專利名稱：用作為免疫治療劑的多肽和制備多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及HPV多肽制劑以及它們?cè)诼訦PV感染的預(yù)防或者治療中的應(yīng)用。制備這些組合物的方法，包括蛋白質(zhì)純化技術(shù)，和為了提高和達(dá)到特定蛋白質(zhì)在異源細(xì)胞(尤其是大腸桿菌細(xì)菌細(xì)胞)中的高水平表達(dá)利用重組DNA技術(shù)的核酸序列的基因工程，一般都可應(yīng)用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)領(lǐng)域，并形成本發(fā)明的另一方面。
背景技術(shù)：
和現(xiàn)有技術(shù)人乳頭瘤病毒(HPV)是導(dǎo)致幾種良性和惡性損傷的動(dòng)因，它們?cè)谌说钠つw和粘膜中增殖。它們是一種感染上皮組織并能導(dǎo)致一系列不同的人類疾病的遺傳多樣化的DNA病毒組?；谒鼈兊幕蚪M之間的交叉雜交程度，已識(shí)別出超過60種不同類型的HPV，在它們當(dāng)中，不同亞群主要與不同類型的疾病相關(guān)。例如，1型、2型等HPV與手和足的皮膚疣有關(guān)。HPV5和8與罕見的紊亂的疣狀表皮發(fā)育不良有關(guān)。
大約二十種HPV類型感染生殖器粘膜，并可按照與它們有關(guān)的疾病的嚴(yán)重性將其分成兩個(gè)亞型。第一組包含病毒，如與多數(shù)良性濕疣(疣)(包含生殖器疣)有關(guān)的HPV-6和HPV-11。第二組包含與子宮頸扁平疣有關(guān)的且在導(dǎo)致子宮頸癌的惡性轉(zhuǎn)化中所涉及的HPV16，18，31，33和45(zur Hausen，癌癥研究，49(1989)pp 4677-4681)。
與HPV有關(guān)的疾病特征一般是直接由病毒感染引起的上皮組織的良性增殖(疣)。這種病毒能感染上皮的非角質(zhì)化的基細(xì)胞，但不能完成它在這些細(xì)胞中的復(fù)制周期。這些病毒的基因表達(dá)僅限于一系列早期蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)能促使受感染的細(xì)胞增殖，產(chǎn)生典型特征的疣。但是，在疣的上層，受感染的細(xì)胞開始向它們的最后角質(zhì)化狀態(tài)進(jìn)行末端分化，并且這一分化足以通過病毒蛋白質(zhì)和最終的新病毒粒子的產(chǎn)生來使病毒完成它的復(fù)制周期。
這些損傷，雖然是增殖性的，但卻處于低危險(xiǎn)性的惡性轉(zhuǎn)變狀態(tài)，并且在大多數(shù)情況下，疣保持良性。然而，在某些情況下，在若干年之后，攜帶HPV序列的細(xì)胞可能變成致瘤性的。在這種情況下，看起來病毒基因組的大部分可能喪失，并且基因組的剩余部分(通常包含病毒E6與E7基因)整合到基因組中。然而，向惡性癌的這種發(fā)展，主要與有限范圍的HPV類型(即HPV16、18、31、33、35、45)有關(guān)，且與特定的組織(如子宮頸與陰莖)有關(guān)。
已經(jīng)知道，免疫系統(tǒng)能在控制HPV感染中起作用。眾所周知，HPV引起的皮膚疣以及與HPV有關(guān)的疾病的發(fā)生，在接受免疫抑制治療的病人中增加，這表明在許多情況下病毒感染可通過免疫機(jī)制得到控制。關(guān)于免疫系統(tǒng)控制感染的能力的其它證據(jù)，來自自發(fā)疣消退的研究。普通觀察是，在一些具有生殖器疣的個(gè)體中，疣突然消失。曾有人在組織學(xué)上研究過這樣消退的疣，研究揭示T淋巴細(xì)胞在損傷中的大量流入。一般認(rèn)為消退是由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的。
一般認(rèn)為對(duì)HPV感染的有效免疫反應(yīng)主要是細(xì)胞介導(dǎo)的，因?yàn)榧膊】梢栽诰哂锌笻PV的血清抗體的個(gè)體內(nèi)持續(xù)。此外，已知疣的自發(fā)消退常常伴有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、發(fā)癢、患部變紅、以及代表細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的其它癥狀。HPV感染在具有削弱的細(xì)胞免疫性的患者中也普遍存在，此時(shí)病毒性疾病的持續(xù)表明了不良的免疫監(jiān)視。
對(duì)在接種的動(dòng)物模型中的與乳頭瘤病毒有關(guān)的疾病的消退的研究，也支持在抵抗疾病方面的免疫效應(yīng)子的概念。例如，接種疫苗以防牛乳頭瘤病毒(BPV)感染的牛產(chǎn)生了據(jù)報(bào)導(dǎo)不是中和性的抗體，利用包含BPV L2序列和非HPV序列(β半乳糖苷酶)的融合蛋白質(zhì)的接種也顯示出在這些動(dòng)物中產(chǎn)生了預(yù)防和治療效果。(參見Cancer Research CampaignTechnilogy LimitedJarrett等的WO 93/00436，和Jarrett等，病毒學(xué)，184(1991)pp 33-42)。
例如，HPV蛋白質(zhì)(如L1和L2)在疫苗制備中的應(yīng)用可從WO93/02184(昆士蘭大學(xué)和CLS有限公司I Frazer等乳頭瘤病毒疫苗)中得知。其它HPV蛋白質(zhì)已被描述應(yīng)用在免疫診斷學(xué)中，如在WO 91/18294(Medscand ABJ Dillner等用于診斷免疫測(cè)定的各種人乳頭瘤病毒的合成肽)和EP 0 375 555(MedgenixG De Martynoff等肽，抗它們的抗體和檢測(cè)方法以及乳頭瘤病毒的劑量)中描述。
EP 0 456 197(1991)(BehringwerkeC Bleul等)公開了具有一個(gè)或多個(gè)血清反應(yīng)性表位的肽，該肽具有來自HPV18蛋白質(zhì)El、E6和E7的確定序列。EP 0 451 550(1991)(BehringwerkeM Mueller等)公開了具有一個(gè)或多個(gè)血清反應(yīng)性表位的肽，該肽具有來自HPV16蛋白質(zhì)E4、E6、E7或L1的確定序列。這些公開部分是為了篩選試驗(yàn)?zāi)康?，也論及了疫苗?yīng)用。
WO 93/00436(癌癥研究運(yùn)動(dòng)技術(shù)，WFH Jarrett等)公開了與L2蛋白質(zhì)有關(guān)的乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)和片段，其中的L2蛋白質(zhì)用于乳頭瘤病毒腫瘤的預(yù)防和治療，也論及了E7蛋白質(zhì)的制備。
WO 92/16636(免疫學(xué)有限公司MEG Boursnell等)公開了作為插入重組牛痘病毒載體中的融合基因的HPV16以及HPV18 E6和E7的基因序列，該基因序列在施用活病毒載體之后產(chǎn)生抗原的體內(nèi)表達(dá)。
WO 92/05248(Bristol-Myers SquibbEK Thomas等)提出了抑制和治療人乳頭瘤病毒感染和細(xì)胞轉(zhuǎn)化的材料，論及了重組細(xì)胞(包括病毒載體)，該細(xì)胞包含編碼肽(基本上對(duì)應(yīng)于E6和/或E7基因產(chǎn)物或嵌合肽化合物的區(qū)域或HPV蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域)的基因。
CP Crum等(病毒學(xué)，178(1990)pp 238-246)描述了HPV-16 L1和E4的融合的序列片段的表達(dá)和蛋白質(zhì)與弗氏完全佐劑免疫兔子而制造用于診斷或者其它試驗(yàn)?zāi)康目寡宓膽?yīng)用。
發(fā)明概要和描述本發(fā)明提供了融合多肽和多肽(具有如下更具體描述的乳頭瘤病毒衍生的抗原)的聚集體，及其組合物和它們?cè)诿庖咴院鸵呙绶矫?引起乳頭瘤病毒特異性免疫反應(yīng))的應(yīng)用。
如下所述，也提供了多肽和組合物的生產(chǎn)、處理和凈化方法。
按照本發(fā)明，提供了多肽和包含乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)的抗原決定簇的多肽組合物，該多肽組合物為聚集態(tài)(當(dāng)在溶液或分散體中時(shí)能通過殺菌濾器)或無定形的聚集態(tài)。
本發(fā)明也提供了結(jié)合乳頭瘤病毒衍生的抗原的融合多肽，例如該抗原得自至少兩種不同的乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)之每種，例如該蛋白質(zhì)包含(a)至少一種乳頭瘤病毒L2蛋白質(zhì)的抗原決定簇，和(b)至少一種選自E1、E2、E4、E5、E6和E7乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)以及與(a)不同的乳頭瘤病毒類型的L2乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)的抗原決定簇。因而，以此提供的其它融合多肽包含來源于選自E1、E2、E4、E5、E6和E7乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)之至少兩種的抗原決定簇，例如，其中所說的蛋白質(zhì)來源于不同的乳頭瘤病毒類型。
特別優(yōu)選的多肽及其組合物包含人乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)(如HPV的6、11、16、18類型)的抗原決定簇。來源于其它HPV類型和非人類動(dòng)物乳頭瘤病毒的蛋白質(zhì)的抗原決定簇也能得到制造和使用。
