專(zhuān)利名稱(chēng)：堿性纖維素酶及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的纖維素酶組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及優(yōu)選得自芽孢桿菌屬菌種(Bacillus sp.)的新纖維素酶組合物。本發(fā)明還涉及新纖維素酶在本領(lǐng)域中公認(rèn)為有益地加入纖維素酶的組合物中的應(yīng)用，包括作為洗滌劑組合物中的添加劑，用于處理含纖維素的織物，用于處理紙漿和紙以及用于處理供生產(chǎn)高果糖含量淀粉糖漿或乙醇的淀粉。
纖維素酶是能水解纖維素中β-D-葡糖甘鍵的酶。纖維素分解酶?jìng)鹘y(tǒng)上分成三大類(lèi)內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或纖維生物水解酶(cellobiohydrolases)以及β-葡糖苷酶(Knowles J.等(1987)，TIBTECH 5,255-261)；已知可通過(guò)大量細(xì)菌、酵母和真菌生產(chǎn)這些酶。
纖維素分解酶的已開(kāi)發(fā)應(yīng)用領(lǐng)域中的主要應(yīng)用方面包括使(木材)纖維素漿降解成糖類(lèi)供(生物)乙醇生產(chǎn)，織物處理如“石洗(stonewashing)”和“生物拋光(biopolishing)”，以及用于洗滌劑組合物中。例如，已知纖維素酶適用于洗滌劑組合物以除去臟物，即清潔處理。例如，英國(guó)申請(qǐng)Nos.2,075,028、2,095,275和2,094,826闡述了摻入纖維素酶的洗滌劑改善的清潔性能。此外，英國(guó)申請(qǐng)No.1,358,599闡述了將纖維素酶用于洗滌劑以減小含棉織物的粗糙性。
纖維素酶在處理織物時(shí)的另一個(gè)有用特征是它們能重整用過(guò)的織物而使它們的顏色更光亮。例如，反復(fù)洗滌含棉織物會(huì)導(dǎo)致織物上淺灰色的色光(cast)，認(rèn)為這是由于機(jī)械作用而引起的原纖維斷裂和紊亂的緣故，有時(shí)稱(chēng)之為“毛球”。彩色織物上尤其可見(jiàn)到這種淺灰色的色光。因此，纖維素酶除去織物紊亂的表層從而改善織物的整個(gè)外觀的性能很重要。
盡管本領(lǐng)域中知道具有一些或所有上述性能的許多纖維素酶組合物，但仍需要具有各種特性范圍的新纖維素酶，它們例如適用于處理織物，用作洗滌劑組合物的成分，用于處理紙漿和紙，以及用于轉(zhuǎn)化生物量。申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)了這樣一些纖維素酶，它們具有這類(lèi)額外的特性且適用于纖維素酶的這類(lèi)已知應(yīng)用場(chǎng)合。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有有益性能的新纖維素酶，它適用于洗滌劑，處理織物以及紙漿和紙的制造。
按本發(fā)明，纖維素酶可得自或衍生自芽孢桿菌屬菌種CBS 669.93，或是所述纖維素酶的衍生物。CBS 669.93在1993.12.23保藏在真菌菌種保藏中心(CBS),Baam，荷蘭，保藏號(hào)為CBS 669.93(“CBS669.93”)。優(yōu)選地，該新纖維素酶包括圖2A-2C的氨基酸序列(SEQ.ID NO.1)，或其具有大于58％序列同一性的衍生物，優(yōu)選具有至少80％序列同一性，更優(yōu)選具有至少90％序列同一性。本發(fā)明還涉及新纖維素酶，它包括圖2A-2C的氨基酸序列(SEQ.ID NO.1)，或其具有大于72％序列相似性的衍生物，優(yōu)選具有至少80％的序列相似性，最優(yōu)選具有至少90％序列相似性。
