蛋白質(zhì)純化的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】蛋白質(zhì)純化 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明一般性地設(shè)及純的且穩(wěn)定的NY-ES0-1相關(guān)多膚W及生產(chǎn)它的方法。
[000引發(fā)明背景 被稱(chēng)為癌癥-睪丸抗原（CT抗原）的、僅在腫瘤細(xì)胞和免疫赦免組織中一般性表達(dá)的 一類(lèi)蛋白的基因調(diào)控，在癌癥患者中受到破碎。該導(dǎo)致該些抗原在多種腫瘤中異常表達(dá)。癌 癥患者中一些CT抗原的免疫原性使它們成為癌癥疫苗開(kāi)發(fā)的理想祀標(biāo)。目前感興趣的用 于癌癥免疫治療的癌癥睪丸抗原是NY-ES0-1。還鑒別了另一個(gè)癌癥睪丸抗原，LAGE-1。已 描述了兩個(gè)LAGE-1轉(zhuǎn)錄物，LAGE-la和LAGE化。LAGE-化被不完全剪接，并且編碼推定的 大約210個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)（Sunetal. (2006)Cancer/備w?(97 /備unWAer, 6: 55: 644-652)0
[0003]LAGE-1和NY-ESO-1蛋白的N末端區(qū)域是高度保守的，并被認(rèn)為具有超過(guò)97%的 同一性。但是，LAGE-1與NY-ES0-1的區(qū)別在于其中間區(qū)域只有62%相同。NY-ES0-1和 LAGE-la的C末端是高度保守的（超過(guò)97%的同一性）。但是，LAGE-化的C末端較長(zhǎng)并且 不保守，并被認(rèn)為與LAGE-la/NY-ESO-1的相同區(qū)域的同一性小于50%。關(guān)于該些蛋白質(zhì)的 一般信息可W在LICR網(wǎng)站（參見(jiàn)WWW.cancerimmunity.org/CTdat油ase)上找到。
[0004] 重組CT抗原的純化是制造基于CT抗原的癌癥免疫治療劑的一個(gè)步驟。已研究 了各種方法W從重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中除去污染物如宿主細(xì)胞蛋白，并且有市售的試劑盒幫 助開(kāi)發(fā)從宿主細(xì)胞如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)可溶性和活性重組蛋白的方法。參見(jiàn)，例如， "ToolsforEnhancingSolubilityofProteinsExpressedinE. coliandrefolding screensforDifficultTargets，copyright2008EMDChemicalsInc.，anaffiliate ofMerckKGaA,Damstadt,Germany。盡管如此，在某些情況下，在獲得足夠純度水平的CT 抗原上遇到困難。
[0005] 例如，已證明難臥用標(biāo)準(zhǔn)的基于大腸桿菌的重組表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生重組NY-ES0-1。參 見(jiàn)Mu:rphy(2005)化邸.做ocAc化做35:119-134。這種純化方案涉及多個(gè) 色譜步驟，伴隨著NY-ES0-1蛋白的大量喪失。此外，所獲得的低純度水平引起了對(duì)根據(jù) 已公開(kāi)的純化方法純化的重組NY-ES0-1的免疫治療用途的關(guān)注，因?yàn)榭赡苡形廴镜拇竽c 桿菌蛋白引起遲發(fā)型超敏反應(yīng)。在解決該些問(wèn)題上的努力導(dǎo)致使用被突變W兼容替代的 表達(dá)系統(tǒng)如酵母的重組NY-ES0-1變體。參見(jiàn)Piatesi(2006)化Wei/7反r/Tressio/?ant/ Purification 232-2A2。
[000引發(fā)明簡(jiǎn)述 本文提供NY-ESO-1相關(guān)多膚的純化方法，W及用該些方法產(chǎn)生的多膚。還提供包含純 的且穩(wěn)定的NY-ES0-1的組合物。
[0007] 在一些實(shí)施方案中，提供純化具有親和標(biāo)簽的NY-ES0-1相關(guān)多膚的方法，包括W 下步驟（a)在包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的緩沖液中溶解包含具有親和標(biāo)簽的多膚的 組合物，W獲得混合物；和化）通過(guò)固定化金屬親和色譜（IMAC)純化所述混合物，W獲得 具有親和標(biāo)簽的純的多膚。