更詳細(xì)地說，例如，本發(fā)明提供了包含來源于至少兩種不同的HPV蛋白質(zhì)之每種的抗原決定簇的多肽。關(guān)于本發(fā)明例如，可以通過有關(guān)的乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)的完整序列或者通過所需的亞序列描述和提供乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)的抗原決定簇，其中的亞序列例如包含有關(guān)蛋白質(zhì)的完整序列的至少25％(例如至少50％或75％)的序列片段，例如N-末端或C-末端序列片段。序列可以得自臨床的乳頭瘤病毒分離物或已公開的序列或其突變蛋白質(zhì)。
其抗原決定簇可以形成這種融合多肽的一部分的HPV蛋白質(zhì)可以選自例如L1、L2、E1、E2、E4、E5、E6和E7蛋白質(zhì)。例如(人)乳頭瘤病毒類型HPV6、11、16和18，以及來源于其它人或動(dòng)物乳頭瘤病毒類型的蛋白質(zhì)，都可以被利用。因而，至少兩種乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)的抗原決定簇可以是例如L2和另一個(gè)，和/或E7和另一個(gè)。
在具體的例子中，多肽可以包含至少一個(gè)抗原決定簇，該抗原決定簇來源于至少兩種不同的乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)之每種，和來源于相同的或不同的乳頭瘤病毒類型。例如，至少一種蛋白質(zhì)可以選自L1或L2，和/或至少一種蛋白質(zhì)可以選自E1、E2、E4、E5、E6和E7。
在具體的例子中，本發(fā)明提供了一種多肽，該多肽包含一個(gè)HPV L2蛋白質(zhì)的抗原決定簇和一個(gè)HPV E7蛋白質(zhì)的抗原決定簇，適當(dāng)?shù)匕鏗PV的基本上完整長(zhǎng)度的L2和/或E7蛋白質(zhì)，或抗原片段或其突變蛋白質(zhì)。
包含HPV的L2和E7蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)，可以包含L2蛋白質(zhì)和E7蛋白質(zhì)之每種的完整序列的至少50％的序列片段，如L2和E7的基本上完整的序列還可選擇地包括L1蛋白質(zhì)的序列。
多肽還可以包括其它HPV蛋白質(zhì)的抗原決定簇，或者與其它HPV蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段(如L1或另一成員或者編碼乳頭瘤病毒的蛋白質(zhì)的L或E系列的其它成員)混合物或聚集物。
多肽可以包含由L2和E7融合組成，或者由L2、E7和L1融合組成的單個(gè)蛋白質(zhì)。此外，多肽可以包含與L1蛋白質(zhì)(用于預(yù)防或治療用途)結(jié)合的L2-E7融合體。
多肽可以包含融合分子，或者可以得自偶聯(lián)或聚集在一起的單個(gè)多肽。多肽的可溶性或者溶解形式屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在一些實(shí)施方案中，可以以本領(lǐng)域已知方式(例如通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù))通過化學(xué)交聯(lián)來偶聯(lián)多肽，所說的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包含例如與暴露的酪氨酸殘基或者與賴氨酸殘基的ε-氨基或者天冬氨酸和谷氨酸殘基的羧基共價(jià)結(jié)合。然而，優(yōu)選的實(shí)施方案是每種融合蛋白質(zhì)都產(chǎn)生于多核苷酸序列(其一部分編碼第一種乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)的氨基酸序列的部分或全部，而另一部分編碼第二種乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)的氨基酸序列的部分或全部)在重組宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
尤其是，例如，本發(fā)明提供了一種包含來源于至少兩種不同乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)之每種的抗原決定簇的多肽，其形態(tài)為在溶液或分散體中時(shí)可以通過如孔徑為0.16-0.22微米(例如0.2微米)的殺菌濾器的聚集態(tài)。
可以看到，例如，本發(fā)明提供了一種多肽，該多肽包含了一個(gè)來源于至少兩種不同的乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)(例如L2或L1以及L1、L2、E1、E2、E4、E6和E7中至少一種其它的蛋白質(zhì))之每種的抗原決定簇，其形態(tài)為在溶液或分散體中時(shí)可以通過如孔徑在0.16-0.22微米(例如0.2微米)的殺菌濾器的重聚集態(tài)。
例如可以通過變性或者還原變性產(chǎn)生合適形式的制劑，例如隨著而后的可以是融合蛋白質(zhì)或其它乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)(其在重組宿主細(xì)胞中以包含體形式表達(dá)，如單個(gè)乳頭瘤病毒蛋白質(zhì))的多肽的重聚集。這種形式可以提供一種優(yōu)點(diǎn)，即它相對(duì)容易純化，如用作疫苗。
多肽的選擇性聚集態(tài)制劑不必是可過濾的而消毒它們，并可以用無菌技術(shù)制備和純化。
例如，本文所描述的聚集態(tài)或重聚集態(tài)多肽可以具有約100,000道爾頓的質(zhì)量，例如160,000-10,000,000道爾頓。L2E7的二聚體的分子量可以為大約130,000。例如，該聚集體在電子顯微鏡下可以具有約為4-50nm(例如10-15nm)的直徑。
本發(fā)明(在下列實(shí)施例中將詳細(xì)地描述)所提供的多肽的一個(gè)實(shí)例包含一種重聚集態(tài)的L2E7融合多肽，該融合多肽含有約500,000道爾頓的聚集體，該聚集體在電子顯微鏡下的直徑約為10-15或15-20nm，每個(gè)聚集體具有大約7-10(例如大約8)條L2E7融合多肽鏈。一般來說，此產(chǎn)物可以是每個(gè)聚集體粒子具有約2至200(例如5-50)條鏈。并且，聚集體的制劑可以包含在組合物中具有的一定顆粒大小的微粒。
例如，作為從脲(例如，約8M脲)中的融合多肽的變性和還原制劑和如約10mM二硫蘇糖醇(優(yōu)選為低至約0.1mM或更少，例如在重聚集產(chǎn)物中為約0.04mM或更少)的巰基還原劑中緩慢或者逐漸地除去尿素和巰基還原劑(一般例如二硫蘇糖醇，或其它可接受的巰基還原劑，如谷胱甘肽)的結(jié)果，可得到合適的重聚集物。例如，這種漸進(jìn)的去除可由如下詳細(xì)描述的柱層析方法實(shí)現(xiàn)。例如，可通過用尿素和巰基還原劑溶解起初不溶的包含體(在大腸桿菌T7系統(tǒng)中由多肽的表達(dá)而產(chǎn)生)，獲得融合多肽的變性和還原制劑。
這種聚集態(tài)的可溶性或者可分散性產(chǎn)物常常是無定形的，可以缺乏L1蛋白質(zhì)，另外也有別于基于乳頭瘤病毒L1蛋白質(zhì)(有時(shí)包括其它乳頭瘤病毒蛋白質(zhì))的類病毒微粒，其中據(jù)報(bào)道乳頭瘤病毒L1蛋白質(zhì)產(chǎn)生于HPV基因(包括L1)在系統(tǒng)(如在昆蟲細(xì)胞或酵母細(xì)胞中的重組桿狀病毒)中的表達(dá)。例如，還沒有揭示這些類病毒粒子經(jīng)歷過溶解變性和巰基還原以及隨后的重聚集。
以上論及的多肽適宜用重組DNA技術(shù)來制備。因此，本發(fā)明也提供了編碼上述多肽的核酸，整合它們與它們的部分的克隆和表達(dá)載體，以及結(jié)合這種核酸并能以蛋白質(zhì)表達(dá)它們的轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選例子中，核酸包含一種融合基因，該基因包含例如從得自臨床的生殖器疣樣品的HPV-6的分離體中分離出來的L2和E7基因。
優(yōu)選地，以上所描述的多肽在原核或真核宿主中用重組DNA技術(shù)通過核酸的表達(dá)來制備。
具體地說，用適于在所選擇系統(tǒng)中表達(dá)的任何輔助序列，將編碼所需多肽的核酸摻入合適的載體系統(tǒng)中而作為合適的開放讀框。用載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。然后，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)物或者從上清液或者從細(xì)胞中分離所需多肽，如下面給出的例子那樣。上述載體以及轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞形成本發(fā)明的另一個(gè)方面。
在酵母和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中測(cè)定由本發(fā)明提供的多肽的表達(dá)，以前有人報(bào)道該系統(tǒng)可以進(jìn)行HPV衍生的基因的表達(dá)。也發(fā)現(xiàn)，在兩種情況下獲得完整長(zhǎng)度的分子表達(dá)都是可能的，但是其表達(dá)水平有時(shí)是低的。為了使表達(dá)水平最優(yōu)化，目前優(yōu)選利用原核宿主表達(dá)系統(tǒng)(尤其是大腸桿菌T7系統(tǒng))，而不是利用兩種檢驗(yàn)過的真核系統(tǒng)(酵母或者桿狀病毒)。
