加入3-β吲哚丙烯酸(25μg/ml)后，再繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，最后將達(dá)2.5升培養(yǎng)液離心，得到的細(xì)胞放于-80℃冰凍保存。
(Ⅱ)從例1中得到的冰凍細(xì)胞(12.1克)懸浮于100ml的提取液中，(PH7.0)，該提取液含有7M鹽酸胍和0.1M Tris、HCl，將懸浮液在4℃攪拌1小時(shí)，將溶胞物離心，28000xg20分鐘，最后得到93ml上清液。
(Ⅲ)對(duì)從例1(Ⅰ)中得到的大腸桿菌(E.Coli)DH1/PTF4細(xì)胞轉(zhuǎn)化物中提取IL-2，分別使用了不同的提取方法以比較各自的提取效率。
在溶菌酶-EDTA方法中，取例Ⅰ(Ⅰ)得到2克大腸桿菌DH1/DTF4細(xì)胞，與16毫升PH7.0溶液混合，該液含有0.1M Tris-HCl，10m M EDTA及250毫克/升溶菌酶，上述混合液于4℃下攪拌1小時(shí)，隨后放37℃攪拌5分鐘，溶胞物再經(jīng)28，000xg離心20分鐘。
在超聲處理方法中，取從例1(Ⅰ)得到的2克細(xì)胞，放于16毫升PH7.0、含有0.1M Tris-HDl溶液中，然后將懸浮液于0℃進(jìn)行超聲處理5分鐘;溶胞物再行28，000xg離心20分鐘。
在鹽酸胍方法中取來(lái)自例1(Ⅰ)的2克細(xì)胞，與16毫升PH7.0溶液混合，該液含有0.1M Tris-HCl及2M、4M或7M的胍-HCl，上述混合液于4℃下攪拌1小時(shí)，溶胞物再經(jīng)28，000xg離心20分鐘，所得的上清液用于蛋白濃度及IL-2活性的測(cè)定，其結(jié)果總結(jié)如表2表2IL-2的提取
Gu.HCl鹽酸胍(Ⅳ)在例1(Ⅱ)中所得到的上清液對(duì)(PH8.5)0.01M Tris-HCl緩沖液透析，然后再行19，000xg離心10分鐘，收取透析清液94毫升，此液用于DE52(DEAE-纖維素)柱該柱體積為50毫升吸附蛋白質(zhì)，該柱事先用0.01M Tris-HCl(PH8.5)緩沖液平衡，以線性梯度的氯化鈉(0-0.15M氯化鈉，1升)洗脫蛋白質(zhì)，具有IL-2活性的部分(53毫升)用YM-5濾膜(美國(guó)、Amicon J)濃縮至4.8毫升，然后，進(jìn)行葡聚糖凝膠S-200(瑞典Pharmacia J)柱的凝膠過濾(柱體積500毫升)。使用PH8.0、0.1M Tris-HCl-1M氯化鈉緩沖液平衡。如此得到的活性部分(28毫升)，再用YM-S濾膜濃縮至2.5毫升。此濃縮物進(jìn)而經(jīng)超微孔R(shí)PSC柱(美國(guó)Altex J)吸附及高效液相色譜分析。在高效液相色譜分析中，以三氟醋酸-乙腈系統(tǒng)作為流動(dòng)相。
使用條件柱超微孔R(shí)PSC(4.6×75毫米);
柱溫度30℃溶劑A0.1%三氟醋酸-99.9%水;
溶劑B0.1%三氟醋酸-99.9%乙腈;
洗脫次序0分鐘(68%A+32%B)-25分鐘(55%A+45%B)-35分鐘(45%A+55%B)-45分鐘(30%A+70%B)-48分鐘(100%B);
洗脫速率0.8毫升/分鐘;
檢測(cè)波長(zhǎng)230nm活性部分的收集時(shí)間大約在第39分鐘。由此得到10毫升溶液，其中含有0.53毫克非糖基化人IL-2蛋白質(zhì)〔特異活性30，000單位/毫克;起始物質(zhì)的活性復(fù)元30.6%，純蛋白質(zhì)99%(使用光密度計(jì)對(duì)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行測(cè)定)。
上述溶液經(jīng)冷凍干燥，得到白色粉末。該粉末具有26，000單位/毫克的特異活性。
(Ⅴ)在例Ⅰ(Ⅳ)得到的人IL-2蛋白質(zhì)從如下性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)1.同質(zhì)性據(jù)Laemmli方法(自然雜志、Nature。227、680、1970)對(duì)SPS-聚丙烯酰胺凝膠電泳用考馬斯亮蘭染色，人的IL-2蛋白質(zhì)僅顯示單一條帶(圖5)，其條帶位置在還原或不還原情況下不改變。