按另一個(gè)實(shí)施方案，提供了包括DNA的組合物，該DNA編碼圖2A-2C的氨基酸序列(SEQ.ID NO.1)，或其具有大于58％序列同一性的衍生物，優(yōu)選具有大于80％序列同一性，更優(yōu)選具有大于90％序列同一性。而且，提供包括DNA的組合物，該DNA編碼圖2A-2C的氨基酸序列(SEQ.ID NO.1)，或其具有大于72％序列相似性的衍生物，優(yōu)選具有大于80％序列相似性，更優(yōu)選具有大于90％序列相似性。
按本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供了用編碼本發(fā)明的氨基酸序列的DNA轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)奈⑸锏姆椒ā?br> 在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該纖維素酶是得自芽孢桿菌屬菌種CBS 669.93、具有約為63kD的理論分子量的纖維素酶。該大約63kD纖維素酶具有約為5的理論等電點(diǎn)以及在40℃和60℃下對(duì)CMC約為6的最適pH。


圖1顯示得自CBS 69.93的大約63kD纖維素酶在40℃和60℃下pH/活性曲線圖。
圖2A-2C顯示得自CBS 669.93的大約63kD纖維素酶的DNA序列(SEQ.ID NO.2)和相應(yīng)的氨基酸序列(SEQ.ID NO.1)，加下線部分是前導(dǎo)肽序列，它在分泌時(shí)被裂解而產(chǎn)生成熟的酶。
“衍生物”是指通過(guò)下列方法得自天然蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，即將一個(gè)或多個(gè)氨基酸加到天然蛋白質(zhì)的C末端和N末端中的一個(gè)或兩個(gè)末端上，取代天然氨基酸序列中一個(gè)或一些不同位點(diǎn)上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，在天然蛋白質(zhì)的一端或兩端或者在該氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸，或者在該天然氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸。酶衍生物的制備優(yōu)選通過(guò)如下方法完成，即修飾編碼天然蛋白質(zhì)的DNA序列，將該DNA序列轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗髦校俦磉_(dá)該修飾的DNA序列而形成該衍生酶。本發(fā)明的衍生物包括這樣的肽，即它們包括與前體酶氨基酸序列(例如本發(fā)明的野生型或天然態(tài)酶)相比已改變的氨基酸序列，且這些肽保持前體酶的特征酶性質(zhì)但在某些特定方面具有改變了的性能。例如，改變了的纖維素酶可能具有更高的最適pH或更高的溫度抗性但保持其特有的纖維素分解活性。衍生物還包括在酶分子內(nèi)氨基酸殘基的化學(xué)修飾。
“可得自”芽孢桿菌668.93的纖維素酶指這種纖維素酶，它具有的氨基酸序列相當(dāng)于可得自該有機(jī)體的纖維素酶的氨基酸序列。因此，與得自不同芽孢桿菌的本發(fā)明的63kD纖維素酶具有相同氨基酸序列的纖維素酶應(yīng)“可得自”芽孢桿菌669.93。
“宿主細(xì)胞”指這種細(xì)胞，它能起宿主和本發(fā)明的重組DNA載體的表達(dá)載體的作用。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，“宿主細(xì)胞”是指芽孢桿菌屬的細(xì)胞。