本文所提供的免疫原性多肽和疫苗組合物在產(chǎn)生HPV特異性免疫反應(yīng)中是有用的，例如用作為預(yù)防或治療與乳頭瘤病毒有關(guān)的癥狀的疫苗。這種免疫原(例如應(yīng)用于預(yù)防或治療與乳頭瘤病毒有關(guān)的疾病的免疫-治療或預(yù)防疫苗)可以被用來產(chǎn)生免疫反應(yīng)，例如與能夠在受感染病人中介導(dǎo)慢性HPV感染的消退的細(xì)胞免疫有關(guān)的反應(yīng)，所說的慢性HPV感染包括生殖器疣(尤其是當(dāng)產(chǎn)物和感染都基于6和/或11型HPV時(shí))或子宮頸內(nèi)上皮瘤(尤其是當(dāng)產(chǎn)物和感染都基于16和/或18型HPV時(shí))。例如通過利用適當(dāng)?shù)淖魟?，這樣的免疫反應(yīng)可以被定向至T-細(xì)胞，例如CD4+細(xì)胞。
因而，本發(fā)明還提供了用于預(yù)防或者治療HPV感染或者與之有關(guān)的損傷的方法，該方法包含給患者施用有效量的本文所描述的多肽。
由本發(fā)明提供的實(shí)施方案包括基于本文所論述的多肽的疫苗制劑，按照特異性，該疫苗制劑有意用來產(chǎn)生抗乳頭瘤病毒(尤其是例如HPV6和11以及HPV16和18類型的乳頭瘤病毒)的免疫反應(yīng)，以及用來預(yù)防和治療人生殖器疣和子宮頸內(nèi)上皮瘤。
觀察到不同類型的HPV之間的交叉反應(yīng)，并且按照這樣的可觀測(cè)到的交叉反應(yīng)，本文所產(chǎn)生的多肽和疫苗可以用來引起抗乳頭瘤病毒類型(而不是它們得自其中的類型)的有用免疫反應(yīng)。
本發(fā)明提供了上述多肽的免疫原組合物，它們適于注射施用，包含諸如免疫佐劑的載體。在某些優(yōu)選的例子(如下面更具體描述的)中，佐劑包含氫氧化鋁和/或單磷酸脂質(zhì)A。
這樣的免疫原組合物(例如用于人或者非人類動(dòng)物中作為治療或者預(yù)防疫苗)可以包含一種吸附復(fù)合物，該復(fù)合物包含″明礬″(即氫氧化鋁，是傳統(tǒng)上通常用作疫苗佐劑的Alhydrogel(TM)或者Rehydrogel(TM))，該″明礬″吸附可得到的上述多肽于其上面。吸附復(fù)合物可以是由明礬和多肽組成的二元復(fù)合物，或者可以有其它成分，例如下述的MPL(形成例如MPL、明礬和多肽的三元復(fù)合物)。
可溶性或聚集多肽可以直接用作為疫苗，或者也可以作為還包含藥物上可接受的載體、緩沖液、佐劑或者其它可接受材料的藥物組合物施用。因此，本發(fā)明還提供了疫苗或藥物組合物，其包含與合適載體或賦形劑結(jié)合的上述多肽。
該多肽可以是一種可溶性單體(例如L2E7的單體)或者是一種多肽聚和體。優(yōu)選地，可通過與佐劑或者其它輔助物質(zhì)(如免疫刺激分子)結(jié)合來制成多肽(如L2E7融合蛋白質(zhì))，以便于提高其作為治療性抗原的效果，以及在受體患者中刺激優(yōu)選類型的免疫反應(yīng)。有用的佐劑包含但不限于如Alhydrogel(TM)或者Rehydrogel(TM)形式的氫氧化鋁(“明礬”)；如在US 4,912,094(Ribi Immunochem ResearchKR Myers和AT Truchot描述基于修飾的脂多糖類的佐劑，脫-3-O-?；鶈瘟姿嶂|(zhì)A)中描述的佐劑3D-MPL(3-脫酰單磷酸脂質(zhì)A)，其可以如US 4,912,094或在說明書WO 94/21292(Smithkline BeechamP Hauser等含有3-O-脫酰單磷酸脂質(zhì)A的疫苗組合物)中所描述的一樣得到應(yīng)用。當(dāng)明礬和MPL都得到使用時(shí)，蛋白質(zhì)優(yōu)選首先吸附至后加的明礬和MPL上。也可使用海藻糖二酯(例如海藻糖二霉菌酸酯)；如在說明書WO 88/09336(劍橋生物科學(xué)，CA Kensil等，皂苷佐劑)和WO 93/05789(劍橋生物技術(shù)，CA Kensil等，皂苷抗原綴合物)中所描述的皂苷和它們的衍生物(如Quil A或QS-21)；如在說明書WO 90/03184(B Morein等，具有免疫調(diào)節(jié)活性的免疫刺激復(fù)合物基質(zhì)，包含脂質(zhì)和可選擇的佐劑)和WO 92/21331(Kabi PharmaciaABB Morein等，包含固醇和皂苷的藥物載體)中所描述的ISCOMS或ISCOM基質(zhì)；或者胞壁酰二肽或霍亂毒素B。在這一方面，有用的其它輔助分子或者免疫刺激分子包括細(xì)胞因子(如白介素)，該細(xì)胞因子包括但不限于GM-CSF、IL-3、IL-2、IL-12和IL-7?？梢园凑招枰獑为?dú)使用或結(jié)合使用這樣的佐劑和/或其它輔助物質(zhì)。
藥物組合物(如本文所提供的疫苗)可以，例如在可接受的礦物或者烴油中乳化，所說的油包括但不限于角鯊烯或可被生物降解的礦物油，如在說明書WO 91/00106和WO 91/00107(SEPPICB Brancq等描述可注射的多相乳劑和含有連續(xù)油相的乳劑載體)中所描述的油；或者可以被膠囊化，例如用可生物降解的微粒或脂質(zhì)體或非離子表面活性劑小泡膠囊化。對(duì)于這些技術(shù)，可分別參見有關(guān)說明書，例如WO 94/27718 (DTO’Hagan等，包含截留抗原的微粒和它們?cè)诿庖呓臃N中的應(yīng)用)和WO93/19781(PCT/GB93/00716)(變形桿菌分子設(shè)計(jì)J Alexander等包含具有截留抗原的非離子表面活性劑小泡的疫苗)。
多肽可以用于治療或預(yù)防目的。施用的途徑和過程包括但不限于標(biāo)準(zhǔn)的肌肉內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、口服或者直腸的途徑和過程。
可以按照配方和將要被治療的癥狀來選擇多肽施用量。一般地可以預(yù)期劑量為1-2000μg的蛋白質(zhì)，優(yōu)選為10-300μg(如10-250μg)。易于確定在患者中的最適量?？梢砸砸欢ㄩg隔施用一個(gè)或多個(gè)的疫苗劑量(參見，例如實(shí)施例13)。這一治療方案易于在患者中優(yōu)化。
此外，編碼所說的多肽的核酸可以摻入合適的重組病毒載體，并可以引入宿主生物體(如人)中，以便于核酸的表達(dá)可以原位產(chǎn)生多肽。適于以這種方式用作重組病毒載體的主要成份的病毒的例子是例如在WO92/05263(免疫學(xué)有限公司，SC Inglis等)和WO 92/16636(免疫學(xué)有限公司，MEG Boursnell等)中描述的病毒。
如本文所描述的包含HPV相關(guān)性多肽的疫苗可以激活范圍廣闊的HPV特異性免疫反應(yīng)。這樣的免疫反應(yīng)可以包括特異性抗體(包括HPV6和HPV11中和抗體)、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(包括HPV6和HPV11特異性的淋巴增殖反應(yīng))、延遲型超敏反應(yīng)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞以及細(xì)胞因子產(chǎn)生。
在制備表達(dá)本發(fā)明的多肽的合適載體的過程中，申請(qǐng)者已設(shè)計(jì)了可以在異源細(xì)胞(尤其是大腸桿菌細(xì)菌細(xì)胞)中提高和實(shí)現(xiàn)特定多肽的高水平表達(dá)的技術(shù)。
因此，另一方面，本發(fā)明提供了一種用于制備重組多肽的方法，該方法包括，在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)核酸序列，該序列編碼所需的多肽，但發(fā)生了突變，以致導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄或者翻譯提前終止的密碼子或者密碼子組已由簡(jiǎn)并密碼子取代。
尤其是，申請(qǐng)者已發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌的T7表達(dá)系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄或翻譯的提前終止的發(fā)生可以通過除去至少一種多T序列(如其中n是2或大于2的[TTT]n)而被有效地阻止或者減少，例如通過用可接受的替換體，如編碼同樣氨基酸的[TTC]n序列)來替換這樣的序列，從而實(shí)現(xiàn)所需多肽的更高產(chǎn)量。
在細(xì)菌的表達(dá)系統(tǒng)(如T7系統(tǒng))中，發(fā)現(xiàn)重組多肽在細(xì)胞內(nèi)是不溶性的聚集態(tài)或者‘包含體’(Ibs)。申請(qǐng)者已經(jīng)設(shè)計(jì)了一種用于回收所說的重組多肽的改進(jìn)技術(shù)。
因此，本發(fā)明的另一方面是，提供了一種從原核宿主細(xì)胞內(nèi)的包含體中回收重組多肽的方法，所說的方法包括，交叉流過濾包含具有不需要物質(zhì)(如破碎細(xì)胞的碎片)的上述包含體的懸浮液，以及從所分離的包含體中回收重組多肽。這項(xiàng)技術(shù)具有綜合效果分離其它細(xì)胞碎片和存在于細(xì)胞勻漿中的包含體，同時(shí)洗滌它們，從而提供有用程度的純化。
在該方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，隨后原位溶解所分離的包含體，并從溶液中回收多肽。溶劑的例子包括尿素和尿素與二硫蘇糖醇或其它巰基還原劑的混合物，如濃度為約8M-10M。