[0008] 在一些實(shí)施方案中，合適的緩沖液包含20mlTrispH8. 0、5%N-月桂酷肌氨酸、 20ml咪挫、和5mlTCEP。在一些實(shí)施方案中，組合物是細(xì)胞團(tuán)塊。在一些實(shí)施方案中，親 和標(biāo)簽是金屬離子結(jié)合親和標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，親和標(biāo)簽是his標(biāo)簽。
[0009] 在一些實(shí)施方案中提供純化具有親和標(biāo)簽的NY-ES0-1相關(guān)多膚的方法，包括W 下步驟（a)在包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的緩沖液中溶解包含具有親和標(biāo)簽的多膚的 組合物，W獲得混合物；(b)通過(guò)IMAC純化混合物，其包含W下子步驟（i)將混合物加樣 在IMAC基質(zhì)上；（ii)用包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的第一緩沖液洗漆基質(zhì)；（iii)用包 含脈、化C1、和TCEP的第二緩沖液洗漆基質(zhì)；（iv)用包含脈、化C1、和TCEP的洗脫緩沖液 洗脫具有親和標(biāo)簽的多膚，W獲得具有親和標(biāo)簽的純的多膚。
[0010] 在一些實(shí)施方案中，IMAC基質(zhì)是Ni"。在一些實(shí)施方案中，IMAC基質(zhì)包含在柱中。 在一些實(shí)施方案中，第一緩沖液包含20ml化ispH8、1%N-月桂酷肌氨酸、和1mlTCEP。 在一些實(shí)施方案中，第二緩沖液包含20mlTrispH7、8M脈、0.5M化Cl、lmlTCEP、和 20ml咪挫。在一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液包含20mlTrispH7、8M脈、0.5M化Cl、l mlTCEP、和 500ml咪挫。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，提供純化具有親和標(biāo)簽的NY-ESO-1相關(guān)多膚的方法，包括W 下步驟（a)在包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的緩沖液中溶解包含具有親和標(biāo)簽的多膚的 組合物，W獲得混合物；(b)通過(guò)IMAC純化混合物，其包含W下子步驟（i)將混合物加樣 在IMAC基質(zhì)上；（ii)用包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的第一緩沖液洗漆基質(zhì)；（iii)用包 含脈、化C1、和TCEP的第二緩沖液洗漆基質(zhì)；（iv)用包含脈、化C1、和TCEP的洗脫緩沖液 洗脫具有親和標(biāo)簽的多膚；（e)將具有親和標(biāo)簽的多膚進(jìn)行緩沖液交換獲得具有親和標(biāo)簽 的純的多膚。
[0012] 在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在葡聚糖G-25柱上使用色譜進(jìn)行緩沖液交換步驟。在一 些實(shí)施方案中，使用包含10ml己酸鋼pH5的緩沖液進(jìn)行緩沖液交換。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，提供純化具有親和標(biāo)簽的NY-ES0-1相關(guān)多膚的方法，包括W 下步驟（a)在包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的緩沖液中溶解包含具有親和標(biāo)簽的多膚的 組合物，W獲得混合物；(b)通過(guò)IMAC純化混合物，其包含W下子步驟（i)將混合物加樣 在IMAC基質(zhì)上；（ii)用包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的第一緩沖液洗漆基質(zhì)；（iii)用包 含脈、化C1、和TCEP的第二緩沖液洗漆基質(zhì)；（iv)用包含脈、化C1、和TCEP的洗脫緩沖液 洗脫具有親和標(biāo)簽的多膚；（C)將具有親和標(biāo)簽的多膚進(jìn)行緩沖液交換獲得包含具有親和 標(biāo)簽的多膚的洗脫液；W及（d)濃縮并滲濾具有親和標(biāo)簽的多膚，W獲得具有親和標(biāo)簽的 純的多膚。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，通過(guò)切向流動(dòng)過(guò)濾（TF巧進(jìn)行濃縮和滲濾步驟。在一些實(shí)施 方案中，在緩沖液中的10kDa再生纖維素C-screen膜上進(jìn)行濃縮和滲濾。在一些實(shí)施方 案中，在包含10ml己酸鋼pH5的緩沖液中進(jìn)行濃縮和滲濾。