“DNA構(gòu)建物”或“DNA載體”指這種核苷酸序列，它包括編碼上述任何新纖維素酶或纖維素酶衍生物的一個(gè)或多個(gè)DNA片段。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該纖維素酶得自真菌菌種保藏中心，Baam，荷蘭，在布達(dá)佩斯條約下于1993.12.23保藏的保藏號(hào)CBS 669.93(描述于PCT申請(qǐng)/EP94/04312)。如本文所應(yīng)用的那樣，保藏的菌種將被稱(chēng)為CBS 669.93。在更優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的纖維素酶是得自CBS 669.93的大約63kD纖維素酶(基于成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列求算的)(本文稱(chēng)為“63kD纖維素酶”)。該大約63kD纖維素酶就成熟蛋白質(zhì)而言理論pI約為5以及在40℃和60℃下對(duì)CMC的最適pH約為6。
編碼該大約63kD纖維素酶的氨基酸序列的基因是這樣分析的，即應(yīng)用CAOS/CAMM Center,University of Nijmegen,Holland的方法，通過(guò)與各種文庫(kù)(GenBank,Swiss-Prot,EMBL和PIR)中的可及序列數(shù)據(jù)比較而分析的。把由本發(fā)明的DNA序列編碼的纖維素酶與由公開(kāi)的或已知的纖維素酶基因序列編碼的纖維素酶進(jìn)行比較的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索顯示，最大數(shù)量的氨基酸同一性見(jiàn)于燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)的纖維素酶CeIB。
采用如Pearson & Lipman在國(guó)家科學(xué)院院報(bào)〔美〕(Proc.Nat.Acad.Sci.),vol.85,pp.2444-2448(1988)中所述的TFastA程序，證實(shí)該大約63kD纖維素酶有58％的序列同一性和72％的序列相似性。該TFastA數(shù)據(jù)檢索程序可以序列分析軟件包6.0版的形式商購(gòu)(GeneticComputer Group,Univ.Wisconsin Biotechnology Center,Madison,Wisconsin 53705)。燦爛芽孢桿菌的序列見(jiàn)于Jorgensen等，基因(Gene),vol.93,pp.55-60(1990)。因此，本發(fā)明包括這種纖維素酶，它具有圖2A-2C的氨基酸序列(SEQ.ID NO.1)或其具有大于58％序列同一性，優(yōu)選大于80％的序列同一性，最優(yōu)選大于90％的序列同一性的衍生物。本發(fā)明進(jìn)一步包括這種纖維素酶，它的氨基酸序列與圖2A-2C的氨基酸序列(SEQ.ID NO.1)相比具有大于72％的序列相似性，優(yōu)選大于80％的序列相似性，最優(yōu)選大于90％的序列相似性。
本發(fā)明還公開(kāi)了生產(chǎn)該纖維素酶的方法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該纖維素酶可通過(guò)在便于生產(chǎn)該纖維素酶的條件下培養(yǎng)合適的有機(jī)體如芽孢桿菌屬菌種CBS 669.93而生產(chǎn)。優(yōu)選地，這些條件包括通常為培養(yǎng)芽孢桿菌屬以最大量地生產(chǎn)纖維素酶而提議的條件，并包括將得自纖維素的底物用作能源同時(shí)結(jié)合必需的鹽、離子和其它熟知的成分。通常，用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于生長(zhǎng)細(xì)菌的任意常規(guī)的培養(yǎng)基?？蓪⒓?xì)胞在需氧條件下、含可同化的碳和氮以及其它必需營(yíng)養(yǎng)物的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。合適的碳源有碳水化合物如蔗糖、葡萄糖和淀粉，或是含碳水化合物的物質(zhì)如糧谷、麥芽、大米和高梁。摻入培養(yǎng)基的碳水化合物濃度可變范圍寬，例如高達(dá)25％和低到1-5％、但通常8-10％將是合適的，該百分?jǐn)?shù)是作為葡萄糖的等效量求算的。