尤其是，可以方便地進(jìn)行得自宿主細(xì)胞破裂的粗懸浮液的交叉流過濾，該懸浮液包含以包含體形式存在的所需要表達(dá)的多肽，該過程在同樣的過濾裝置中分為兩個(gè)階段，第一個(gè)階段是在非溶解條件下在濾器滲余物中保留和洗滌所需的包含體，第二個(gè)階段是使上述包含體與溶解液接觸并在該溶解液(例如8-10M尿素，其可選擇地具有巰基還原劑，如二硫蘇糖醇)的濾液中收集該包含體。隨之進(jìn)行的通常是除去溶劑和重聚集。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)制劑的具體實(shí)例包括融合蛋白質(zhì)，該融合蛋白質(zhì)包含基于HPV-6的L2E7蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)適于在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)，將其純化至均一性，然后用佐劑(如明礬)來配制。這種制劑在治療生殖器疣中是有用的，并且可配制成為適于向受體患者進(jìn)行腸胃外注射的給藥形式。
通過實(shí)施例并參照附圖，本發(fā)明將在下面得到進(jìn)一步描述，附圖即

圖1顯示按照本發(fā)明的實(shí)施方案表達(dá)HPV L2E7融合蛋白質(zhì)的載體的核苷酸序列；圖1a和1b顯示先于在圖1序列中的起始密碼子和跟隨在終止密碼子之后的載體的序列；圖2顯示對(duì)應(yīng)的氨基酸序列以及，圖3說明按照本發(fā)明的實(shí)施方案用于純化圖1和2中的L2E7融合蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)純化過程。
申請(qǐng)者已分離了一些HPV基因，尤其是來源于HPV-6病毒的L1、L2和E7基因。如本文所描述的，基因序列用來構(gòu)建基因融合體，該基因融合體用于在原核和真核系統(tǒng)中高水平表達(dá)HPV-6蛋白質(zhì)。
為實(shí)現(xiàn)這一目的，構(gòu)建了表達(dá)上述多肽(如在大腸桿菌中作為單一融合蛋白質(zhì)的HPV-6、L2和E7)的質(zhì)粒載體。
從由單一臨床分離物(得自受HPV-6感染的疣組織)制備的病毒DNA樣品中，由聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增HPV-6病毒的基因。在異源系統(tǒng)中，分離的基因用來構(gòu)建表達(dá)HPV-6衍生的蛋白質(zhì)的基因融合盒。
為改進(jìn)生產(chǎn)過程，對(duì)基因構(gòu)建體進(jìn)行一定的修飾。特別有用的修飾如下1.在編碼的蛋白質(zhì)序列的N端引入了前導(dǎo)序列(“pelB前導(dǎo)序列”)，以便于提高蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)(而不是指引該表達(dá)到周質(zhì)中)。
2.在編碼的蛋白質(zhì)序列的C端引入了一個(gè)序列(“His-Tag”)，以便于可以通過金屬螯合層析純化蛋白質(zhì)。
3.使胸苷殘基的序列發(fā)生突變，以便于根除參與融合基因的轉(zhuǎn)錄的提前終止的序列。該突變只單獨(dú)影響基因構(gòu)建體的DNA序列，而不影響所編碼的蛋白質(zhì)的序列，因?yàn)樗鼱可娴矫艽a子中的變性的第三位置的突變。
通過蛋白質(zhì)開放讀框的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯來測(cè)定構(gòu)建體。在HPV-6L2E7融合蛋白質(zhì)的情況下，當(dāng)用在體外表達(dá)的HPV-6 L2E7基因融合構(gòu)建體時(shí)，完整長(zhǎng)度的蛋白質(zhì)(80kD)和被截短的蛋白質(zhì)產(chǎn)物(70kD)都可觀測(cè)到，并且這種模式可在體內(nèi)重復(fù)。靶蛋白質(zhì)的截短形式的出現(xiàn)與在一長(zhǎng)串胸苷(T)殘基的HPV-6 L2序列中的存在有關(guān)。也識(shí)別出包含6個(gè)胸苷殘基的第二個(gè)富T區(qū)。利用改變HPV-6 L2蛋白質(zhì)的DNA序列但是不改變氨基酸序列的寡核苷酸，對(duì)這些區(qū)域進(jìn)行體外誘變。將突變的HPV-6L2E7基因融合體亞克隆進(jìn)入質(zhì)粒表達(dá)載體，該載體驅(qū)動(dòng)噬菌體T7啟動(dòng)子克隆序列的表達(dá)(pET表達(dá)系統(tǒng)，Novagen)。獲得的質(zhì)粒構(gòu)建體(指定為pGW53，選擇它用來表達(dá)HPV-6 L2E7)編碼上游前導(dǎo)序列、pelB、HPV-6 L2E7 ORF’s和下游序列，該下游序列編碼6個(gè)“符合讀框的”組氨酸殘基(His Tag)，該殘基具有HPV-6融合蛋白質(zhì)的C端。圖1-2在圖1和2中的序列數(shù)據(jù)揭示了無限制條件的核苷酸和L2E7融合蛋白質(zhì)(由本文所描述的技術(shù)產(chǎn)生)的優(yōu)選實(shí)施例的所編碼的氨基酸序列(包括上游前導(dǎo)和下游標(biāo)記序列)。如果需要，可以省略前導(dǎo)序列和標(biāo)記序列(aa 591-601)。圖1a和1b顯示在優(yōu)選的T7表達(dá)載體中的非編碼序列，該序列先于圖1中的起始密碼子并跟隨在終止密碼子之后。
圖2顯示優(yōu)選的L2和E7融合蛋白質(zhì)的序列。在1827對(duì)堿基對(duì)的DNA序列中，位置7至1812(包含終止密碼子)編碼L2E7融合蛋白質(zhì)和標(biāo)記。在圖1-2中，通過與已公開的L2和E7的分離氨基酸序列比較，發(fā)現(xiàn)與L2和E7對(duì)應(yīng)的序列區(qū)結(jié)合了一些不同之處。不同之處如下(首先參考本文圖1-2的序列編號(hào)中的氨基酸殘基，然后參考在公開序列的對(duì)應(yīng)位置上的(不同的)氨基酸)105 Gly在公開序列中是Gln；215 Ile是Val；230 Ile是Val；373 Glu是Asp；381 Lys是Glu；386 Asp是Gly；422 Ile是Leu；544 Tyr是Phe。
此外，在多核苷酸序列中發(fā)現(xiàn)一些“沉默”不同點(diǎn)，即在所翻譯的氨基酸序列中未導(dǎo)致任何不同之處的不同點(diǎn)。對(duì)于本發(fā)明，一般認(rèn)為這些是不顯著的。由于本文所討論的原因而產(chǎn)生的兩種沉默突變(從TTTTTT到TTCTTC)位于氨基酸位置83-4和483-4。
用與公開序列精確對(duì)應(yīng)的序列表達(dá)的、以及摻入如本文所揭示的組合物中的融合蛋白質(zhì)，具有與圖1和2中所顯示的優(yōu)選的L2E7融合蛋白質(zhì)之間的高度交叉反應(yīng)性，并且可產(chǎn)生等價(jià)地類似的或高度交叉反應(yīng)性的免疫反應(yīng)。
L2E7融合蛋白質(zhì)也是功能性類似的，該融合蛋白質(zhì)來源于其它的HPV的臨床分離物的序列與本文所給出的序列相比，這種來源于臨床環(huán)境的其它分離物，可能有序列上的差異，但是被預(yù)料這些差異對(duì)于本發(fā)明的性能來說是不顯著的。如果需要，易于消除在特殊臨床分離物中發(fā)現(xiàn)的任何差異，例如通過由此制備的相應(yīng)克隆載體的定點(diǎn)誘變。
將按照本文所描述的方法獲得的基因構(gòu)建體插入表達(dá)系統(tǒng)中，該表達(dá)系統(tǒng)是在異源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的高水平表達(dá)方面得到了優(yōu)化的。這個(gè)表達(dá)系統(tǒng)基于達(dá)到顯著密度的大腸桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)，以及隨后的細(xì)胞內(nèi)部的T7聚合酶的誘導(dǎo)，該誘導(dǎo)引起基因構(gòu)建體的高水平轉(zhuǎn)錄。
然后在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的包含體中，蛋白質(zhì)產(chǎn)物得到表達(dá)和累積。細(xì)胞收獲后，純化蛋白質(zhì)以除去細(xì)菌的蛋白質(zhì)，并將其制備為溶解的蛋白質(zhì)抽提物。這種蛋白質(zhì)抽提物包含高分子量的蛋白質(zhì)分子聚集體，其在水溶液中是可溶性的。
由此獲得的純化蛋白質(zhì)可以用來形成特別用于治療生殖器疣的治療性抗原產(chǎn)品的基礎(chǔ)。
本文所給出的下列實(shí)施例和序列數(shù)據(jù)可說明本發(fā)明，但并不有意限制目前公開的范圍。實(shí)施例1HPV-6基因的擴(kuò)增和克隆對(duì)于在受感染的組織中的HPV類型的病毒的DNA，最初用HPV-6的標(biāo)準(zhǔn)引物由PRC推定，使用的方法是基于Snijders等，1990，普通病毒學(xué)雜志，71pp 173-191的方法的改進(jìn)方法。
通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從一種病毒的DNA樣品中擴(kuò)增HPV-6L1、L2和E7基因，該樣品在易于分離基因的基礎(chǔ)上，從選擇作為治療本體的發(fā)展基礎(chǔ)的單個(gè)臨床分離物(H26)中制備。臨床分離物的同一性并不重要，因?yàn)槿魏纹胀ǖ腍PV-6臨床分離物實(shí)際上是等價(jià)的，即使它不是同一的。利用Taq DNA聚合酶來實(shí)現(xiàn)初始的PCR。用于PCR反應(yīng)的寡核苷酸引物編碼確實(shí)與感興趣的基因序列同源的24個(gè)核苷酸和附加的核苷酸，其中這些寡核苷酸編碼限制酶位點(diǎn)或者被加入以維持最終的基因融合體之間的讀框或者在最后的表達(dá)構(gòu)建體中引入終止密碼子。所用的寡核苷酸的例子如下JPC08 CAGTGTCGACGGTCTTCGGTGCGCAGATGGGACASEQ ID NO1用于擴(kuò)增HPV-7 E7基因的非編碼鏈寡核苷酸引物和用于定向克隆的Sall位點(diǎn)。
