專利名稱：β-葡聚糖酶活力的測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種測定β “葡聚糖酶活力的方法，具體涉及用MBTH法測定β-葡聚糖酶活力的方法尤其涉及測定過程中關鍵參數的選擇。
背景技術：
β-葡聚糖是一類非淀粉類多糖，它是由β-1，3_葡萄糖苷鍵和/或β-1，4_葡萄 糖苷鍵組成的鏈狀多糖，是植物細胞壁的組成成分，存在于禾谷類(包括大麥、燕麥、黑麥 和小麥等)的糊粉層和胚乳細胞壁中。葡聚糖酶對葡聚糖中的糖苷鍵具有重要的 水解作用。目前，該酶已廣泛用于啤酒、飼料、紡織、造紙、醫(yī)藥等行業(yè)。該酶活力的檢測方 法有粘度法、熒光法、顯色底物法、凝膠擴散法、還原糖測定法等，其中最常采用的方法為還 原糖測定法中的DNS法、鐵氰化鉀法和Somogyi-nelson法。由于這三種方法靈敏度較低， 很難測到酶解反應的初速度，因此，準確度較差。本發(fā)明以MBTH(3-甲基_2_苯并噻唑酮腙)試劑為顯色劑來測β _葡聚糖酶的活 力。該法不受低濃度醋酸鹽和丁二酸鹽緩沖液的干擾，所得酶濃度曲線與酶解反應速度在 較寬的酶濃度范圍內呈線性相關。

發(fā)明內容
針對已有技術的不足，本發(fā)明提供一種葡聚糖酶活力的測定方法，該方法采 用3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法來測定β -葡聚糖酶的活力。以下詳細介紹本發(fā)明一種葡聚糖酶活力的測定方法，Α，制作用MBTH法測得的 葡萄糖吸光度值與其相應濃度的標準對應關系曲線；B，用MBTH法檢測待測β-葡聚糖酶水 解β _葡聚糖后產生的相當于葡萄糖的吸光度值；根據上一步驟制作的葡萄糖濃度與測得 的相應吸光度值之間的標準對應關系曲線確定待測β-葡聚糖酶的酶解產物中在單位時 間內所產生的相當于葡萄糖的還原糖的含量，以此來推算葡聚糖酶的活力。優(yōu)化地；上述步驟A的具體步驟是；作用MBTH法測得的葡萄糖吸光度值與其 相應濃度標準對應關系曲線；分別取6-15組不同濃度(0-30μ g/mL)的葡萄糖標準溶液 0. 6mL，加入0. 6mL0. 5當量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH試劑0. 6mL于75_85°C水浴加熱 5-20min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長620-680nm處測定葡萄糖的吸 光度值；每個濃度做三個平行樣；以上加量可按比例增減；根據每組葡萄糖濃度與測得的 相應吸光度值之間的關系繪制標準對應關系曲線；優(yōu)化地；上述步驟B的具體步驟是；用MBTH法檢測β -葡聚糖酶的活力；將濃度 為l_5mg/mL的預熱至測定溫度的β -葡聚糖溶液，加入至預熱至測定溫度的β _葡聚糖 酶溶液中進行酶解反應，測定溫度為25-40°C，水解時間為60min以內，取水解液迅速與等 體積的0. 5當量的NaOH溶液充分混勻以終止反應(可在反應過程中分時間段取樣檢測)， 取1. 2mL加入到試管中(做三個平行樣)，再加入MBTH試劑0. 6mL于75-85°C水浴加熱 5-20min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長620-680nm處測定吸光度值，以上加量可按比例增減。根據上一步驟制作的葡萄糖的濃度與測得的相應吸光度值之間的 標準對應關系曲線確定待測β-葡聚糖酶的活力；β-葡聚糖酶的活力單位可被定義為在 上述條件下，每毫升反應體系中，每分鐘產生Inmol相當于葡萄糖所需的酶量為一個酶活 力單位。其中MBTH試劑的制法是3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二 硫蘇糖醇溶液等體積混合即得，現用現配，一天內有效。優(yōu)化地；上述硫酸鐵銨試劑的制法是0. 5% (FeNH4(SO4)2) · 12Η20,0. 5%氨基磺酸，
0.5當量鹽酸。優(yōu)化地；上述β -葡聚糖以50mM的丁二酸緩沖溶液或醋酸緩沖溶液為溶劑。優(yōu)化地；上述測定吸光度值的最佳波長為650nm。本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明用MBTH法對β-葡聚糖酶水解β-葡聚糖后所產生的葡 萄糖端基的數量進行檢測以此來確定葡聚糖酶的活力；葡萄糖以及低聚葡聚糖是 β -葡聚糖酶水解的產物，因此對葡萄糖端基含量檢測的靈敏度直接決定著對β “葡聚糖 酶活力檢測的靈敏度。該方法比比濁法簡便、快速、準確、價廉。檢測限和工作濃度范圍都 明顯低于DNS法和鐵氰化鉀法，所以本方法的靈敏度明顯高于DNS法和鐵氰化鉀法。
具體實施例方式實施例1 主要儀器水浴恒溫振蕩器，SHZ-82型，國華電器有限公司；電熱恒溫水浴鍋， ΗΗ-4型，國華電器有限公司；數字酸度計，梅特勒-托利多公司；UV2100紫外分光光度計， 上海UNICO儀器有限公司；β-葡聚糖酶，寧夏和氏璧生物技術有限公司；β-葡聚糖，百特 純大分子科技有限公司；移液器，Finnpipette芬蘭雷勃。溶液配置MBTH顯色液3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫蘇糖醇溶 液等量混合即得，現用現配，一天內有效。葡萄糖標準溶液(30 μ g/mL)精確稱取干燥至恒質量的葡萄糖0. 3000g,用50mM pH5. 5的醋酸緩沖溶液溶解、轉移并定容至IOOmL,配成3. 00mg/mL的葡萄糖標準溶液；從中 取ImL葡萄糖溶液，轉移并定容至IOOmL,即得30 μ g/mL的葡萄糖標準溶液。硫酸鐵銨試劑的制法是0. 5% (FeNH4(SO4)2) · 12H20，0. 5%氨基磺酸，0. 5當量鹽酸。步驟A，制作用MBTH法測得的葡萄糖吸光度值與其相應濃度的標準對應關系曲 線.
