專利名稱：具有核定位信號的噬菌體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及遺傳工程領域，尤其是通過病毒顆粒進行外源物質的轉運。
將外源基因人工導入細胞的轉基因技術是一種重要的技術，不僅僅因為它是一種分析各種生物現象的基本技術，而且因為其在諸如基因治療和有益動物生產方面的應用。一般而言，轉基因有兩種方法。一種是利用具有外源基因的病毒的生物學方法，另一種用物理學方法將外源基因導入細胞的物理學方法。
利用病毒的方法的原理是用摻入目的基因的重組病毒感染細胞，并將整個重組病毒基因組整合到宿主細胞的基因組中。這種方法目前正受到很大的關注，因為它是作為例如Lesch-Nyhan綜合癥和腺苷脫氨酶(ADA)缺陷這一類疾病的基因治療的技術基礎。然而，有人指出該方法存在一些問題，例如病毒的致病性，這是由于利用了病毒本身的生物學特性而引起的。因此，目前正在開發(fā)改良的逆轉錄病毒載體，它們沒有與病毒致病性和復制相關的區(qū)域。但是，這些改良的載體仍然具有許多問題，因為它們仍然可能對細胞產生一些不良影響，而且它們僅僅感染正在分裂的細胞。
所以，除了上述利用病毒的方法之外，目前也在使用導入非病毒載體的物理學方法。在一種成熟的物理學方法中，將非病毒載體與化學物質例如磷酸鈣、DEAE-葡聚糖、聚陽離子或脂質體一起導入細胞中。不過，這些物理學有這些問題，將基因轉染到細胞中的效率低，在許多情況下如此轉染的非病毒載體上的外源基因并未到達細胞核。因此，要應用于基因治療，該方法有許多困難需要克服。
最近，有報道說被轉送到真核細胞核中并在那里起作用的蛋白質具有一特定的氨基酸序列，其作用是作為將該蛋白質轉入核中的信號(NLS核定位信號)(G.Garcia-Bustos等，生物化學與生物物理(Biochem.Biophys.Acta)1071:83-101(1991))。而且，還有報道說將核定位信號結合到正常情況下并不轉運到核中的蛋白質上將會使該蛋白質具有核轉運活性(R.E.Lanford等，細胞(Cell)46:575-582(1986),Y.Yoneda等，實驗細胞研究(Exp.Cell.Res.) 170:439-452(1987),D.Chelsky等，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)9:2487-2492(1989))。根據這種知識，已用核定位信號進行了研究，從而以物理學方法導入的基因就非常有可能到達細胞核。也就是說，進行了技術研究就使DNA盡可能緊密地濃縮至40納米(即核膜孔的大小)，以及使核定位信號結合到該濃縮物上，并因此可以積極地將DNA轉運到核中。例如，通過利用蛋白質進行了使DNA更緊密的研究，這些蛋白質例如HMG-1和組蛋白，以及聚-L-賴氨酸(Jose C.Perales等，E.J.B.266:255-266(1994)),和陽離子脂質體(J.Zabner等，J.B.C.270:18997-19007(1995))。
但是，這種合成化學方法存在與DNA復合物的溶解性和均一性的問題，以及依賴于鹽濃度的DNA的濃縮的不同程度問題。而且，復合物的構建僅在高堿條件下才有可能，而在生理條件下是不可能的，這在實際運用中是一個需要解決的問題。
有人建議可在感染動物的病毒例如腺病毒和SV40中，核定位信號存在于其衣殼蛋白質中，它們能在感染早期使其DNA積極地進行轉運(Urs.F.Greber和Harumi Kasamatsu，細胞生物學動態(tài)(Trends in Cell Biology)6:189-195(1996))。還有人建議將直徑為45納米的SV40顆粒以病毒顆粒的形式侵入核中(K.Hummeler等，J.Virol.6:87-93(1970))。而且，據報道，MS-2噬菌體有轉運系統(tǒng)，其中外源物質被衣殼包裹(日本公開國際申請No.Hei-508168)。但是，還未報道過任何可利用長鏈DNA并將DNA轉運到核中的利用病毒顆粒的轉運系統(tǒng)。