營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中的氮源可以是無(wú)機(jī)的和/或有機(jī)的氮源。合適的無(wú)機(jī)氮源有硝酸鹽和銨鹽。在涉及細(xì)菌培養(yǎng)的發(fā)酵過(guò)程中經(jīng)常應(yīng)用的有機(jī)氮源有大豆粉、棉籽粉、花生餅粉、酪蛋白、玉米、玉米浸泡液的濃縮物、酵母提取物、脲和白蛋白。此外，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基還應(yīng)含標(biāo)準(zhǔn)的痕量物質(zhì)。
纖維素酶可通過(guò)常規(guī)方法從培養(yǎng)基回收，這類(lèi)方法包括通過(guò)離心或過(guò)濾從培養(yǎng)基分離細(xì)胞，如果需要的話，在細(xì)胞破裂后應(yīng)用鹽如硫酸銨沉淀上清液或?yàn)V液中的蛋白質(zhì)組分，接著應(yīng)用各種色譜法如離子交換色譜、親和色譜或類(lèi)似的技術(shù)上認(rèn)可的方法純化。至于本發(fā)明的堿性纖維素酶的生產(chǎn)，優(yōu)選在堿性條件下應(yīng)用含基于纖維素的能源的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
優(yōu)選地，本發(fā)明的纖維素酶是這樣生產(chǎn)利用基因工程技術(shù)用編碼該纖維素酶的基因轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，再在適合宿主細(xì)胞生長(zhǎng)和纖維素酶表達(dá)的條件下進(jìn)行表達(dá)。第一步，該染色體DNA可通過(guò)Saito和Miura的方法(Saito & Miura，生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(bào)〔荷〕，vol.72,pp.619(1963))或通過(guò)類(lèi)似方法得自供體細(xì)菌菌株。限制酶切割這樣獲得的染色體DNA而產(chǎn)生含堿性纖維素酶基因的DNA片段。為此目的，任何限制酶，只要不切割所述基因的區(qū)域都可應(yīng)用。在備擇方法中，可應(yīng)用切割該基因的限制酶，但應(yīng)用更低的酶濃度或更短的培養(yǎng)時(shí)間以致只允許部分消化。一種優(yōu)選的限制酶是Sau3A。從產(chǎn)生的消化混合物中，可分離合適的片段(4-10kb)并應(yīng)用于用DNA構(gòu)建物對(duì)適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞進(jìn)行的轉(zhuǎn)化，例如用包括編碼本發(fā)明的63kD纖維素酶的大約9kbDNA片段和適當(dāng)?shù)妮d體序列的DNA構(gòu)建物。
編碼本發(fā)明的纖維素酶的基因可應(yīng)用λ-噬菌體(表達(dá))載體和大腸桿菌(E.coli)宿主細(xì)胞來(lái)克隆。(也可應(yīng)用PCR克隆法，它利用保守域上設(shè)計(jì)的共有引物)。本申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化編碼本發(fā)明的纖維素酶的基因并在大腸桿菌中表達(dá)可產(chǎn)生活性蛋白質(zhì)。在大腸桿菌內(nèi)的首次克隆步驟之后，可將本發(fā)明的纖維素酶基因轉(zhuǎn)移到更優(yōu)選的工業(yè)表達(dá)宿主，例如芽孢桿菌屬或鏈霉菌屬(Streptomyces)，絲狀真菌如曲霉屬(Aspergillus)或木霉屬(Trichoderma)，或者酵母如酵母屬(Saccharomyces)。在這些宿主有機(jī)體中能達(dá)到的高水平表達(dá)和分泌使得纖維素酶在發(fā)酵培養(yǎng)基中積累，隨后就可從培養(yǎng)基回收它。