來源于L1、L2和E7基因的擴(kuò)增反應(yīng)的單個(gè)PCR產(chǎn)物，在測(cè)序反應(yīng)中用作為模板DNA以產(chǎn)生每三個(gè)基因的共有序列。假定共有DNA序列是病毒的DNA提取物中基因的實(shí)際DNA序列的精確反映，因?yàn)樗钱a(chǎn)生于許多個(gè)體模板分子的序列。
由PCR從HPV-6病毒DNA擴(kuò)增HPV-6 L2基因，而形成約1400bp的單個(gè)產(chǎn)物。由瓊脂糖純化該產(chǎn)物，并將其用作為DNA序列分析的模板，并利用寡核苷酸引物產(chǎn)生擴(kuò)增的L2基因的共有序列。
將純化的L2產(chǎn)物直接亞克隆到載體pGEM-T中，以制造質(zhì)粒pGWl2。利用有相同共有序列的寡核苷酸引物，從pGW12模板DNA產(chǎn)生亞克隆的L2基因的完整DNA序列。顯示出克隆的L2基因的DNA序列與共有區(qū)的DNA序列相同。由PCR從HPV-6病毒的DNA擴(kuò)增HPV-6E7基因，而成為約300bp的單個(gè)產(chǎn)物。由瓊脂糖純化這個(gè)基因產(chǎn)物，并將其用作為DNA序列分析的模板，并利用寡核苷酸引物產(chǎn)生擴(kuò)增的基因的共有序列。
將純化的E7 PCR產(chǎn)物直接亞克隆進(jìn)入載體pGEM-T，以制造質(zhì)粒pGW04。利用有相同共有序列的寡核苷酸引物，從pGW04模板產(chǎn)生亞克隆的E7基因的完整DNA序列。顯示出克隆的E7基因的序列與共有區(qū)的DNA序列相同。
由PCR從HPV-6病毒的DNA擴(kuò)增HPV-6 L1基因，而成為約1500bp的單個(gè)產(chǎn)物。由瓊脂糖純化這個(gè)基因產(chǎn)物，并將其用作為DNA序列分析的模板，并利用寡核苷酸引物產(chǎn)生擴(kuò)增的基因的共有序列。
將純化的L1 PCR產(chǎn)物直接亞克隆進(jìn)入載體pGEM-T，以制造質(zhì)粒pGW-A。利用有相同共有序列的寡核苷酸引物，從pGW-A模板產(chǎn)生亞克隆的L1基因的完整DNA序列。顯示出克隆的E7基因的序列與共有區(qū)的DNA序列相同。
PCR產(chǎn)物通過與硅石基質(zhì)結(jié)合由瓊脂糖凝膠純化并連接到pGEM-I載體DNA上。這些連接反應(yīng)產(chǎn)物用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌的DH5a細(xì)胞。分離重組的克隆，并利用基于PCR的方法進(jìn)一步篩選正確的HPV-6基因插入片段。
獲得克隆的HPV-6 L2與E7基因的DNA序列，并將其與直接產(chǎn)生于最初的PCR產(chǎn)物的共有序列進(jìn)行比較。其序列與共有序列一致的克隆用于構(gòu)建重組蛋白質(zhì)表達(dá)盒。實(shí)施例2HPV-6序列與EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)的比較共有序列與密切相關(guān)的HPV類型(包含HPV-11、HPV-16和HPV-18)的序列以及來源于歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的公開的HPV-6b序列進(jìn)行了比較，以確保擴(kuò)增的基因是來源于HPV-6型病毒的。
該比較是借助于Lasergene Navigator軟件(DNAStarInc.)，用EditSeq，SeqMan，Megalign和Protean程序進(jìn)行的。在DNA水平上并由三個(gè)基因的預(yù)料的氨基酸序列進(jìn)行了比較。
這種分析表明，所擴(kuò)增的L2、L1和E7基因得自HPV-6型病毒。結(jié)果表明，雖然基因序列是高度保守的，但仍從所預(yù)料的序列中觀察到一些變化。
因此，我們認(rèn)為，適于在本發(fā)明中應(yīng)用的構(gòu)建體可在來源于野生型臨床HPV分離物的DNA基礎(chǔ)上制得。實(shí)施例3表達(dá)盒的構(gòu)建以下列方式裝配L2和E7的個(gè)體基因以產(chǎn)生融合分子由PCR擴(kuò)增來克隆L2和E7基因，以引入新的N端和C端限制酶位點(diǎn)，而保持蛋白質(zhì)序列的完整性。然后，用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)，將這些基因序列連接起來進(jìn)入克隆載體以制造L2E7融合基因，以便于兩種序列的開放讀框得到維持。按照如下方法構(gòu)建L2E7融合基因。
首先將HPV-6 L2基因作為由BamHI和Nco I位點(diǎn)側(cè)連的1.1kbPCR片段產(chǎn)生。將這種PCR片段亞克隆入pGEM-T克隆載體。用兩種酶消化具有所需插入片段的克隆，以便釋放L2基因，然后通過在瓊脂糖凝膠上的分離以及其后的在玻璃乳狀物(glass milk)上的抽提來純化之。與此類似，將HPV-6 E7基因作為300bp的Nco ISal I片段產(chǎn)生，并將其亞克隆入PGEM-T。將這兩個(gè)基因片段連接在一起，以產(chǎn)生1.4kb BamHI-Sal I DNA片段，該片段編碼L2E7融合蛋白質(zhì)。
然后，將所產(chǎn)生的BamH I-Sal I DNA片段連接至pET16b的衍生物，它是一種具有卡那霉素抗性的非表達(dá)克隆載體。所產(chǎn)生的構(gòu)建體命名為pGW48。隨后，將L2E7基因融合體轉(zhuǎn)移到表達(dá)pET載體上，以便分析蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)。
在融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)分析以后，如已描述的那樣進(jìn)行基因的突變，以便消除T殘基鏈段(一般認(rèn)為其將造成轉(zhuǎn)錄的提前終止)。
然后，由PCR修飾L2E7融合基因以產(chǎn)生BamH I和Not I末端，該末端能夠使基因盒得以插入至在5’端含有符合讀框pelB前導(dǎo)序列和在3’端含有符合讀框His Tag的表達(dá)載體。通過pGEM-T載體克隆PCR片段，并最終將其轉(zhuǎn)移到得自pET22b的pET載體上。這一最終構(gòu)建體命名為pGW53。
在裝配之后，將融合構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到一系列原核表達(dá)載體(稱為pET載體)上。這些本領(lǐng)域所熟知的載體含有強(qiáng)的噬菌體T7轉(zhuǎn)錄和翻譯信號(hào)。然后在可誘導(dǎo)的lacUV5啟動(dòng)子的控制下，通過在宿主細(xì)胞中提供T7 RNA聚合酶源來誘導(dǎo)表達(dá)。然后，誘導(dǎo)物IPTG的加入導(dǎo)致細(xì)胞的資源向靶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化。然后，所需的產(chǎn)物可能占總細(xì)胞蛋白質(zhì)的50％以上。此外，因?yàn)橄到y(tǒng)是可誘導(dǎo)的，所以它可以維持在誘導(dǎo)之前處于轉(zhuǎn)錄沉默狀態(tài)的靶基因序列，從而使基因序列(對(duì)宿主細(xì)胞可能有毒性)的表達(dá)得以進(jìn)行。
因此，IPTG向用pET載體(包含靶基因)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的快速生長(zhǎng)培養(yǎng)物中的加入導(dǎo)致聚合酶的誘導(dǎo)和克隆化基因的伴隨表達(dá)。蛋白質(zhì)產(chǎn)物或者得到分泌，或者在這些HPV基因產(chǎn)物的情況下被引導(dǎo)進(jìn)入包含體。
通過在基因片段的兩端引入Bgl II限制酶位點(diǎn)，利用PCR誘變來完成克隆步驟，所用的寡核苷酸如下NRW170 GTCGACAGATCTGGCACATAGTAGGGCCCGA SEQ IDNO 2用于PCR克隆HPV 6 L2E7進(jìn)入pET載體的寡核苷酸。將BgIII位點(diǎn)引入HPV 6 L2的N端。對(duì)于融合進(jìn)入pET前導(dǎo)序列(pelB)，不需要任何甲硫氨酸密碼子。
隨后進(jìn)行DNA測(cè)序。然后，使L2E7融合基因結(jié)合到下列載體中pET11b、pET12b、pET16b和pET22b，它們的N端與C端序列具有不同的性質(zhì)。然后，重組的質(zhì)粒用來轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞HMS174，它含有T7聚合酶的基因。也可得到在抑制基礎(chǔ)表達(dá)的嚴(yán)格性方面不同的其它宿主細(xì)胞，并在這一方法中得到成功的應(yīng)用。實(shí)施例4L2E7構(gòu)建體在大腸桿菌中的表達(dá)從轉(zhuǎn)化平板挑取個(gè)體細(xì)菌菌落，并且將其用來接種2YT培養(yǎng)基的2mL等分試樣。培育這些等分試樣2小時(shí)，然后將其用來接種加溫培養(yǎng)基的12 mL培養(yǎng)物，調(diào)整接種物的量以提供一致數(shù)量(由在600nm處的光密度測(cè)定所確定)的細(xì)菌。培育這些培養(yǎng)物，直到光密度達(dá)到0.6，此時(shí)將培養(yǎng)物分成兩份5.0mL的等分試樣。以推薦的1.0mM的濃度將IPTG加至一種培養(yǎng)物中，并且在同一條件下培養(yǎng)兩種培養(yǎng)物3小時(shí)。
這一時(shí)期結(jié)束時(shí)，轉(zhuǎn)移細(xì)菌以便冰凍，并測(cè)量光密度。通過在15mLFalcon管中以4,000rpm離心10分鐘來收獲細(xì)菌培養(yǎng)物。除去上清液，并且在最后的0.5mL TE中再懸浮細(xì)菌。