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，提供純化具有親和標(biāo)簽的NY-ES0-1相關(guān)多膚的方法，包括W 下步驟（a)在包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的緩沖液中溶解包含具有親和標(biāo)簽的多膚的 組合物，W獲得混合物；化）使該混合物澄清；（C)通過(guò)IMAC純化混合物，其包含W下子步 驟（i)將混合物加樣在IMAC基質(zhì)上；（ii)用包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的第一緩沖液 洗漆基質(zhì)；（iU)用包含脈、化C1、和TCEP的第二緩沖液洗漆基質(zhì)；（iv)用包含脈、化C1、 和TCEP的洗脫緩沖液洗脫具有親和標(biāo)簽的多膚；（d)將具有親和標(biāo)簽的多膚進(jìn)行緩沖液 交換獲得包含具有親和標(biāo)簽的多膚的洗脫液；W及（e)濃縮并滲濾具有親和標(biāo)簽的多膚， W獲得具有親和標(biāo)簽的純的多膚。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，澄清步驟進(jìn)一步包括離屯、混合物。在一些實(shí)施方案中，澄清步 驟進(jìn)一步包括混合物的過(guò)濾。在一些實(shí)施方案中，澄清步驟進(jìn)一步包括離屯、混合物和混合 物的過(guò)濾二者。在一些實(shí)施方案中，離屯、步驟W15, 900Xg進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，過(guò) 濾步驟使用0. 45/0. 22umPES濾器進(jìn)行。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，提供純化具有親和標(biāo)簽的NY-ES0-1相關(guān)多膚的方法，包括W 下步驟（a)破碎包含具有親和標(biāo)簽的多膚的細(xì)胞，W獲得組合物；化）在包含N-月桂酷 肌氨酸和TCEP的緩沖液中溶解包含具有親和標(biāo)簽的多膚的組合物，W獲得混合物；(C)使 該混合物澄清；（d)通過(guò)IMC純化混合物，其包含W下子步驟（i)將混合物加樣在IMC 基質(zhì)上；（ii)用包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的第一緩沖液洗漆基質(zhì)；（iii)用包含脈、 化C1、和TCEP的第二緩沖液洗漆基質(zhì)；（iv)用包含脈、化C1、和TCEP的洗脫緩沖液洗脫具 有親和標(biāo)簽的多膚；（e)將具有親和標(biāo)簽的多膚進(jìn)行緩沖液交換獲得包含具有親和標(biāo)簽的 多膚的洗脫液；W及（f)濃縮并滲濾具有親和標(biāo)簽的多膚，W獲得具有親和標(biāo)簽的純的多 膚。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，提供純化具有親和標(biāo)簽的NY-ES0-1相關(guān)多膚的方法，包括W 下步驟（a)破碎包含具有親和標(biāo)簽的多膚的細(xì)胞，W獲得組合物；化）在包含N-月桂酷 肌氨酸和TCEP的緩沖液中溶解包含具有親和標(biāo)簽的多膚的組合物，W獲得混合物；(C)使 該混合物澄清；（d)通過(guò)IMC純化混合物，其包含W下子步驟（i)將混合物加樣在IMC 基質(zhì)上；（ii)用包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的第一緩沖液洗漆基質(zhì)；（iii)用包含脈、 化C1、和TCEP的第二緩沖液洗漆基質(zhì)；（iv)用包含脈、化C1、和TCEP的洗脫緩沖液洗脫具 有親和標(biāo)簽的多膚；（e)將具有親和標(biāo)簽的多膚進(jìn)行緩沖液交換獲得包含具有親和標(biāo)簽的 多膚的洗脫液；W及（f)濃縮并滲濾具有親和標(biāo)簽的多膚；和（g)使具有親和標(biāo)簽的多膚 過(guò)濾，W獲得具有親和標(biāo)簽的純的多膚。
[001引在一些實(shí)施方案中，過(guò)濾是無(wú)菌過(guò)濾。在一些實(shí)施方案中，在0.45/0. 2Sartobran? 300己酸纖維素囊包上進(jìn)行過(guò)濾。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，提供純化具有his標(biāo)簽的NY-ES0-1相關(guān)多膚的方法，包括W 下步驟（a)通過(guò)W下子步驟破碎包含具有his標(biāo)簽的多膚的細(xì)胞，所述子步驟包括（i) 使細(xì)胞懸浮于包含50mlTrispH8、150ml化Cl、和10ml邸TA的緩沖液中；（ii)應(yīng)用 細(xì)胞破碎技術(shù)，例如高壓均質(zhì)機(jī)、弗氏壓碎器、或滲透壓沖擊；（iii)W15, 900X g離屯、細(xì) 胞，W獲得沉淀；（iv)在包含50mlTris抑8和150ml化C1的緩沖液中洗漆