優(yōu)選地，該表達(dá)宿主細(xì)胞包括芽孢桿菌屬菌種，更優(yōu)選地是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)化宿主缺失蛋白酶基因以保證產(chǎn)物纖維素酶在發(fā)酵液或其濃縮物中不遭受蛋白酶解。Ferrari等在美國(guó)專(zhuān)利No.5,264,366中提供了關(guān)于蛋白酶缺失芽孢桿菌屬菌株的一個(gè)優(yōu)選的一般性轉(zhuǎn)化和表達(dá)方案，該文獻(xiàn)并入本文作參考。還優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化過(guò)的芽孢桿菌屬宿主的發(fā)酵是在約為6.9的pH下進(jìn)行的。在曲霉屬中的轉(zhuǎn)化和表達(dá)例如由Berka等描述于美國(guó)專(zhuān)利No.5,364,770中，該文獻(xiàn)并入本文作參考。當(dāng)該轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬時(shí)，優(yōu)選的啟動(dòng)子是aprE啟動(dòng)子。
該得自CBS 669.93的大約63kD纖維素酶已被證實(shí)在包括甘氨酸、乙酸銨、硼砂和/或Tris的緩沖體系中很有用。也發(fā)現(xiàn)了該纖維素酶對(duì)CMC的作用可因鎂的存在而激活并因鈣的存在而抑制。還發(fā)現(xiàn)了約250ppm:750ppm的鎂與鈣之比對(duì)活性有益。
按本發(fā)明，上述纖維素酶組合物可根據(jù)技術(shù)上認(rèn)可的在洗滌劑中使用纖維素酶的方法而應(yīng)用于洗滌劑組合物中。在堿性pH下該纖維素酶極好的活性應(yīng)使本纖維素酶特別適用于高pH洗滌劑中。
本發(fā)明將在如下實(shí)施例中被更詳細(xì)地闡釋?zhuān)峁┻@些實(shí)施例只是為了闡述而不能認(rèn)為是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1從堿性土壤和水樣品篩選和分離纖維素酶應(yīng)用了兩種方法從堿性土壤和水樣品分離產(chǎn)纖維素酶的微生物。在一種方法中，將土壤和水樣品懸浮于0.85％鹽水溶液，再直接用于羧甲基纖維素(CMC)-瓊脂擴(kuò)散分析以檢測(cè)生產(chǎn)纖維素酶的菌落。在第二種方法中，通過(guò)在40℃下在含纖維素的液體基本培養(yǎng)基或GAM培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～3天使土壤和水樣品富集包含纖維素酶的菌株。應(yīng)用CMC-瓊脂擴(kuò)散分析對(duì)顯示出細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)物分析纖維素酶活性以檢測(cè)生產(chǎn)纖維素酶的菌落。該CMC-瓊脂擴(kuò)散分析和富集過(guò)程利用pH約為9.7的基本培養(yǎng)基制品，該樣品包括1％KNO3、0.1％酵母提取物(Difco)、0.1％KH2PO4、0.02％MgSO4·7H2O、1％Na2CO3、4％NaCl和0.25％CMC(Sigma C-4888)。為了固化而加入1.5瓊脂。
將兩種方法中的哪一個(gè)用于該CMC-瓊脂擴(kuò)散分析取決于待測(cè)試的是菌落還是液體級(jí)分。若測(cè)試菌落，將0.85％鹽水溶液中的細(xì)胞懸浮液涂在含CMC的基本培養(yǎng)基上。在40℃下培養(yǎng)1～3天后，將平板進(jìn)行復(fù)制鋪板，用0.1剛果紅浸漬親代板達(dá)15分鐘。用1M NaCl使平板脫色達(dá)30分鐘。分離在菌落周?chē)憩F(xiàn)為清亮區(qū)的菌株作為可能的生產(chǎn)纖維素酶的微生物。這樣分析液體級(jí)分吸移40μl酶溶液或發(fā)酵液等分樣注入培養(yǎng)皿中從一層5mm基本培養(yǎng)基沖出的孔內(nèi)。在40℃下培養(yǎng)16小時(shí)后通過(guò)剛果紅/NaCl處理檢測(cè)纖維素酶活性。清亮區(qū)的直徑是CMC酶活性的量度。