按照如下方法進(jìn)行SDS-PAGE分析然后，將樣品加至等量的還原性電泳樣品緩沖液中，并在100℃下加熱10分鐘。然后，將50μl的樣品加入5-15％的聚丙烯酰胺凝膠中，并在10mA條件下電泳12小時(shí)。通過用考馬斯亮藍(lán)(在10％乙酸、10％甲醇中)染色30分鐘以及隨后的脫色，可看見蛋白質(zhì)條帶。除了至少一條80kD的其它條帶(對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)錄或翻譯的提前終止或者蛋白質(zhì)降解的產(chǎn)物)外，可以由考馬斯染色凝膠檢測(cè)到分子量為90kD的主要蛋白質(zhì)條帶(對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)L2E7蛋白質(zhì))。
在利用定點(diǎn)誘變(如實(shí)施例6中所描述的)對(duì)基因序列進(jìn)行修飾后，通過考馬斯藍(lán)染色不能檢測(cè)到80kD的條帶，這表明轉(zhuǎn)錄或者翻譯提前終止的假說是正確的。
與已知標(biāo)準(zhǔn)比較，存在于凝膠上的蛋白質(zhì)量使細(xì)菌內(nèi)表達(dá)水平的評(píng)估得以進(jìn)行。其水平似乎一致在10-30mg/L的范圍之內(nèi)。
為了更詳盡地描述所表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，對(duì)凝膠進(jìn)行Western轉(zhuǎn)移，隨后用由綿羊免疫(利用大腸桿菌衍生的L2融合蛋白質(zhì))產(chǎn)生的抗-L2抗血清進(jìn)行探查。Western印跡使大量低于全長(zhǎng)種類的分子量的條帶變成可見的，大概它們中的所有都可通過蛋白質(zhì)降解或者轉(zhuǎn)錄或翻譯的提前終止而再次產(chǎn)生。
初步的SDS-PAGE分析表明與所期望的全長(zhǎng)L2E7基因產(chǎn)物的大小相對(duì)應(yīng)的考馬斯染色的蛋白質(zhì)條帶是存在的。此外，有一些其它可見的條帶，它們或者對(duì)應(yīng)于L2E7的蛋白質(zhì)的片段或者符合提前終止的假象。
這可由Western印跡利用抗-L2或者抗-E7抗血清來調(diào)查。結(jié)果證實(shí)主要產(chǎn)物是L2E7，并且表明次要條帶是缺乏C端區(qū)域的。
通過蛋白質(zhì)測(cè)序完成進(jìn)一步鑒定，結(jié)果證實(shí)兩個(gè)主要條帶包含完整的N端序列(包括未切割的pelB前導(dǎo)序列)。實(shí)施例5體外轉(zhuǎn)錄和翻譯為進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物，用一系列體外偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄和翻譯實(shí)驗(yàn)分析基因。這一系統(tǒng)利用引入的T7聚合酶以在表達(dá)載體中從克隆的基因中產(chǎn)生mRNA轉(zhuǎn)錄物，然后體外翻譯該轉(zhuǎn)錄物以產(chǎn)生合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。通過將放射性標(biāo)記摻入蛋白質(zhì)產(chǎn)物，利用SDS-PAGE分析可監(jiān)測(cè)它的合成。
體外轉(zhuǎn)錄和翻譯揭示具有與在大腸桿菌異源系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的相似的蛋白質(zhì)合成模式。L2E7融合蛋白質(zhì)由80kD和70kD的兩個(gè)主要條帶組成，而除了假定的60kD的全長(zhǎng)產(chǎn)物外，L1產(chǎn)物包含30和32kD的兩條主要條帶。
DNA序列分析揭示，在L1和L2的序列中，存在由7和9個(gè)T殘基組成的多T鏈段，這似乎與L1和L2E7分子的提前終止的片段的位置相符合。這表明，這些區(qū)域造成了轉(zhuǎn)錄或者翻譯的提前終止，最有可能的是前者。通過對(duì)T7聚合酶的終止子序列中的多T區(qū)的觀察，這種觀點(diǎn)得到支持。實(shí)施例6DNA序列的誘變?yōu)榱讼凉撛诘慕K止假象，決定使兩個(gè)富T區(qū)的鏈段發(fā)生突變。密碼子TTT編碼氨基酸苯丙氨酸(Phe)(其可選擇的密碼子(TTC)存在)。因此，決定通過突變來替代TTT密碼子以產(chǎn)生序列TTC，由此可保持讀框和天然的蛋白質(zhì)序列。在本實(shí)施例中，選擇TTT以便通過使免疫治療試劑的蛋白質(zhì)序列不改變來使產(chǎn)物的性質(zhì)不受影響。然而，通過使轉(zhuǎn)錄或者翻譯的提前終止的假象的水平降到最低，突變將增加所表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的產(chǎn)量。
利用下面定義的寡核苷酸JCT61、JPC81由基因重疊區(qū)延伸的PCR技術(shù)來實(shí)現(xiàn)突變，其中天然的DNA序列為有關(guān)區(qū)域中的突變序列所代替。
在誘變中利用下列寡核苷酸JCT61 CCAACCCTCCGAAGAACACCCCCAAACSEQ ID NO 3(用于在DNA序列位置159和162處(TTTTTT至TTCTTC)的HPV 6 L2的誘變的非編碼鏈寡核苷酸引物)JPC81 GATCAAATATTAAAATGGGGAAGTTTGGGGGTGTTCTTCGGAGGGSEQ ID NO 4(用于摻入在位置159和162處的序列TTTTTT至TTCTTC的誘變的HPV 6 L2的編碼鏈寡核苷酸引物)。寡核苷酸編碼Sspl位點(diǎn)AATATT。
利用下列寡核苷酸通過定點(diǎn)誘變，第二個(gè)位點(diǎn)也得到突變JPC90 CGTATTCCCTTATTCTTCTCAGATGTGGCGGCSEQ ID NO 5(用于摻入在位置1359和1362處的序列的體外誘變的HPV 6 L2的編碼鏈寡核苷酸引物)然后，將最后的基因產(chǎn)物插入以便制造設(shè)計(jì)為pGW53的最終表達(dá)載體，并由體外和體內(nèi)表達(dá)分析之。實(shí)施例7突變的序列的表達(dá)在L2E7構(gòu)建體的誘變之后，通過體外和體內(nèi)表達(dá)，隨后用SDS-PAGE分析和適當(dāng)?shù)腤estern印跡分析來監(jiān)測(cè)其效果。
初始的實(shí)驗(yàn)用來分析兩種突變的L2E7和L1基因的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物。
如前檢測(cè)突變的L2E7和L1基因的體內(nèi)表達(dá)。選擇個(gè)體菌落，并將其培養(yǎng)至光密度為0.6，此時(shí)用IPTG來誘導(dǎo)一半培養(yǎng)物，誘導(dǎo)后三個(gè)小時(shí)，收獲細(xì)胞，用SDS-PAGE分析所制備的等分試樣。發(fā)現(xiàn)表達(dá)盒得到滿意的翻譯。
體外和體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，多T區(qū)的誘變導(dǎo)致L2E7和L1的提前終止片段的產(chǎn)量的降低，而使全長(zhǎng)產(chǎn)物的產(chǎn)量提高。凈結(jié)果是來源于L2E7表達(dá)的70kD產(chǎn)物的產(chǎn)量降低，和來源于L1表達(dá)的30-32kD片段的喪失。
因此，清楚的是，多-T區(qū)的突變?cè)谶@一表達(dá)系統(tǒng)中導(dǎo)致全長(zhǎng)種類表達(dá)的提高。對(duì)于以T7聚合酶為基礎(chǔ)的表達(dá)系統(tǒng)來說，以前未曾描述過這一結(jié)果，并且該結(jié)果可能在表達(dá)工作的其它領(lǐng)域中有廣泛的用途。實(shí)施例8蛋白質(zhì)產(chǎn)生和純化過程將捐獻(xiàn)的(Dedicated)包含pGW53質(zhì)粒和如本文所述衍生的大腸桿菌HMS174細(xì)胞的主要的工作細(xì)胞庫(kù)放置和存儲(chǔ)在-80℃下。為進(jìn)行生產(chǎn)，解凍來源于工作細(xì)胞庫(kù)的1安瓿細(xì)胞，并在2YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)至適當(dāng)?shù)捏w積以進(jìn)行發(fā)酵罐接種。發(fā)酵的規(guī)模是從1.3L至50L，并且可望進(jìn)行更大規(guī)模的發(fā)酵。培養(yǎng)細(xì)胞直到細(xì)胞密度達(dá)到一個(gè)預(yù)先設(shè)定的點(diǎn)(典型的為每L 0.3g)。在這一點(diǎn)，用IPTG來誘導(dǎo)培養(yǎng)物，此后在約2小時(shí)以后收獲細(xì)胞。用標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)酵條件，有時(shí)可以獲得每g干重細(xì)胞24-50mgL2E7的產(chǎn)量。然后進(jìn)行如下面和附圖3中所指明的細(xì)胞破壞和蛋白質(zhì)提純。
進(jìn)行細(xì)胞破碎以便釋放存儲(chǔ)作為胞內(nèi)包含體(IB)的不溶性L2E7。這可利用液壓使細(xì)胞在5000psi壓力下通過一個(gè)狹窄的孔徑造成細(xì)胞裂解來完成。用標(biāo)準(zhǔn)方法可以獲得約95％效率的裂解，在3次通過后可以達(dá)到真正完全的裂解。