本發(fā)明的目的之一是提供一個系統(tǒng)，該系統(tǒng)可將導入細胞中的基因送入核中。更具體地，本發(fā)明的目的是提供一種λ噬菌體，其帶有暴露于頭部的外表面的核定位信號，并能包裝長鏈DNA。
為了將長鏈DNA轉運到核中，有必要將DNA濃縮至約40納米，即核膜孔的大小。本發(fā)明者注意到了λ噬菌體的頭部，其頭部在體外可對目的長鏈DNA進行緊密包裝而且可使DNA免于遭受外部DNA酶的攻擊，并作為該DNA的載體。而且，我們還注意到一個現象，即感染動物的病毒可以利用其衣殼蛋白內核定位信號而以病毒顆粒的形式侵入到核中，并嘗試通過制備和利用結合有核定位信號的λ噬菌體頭部將DNA積極地轉運至核中。更具體地，我們利用以下步驟。
首先，我們構建了表達gpD蛋白質和核定位信號序列的融合蛋白的載體，其中的gpD蛋白質是組成λ噬菌體頭部的蛋白質之一；以此載體轉化大腸桿菌(Escherichia Coli)，接著再以在大腸桿菌細胞中不能表達gpD的突變噬菌體(此后稱之為“D琥珀噬菌體”)來對轉化體進行感染。通過噬菌斑形成分析及利用抗-gpD抗體的Westem印跡分析，我們證實了載體表達的gpD蛋白和核定位信號序列之間的融合蛋白可以對突變噬菌體進行補充，而且還得到了其頭部結合有核定位信號的λ噬菌體。也就是說，我們已經發(fā)現了在大腸桿菌中表達的融合蛋白已被補充地整合到了其本身并不表達該蛋白的噬菌體頭部。
接著，我們通過將表達gpD蛋白和核定位信號序列之間的融合蛋白的載體導入到以突變λ噬菌體溶源化的大腸桿菌中，然后熱誘導該溶源化噬菌體而得到了類似的結果。更具體地，我們將表達上述融合蛋白的載體導入到以D琥珀噬菌體溶源化的大腸桿菌中，并以熱誘導該轉化體。結果是其頭部未摻入該融合蛋白并由gpE蛋白組成的噬菌體對EDTA敏感，而摻入有該融合蛋白的噬菌體對EDTA具有抗性。然后，我們以EDTA處理所得噬菌體并計算其滴度。結果發(fā)現構建了包裝有80％基因組大小的DNA的噬菌體，而且融合蛋白摻入到了其噬菌體頭部之中。而且我們已證明確實存在有暴露于噬菌體頭部的外表面的核定位信號。我們還證實甚至我們使用100％基因組大小DNA時，仍然以相同的方式形成摻入該融合蛋白的噬菌體。而且，我們將有核定位信號暴露于其頭部外表面的噬菌體通過微注射導入到屬于人胎兒肺細胞的HEL-R66細胞中并證實該噬菌體具核轉運活性，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明涉及能夠包裝大分子例如長鏈DNA并具有核轉運活性的λ噬菌體。
更具體地，其涉及(1)具有作為其頭部一個組分的核定位信號的包含蛋白質的噬菌體或其頭部，(2)(1)的噬菌體或其頭部，其中所說的核定位信號包含SEQ ID NO:1到SEQID NO:4中的任何一段序列。(3)(1)的噬菌體或其頭部，其中所說的噬菌體是λ噬菌體，(4)(3)的噬菌體或其頭部，其中所說的含有核定位信號的蛋白質是在核定位信號和噬菌體頭部蛋白質之間的融合蛋白。(5)(4)的噬菌體或其頭部，其中所說的噬菌體頭部蛋白質是λ噬菌體的D蛋白。(6)核定位信號和形成噬菌體頭部的蛋白質之間的融合蛋白。(7)(6)的融合蛋白，其中所說的核定位信號包括SEQ ID NO:1到SEQ IDNO:4中的任何一段序列。(8)(6)的融合蛋白，其中所說的噬菌體是λ噬菌體。