應(yīng)用兩種篩選方法中任一種時(shí)表現(xiàn)清亮區(qū)的菌株被選出用于逐漸生長(zhǎng)并分離纖維素酶。在40℃下250r.p.m的培養(yǎng)箱振蕩器(NewBrunswick Scientific,Edison,NJ,USA)中，將菌落在100毫升搖瓶?jī)?nèi)的25毫升GAM培養(yǎng)基中發(fā)酵72小時(shí)。在pH9和40℃下測(cè)定培養(yǎng)液中CMC酶活性以證實(shí)發(fā)酵液中纖維素酶的存在。用于生產(chǎn)酶的復(fù)合培養(yǎng)基(GAM)包括胨(Difco)0.5％，酵母提取物(Difco)0.5％，葡萄糖·H2O 1％,KH2PO40.1％,MgSO4·7H2O 0.02％,Na2CO31％,NaCl 4％。用4M HCl 將pH調(diào)到9.5，然后加入1％CMC。
應(yīng)用上述方法，分離生產(chǎn)纖維素酶的微生物并進(jìn)一步表征為能活動(dòng)的、細(xì)長(zhǎng)的桿形細(xì)菌，它出現(xiàn)長(zhǎng)鏈且呈絲狀外觀，或表現(xiàn)為呈“V”形的成對(duì)細(xì)胞。近末端的孢子是具有清楚的孢子囊膨脹的橢球形物。GAM瓊脂上的菌落表現(xiàn)為奶油色、環(huán)形、扁平、光滑而發(fā)亮，暴露出稍不規(guī)則的邊緣?；?6S rRNA序列分析，該微生物被歸類(lèi)為芽孢桿菌屬的菌種。本文將該有機(jī)體稱(chēng)為CBS 669.93，并在該保藏號(hào)下保藏在真菌菌種保藏中心，Baam，荷蘭。
實(shí)施例2DNA的分離，纖維素酶的轉(zhuǎn)化和表達(dá)選擇親堿性芽孢桿菌屬菌株CBS 669.93作為供體菌株用于在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)克隆。按Saito & Miura在生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(bào)〔荷〕，vol.72,pp.619-629(1963)中描述的方法分離染色體DNA。
將分離后的染色體DNA通過(guò)限制酶Sau3A應(yīng)用系列稀釋的酶溶液部分地消化，是應(yīng)用React Buffers(Gibco BRL Life Technologies,Gaithersburg,Md.,USA)在供應(yīng)商建議的條件下在37℃下消化1小時(shí)。將消化過(guò)的DNA通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級(jí)分離，應(yīng)用QIAquick GelExtraction Kit按供應(yīng)商(QIAGEN Inc.,Chatsworth,Ca.USA)描述的方案從凝膠分離合適的級(jí)分(4-10kb)。
將染色體DNA的Sau3A片段用于按供應(yīng)商(Stratagene CloningSystems,La Jolla,Ca.,USA)提供的方案在BamH1消化的CIAP處理過(guò)的ZAP Express載體中構(gòu)建基因組基因文庫(kù)。把含克隆化DNA插入片段的pBK-CMV噬菌體從該ZAP ExpressTM載體上切除，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株XLOLR。