離心包含包含體形式的不溶性L2E7的大腸桿菌細(xì)胞裂解物。在含有曲通X-100去污劑的緩沖液中再懸浮包含包含體和細(xì)胞碎片的沉淀小球。在這樣的切線交叉流過濾中，它是在市售的″Filtron″(TM)裝置中進(jìn)行的本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，在足夠的驅(qū)動(dòng)濾液通過膜的跨膜壓力下，使待超濾或過濾的液體或懸浮液流通過一個(gè)超濾膜或過濾膜。在當(dāng)前的實(shí)施方案中，切線的交叉流過濾用來針對(duì)0.16μm濾器濃縮包含體懸浮液。在滲余物中濃縮包含體，除去濾液中的雜質(zhì)。然后，稀釋濃縮物以降低曲通X-100濃度，然后再濃縮一次。然后，分別加入尿素和DTT(二硫蘇糖醇)分別至最終的8M和10M濃度，從而溶解L2E7。然后，使變性的和還原的L2E7蛋白質(zhì)穿過0.16μ的濾器而進(jìn)入進(jìn)一步收集的濾液中。
然后，用離子交換層析法純化以變性的、還原的、過濾的形式存在的L2E7。首先由陰離子交換層析法用圖3說明的條件來純化8.0M尿素所溶解的L2E7蛋白質(zhì)。典型地，在一個(gè)250-350mL柱上純化1-2g產(chǎn)物。將尿素所溶解的L2E7裝載在陰離子交換樹脂上，并用4柱體積的含50mM NaCl的尿素DTT Tris緩沖液(pH8.0)洗脫以除去弱結(jié)合的雜質(zhì)。最后，用最多5柱體積的含350mM NaCl的尿素DTT Tris緩沖液(pH8.0)從柱中洗脫L2E7蛋白質(zhì)。整個(gè)步驟的流速約為5mL cm-2/分鐘。
將陰離子交換層析峰產(chǎn)物裝載在陽(yáng)離子交換劑上。典型地，在約250mL柱的材料上純化1-2g產(chǎn)物。將產(chǎn)物以2.5mL分鐘cm-1裝載在樹脂上，然后用4柱體積的含210mM氯化鈉的8.0M尿素DTT磷酸鹽(pH6.2)洗滌，隨后用含500mM氯化鈉的洗滌緩沖液洗脫L2E7峰至約1.5柱體積。
用含有75mM氯化鈉的25mM Tris pH8.0的操作緩沖液將陽(yáng)離子交換劑峰產(chǎn)物裝載在大小排阻基質(zhì)(如圖3中所表明的)上。典型地，將含有200-400mg L2E7的100mL(以0.2mL cm-2/分鐘)裝載在6.5L的(柱)床高100cm的基質(zhì)上。相應(yīng)于主要產(chǎn)物和次要N末端剪除片段的峰是以大約0.46柱體積的洗脫體積切割的峰。
在此過程的這個(gè)階段，以約0.25-0.5mg mL-1的濃度稀釋大小排阻層析峰。通過以0.5mL cm-2/分鐘流速裝載在小量的陰離子交換基質(zhì)(大約75mL)上來濃縮產(chǎn)物(1-2L)。用含有1.0M氯化鈉的尿素DTT磷酸鹽緩沖液pH8.0來洗脫產(chǎn)物。峰體積是1-2柱體積。
在包含5mM DTT的48.9mM Tris pH8.0時(shí)，將濃縮的Q陰離子柱體峰進(jìn)行緩沖交換進(jìn)入最后的配方緩沖液。柱基質(zhì)是具有大約2.5升體積的瓊脂糖凝膠基質(zhì)。將一“彈丸”緩沖液(含有等于產(chǎn)物體積的8M尿素)預(yù)裝在柱上。然后，以大約100-150mL負(fù)載裝載產(chǎn)物。典型地，利用0.06mL cm-2/分鐘流速，以0.5柱體積洗脫用配方緩沖液交換的產(chǎn)物峰。然后，將最后的產(chǎn)物本體貯存在-80℃。
可以此方式獲得的產(chǎn)物L(fēng)2E7蛋白質(zhì)的溶液或分散液以聚集(重聚集)形式存在，然而該產(chǎn)物可以穿過殺菌濾器，例如規(guī)格為0.16-0.22微米范圍(如0.2微米)的濾器。實(shí)施例9HPV-6基因在酵母-釀酒酵母中的克隆和表達(dá)為了檢查其它異源系統(tǒng)高水平表達(dá)HPV-6基因的能力，將L2E7和L1融合構(gòu)建體的基因克隆進(jìn)入一般可獲得的釀酒酵母的自主復(fù)制的表達(dá)載體。這種基于2μ質(zhì)粒的元件的載體，使為GAL7啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的異源符合讀框基因得以表達(dá)。該載體也包含LEU-2d標(biāo)記(用于選擇酵母細(xì)胞中的增加的拷貝數(shù))和卡那霉素抗性基因(使選擇能夠在大腸桿菌中進(jìn)行)。用于表達(dá)的釀酒酵母宿主菌株是S150-2B(基因型a，leu2-3，112，Δhis3，trpl-289，ura3-52)。
用HPV-6L2-E7構(gòu)建體轉(zhuǎn)化酵母，并在包含2％葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)之，以便于抑制GAL7啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。在培養(yǎng)基中在存在2％半乳糖(作為唯一碳源)時(shí)誘導(dǎo)基因表達(dá)。
在玻璃珠存在時(shí)通過細(xì)胞膜的破裂來產(chǎn)生細(xì)胞提取物。提取緩沖液基于Tris，并且含有廣闊范圍的蛋白酶抑制劑PMSF、胃酶抑素、亮肽素、抗蛋白酶和抑糜蛋白酶素。由SDS PAGE處理細(xì)胞提取物，并利用針對(duì)HPV-6 L2和HPV-6 E7在綿羊中產(chǎn)生的多克隆抗血清來Western印跡所解析的蛋白質(zhì)。
在某些實(shí)施方案中估算用這種方式得自釀酒酵母的HPV-6 L2-E7融合蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，其值為每升培養(yǎng)物10μg。實(shí)施例10HPV-6基因在酵母-巴斯德畢赤酵母中的克隆和表達(dá)可制造L2E7融合分子(參見上面的實(shí)施例3)作為BamH I-Not I DNA片段，并可將其克隆進(jìn)入合適的表達(dá)載體中，如畢赤酵母屬表達(dá)載體pPIC3K(可在Phillips Petroleum許可下獲得)。為獲得融合蛋白質(zhì)的高水平表達(dá)，可將基因置于醇氧化酶啟動(dòng)子AOXI控制下。在表達(dá)構(gòu)建體的線性化之后，可以通過原生質(zhì)球融合將DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入酵母細(xì)胞。
可通過它們?cè)谌狈M氨酸的基本培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力來選擇轉(zhuǎn)化體，這不象未轉(zhuǎn)染細(xì)胞一樣在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中仍保留著對(duì)組氨酸的需求。在甲醇底物上緩慢生長(zhǎng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行第二輪篩選，以選擇那些含有整合在正確基因座上的L2E7基因的克隆。實(shí)施例11HPV-6基因在桿狀病毒中的克隆和表達(dá)為了研究在桿狀病毒中L2E7融合基因的表達(dá)，產(chǎn)生兩個(gè)構(gòu)建體，每個(gè)都編碼有或者無HisTag尾的HPV-6 L2E7融合蛋白質(zhì)。沒有一個(gè)構(gòu)建體包含前導(dǎo)序列，因?yàn)榇藭r(shí)希望檢查胞內(nèi)表達(dá)的水平。
通過PCR擴(kuò)增(引入末端的Bgl II位點(diǎn)進(jìn)入pGEM-T載體)克隆這兩個(gè)構(gòu)建體。然后，分離L2E7基因作為Bgl II-Bgl II片段，并且將其亞克隆進(jìn)入轉(zhuǎn)移載體pBacPAK1(Clontech)的BamHI克隆位點(diǎn)。然后，由PCR分析測(cè)定插入片段的取向，并由包含正確取向的克隆制備DNA。
利用標(biāo)準(zhǔn)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的方法，將pBacPAK1轉(zhuǎn)移載體的DNA(包含任何L2E7構(gòu)建體)連同Bsu361切割的pBacPAK1病毒DNA(Clontech)一起，轉(zhuǎn)染進(jìn)入草地夜蛾(類型Sf9)細(xì)胞。然后進(jìn)行質(zhì)粒和病毒DNA之間的體內(nèi)同源重組，以拯救病毒DNA，并且在此過程中將靶基因轉(zhuǎn)移至病毒基因組。
然后，通過感染新鮮細(xì)胞來擴(kuò)增在共轉(zhuǎn)染的上清液中產(chǎn)生的子代病毒。
收獲一部分感染細(xì)胞，并制備基因組DNA。利用上述引物的PCR擴(kuò)增表明在細(xì)胞中存在重組病毒。
然后，傳代的一個(gè)病毒原種用來以高感染復(fù)數(shù)進(jìn)一步感染細(xì)胞，以通過測(cè)定蛋白質(zhì)生產(chǎn)的時(shí)間過程來鑒定基因表達(dá)以高感染復(fù)數(shù)來感染鋪滿在6個(gè)加樣孔平皿中的Sf9細(xì)胞，感染24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后分別收獲細(xì)胞和上清液。通過SDS-PAGE分析和Western印跡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以檢測(cè)蛋白質(zhì)的合成。
在考馬斯染色的SDS/PAGE凝膠上沒有觀察到重組蛋白質(zhì)，但是在低水平時(shí)可通過Western印跡得到檢測(cè)。正如所期望的，蛋白質(zhì)由于前導(dǎo)序列的缺乏而沒有得到分泌。完全排序擴(kuò)增的基因，并將其亞克隆進(jìn)入質(zhì)粒載體?；蛐蛄杏脕順?gòu)建基因融合體，該基因融合體用于在原核和真核系統(tǒng)中高水平表達(dá)HPV-6蛋白質(zhì)。實(shí)施例12在小鼠中的L2E7免疫原性在小鼠中檢測(cè)L2E7的聚集體的免疫原性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)將吸附在氫氧化鋁(“明礬”)上的L2E7的聚集體注射進(jìn)B6CBA小鼠時(shí)，可引起L2E7的特異性免疫。這種L2E7特異性免疫包括免疫球蛋白G(IgG)類和免疫球蛋白G1亞類(IgG1)的血清抗體。也發(fā)現(xiàn)L2E7的體外特異性延遲型過敏性反應(yīng)和淋巴增殖反應(yīng)。