(9)(6)的融合蛋白，其中所說的噬菌體頭部蛋白是λ噬菌體的D蛋白，(10)編碼(6)到(9)中任一個蛋白質的DNA，(11)含有(10)的DNA的載體，(12)攜帶(11)的載體的細菌宿主，(13)(12)的細菌宿主，其中所說的宿主是大腸桿菌，(14)用于轉化細胞的試劑盒，其中所說試劑盒含有(12)或(13)的細菌宿主，和(b)從其上已衍生出包含于在所說宿主中表達的融合蛋白中的頭部蛋白的噬菌體，其中所說噬菌體在所說細菌宿主中不能表達所說的頭部蛋白，(15)(14)的試劑盒，其中所說的噬菌體是λ噬菌體。(16)(14)的試劑盒，其中所說的包含于在細菌宿主中表達的融合蛋白的頭部蛋白是λ噬菌體的D蛋白。(17)將所需物質轉運到目的細胞的核中的方法，其中所說方法包括(a)將要被轉位至核中的目的物質包裝到(1)的噬菌體或其頭部中，和(b)將所說噬菌體或其頭部導入所需細胞中，(18)(17)的方法，其中所說的目的物質是核酸，(19)(17)的方法，其中所說的噬菌體是λ噬菌體，(20)(17)的方法，其中所說的細胞是哺乳動物細胞。
本發(fā)明涉及將外源物質包裝到結合有核定位信號的噬菌體頭部，將該噬菌體導入外源物質要在其中發(fā)揮功能的目的細胞內，以及將外源物質與噬菌體顆粒一同轉運到靶細胞核中的技術。
對本發(fā)明所使用的核定位信號并無特別限制，只要它具有將結合于該信號序列的物質轉運到核中的活性即可。例如，在將λ噬菌體顆粒轉位到核內的情況下，優(yōu)選使用SV40 VP1。SV40大T抗原，或丁型肝炎病毒δ抗原的核定位信號，或者含有在SV40大T抗原核定位信號內具核轉位活性的最小單位的“PKKKRKV的序列(生物化學百科全書(Encyclopedia ofBiochemistry)第二版中的氨基酸單字母表示法)”。
只要外源物質能包裝到其頭部，對本發(fā)明所使用的噬菌體并無特定限制?？梢允褂美缛胧删w和M13噬菌體的噬菌體。
可以采用多種方法來制備其頭部由含有核定位信號的蛋白質組成的噬菌體。例如，可將核定位信號序列以化學方法結合到噬菌體頭部蛋白上，或者可將編碼核定位信號序列的DNA與編碼噬菌體頭部蛋白質的基因結合在一起并摻入到載體中，在細菌宿主中將其作為融合蛋白表達，并在宿主中使不能表達該頭部蛋白的突變噬菌體進行增殖，從而構建了該噬菌體頭部。對上述方法中所使用的載體并無限制，可使用各種載體。只要本方法中所用的噬菌體在宿主中可以增殖，對細菌宿主沒有特定的限制。例如，當使用λ噬菌體時，可以使用噬菌體可在其中增殖的各種大腸桿菌株。核定位信號可以通過直接地或者通過交聯劑或間隔肽而化學方法結合到噬菌體頭部蛋白上。編碼核定位信號序列的DNA和編碼噬菌體頭部蛋白的基因可以直接或者通過間隔核苷酸而結合在一起。
對上述方法中使用的頭部蛋白是沒有限制的，當噬菌體是λ噬菌體時，蛋白質可使用gpD蛋白或gpE蛋白，噬菌體是M13時使用基因3蛋白質。
本發(fā)明中，在外源物質包裝好之后將噬菌體導入細胞中。對包裝而言，可以使用Ishiura等(基因(Gene)82:281-289(1989))的方法，也可以使用Sternberg等(日本專利No.Hei 59-500042)的方法。對外源物質而言，可以使用基因、基因片段、核酶、反義基因或任何其它能在核內發(fā)揮功能的物質。例如，當進行基因治療時，使用缺陷基因的正常的對應物是有效的。當進行特定基因的功能分析時，用該基因的反義基因將是有效的。而且，如果希望創(chuàng)造轉基因動物，在其中導入一個與要賦予的表型相關的基因是有效的。應該注意到的是本發(fā)明使得有可能包裝長鏈核酸，例如帶有其上游區(qū)的基因。