按Wood等在Meth.Enzym.,vol.160,pp.59-74(1988)中描述的方法通過(guò)瓊脂擴(kuò)散篩選重組克隆。分離在菌落周?chē)憩F(xiàn)為清亮區(qū)的菌株。在4*YEP培養(yǎng)基中發(fā)酵48小時(shí)后測(cè)定分離了的重組體的CMC酶活性，所述培養(yǎng)基包括酵母提取物(Difco)4％，蛋白胨(Difco)8％，乳糖0.2％，氨芐青霉素100μg/ml。該重組蛋白質(zhì)被純化(實(shí)施例3)，測(cè)得N端氨基酸序列如下所示Asn-Glu-Asp-Val-Lys-Thr-Leu-Asp-Ile-Gln(SEQ.ID NO.3)應(yīng)用QIAprep Plasmid Kit按供應(yīng)商(QIAGEN Inc.)描述的方案分離生產(chǎn)纖維素酶的重組體的質(zhì)粒DNA。該質(zhì)粒含染色體DNA的大約9kb插入片段。測(cè)定2777bp片段的核苷酸序列，其中把一組得自N端氨基酸序列的簡(jiǎn)并的寡核苷酸用作確定9kb插入片段上的基因位置的引物。該2777bp片段含有一個(gè)1746bp的開(kāi)放讀框，從該讀框可推斷出574個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。編碼所述纖維素酶的基因的核苷酸序列(SEQ.IDNO.2)和已分離的單一纖維素酶的推斷氨基酸序列(SEQ.ID NO.1)示于圖2A-2C。
實(shí)施例3纖維素酶的純化使得自實(shí)施例2的纖維素酶生產(chǎn)菌落在由酵母提取物(Difco)4％、胨(Difco)8％、乳糖0.2％、100μg/ml氨芐青霉素構(gòu)成的復(fù)合培養(yǎng)基(4*YEP)上生長(zhǎng)。通過(guò)離心(8000rpm)從培養(yǎng)液分離發(fā)酵液。用硫酸銨(65％飽和溶液)沉淀上清液中的纖維素酶。將沉淀物溶于25mM磷酸鹽緩沖液(pH7)+5mM EDTA，直至達(dá)到7mS/cm的電導(dǎo)率。將該溶液加到Q-Sepharose FF(直徑5cm，長(zhǎng)10cm)陰離子交換柱中，然后用25mM磷酸鹽緩沖液(pH7)+5mM EDTA洗滌該柱直至吸光度為0.2AU。在80分鐘內(nèi)對(duì)該柱應(yīng)用0～0.5M NaCl于25mM磷酸鹽(pH7)中的梯度。接著在10分鐘內(nèi)應(yīng)用0.5～1M NaCl的梯度。洗脫發(fā)生于第一個(gè)梯度中。洗脫后用1M NaOH清洗該柱(上流)，再用25mM磷酸鹽(pH7)+5mM EDTA平衡。由洗脫分布曲線而定，所得纖維素酶的純度高達(dá)約80％。
實(shí)施例4本發(fā)明的纖維素酶的性能為測(cè)定本發(fā)明的大約63kD纖維素酶的pH/溫度曲線，在不同的pH和溫度值下測(cè)定了該纖維素酶對(duì)CMC的活性。用10mM磷酸鹽緩沖液(pH7)稀釋而將包括該大約63kD纖維素酶的溶液與緩沖液合并。(應(yīng)用包括100ml 1M磷酸、100ml檸檬酸和600ml蒸餾水的混合物的緩沖液控制pH，用4M NaOH將pH調(diào)節(jié)到4、5、6、7、8、9或10，然后用蒸餾水注入該混合物至1L)。稀釋酶溶液直至在pH7和40℃下測(cè)得為0.05U/ml。在混合0.5ml Buffer、0.5ml底物(1％CMC)和0.1ml 10mM磷酸鹽緩沖液后測(cè)定各緩沖體系以獲得實(shí)際pH。pH4、5、6、7、8、9和10的溶液的實(shí)際pH分別為4.2、5.2、6.2、7、8、8.7和9.9。
圖1闡明的結(jié)果顯示該纖維素酶極好的堿活性。校正曲線的斜率取決于該酶底物混合物的pH，為此在各pH下采取兩個(gè)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品即(500mg葡萄糖.H2)/100ml稀釋10倍和25倍。