在B6CBA小鼠中檢測(cè)吸附在明礬上的L2E7的免疫原性。隔14天后分別給予小鼠兩次180μg L2E7/明礬皮下注射。
分別在第二次L2E7/明礬注射后的第7、14和56天收集血清。用L2E7特異性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法來測(cè)定血清的抗L2E7抗體水平。第二次L2E7注射后的第14天，血清抗L2E7反應(yīng)達(dá)到峰值(中間點(diǎn)滴度為4.572log10)，并且持續(xù)到第56天(中間點(diǎn)滴度為4.127log10)。
用第二組得到上述免疫的小鼠測(cè)定對(duì)L2E7的體內(nèi)延遲型過敏性反應(yīng)(DTH)。第二次L2E7/明礬注射后的第7天，在小鼠的右耳用1.8μgL2E7以及在它們的左耳用等量的緩沖液攻擊它們。在耳攻擊后的第24、48和72小時(shí)，用工程測(cè)微計(jì)測(cè)定耳厚度的L2E7的特異性增加。用L2E7/明礬免疫的小鼠具有體內(nèi)DTH反應(yīng)。
在它們的第二次L2E7/明礬產(chǎn)物注射(如上所述)后的第七天，通過導(dǎo)出取自第三組小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞(腋淋巴結(jié)細(xì)胞)，來測(cè)定體外淋巴增殖反應(yīng)。制造單一淋巴結(jié)細(xì)胞的懸浮液，并將2×106可存活淋巴細(xì)胞/mL平板接種在以1％正常小鼠血清、谷氨酸、β-巰基乙醇和抗生素補(bǔ)料的培養(yǎng)基(Iscove改良型Dulbecco培養(yǎng)基)中。將L2E7滴定入培養(yǎng)物中(91μg/mL)，并通過摻入滴定的胸苷評(píng)價(jià)72小時(shí)培養(yǎng)中的最后24小時(shí)的細(xì)胞增殖。用響應(yīng)L2E7而體外增殖的L2E7/明礬來免疫小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞(42000cpm，刺激指數(shù)50)。實(shí)施例13人體中的免疫反應(yīng)如上所述的疫苗(一種按照上述方法等價(jià)制備的L2E7的氫氧化鋁凝膠復(fù)合物)顯示出在健康的男性志愿者中誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)摹⑴c劑量有關(guān)的免疫反應(yīng)。來源于所有36位得到接種的志愿者的細(xì)胞顯示出表明對(duì)產(chǎn)物的免疫反應(yīng)的L2E7特異性體外淋巴增殖反應(yīng)(CD4+T細(xì)胞)。通過肌肉內(nèi)注射方式給志愿者施用產(chǎn)物，其劑量在第0天的初始劑量為3、30或300μg，并在第7和28天給以重復(fù)劑量(加速程序)。(一個(gè)可選擇的、緩慢的、在第0、28和56天的疫苗接種程序也得到試驗(yàn)，并發(fā)現(xiàn)其不是優(yōu)選的)。在包括最低劑量(3μg)的劑量水平下在第7天觀測(cè)到淋巴增殖反應(yīng)。在來源于志愿者的32個(gè)可評(píng)估樣品中的29個(gè)中，也顯示出L2E7特異性抗體反應(yīng)(在抗體試驗(yàn)中，給三個(gè)無反應(yīng)者施用最低劑量)。也觀測(cè)到與抗體產(chǎn)生一致的IL-5體外產(chǎn)生的增加。兩個(gè)較高劑量比最低劑量更快地誘導(dǎo)T-細(xì)胞增殖。最高劑量(300μg)比最低劑量刺激更多的IFN-γ的產(chǎn)生。對(duì)快速T-細(xì)胞增殖和相關(guān)的IFN-γ產(chǎn)生的觀測(cè)，和所計(jì)劃的產(chǎn)物用作為生殖器疣的治療疫苗的用途，是適當(dāng)?shù)匾恢碌摹?br> 在施用3μg劑量的產(chǎn)物的受體中也觀察到長(zhǎng)期形成的人腳底疣的消退(一般認(rèn)為其是由于人類乳頭瘤病毒所致)，其細(xì)胞屬于那些顯示淋巴增殖反應(yīng)的細(xì)胞。在第7天觀察到消退，到第14天疣消失。
本文所描述的本發(fā)明和公開部分易于得到許多修飾與變化，根據(jù)本公開部分，對(duì)于技術(shù)人員來說，這些修飾和變化是明顯的和容易實(shí)現(xiàn)的；同時(shí)本公開擴(kuò)展至本文所論及和/或描述的特征的適應(yīng)、結(jié)合和次結(jié)合。本文所引用的文獻(xiàn)與本文一并參考。
權(quán)利要求
1.一種多肽或多肽組合物，該多肽或多肽組合物包含乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)的抗原決定簇，它們以在溶液或分散體中時(shí)可以通過殺菌濾器的聚集態(tài)形式或者無定形聚集態(tài)形式存在。
2.按照權(quán)利要求1的多肽或多肽組合物，該多肽或多肽組合物含有至少兩種乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)的抗原決定簇，如L2和另一個(gè)，或E7和另一個(gè)。
3.按照權(quán)利要求1或2的多肽或多肽組合物，該多肽或多肽組合物含有至少一個(gè)乳頭瘤病毒L2蛋白質(zhì)的抗原決定簇和至少一個(gè)乳頭瘤病毒E1、E2、E4、E6或E7蛋白質(zhì)的抗原決定簇。
4.按照權(quán)利要求1、2或者3的多肽或多肽組合物，該多肽或多肽組合物含有HPV的L2和E7蛋白質(zhì)的抗原決定簇，例如含有L2蛋白質(zhì)和E7蛋白質(zhì)之每種全序列的至少50％的序列片段，例如含有L2和E7的基本上完整的序列，可選擇地還包含L1蛋白質(zhì)的序列。
5.按照前述之任一權(quán)利要求的多肽或多肽組合物，其中的抗原決定簇是HPV類型6、11、16，18的乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)的或非人類動(dòng)物的乳頭瘤病毒的抗原決定簇。
6.按照前述之任一權(quán)利要求的多肽或多肽組合物，該多肽或多肽組合物形式為變性的、還原的和重聚集的制劑。
7.按照前述之任一權(quán)利要求的多肽或多肽組合物，該多肽或多肽組合物可通過變性或者還原變性以及其后的在重組宿主細(xì)胞中以包含體形式表達(dá)的多肽的重聚集來獲得。
8.按照權(quán)利要求7的多肽或多肽組合物，該多肽或多肽組合物的每個(gè)聚集體的分子量范圍為約100,000至約10,000,000道爾頓。
9.按照權(quán)利要求7的多肽或多肽組合物，該多肽或多肽組合物含有的聚集體顆粒直徑，在電子顯微鏡上的范圍約為4至50nm，例如為約10-15nm。
10.按照權(quán)利要求7的多肽或多肽組合物，該多肽或多肽組合物含有的聚集體顆粒具有每聚集體為2-200，例如5-50的多肽鏈。
11.按照權(quán)利要求1的多肽或多肽組合物，該多肽或多肽組合物包含一種融合多肽，該融合多肽包含(a)至少一個(gè)乳頭瘤病毒L2蛋白質(zhì)的抗原決定簇，和(b)至少一個(gè)選自E1、E2、E4、E5、E6和E7乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)以及與(a)不同的乳頭瘤病毒類型的L2乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)的抗原決定簇；或者含有至少兩種選自E1、E2、E4、E5、E6和E7乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)的抗原決定簇，例如其中所說的蛋白質(zhì)得自不同乳頭瘤病毒類型。
12.按照權(quán)利要求11的多肽或多肽組合物，該多肽或多肽組合物含有一種融合多肽，該融合多肽包含一個(gè)L2蛋白質(zhì)的抗原決定簇和得自E1、E2、E4、E6和E7蛋白質(zhì)之至少一種的抗原決定簇。
13.一種適于通過注射使用的免疫原組合物，其含有按照前述之任一權(quán)利要求的多肽以及免疫佐劑。
14.按照權(quán)利要求13的免疫原組合物，其中的佐劑含有氫氧化鋁和/或單磷酸脂質(zhì)A。
15.按照前述之任一權(quán)利要求的多肽或者免疫原組合物作為免疫原的用途，例如用作為用于預(yù)防或治療與乳頭瘤病毒有關(guān)的病癥的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了包含來源于乳頭瘤病毒的抗原的融合多肽和多肽聚集體,及其組合物和它們的應(yīng)用,例如,它們含有佐劑用于免疫原性和疫苗目的,引起如HPV特異性免疫反應(yīng)?？梢约兓嚯?以產(chǎn)生當(dāng)其在溶液或分散體中時(shí)能夠通過殺菌濾器的聚集體,和無定形聚集體。這樣的多肽的例子是人乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)L2和E7的融合蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N15/34GK1229437SQ96180428
公開日1999年9月22日 申請(qǐng)日期1996年7月29日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月29日
發(fā)明者N·R·懷特爾, J·P·卡米查爾, S·E·康諾爾, H·S·G·索姆普森, M·J·威爾森 申請(qǐng)人:劍橋藥物研究有限公司