一入 ，分別加入8組不同濃度的葡萄糖標準溶液0. 5mL,加入0. 5mL0. 5當量的NaOH溶 液，混勻，再加入MBTH試劑0. 5mL于80°C水浴加熱ll-13min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑lmL， 室溫冷卻后于波長650nm處測定葡萄糖的吸光度值；每個濃度做三個平行樣；根據每組葡 萄糖溶液濃度與測得的相應吸光度值之間的關系繪制標準對應關系曲線；B,用MBTH法檢測的β -葡聚糖酶活力；將5mL β -葡聚糖溶液其濃度為2mg/mL，pH值為5. 5，加入到錐形瓶中于30°C的水 浴搖床中預熱lOmin，加入待測的β-葡聚糖酶溶液5mL進行水解反應，為確定合適的待測 β-葡聚糖酶濃度可以將待測的β“葡聚糖酶溶液稀釋成不同濃度梯度逐個檢測，水解時間為60min以內，取水解液2mL (可在反應過程中分時間段取樣檢測)，迅速加入2mL 0. 5當 量的NaOH溶液中(做三個平行樣)，混勻，取ImL加入到試管中，再加入MBTH試劑0. 5mL于 80°C水浴加熱ll-13min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長650nm處測定 吸光度值，根據上一步驟制作的葡萄糖濃度與測得的相應吸光度值之間的標準對應關系曲 線確定待測的葡聚糖酶的酶解產物中所含有的相當于葡萄糖的還原糖的量。葡聚 糖酶的活力單位可被定義為在上述條件下，每毫升反應體系中每分鐘產生Inmol相當于葡 萄糖的量的酶量為一個酶活力單位，從而根據酶活力定義來推算木葡聚糖酶的活力。實施例2 主要儀器電熱恒溫水浴鍋，ΗΗ-4型，國華電器有限公司；數字酸度計，梅特勒-托利多公司；UV2100紫外-可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；葡 聚糖酶，武漢新華揚生物有限責任公司；葡聚糖，百特純大分子科技有限公司；移液器， Finnpipette芬蘭雷勃集團。溶液配置MBTH顯色液3mg/mL的3_甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫蘇糖醇溶 液等量混合即得，現用現配，一天內有效。葡萄糖標準溶液(30 μ g/mL)精確稱取干燥至恒質量的葡萄糖0. 3000g,用50mM pH4. 0的醋酸緩沖溶液溶解、轉移并定容至IOOmL,配成3. 00mg/mL的葡萄糖標準溶液；從中 取ImL葡萄糖溶液，如前法操作并定容至IOOmL,即得30 μ g/mL的葡萄糖標準溶液。硫酸鐵銨試劑的制法是0. 5% (FeNH4(SO4)2) · 12H20，0. 5%氨基磺酸，0. 5當量鹽酸。步驟A，制作用MBTH法測得的葡萄糖吸光度值與其相應濃度的標準對應關系曲 線.