可應(yīng)用如下修正了的PAHBAH方法(Lever M.分析生物化學(xué)〔美〕(Anal.Biochem.),1972,47,273-279和Lever M.，分析生物化學(xué)〔美〕,1977,81,21-27)測(cè)定纖維素酶活性。可這樣測(cè)定pH/溫度曲線，即應(yīng)用固定的酶濃度，后者符合在pH7和40℃下測(cè)得的劑量響應(yīng)曲線的線性范圍。該酶濃度可用于測(cè)定所有其它測(cè)定條件下的活性。在一支試管中注入250μl于50mM pH9甘氨酸緩沖液中的2.5％CMC(購(gòu)自Sigma的低粘度CMC)和250μl該63kD纖維素酶的等分樣，用適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋。將該試管置于40℃的水浴中保溫30分鐘，隨后加入1.5ml當(dāng)日新配制的PAHBAH溶液(1％PAHBAH于100ml 0.5M NaOH中)和100ml鉍溶液(100ml中含有48.5g硝酸鉍、28.2g酒石酸鉀鈉和12.0gNaOH)。在70℃下將該混合物加熱10分鐘，然后在冰上冷卻2分鐘。在410nm處測(cè)定吸光度。為消除該酶樣品的背景吸收而進(jìn)行如下對(duì)照實(shí)驗(yàn)在與試驗(yàn)試管同樣的條件下將盛有底物的試管保溫。保溫后依次加入1.5ml PAHBAH和該酶制劑。一個(gè)單位(U)定義為從CMC等效物產(chǎn)生1μmol葡萄糖所需酶的量，以每分鐘每克產(chǎn)物的還原糖而定。
權(quán)利要求
1．可得自或衍生自芽孢桿菌屬菌種CBS 669.93的纖維素酶，或其衍生物。
2．含纖維素酶的組合物，該纖維素酶包括SEQ.ID NO.1的氨基酸序列，或其具有大于58％序列同一性的衍生物。
3．權(quán)利要求2的組合物，其中所述纖維素酶具有與SEQ.ID No.1的至少80％序列同一性。
4．權(quán)利要求3的組合物，其中所述纖維素酶具有與SEQ.ID No.1的至少90％序列同一性。
5．含纖維素酶的組合物，該纖維素酶包括SEQ.ID NO.1的氨基酸序列，或其具有大于72％序列相似性的衍生物。
6．權(quán)利要求5的組合物，其中所述纖維素酶具有至少80％的序列相似性。
7．權(quán)利要求5的組合物，其中所述纖維素酶具有至少90％的序列相似性。
8．權(quán)利要求1的組合物，其中所述纖維素酶得自芽孢桿菌屬菌種CBS 669.93。
9．包括編碼權(quán)利要求2或5的氨基酸序列的DNA的組合物。
10．包括編碼權(quán)利要求3或6的氨基酸序列的DNA的組合物。
11．包括編碼權(quán)利要求4或7的氨基酸序列的DNA的組合物。
12．包括權(quán)利要求9的DNA組合物的表達(dá)載體。
13．包括權(quán)利要求10的DNA組合物的表達(dá)載體。
14．包括權(quán)利要求11的DNA組合物的表達(dá)載體。
15．表達(dá)纖維素酶的方法，該方法包括(a)用編碼權(quán)利要求2或5的氨基酸序列的DNA轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)奈⑸铮?b)在適合表達(dá)所述DNA的條件下制備含所述適當(dāng)微生物的發(fā)酵液；(c)在允許表達(dá)所需量的所述纖維素酶的條件下將所述發(fā)酵液保持一段時(shí)間；以及(d)收集合所述纖維素酶的所述發(fā)酵液。
16．包括權(quán)利要求1、2或5的纖維素酶的洗滌劑組合物。
17．處理織物的方法，它包括將所述織物與權(quán)利要求1、2或5的纖維素酶接觸。
18．處理基于纖維素的紙漿的方法，它包括將所述基于纖維素的紙漿與權(quán)利要求1、2或5的纖維素酶接觸。
全文摘要
本發(fā)明提供了可得自芽孢桿菌屬菌種CBS669.93的纖維素酶組合物。一種優(yōu)選的纖維素酶理論分子量約為63kD,理論等電點(diǎn)約為5以及在40℃和60℃下對(duì)CMC的最適pH約為6。
文檔編號(hào)C12N15/56GK1214082SQ96180208
公開(kāi)日1999年4月14日 申請(qǐng)日期1996年4月26日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月12日
發(fā)明者P·范索林根 申請(qǐng)人:金克克國(guó)際有限公司