將包裝有外源物質的噬菌體導入的方法，包括微注射法、脂質轉染法、脂質體法、HVJ-脂質體法、免疫-脂質體法、pH敏感脂質體法、紅細胞血影法、DEAE-葡聚糖法、利用細胞表面的受體的胞吞作用的方法、利用細胞表面特異抗原的方法、利用合成的大分子載體的方法、利用微粒槍的方法等等。對導入包裝有外源物質的噬菌體的細胞并沒有特定的限制，根據目的可以采用各種細胞。


圖1表明的是各種核定位信號和作為λ噬菌體頭部蛋白的gpD蛋白質之間的融合蛋白的圖解。
圖2表明的是顯示通過交聯劑將核定位信號結合到其上的λ噬菌體的核轉位活性的顯微攝影。
圖3顯示的是描述在其頭部表面暴露有核定位信號的λ噬菌體的核轉位活性的顯微攝影。
下面將以實施例對本發(fā)明進行詳細描述，但不應被理解為是對本發(fā)明的限制。實施例1構建帶有核定位信號的λ噬菌體用野生型λ噬菌體基因作模板通過PCR克隆了編碼gpD蛋白質的cDNA，該gpD蛋白質是組成λ噬菌體頭部的一種蛋白質。根據Stemberg等人的方法(Sternberg等，PNAS 92:1609-1613(1995))進行PCR。更具體地，用5′-GTAAGCCATGGTTATGACGAGCAAAG-3＇(其含有從5′端的第6到第11位核苷酸殘基的NcoⅠ位點)(SEQ ID NO:5)和5′-GTTCGAATTCCTATTAAACG ATGCTGATTGCC-3′(其含有從5′端的第5到第10位核苷酸殘基的EcoRⅠ位點)(SEQ ID NO:6)作為引物，將含有該gPD基因的約4kb的片段作為模板，此片段通過用ApaⅠ和ApaLⅠ消化20微克的λ噬菌體基因組(TOYOBO,7.9OD/毫升)而產生。PCR反應中，使用0.2微克模板，10×反應緩沖液(Pharmacia；500毫摩爾/升KCl,15毫摩爾/升MgCl2,100毫摩爾/升Tris-HCl(pH9.0)),1微摩爾/升各種引物，50微摩爾/升dNTP,100微升的5U Taq DNA聚合酶(Pharmacia)，進行的25個循環(huán)，包括90℃變性3分鐘，55℃退火2分鐘，72℃延伸3分鐘，最后的一個循環(huán)90℃熱變性3分鐘55℃退火2分鐘，72℃延伸10分鐘。將通過上述PCR擴增的DNA片段導入大腸桿菌表達載體pTrcHisA(Invitrogen)的NcoⅠ和EcoRⅠ位點，所得載體被稱之為“pTrcHisA-gpD”。通過循環(huán)測序法確證DNA的序列之后，將載體導入大腸桿菌TOP10(Seth G.N.Grant等，PNAS 87:4645-4649(1990))中，并在大腸桿菌中高水平地表達gPD蛋白質。通過SDS聚丙烯酰胺膠凝膠電泳(SDS-PAGE)測定蛋白質的表達。結果，在以1毫摩爾/升IPTG誘導6小時之后在11.6kDa的位置處檢測到強帶，它就是該蛋白質的分子量。
接著，用D琥珀噬菌體感染大腸桿菌TOP10(pTrcHisA-gpD)和大腸桿菌594(pTrcHisA-gpD)，這兩個菌株都因為導入了“pTrc HisA-gpD”而正表達gpD蛋白而且不含有抑制突變(sup°)，然后測定其噬斑形成活性及滴度。結果表明在兩種情況下都形成了噬菌斑，滴度相當于帶有含有對D琥珀抑制突變的LE392的情況。因此，證明了甚至在gpD基因以反式存在時，通過功能互補也形成了該噬菌體。
然后，通過在大腸桿菌中表達核定位信號和gpD之間融合蛋白質而構建了具有核定位信號的噬菌體。核定位信號可以使用除三種類型的被本發(fā)明人證實是有效的來自于SV40VP1、SV40大T抗原和丁型肝炎病毒δ抗原的核定位信號(分別為SEQ ID NOs:1,2,3)之外的其它兩種核定位信號，一種是(1)核定位信號最小單位“PKKKRKV(SEQID NO:4)”和間隔蛋白質之間的融合蛋白，以及(2)單獨的核定位信號最小單位“PKKKRKV”。