2.分子量以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果為基礎(chǔ)，計(jì)算人IL-2蛋白質(zhì)分子量大約為15，000道個(gè)頓(圖5)。
3.氨基酸組分20微克人IL-2蛋白質(zhì)放于玻璃試管內(nèi)進(jìn)行水解，加入沸騰的含有4%巰基乙酸的鹽酸，真空密封管口，將試管置于110℃條件下反應(yīng)24小時(shí)，48小時(shí)或72小時(shí)進(jìn)行水解。水解后打開試管封口，減壓抽去鹽酸，其剩余物用0.02N鹽酸再次溶解，對(duì)此用835型Hitachi氨基酸分析儀進(jìn)行氨基酸分析。
對(duì)胱氨酸和半胱氨酸的測(cè)定，系使用Hirs的方法(酶學(xué)方法，Methods In EnzymolⅡ、197、(1967)〕將人IL-2蛋白質(zhì)用過甲酸氧化，隨后在恒沸鹽酸中減壓24小時(shí)進(jìn)行水解。其水解產(chǎn)物用氨基酸分析儀進(jìn)行磺基丙氨酸測(cè)定。分析結(jié)果見表3，其數(shù)值系水解24小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)各所得三個(gè)數(shù)值的平均值。而絲氨酸蘇氨酸由推斷水解起始時(shí)間測(cè)知。
表3氨基酸 摩爾%天冬氨酸/天冬酰胺 8.8蘇氨酸 9.3絲氨酸 5.7谷氨酸/谷氨酰胺 13.7脯氨酸 3.4甘氨酸 1.7丙氨酸 3.81/2半胱氨酸 2.3纈氨酸 3.1蛋氨酸 3.7異亮氨酸 6.3亮氨酸 16.3酪氨酸 2.3苯丙氨酸 4.5賴氨酸 8.3組氨酸 2.5精氨酸 3.1色氨酸 1.14.N-末端氨基酸順序取34微克人IL-2蛋白質(zhì)，以自動(dòng)的Edman降解方法，用氣相蛋白順序分析儀(470A型，應(yīng)用生物分析廠、美國(guó))進(jìn)行N-末端氨基酸順序分析。
選用Micropak-SP柱(美國(guó)、VarianT)以高壓液相層析分析鑒定苯基乙內(nèi)酰硫脲-氨基酸(PTH-氨基酸)
表4顯示了每步驟檢出的PTH-氨基酸或其他酸表4步驟 測(cè)出的PTH-氨基酸1 丙氨酸蛋氨酸2 脯氨酸丙氨酸3 蘇氨酸脯氨酸4 絲氨酸蘇氨酸5 絲氨酸6 絲氨酸7 蘇氨酸8 賴氨酸9 賴氨酸10 蘇氨酸11 谷氨酰胺12 亮氨酸13 谷氨酰胺14 亮氨酸15 谷氨酸16 Y＊17 亮氨酸18 亮氨酸19 亮氨酸20 天冬氨酸＊尚未鑒定
5.C-未端氨基酸取33微克人IL-2蛋白質(zhì)加入到玻璃試管中，加入不含水的肼0.05毫升，將試管真空封口，于100℃加熱6小時(shí)，進(jìn)行肼降解。獲得的肼降解物冷凍干燥，然后再溶于蒸餾水中。此溶液再加入苯甲醛，于室溫下攪拌混合1小時(shí)后離心。取液層冷凍干燥，用Hitachi835型氨基酸分析儀，進(jìn)行氨基酸分析。只有蘇氨酸被測(cè)定。
6.胰蛋白多肽圖譜取15微克人IL-2蛋白質(zhì)，放于含有0.4微克胰蛋白的120微升，0.02M碳酸氫鈉液中，37℃酶解18小時(shí)。然后加入5微升-巰基乙醇，37℃再反應(yīng)2小時(shí)。然后加1%三氟醋酸75微升中止反應(yīng)。
該反應(yīng)混合物的高壓液相色層析按照如下方法進(jìn)行，洗脫情況見圖6，柱超微粒-辛基型(5微米、4.6×250毫米，美國(guó)AlTeXJ)柱溫度30℃流動(dòng)相溶液A0.02%三氟醋酸-99.98%水;
溶液B0.02%三氟醋酸-99.98%乙腈;
0分鐘(95%溶液A+5%溶液B);
45分鐘(30%溶液A+70%溶液B);
流速1.0毫升/分鐘檢測(cè)使用熒光胺(美國(guó)RocheT)的熒光方法(生物化學(xué)分析Analytical Biochem 67、438(1975)〕。
7.對(duì)本發(fā)明非糖基化人IL-2蛋白質(zhì)的IL-2依賴細(xì)胞系的活性分析，是依據(jù)生物化學(xué)、生物生理學(xué)研究通訊109，363(1982)中，描述的一個(gè)方法分析表明，在小鼠IL-2蛋白依賴細(xì)胞系(NKC3圖7)該IL-2蛋白有促進(jìn)攝取氚標(biāo)記的胸腺嘧啶的活性。人IL-2依賴細(xì)胞系活性亦相同(參見圖8)。