一入 ，分別加入8組不同濃度的葡萄糖標準溶液lmL，加入ImL 0. 5當量的NaOH溶液，混 勻，再加入MBTH試劑ImL于80°C水浴加熱ll-13min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑2mL，室溫冷 卻后于波長650nm處測定葡萄糖的吸光度值；每個濃度做三個平行樣；根據每組葡萄糖溶 液濃度與測得的相應吸光度值之間的關系繪制標準對應關系曲線；B,用MBTH法檢測β -葡聚糖酶的活力；將0. 25mL β -葡聚糖溶液(其濃度為2mg/mL，pH值為5. 5)，加入試管中于30°C 的水浴鍋中預熱lOmin，加入待測的已預熱至30°C的β _葡聚糖酶溶液0. 25mL進行水解反 應，為確定合適的待測β-葡聚糖酶濃度可以將待測的β-葡聚糖酶溶液稀釋成不同濃度 梯度逐個檢測，水解時間為30分鐘，迅速加入0. 5mL 0. 5當量的NaOH溶液充分混勻以終止 反應，加入0. 5mL MBTH試劑，充分混勻，于80°C水浴加熱后趁熱加入硫酸鐵銨試劑lmL，室 溫冷卻后于波長650nm處測定吸光度值，如法做三個平行樣，根據上一步驟制作的葡萄糖 濃度與測得的相應吸光度值之間的標準對應關系曲線確定待測的β“葡聚糖酶的酶解產 物中所含有的相當于葡萄糖的還原糖的量。β“葡聚糖酶的活力單位可被定義為在上述條 件下，每毫升反應體系中每分鐘產生Inmol相當于葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位， 從而根據酶活力定義來推算木葡聚糖酶的活力。當然，上述說明并非是對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述操作，所有在本發(fā) 明的實質范圍內作出的變化、改型、添加或替換，都應屬于本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
一種β-葡聚糖酶活力的測定方法，其特征是；A，制作用MBTH法測得的葡萄糖的吸光度值與其相應濃度的標準對應關系曲線；B，用MBTH法檢測待測β-葡聚糖酶水解β-葡聚糖后產生的相當于葡萄糖的吸光度值；根據上一步驟制作的葡萄糖濃度與測得的相應的吸光度值之間的標準對應關系曲線確定待測β-葡聚糖酶的酶解產物中在單位時間內所產生的相當于葡萄糖的還原糖的含量，以此來推算β-葡聚糖酶的活力。
2.根據權利要求1所述的葡聚糖酶活力的測定方法，其特征是；上述步驟A的具 體步驟是；分別取6-15組具有不同濃度的葡萄糖標準溶液0. 6mL,濃度范圍在0_30微克/ 毫升之間，加入0. 6mL 0. 5當量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH試劑0. 6mL于75_85°C水浴 加熱8-20min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長620-680nm處測定吸光度 值；每個濃度做三個平行樣；以上加量可按比例增減；根據每組葡萄糖濃度與測得的吸光 度值之間的關系繪制標準對應關系曲線；
3.根據權利要求1或2所述的葡聚糖酶活力的測定方法，其特征是；上述步驟B 的具體步驟是；將終濃度為l_5mg/mL的預熱至測定溫度的β _葡聚糖溶液，加入到預熱至 相應溫度的β “葡聚糖酶溶液中開始水解反應，酶解溫度為25-40°C，水解時間為60min以 內，將該酶解液與等體積的0. 5當量的NaOH溶液迅速混合以終止反應，可在反應過程中分 階段取樣，從中取1. 2mL加入到試管中做三個平行樣，再加入MBTH試劑0. 6mL于75_85°C水 浴加熱5-20min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1. 2mL,室溫冷卻后于波長620-680nm處測定吸光 度值，根據步驟A制作的葡萄糖濃度與測得的相應吸光度值之間的標準對應關系曲線確定 酶解產物中所含有的相當于葡萄糖的還原糖濃度，以此來推算β-葡聚糖酶的活力；β-葡 聚糖酶的活力單位可被定義為在上述條件下，每毫升反應體系每分鐘產生Inmol相當于葡 萄糖的量所需的酶量為一個酶活力單位；其中MBTH試劑的制法是3mg/mL的3-甲基-2-苯 并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫蘇糖醇溶液等體積混合即得，現用現配，一天內有效。
4.根據權利要求3所述的葡聚糖酶活力的測定方法，其特征是；上述硫酸鐵銨試 劑的制法是0. 5% FeNH4(SO4)2 · 12Η20，0. 5%氨基磺酸，0. 5當量鹽酸。
5.根據權利要求3所述的葡聚糖酶活力的測定方法，其特征是；上述葡聚糖 酶溶液以50mM的丁二酸或醋酸溶液為溶劑。
6.根據權利要求3所述的葡聚糖酶活力的測定方法，其特征是；上述測定吸光度 值的最佳波長為650nm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種β-葡聚糖酶活力的測定方法，A，制作用MBTH法測得的葡萄糖吸光度值與其相應濃度的標準對應關系曲線；B，用MBTH法檢測待測β-葡聚糖酶水解β-葡聚糖后產生的相當于葡萄糖的吸光度值；根據上一步驟制作的葡萄糖濃度與測得的相應吸光度值之間的標準對應關系曲線確定待測β-葡聚糖酶的酶解產物中在單位時間內所產生的相當于葡萄糖的還原糖的含量，以此來推算β-葡聚糖酶的活力。該方法測定葡萄糖的檢測限和工作濃度范圍都明顯低于DNS法、鐵氰化鉀法和Somogyi-Nelson，所以本方法的靈敏度明顯高于這三種方法，而且，采用本方法使底物β-葡聚糖的用量大大降低，因此可大大降低實驗成本。
文檔編號G01N21/31GK101819138SQ201010144060
公開日2010年9月1日 申請日期2010年4月12日 優(yōu)先權日2010年4月12日
發(fā)明者葉慶國, 張 杰, 張永勤, 張洪妮, 曾凡偉, 王哲平, 王斐 申請人:青島科技大學