而且，為了確證噬菌體形成能力，使用了來自Sternberg等在PNAS 92:1609-1613(1995)中所述的血管緊張肽Ⅱ(并非核定位信號)的8個多肽和間隔蛋白質之間的融合蛋白，總共6種類型(圖1)。接著，合成相應于這些核定位信號的寡核苷酸并導入到上述的“pTrcHisA-gpD”的NcoⅠ位點上。在通過循環(huán)測序法證實已正確地構建了質粒之后，將載體導入到了大腸桿菌TOP10中，并在大腸桿菌中高水平地表達核定位信號和gpD蛋白質之間的融合蛋白質。以SDS聚丙烯酰胺膠電泳(SDS-PAGE)測定融合蛋白質的表達。結果，在以1毫摩爾/升IPTG誘導6小時之后，在所期望的蛋白質的分子量的預期位置檢測到了強的帶。而且，通過用D琥珀噬菌體感染細菌細胞來檢測噬菌斑形成能力，并在使用三類肽，SV40大T抗原，丁型肝炎病毒δ抗原，和來自血管緊張素Ⅱ的8個多肽與間隔蛋白質之間的融合蛋白質時，檢測了噬斑形成。滴度測試表明所有噬菌體滴度的數量級為1010，但噬菌斑形成時間對SV40大T抗原而言是10小時，對丁型肝炎病毒δ抗原而言是18小時，與正常的噬菌斑形成時間的6小時相比延遲了(表1)。
表1
還通過Westem印跡法證實如此所得的噬菌體顆粒含有核定位信號和gpD之間的融合蛋白。實施例2用具有核定位信號的λ噬菌體包裝λ噬菌體基因組代替通過大腸桿菌TOP 10感染形成噬菌體的上述方法不同，在下面將使用其中的溶源性噬菌體(大腸桿菌594)或者80％基因組噬菌體在熱誘導下期望能提供更好的噬菌體形成能力的方法。用100％基因組噬菌體使大腸桿菌594(λDam15 cIts 857 Sam7)溶源化，而且具有一個在42℃處理15分鐘可使之失活的溫度敏感型阻遏物cI。但由于D琥珀突變，在此大腸桿菌Sup0菌株中不能產生頭部而僅能產生尾部。在大腸桿菌菌株中導入“pTrcHisA-gpD”以表達該融合蛋白，并用熱誘導檢測噬菌體形成。結果，使用上述6種肽中的任何一種都形成了噬菌體。結果表明在通過100％基因組噬菌體溶源化的該大腸桿菌菌株中，融合蛋白被摻入到了噬菌體頭部。所得噬菌體的滴度見表2所示。
表2
接著，以通過80％基因組D琥珀噬菌體溶源化的大腸桿菌(E.coli 594)進行另一套實驗。噬菌體本身所編碼的并作為該噬菌體的阻遏物的cI是溫度敏感的，它在42℃處理15分鐘后可失活，導致該細菌被噬菌體所裂解。另外，既然該噬菌體包含D琥珀突變，在這個Sup°宿主中，其不能表達gpD，其頭部一般僅由gPE形成。(λ噬菌體頭部蛋白質有兩種-gpD和gpE.)僅由gpE形成的噬菌體對EDTA極其敏感。另一方面，如果允許大腸桿菌表達該融合蛋白并經熱誘導噬菌體摻入融合蛋白，則其將表現出EDTA抗性。將“pTrcHisA-gpD”導入大腸桿菌菌株中，在8毫升的規(guī)模上制備噬菌體并以10mMEDTA進行處理。并以其感染大腸桿菌LE392，測定其滴度。結果證實用實施例1中6種肽中任何一種都有EDTA抗性。該結果表明80％基因組噬菌體比100％基因組噬菌體有更高的滴度，表明在前一種情況下頭部結構被穩(wěn)定(表3)。
表3
實施例3其上有通過交聯劑結合的核定位信號的λ噬菌體的核轉位活性(1)從λ噬菌體溶源化細菌中制備噬菌體顆粒于32℃在LB(thy)培養(yǎng)基上培養(yǎng)以λ噬菌體溶源化的大腸桿菌w3550thy-(λcI847 Sam7)，于45℃振搖處于對數生長期(2×108個細胞/毫升)的菌體25分鐘以誘導噬菌體產生。然后，將培養(yǎng)物在39℃振蕩3小時，于5000rpm離心10分鐘，將沉淀的大腸桿菌重新懸浮于SM緩沖液中(0.1摩爾/升NaCl,8毫摩爾/升MgSO4、0.01％明膠、50毫摩爾/升Tris-HCl(pH7.5))加入37℃的氯仿并攪拌使?jié)饪s的菌體裂解。