而且發(fā)現(xiàn)將該IL-2蛋白質(zhì)以0.5單位/毫升的濃度溶于20%FCS加RPMI-1640培養(yǎng)基中，其中懸浮2×105個(gè)細(xì)胞/毫升的NKC3細(xì)胞系。于37℃5%的CO2環(huán)境下，在Linbro Multi皿(美國(guó)，F(xiàn)low)上連續(xù)傳代，同時(shí)間隔2或3天計(jì)數(shù)反復(fù)成活的細(xì)胞，並再懸浮培養(yǎng)于新鮮培養(yǎng)基中?？梢砸姷皆揑L-2蛋白質(zhì)具有維持NKC3細(xì)胞系長(zhǎng)時(shí)期生長(zhǎng)的活性。說(shuō)明見圖9。
例2(注射劑制備)應(yīng)用CM-Toyopearl(日本，Toyo SodaT)柱，對(duì)在例1(Ⅳ)中得到的含有非糖基化人IL-2蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行吸附，該柱用0.025M醋酸銨緩沖液(PH5.0)平衡。在無(wú)菌條件下進(jìn)行吸附，隨后使用含有0.15M氯化鈉的上述緩沖液作洗脫。該洗脫液加入適量的0.15M氯化鈉稀釋，接著加入HSA使?jié)舛葹?.5%，再經(jīng)濾膜(0.22微米孔徑)過濾。無(wú)菌分裝1毫升濾液于小瓶中，冷凍干燥。注射時(shí)每瓶人IL-2制劑加入1毫升蒸餾水溶解使用。
參考例4從參考例1中得到的PILOT 135-8質(zhì)粒用Hgi AI限制性內(nèi)切酶斷開，得到的1294bp DNA片斷，用T4DNA聚合酶處理產(chǎn)生平端，再用T4DNA連接酶同ECO RI連接子d TGCCATGAA-TTCATGGCA連接。
如上得到的DNA經(jīng)Eco RI酶解，將獲得附加有轉(zhuǎn)譯起動(dòng)密碼ATG和人IL-2基因的DNA片斷。
該DNA片斷，用T4DNA連接酶插入到在Eco RI-Pst I位點(diǎn)已被酶解的Ptrp 781中(核酸研究，Nucleic AcidsResearch，11 3077(1983)〕，這樣所得到的表達(dá)質(zhì)粒PTE1，在啟動(dòng)子的下方具有一個(gè)轉(zhuǎn)譯起始密碼子及一個(gè)人類IL-2基因(圖10)。
PTF 1質(zhì)粒用Stu 1限制性內(nèi)切酶斷開，並同Bam HI連接子連接。這個(gè)質(zhì)粒DNA用Bam HI和Eco RI限制性內(nèi)切酶處理，隨后插入PTB281中。PTB281在Eco RI-Bam HI位點(diǎn)有λPL啟動(dòng)子。上述得到的表達(dá)質(zhì)粒稱為PTB285(圖11)。
參考例5用參考例4得到的PTB285質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌N4830，依據(jù)Cohen等人的方法(參看上文)進(jìn)行，將得到一個(gè)轉(zhuǎn)化物(大腸桿菌N4830/PTB285)，它攜帶該質(zhì)粒。
例3從參考例5中得到的大腸桿菌N4830/PTB285接種于50毫升液體培養(yǎng)基中(PH7.0)。此培養(yǎng)基含有1%細(xì)菌用胰蛋白胨(美國(guó)，Difco實(shí)驗(yàn)室)、0.5%氯化鈉和7微克/毫升四環(huán)素，共裝入250毫升錐形燒瓶中，上搖床，35℃過夜。然后將培養(yǎng)基移入5升的發(fā)酵瓶?jī)?nèi)，瓶?jī)?nèi)裝入2.5升M9培養(yǎng)液。該培養(yǎng)液含有0.5%酪蛋白氨基酸，0.5%葡萄糖以及7微克/毫升四環(huán)素。將上述培養(yǎng)物放于35℃通風(fēng)及搖動(dòng)條件下孵育4小時(shí)，然后以42℃再培養(yǎng)3小時(shí)。最后，從2.5升液體培養(yǎng)基中離心收集細(xì)胞，置-80℃冰凍保存。