而且，在溶液中加入DNase，在8000rpm離心30分鐘以除去不溶物，并將上清于23000rpm離心60分鐘沉淀噬菌體，并將噬菌體重新懸浮于SM緩沖液。以氯化銫密度梯度離心純化所回收得到的噬菌體顆粒。(2)交聯核定位信號與λ噬菌體用交聯劑(SMPB；Pierce)將核定位信號與λ噬菌體交聯起來。用SV40大T抗原(SEQ ID NO:2)作為核定位信號。以1.1毫克/毫升在緩沖液(0.1摩爾/升NaCl,8毫摩爾/升MgSO4,20毫摩爾/升Hepes.NaOH(pH7.0))中制備λ噬菌體。將溶于無水DMSO中的10毫摩爾/升SMPB加入其中，其摩爾比為噬菌體顆粒的5000倍，并將混合物在25℃溫育1個小時。然后在緩沖液(0.1摩爾/升NaCl、8毫摩爾/升MgSO4、20毫摩爾/升Tris-HCl(pH7.5))中透析過夜，除去未反應的SMPB就得到了SMPD修飾的λ噬菌體。以與SMPB等摩爾的量在含0.1摩爾/升的NaCl的20毫摩爾/升Tris-HCl(pH8.0)中溶解合成的核定位信號肽(Sawady Technology)，并在溶液中將DTT加至50毫摩爾/升，在37℃進行還原反應1小時。在緩沖溶液(0.1摩爾/升NaCl、8毫摩爾/升MgSO4、20毫摩爾/升Heps.NaOH(pH7.0))中進行凝膠過濾除去DTT之后，將洗脫物加到SMPB修飾的噬菌體上，并在25℃下反應3小時。將反應溶液置于離心管中以在預先置于管中的1毫升10％蔗糖溶液(含0.1摩爾/升NaCl、8毫摩爾/升MgSO4、20毫摩爾/升Hepes.NaOH(pH7.0))層上的分層，于4℃在20000rpm(Beckman TLS-55轉頭)離心1小時。在緩沖液(0.1摩爾/升NaCl,8毫摩爾/升MgSO4,20毫摩爾/升Hepes.NaOH(pH7.0))中重新懸浮沉淀物以回收其上結合有核定位信號的噬菌體。(3)通過微注射及間接熒光抗體法檢測核轉位活性將具有核定位信號的λ噬菌體通過微注射注入以文獻(Y.Yoneda等，Exp.Cell.Res.170:439-452(1987),T.Tachibana等，J.Biol.Chem.269:24542-24545(1994))所述方法在蓋玻片上培養(yǎng)的細胞的胞質中。將細胞在37℃孵育5分鐘到4小時之后，加入含3.7％甲醛的PBS(-)在室溫下將細胞進行固定20分鐘。固定前的“5分鐘到4小時”孵育時間范圍的設定是為了測定具核定位信號的噬菌體在注射后要到達核所需的時間。固定后在室溫下以0.5％TritonⅩ-100將細胞處理5分鐘，在室溫下浸入10％BlockAce(Dainippon Pharmaceutical)中阻斷1小時。接著，將細胞在室溫下與作為一級抗體的稀釋500倍的兔抗-λ噬菌體血清(得自Dr.Hideyuki Ogawa,Osaka University)進行反應1小時，然后與作為二級抗體的FITC-標記的抗免IgG(6微克/毫升)在室溫下反應1小時，用熒光顯微鏡檢測細胞中具核定位信號的λ噬菌體的定位。結果證實具核定位信號的噬菌體在微注射之后立刻轉位到了細胞核(圖2，左上)，在微注射30分鐘之后仍然保留在細胞核周圍(圖2，右上)。在本實驗中對照使用的是未修飾的λ噬菌體(該噬菌體不具有核定位信號)，在微注射后噬菌體立刻分散于細胞質中(圖2，左下)，在30分鐘之內均勻彌散(圖2，右下)。實施例4核定位信號在噬菌體頭部的表面暴露的分析將合成SV40大T抗原的N末端的半胱氨酸殘基與SulfoLink Gel(Pierce)進行交聯以制備固定柱(2毫升，5厘米)。用飽和硫酸銨對10毫升的抗-SV40LT-兔血清進行處理，并在偶聯緩沖液(50毫摩爾/升Tris-HCl(pH8.5)，5毫摩爾/升EDTA-Na)中通過透析進行平衡。并將其置于柱上，結合抗體以0.1摩爾/升Gly-HCl(pH2.5)洗脫，并以0.5毫升每份分餾，洗脫的餾分用0.5毫升的2摩爾/升Tris-HCl(pH8.0)中和。將如此所得的10毫克親和純化抗體與3×108分子的表達SV40大T抗原的80％基因組噬菌體(此后被稱為“LT-噬菌體”)于4℃反應過夜。在其中加入100毫升的蛋白質A-Sepharose4B(Pharmacia,50％懸浮液)，在室溫下進行反應吸收1小時，于5000rpm離心5分鐘，用大腸桿菌LE 392在上清中測定未吸收性噬菌體的滴度。作為對照，用相似的方法對僅表達gpD蛋白的噬菌體進行了分析。此外，用兔γ球蛋白取代抗-SV40LT兔血清進行了相似的分析，同樣也未使用這些抗體(表4)。
表4
結果表明絕大部分“LT-噬菌體”都有暴露于其頭部表面的NLS，其滴度大約下降1/10證實了這一點(從3×108到2.4×107)。實施例5其頭部表面暴露有核定位信號的λ噬菌體的核轉位活性將可以表達SV40大T抗原和gpD之間的融合蛋白的質粒導入以80％基因組D琥珀噬菌體溶源化的大腸桿菌TOP10中。于32℃下將細菌在LB培養(yǎng)基(10毫摩爾/升MgSO4、100微克/毫升氨芐青霉素)中進行培養(yǎng)，對數生長期(2×108細胞/毫升)時在45℃振搖20分鐘以誘導噬菌體產生。然后將培養(yǎng)物在有1毫摩爾/升IPTG存在的情況下在39℃振搖3小時，于5000rpm離心10分鐘，并將沉淀的大腸桿菌細胞重新懸浮于λ緩沖液(10毫摩爾/升Tris-HCl(pH7.5),10毫摩爾/升MgSO4,0.01％明膠，10毫摩爾/升腐胺)中。在37℃時加入氯仿并攪拌以使?jié)饪s的細菌裂解。而且，在溶液中加入了DNase，并在8000rpm離心30分以除去不溶物。在上清中加入10％的聚乙二醇#6000和1摩爾/升NaCl，在0℃處理2小時，并于8000rpm離心30分以沉淀噬菌體。將該噬菌體重新懸浮于λ-緩沖液中，所回收到的噬菌體粒子通過氯化銫密度梯度超離心進行純化。
將噬菌體粒子溶于λ緩沖液中直至2毫克/毫升，并以與實施例3(3)相同的方式進行微注射。將以野生型λ噬菌體與弗倫德(Freund′s)佐劑敏化的兔子制備的血清作為一級抗體用于檢測。結果證實雖然作為對照的野生型λ噬菌體未表現出核轉位活性(圖3，上)，具核定位信號的λ噬菌體在30分鐘之內在細胞核中積累(圖3，下)。工業(yè)實用性本發(fā)明提供了能夠包裝大分子例如長鏈DNA并具有核轉位活性的具有核定位信號的λ噬菌體。該噬菌體例如能夠將所希望的外源基因，如包括上游區(qū)的長鏈DNA運輸到細胞核中，因此其可望能在例如闡明生物學現象和基因治療的各個領域中有效地應用。
序列表序列編號1序列長度20序列類型氨基酸拓撲學線性分子類型肽序列描述序列編號1Lys Met Ala Pro Thr Lys Arg Lys Gly Ser Ala pro Gly Ala Ala Pro Lys Lys1 5 10 15Pro Lys20序列編號2序列長度33序列類型氨基酸拓撲學線性分子類型肽序列描述序列編號2Tyr Asp Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gln His Ser Thr pro pro Lys Lys Lys1 5 10 15Arg Lys Val Glu Asp Pro Lys Asp phe Glu Ser Glu Leu Leu Ser20 25 30序列編號3序列長度30序列類型氨基酸拓撲學線性分子類型肽序列描述序列編號3Lys Lys Asp Lys Asp Gly Glu Gly Ala Pro pro Ala Lys Lys Leu Arg Met Asp1 5 10 15Gln Met Glu Ile Asp Ala Gly pro Arg Lys Arg Pro序列編號4序列長度7序列類型氨基酸拓撲學線性分子類型肽序列描述序列編號4pro Lys Lys Lys Arg Lys Val1 5序列編號5序列長度26序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲學線性分子類型其它核酸，合成DNA序列描述序列編號5GTAAGCCATG GTTATGACGA GCAAAG 26序列編號6序列長度32序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲學線性分子類型其它核酸，合成DNA序列描述序列編號6GTTCGAATTC CTATTAAACG ATGCTGATTG CC 3權利要求
1．噬菌體或其頭部，具有作為其頭部一個組分的包含核定位信號的蛋白質。
2．權利要求1的噬菌體或其頭部，其中所說的核定位信號包含SEQ IDNO:1到SEQ ID NO:4中的任何一段序列。
3．權利要求1的噬菌體或其頭部，其中所說的噬菌體是λ噬菌體。
4．權利要求3的噬菌體或其頭部，其中所說的含有核定位信號的蛋白質是核定位信號和噬菌體頭部蛋白質的融合蛋白。
5．權利要求4的噬菌體或其頭部，其中所說的噬菌體頭部蛋白質是λ噬菌體的D蛋白。
6．核定位信號和形成噬菌體頭部的蛋白質的融合蛋白。
7．權利要求6的融合蛋白，其中所說的核定位信號包括SEQ ID NO:1到SEO ID NO:4中的任何一段序列。
8．權利要求6的融合蛋白，其中所說的噬菌體是λ噬菌體。
9．權利要求6的融合蛋白，其中所說的噬菌體頭部蛋白是λ噬菌體的D蛋白。
10．編碼權利要求的6到9中任一個蛋白質的DNA。
11．含有權利要求10的DNA的載體。
12．攜帶權利要求11的載體的細菌宿主。
13．權利要求12的細菌宿主，其中所說的宿主是大腸桿菌。
14．用于轉化細胞的試劑盒，其中所說試劑盒含有(a)(12)或(13)的細菌宿主，和(b)從其上已衍生出包含于在所說宿主中表達的融合蛋白中的頭部蛋白的噬菌體，其中所說噬菌體在所說細菌宿主中不能表達所說的頭部蛋白。
15．權利要求14的試劑盒，其中所說的噬菌體是λ噬菌體。
16．權利要求14的試劑盒，其中所說的包含于在細菌宿主中表達的融合蛋白中的頭部蛋白是λ噬菌體的D蛋白。
17．將所需物質轉運到目的細胞的核中的方法，所說方法包括(a)將要被轉位至核中的目的物質包裝到權利要求1的噬菌體或其頭部中，和(b)將所說噬菌體或其頭部導入所需細胞中。
18．權利要求17的方法，其中所說的目的物質是核酸。
19．權利要求17的方法，其中所說的噬菌體是λ噬菌體。
20．權利要求17的方法，其中所說的細胞是哺乳動物細胞。
全文摘要
通過構建能表達組成λ噬菌體頭部的gpD蛋白和核定位信號序列的融合蛋白的載體,并用該載體轉化大腸桿菌,并且在此轉化體中對在不能在大腸桿菌中表達gpD蛋白的突變λ噬菌體進行增殖而得到具核定位信號的λ噬菌體。已證明所得的λ噬菌體能夠包裝80%到100%基因組的λ噬菌體DNA。在進一步確證了核定位信號暴露于該噬菌體頭部的外面之后,將該噬菌體微注射到細胞中以分析其核定位活性。因此已闡明該噬菌體具有核定位活性。
文檔編號C12N7/01GK1234832SQ96180464
公開日1999年11月10日 申請日期1996年12月27日 優(yōu)先權日1996年8月9日
發(fā)明者中西真人, 名越繪美, 芥照夫, 武田勝男, 長谷川護 申請人:株式會社載體研究所