按照例1方法對(duì)上述細(xì)胞進(jìn)行提取和純化，將從上述的大腸桿菌N4830/PTB285細(xì)胞中得到具有同例1(Ⅴ)中一樣性能的高純度人IL-2蛋白質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)基本上純凈的非糖基化的人類白細(xì)胞介素-2蛋白質(zhì)的方法，所說(shuō)的人類白細(xì)胞介素-2蛋白質(zhì)的特異活性不低于104單位/毫克，其特征在于，它包括培養(yǎng)一種帶有一種DNA的轉(zhuǎn)化物，該DNA帶有一個(gè)編碼人類白細(xì)胞介素-2的堿基序列，從而造成在生長(zhǎng)的細(xì)胞中生產(chǎn)和積累人類白細(xì)胞介素-2，用一種蛋白質(zhì)變性劑的溶液從該細(xì)胞中提取人類白細(xì)胞介素-2，將這樣所獲取的含有人類白細(xì)胞介素-2的液體通過一個(gè)包括疏水性柱層析的提純過程而純化。
2.一種根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)具有如下所示的氨基酸序列X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu GlnLeu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu AsnGly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg MetLeu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr GluLeu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys ProLeu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn PheHis Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn ValIle Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe MetCys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu PheLeu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile SerThr Leu Thr其中的X是甲硫氨酸或是氫。
3.一種根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)為冷凍干燥形式的。
4.一種根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其特征在于，其中所述的人類白細(xì)胞介素-2是用一種濃度為2至8摩爾的胍鹽酸溶提取的。
5.一種根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其特征在于，其中所述的疏水性柱層析是一種使用反相柱的高效液相層析。
6.一種根據(jù)權(quán)項(xiàng)5所述的方法，其特征在于，在進(jìn)行層析時(shí)，所用的洗脫液的PH值為1.5至8。
7.一種根據(jù)權(quán)項(xiàng)5所述的方法，其特征在于，在進(jìn)行層析時(shí)，流速為0.1至100毫升/每分鐘。
8.一種生產(chǎn)含有基本上純凈的非糖基化人類白細(xì)胞介素-2蛋白質(zhì)的藥用組合物的方法，所說(shuō)的人類白細(xì)胞介素-2蛋白質(zhì)的特異活性不低于104單位/毫克，其特征在于，將所述的蛋白質(zhì)與藥理上相容載體，賦形劑或稀釋劑等相互混合。
9.一種根據(jù)權(quán)項(xiàng)8所述的方法，其特征在于，所述的組合物是冷凍干燥形式的。
專利摘要
一種基本上純凈的非糖基化人類白細(xì)胞介素-2蛋白質(zhì)，其具有的特異活性不低于10
文檔編號(hào)C12N15/00GK85101341SQ85101341
公開日1987年1月31日 申請(qǐng)日期1985年4月1日
發(fā)明者加藤光一, 山田隆央, 音田治夫 申請(qǐng)人:武田藥品工業(yè)株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan