專利名稱：動物源性食品中重氮氨苯脒免疫學快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物源性食品中藥物殘留的檢測方法，具體是一種動物源性食品中重 氮氨苯脒免疫學快速檢測方法。
背景技術(shù)：
重氮氨苯脒(Diminazene)，是一種抗寄生蟲藥物，該藥早在1994年6月已經(jīng)被 FA0/WH0列入需要檢測殘留的獸藥列表中，我國農(nóng)業(yè)部于2002年12月24日發(fā)布《第235 號公告》，規(guī)定了該藥的最高殘留限量(同F(xiàn)A0/WH0)；同時，該藥已被列入日本獸藥殘留“肯 定列表”中。重氮氨苯脒的檢測目前已經(jīng)有薄層色譜方法、高效液相色譜方法等方法進行檢 測，在樣品的確證分析中有較好的檢測效果，但同時需要配備價格昂貴的儀器并優(yōu)化各種 藥物測定參數(shù)，操作較為復雜，且這些方法或者需要時間長、價格貴，靈敏度低，或者樣品處 理工作量大，或者廢棄物處理困難，不太適合基層對大量樣品的快速檢驗。免疫學快速檢測 (ELISA)法檢測重氮氨苯脒目前國內(nèi)外未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種操作簡便、測量準確、靈敏度高、成本低 廉的動物源性食品中重氮氨苯脒免疫學快速檢測方法。本發(fā)明的方法包括以下步驟a.將牛奶或者動物的肉類或內(nèi)臟樣品制備成用于檢測的樣液；其中牛奶樣液的制備方法是將牛奶樣品置于離心管中，在4°C下15000轉(zhuǎn)/分鐘 離心10分鐘，取上清液，即為樣液；動物肉類或內(nèi)臟樣液的制備方法是將動物肉類或內(nèi)臟樣品充分磨細備用，在1 重量份磨細的樣品中加入2重量份體積濃度5%的甲醇0. 01moL/L PH6. 74PBS溶液，然后超 聲提取15分鐘，在4°C下4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液；同法再對殘渣進行一次提 取，合并兩次提取液，置于容器中；將裝有提取液的容器置于100°C水浴中煮沸1分鐘，過濾 后用體積濃度5%的甲醇0. 01moL/L PH6. 74PBS溶液定容至10重量份作為樣液；b.制備抗血清，其方法依次經(jīng)過以下步驟(1)制備重氮氨苯脒基礎(chǔ)反應(yīng)液體，其 步驟是將0. 05重量份重氮氨苯脒溶于2重量份蒸餾水獲得的重氮氨苯脒溶液、1重量份鹽 酸lmoL/L、0. 05重量份硝酸鈉溶于2重量份蒸餾水獲得的溶液在室溫下攪拌反應(yīng)Ih后， 加入0. 02重量份氨基磺酸銨溶于200重量份蒸餾水而獲得的氨基磺酸銨溶液，反應(yīng)IOmin 終止反應(yīng)，獲得重氮氨苯脒基礎(chǔ)反應(yīng)液體；(2)將0. 05重量份牛血清白蛋白溶于2重量份 0. ImoL/L PH9. 1碳酸鹽緩沖液獲得的溶液加入前一步驟獲得的所有重氮氨苯脒基礎(chǔ)反應(yīng) 液體，再加入3moL/L的NaOH調(diào)節(jié)PH值至7. 5-8左右，室溫攪拌12h ； (3)將前一步驟獲得 的反應(yīng)液10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘；上清液用蒸餾水4°C透析6次，每次8小時過G50 柱；用聚乙二醇2000濃縮至過柱前體積；紫外可見光分光分度計掃描后，作為免疫原；(4)選用臨床健康，體重1. 5-2kg的新西蘭雄性兔，注射上述免疫原；第一次免疫用1重量份弗 氏完全佐劑加1重量份免疫原皮下或皮內(nèi)多點注射，此后每間隔四周用1重量份弗氏不完 全佐劑加1重量份免疫原皮下或皮內(nèi)多點注射，前后共5次，最后一次免疫后10天宰殺，采 血，分離血清；C.制備已包被的酶標條，制備方法依次經(jīng)過以下步驟(1)包被抗原的制備，方法 是，取0. 05重量份重氮氨苯脒溶于1重量份蒸餾水獲得的重氮氨苯脒溶液、0. 025重量份卵 清白蛋白溶于0. 5重量份蒸餾水獲得的卵清白蛋白溶液、0. 025重量份碳二亞胺鹽酸鹽溶 于0. 5重量份蒸餾水獲得的碳二亞胺鹽酸鹽溶液、0. 0025重量份N-羥基琥珀酰亞胺溶于 0. 1重量份二甲亞楓 獲得的N-羥基琥珀酰亞胺溶液；室溫攪拌反應(yīng)12h后，將反應(yīng)液10000 轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘；上清液樣用蒸餾水4°C透析6次，每次8小時；過G25柱，用聚乙二 醇2000濃縮調(diào)整至過柱前體積，作為包被抗原；(2)酶標條的包被處理，方法是取空白酶 標條，每孔加入包被抗原與0. ImoL/L PH9. 1碳酸鹽緩沖液體積比為1 400的包被抗原溶 液0. 1體積份，置4°C 12h或置37 °C 2h，用0. 01moL/LPH6. 74PBST洗滌液清洗三次，每次三 分鐘，甩干拍凈后，加入0. 2體積份lmg/mL的卵清白蛋白0. 0ImoL/L PH6. 74PBS溶液，37°C 濕盒內(nèi)反應(yīng)0. 5h后甩干拍凈。d.對樣液進行檢測，其方法是吸取0. 1重量份樣液加入到空白的酶標條中，再加 入0. 1重量份抗血清與0. 0ImoL/L PH6. 74PBS重量比為1 1500的溶液，振蕩混和均勻后 置37°C濕盒放置30min，然后在上述已包被的酶標條中每孔加入0. 1重量份反應(yīng)液，37°C濕 盒內(nèi)反應(yīng)1. 5h后，每孔加0. 2重量份PBST清洗3次，每次間隔3分鐘；再每孔加入羊抗兔 HRP-IgG與0. 0ImoL/L PH6. 74PBS重量比為1 5000的溶液0. 1重量份，置37°C反應(yīng)Ih 后拍干洗凈；然后加入0. 1重量份lmg/mL四甲基鄰苯氨(TMB)的二甲基亞楓溶液，于37°C 濕盒反應(yīng)IOmin分鐘，再加0. 05重量份的2moL/L硫酸終止液靜置5min后，在酶聯(lián)免疫檢 測儀上讀取吸光度值(0D值)；依據(jù)標準濃度重氮氨苯脒吸光度值(0D值)的梯度變化，繪 制重氮氨苯脒抑制標準曲線；每個樣品做4孔，按Iogit-Iog法作圖，計算重氮氨苯脒含量； 根據(jù)各孔的值進行數(shù)理統(tǒng)計，求其平均值，如果樣品為牛奶，則可直接作為檢測結(jié)果，如果 樣品為動物肉類或內(nèi)臟，則需將平均值擴大10倍后作為檢測結(jié)果。本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在1.該方法檢測線性范圍為500ng-4. 2ng/g (ml)，檢測底線為4. 2ng/ml，，線性相關(guān) 系數(shù)大于0. 99，該方法的重復性測定的變異系數(shù)為5. 7%，該方法除對結(jié)構(gòu)相似的戊烷脒 有50%的交叉反應(yīng)，對其他4種結(jié)構(gòu)和功能相似的物質(zhì)基本無交叉反應(yīng)。2.試驗篩選出牛奶、牛肉、牛腎、牛肝以及豬肉中重氮氨苯脒的簡便樣品前處理方 法，基本消除基質(zhì)影響，有利于基層單位的使用。3.操作簡便，2-3小時即可完成20-30份樣品的測定，大大提高檢測效率。4.該方法檢測牛奶平均回收率為89%、牛肉平均回收率為82%、牛腎平均回收率 為77%。牛肝平均回收率為88%、豬肉平均回收率為90%.5.該方法在37°C穩(wěn)定放置7天，4°C放置3個月后，線性關(guān)系良好，有利于試劑盒 的運輸、攜帶和、貯存。
具體實施例方式本發(fā)明的實施例包括以下步驟a.將牛奶或者動物的肉類或內(nèi)臟樣品制備成用于檢測的樣液；其中牛奶樣液的制備方法是將牛奶樣品置于離心管中，在4°C下15000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液，即為樣液；動物肉類或內(nèi)臟樣液的制備方法是將動物肉類或內(nèi)臟樣品充分磨細備用，在1 重量份磨細的樣品中加入2重量份體積濃度5%的甲醇0. 01moL/L PH6. 74PBS溶液，然后超 聲提取15分鐘，在4°C下4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液；同法再對殘渣進行一次提 取，合并兩次提取液，置于容器中；將裝有提取液的容器置于100°C水浴中煮沸1分鐘，過濾 后用體積濃度5%的甲醇0. 01moL/L PH6. 74PBS溶液定容至10重量份作為樣液；b.制備抗血清，其方法依次經(jīng)過以下步驟(1)制備重氮氨苯脒基礎(chǔ)反應(yīng)液體，其 步驟是將0. 05重量份重氮氨苯脒溶于2重量份蒸餾水獲得的重氮氨苯脒溶液、1重量份鹽 酸lmoL/L、0. 05重量份硝酸鈉溶于2重量份蒸餾水獲得的溶液在室溫下攪拌反應(yīng)Ih后， 加入0. 02重量份氨基磺酸銨溶于200重量份蒸餾水而獲得的氨基磺酸銨溶液，反應(yīng)IOmin 終止反應(yīng)，獲得重氮氨苯脒基礎(chǔ)反應(yīng)液體；(2)將0. 05重量份牛血清白蛋白溶于2重量份 0. ImoL/L PH9. 1碳酸鹽緩沖液獲得的溶液加入前一步驟獲得的所有重氮氨苯脒基礎(chǔ)反應(yīng) 液體，再加入3moL/L的NaOH調(diào)節(jié)PH值至7. 5-8左右，室溫攪拌12h ； (3)將前一步驟獲得 的反應(yīng)液10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘；上清液用蒸餾水4°C透析6次，每次8小時；過G50 柱；用聚乙二醇2000濃縮至過柱前體積；紫外可見光分光分度計掃描后，作為免疫原；(4) 選用臨床健康，體重1. 5-2kg的新西蘭雄性兔，注射上述免疫原；第一次免疫用1重量份弗 氏完全佐劑加1重量份免疫原皮下或皮內(nèi)多點注射，此后每間隔四周用1重量份弗氏不完 全佐劑加1重量份免疫原皮下或皮內(nèi)多點注射，前后共5次，最后一次免疫后10天宰殺，采 血，分離血清；c.制備已包被的酶標條，制備方法依次經(jīng)過以下步驟(1)包被抗原的制備，方法 是，取0. 05重量份重氮氨苯脒溶于1重量份蒸餾水獲得的重氮氨苯脒溶液、0. 025重量份卵 清白蛋白溶于0. 5重量份蒸餾水獲得的卵清白蛋白溶液、0. 025重量份碳二亞銨溶于0. 5重 量份蒸餾水獲得的碳二亞銨溶液、0. 0025重量份N-羥基琥珀酰亞胺溶于0. 1重量份二甲亞 楓獲得的N-羥基琥珀酰亞胺溶液；室溫攪拌反應(yīng)12h后，將反應(yīng)液10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10 分鐘；上清液樣用蒸餾水4°C透析6次，每次8小時；過G25柱，用聚乙二醇2000濃縮至過柱 前體積，作為包被抗原；(2)酶標條的包被處理，方法是，取空白酶標條，每孔加入包被抗原與 0. ImoL/L PH9. 1碳酸鹽緩沖液重量比為1 400的包被抗原溶液0. 1重量份，置4°C 12h或 置37°C 2h，用0. 0ImoL/L PH6. 74PBST洗滌液清洗三次，每次三分鐘，甩干拍凈后，加入0. 2體 積份lmg/mL的卵清白蛋白0. 0ImoL/L PH6. 74PBS溶液，37°C濕盒內(nèi)反應(yīng)0. 5h后甩干拍凈。d.對樣液進行檢測，其方法是吸取0. 1重量份樣液加入到空白的酶標條中，再加 入0. 1重量份抗血清與0. 0ImoL/L PH6. 74PBS重量比為1 1500的溶液，振蕩混和均勻后 置37°C濕盒放置30min，然后在上述已包被的酶標條中每孔加入0. 1重量份反應(yīng)液，37°C濕 盒內(nèi)反應(yīng)1. 5h后，每孔加0. 2重量份PBST清洗3次，每次間隔3分鐘；再每孔加入羊抗兔 HRP-IgG與0. 01moL/LPH6. 74PBS重量比為1 5000的溶液0. 1重量份，置37°C反應(yīng)Ih后 拍干洗凈；然后加入0. 1重量份lmg/mL四甲基鄰苯氨(TMB)的二甲基亞楓溶液，于37°C濕盒反應(yīng)IOmin分鐘，再加O. 05重量份的2moL/L硫酸終止液靜置5min后，在酶聯(lián)免疫檢測儀上讀取吸光度值(OD值)；依據(jù)標準濃度重氮氨苯脒吸光度值(OD值)的梯度變化，繪制 重氮氨苯脒抑制標準曲線；每個樣品做4孔，按Iogit-Iog法作圖，計算重氮氨苯脒含量； 根據(jù)各孔的值進行數(shù)理統(tǒng)計，取其平均值，如果樣品為牛奶，則可直接作為檢測結(jié)果，如果 樣品為動物肉類或內(nèi)臟，則需將平均值擴大10倍后作為檢測結(jié)果。
權(quán)利要求
一種動物源性食品中重氮氨苯脒免疫學快速檢測方法，其特征是該方法包括以下步驟，a.將牛奶或者動物的肉類或內(nèi)臟樣品制備成用于檢測的樣液；其中牛奶樣液的制備方法是將牛奶樣品置于離心管中，在4℃下15000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液，即為樣液；動物肉類或內(nèi)臟樣液的制備方法是將動物肉類或內(nèi)臟樣品充分磨細備用，在1重量份磨細的樣品中加入2重量份體積濃度5％的甲醇0.01moL/L PH6.74PBS溶液，然后超聲提取15分鐘，在4℃下4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液；同法再對殘渣進行一次提取，合并兩次提取液，置于容器中；將裝有提取液的容器置于100℃水浴中煮沸1分鐘，過濾后用體積濃度5％的甲醇0.01moL/L PH6.74PBS溶液定容至10重量份作為樣液；b.制備抗血清，其方法依次經(jīng)過以下步驟(1)制備重氮氨苯脒基礎(chǔ)反應(yīng)液體，其步驟是將0.05重量份重氮氨苯脒溶于2重量份蒸餾水獲得的重氮氨苯脒溶液、1重量份鹽酸1moL/L、0.05重量份硝酸鈉溶于2重量份蒸餾水獲得的溶液在室溫下攪拌反應(yīng)1h后，加入0.02重量份氨基磺酸銨溶于200重量份蒸餾水而獲得的氨基磺酸銨溶液，反應(yīng)10min終止反應(yīng)，獲得重氮氨苯脒基礎(chǔ)反應(yīng)液體；(2)將0.05重量份牛血清白蛋白溶于2重量份0.1moL/L PH9.1碳酸鹽緩沖液獲得的溶液加入前一步驟獲得的所有重氮氨苯脒基礎(chǔ)反應(yīng)液體，再加入3moL/L的NaOH調(diào)節(jié)PH值至7.5-8左右，室溫攪拌12h；(3)將前一步驟獲得的反應(yīng)液10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘；上清液用蒸餾水4℃透析6次，每次8小時；過G50柱；用聚乙二醇2000濃縮至過柱前體積；紫外可見光分光分度計掃描后，作為免疫原；(4)選用臨床健康，體重1.5-2kg的新西蘭雄性兔，注射上述免疫原；第一次免疫用1重量份弗氏完全佐劑加1重量份免疫原皮下或皮內(nèi)多點注射，此后每間隔四周用1重量份弗氏不完全佐劑加1重量份免疫原皮下或皮內(nèi)多點注射，前后共5次，最后一次免疫后10天宰殺，采血，分離血清；c.制備已包被的酶標條，制備方法依次經(jīng)過以下步驟(1)包被抗原的制備，方法是，取0.05重量份重氮氨苯脒溶于1重量份蒸餾水獲得的重氮氨苯脒溶液、0.025重量份卵清白蛋白溶于0.5重量份蒸餾水獲得的卵清白蛋白溶液、0.025重量份碳二亞胺鹽酸鹽溶于0.5重量份蒸餾水獲得的碳二亞胺鹽酸鹽溶液、0.0025重量份N-羥基琥珀酰亞胺溶于0.1重量份二甲亞楓獲得的N-羥基琥珀酰亞胺溶液；室溫攪拌反應(yīng)12h后，將反應(yīng)液10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘；上清液樣用蒸餾水4℃透析6次，每次8小時；過G25柱，用聚乙二醇2000濃縮調(diào)整至過柱前體積，作為包被抗原；(2)酶標條的包被處理，方法是取空白酶標條，每孔加入包被抗原與0.1moL/L PH9.1碳酸鹽緩沖液體積比為1∶400的包被抗原溶液0.1體積份，置4℃12h或置37℃2h，用0.01moL/L PH6.74PBST洗滌液清洗三次，每次三分鐘，甩干拍凈后，加入0.2體積份1mg/mL的卵清白蛋白0.01moL/L PH6.74PBS溶液，37℃濕盒內(nèi)反應(yīng)0.5h后甩干拍凈。d.對樣液進行檢測，其方法是吸取0.1重量份樣液加入到空白的酶標條中，再加入0.1重量份抗血清與0.01moL/L PH6.74PBS重量比為1∶1500的溶液，振蕩混和均勻后置37℃濕盒放置30min，然后在上述已包被的酶標條中每孔加入0.1重量份反應(yīng)液，37℃濕盒內(nèi)反應(yīng)1.5h后，每孔加0.2重量份PBST清洗3次，每次間隔3分鐘；再每孔加入羊抗兔HRP-IgG與0.01moL/L PH6.74PBS重量比為1∶5000的溶液0.1重量份，置37℃反應(yīng)1h后拍干洗凈；然后加入0.1重量份1mg/mL四甲基鄰苯氨(TMB)的二甲基亞楓溶液，于37℃濕盒反應(yīng)10min分鐘，再加0.05重量份的2moL/L硫酸終止液靜置5min后，在酶聯(lián)免疫檢測儀上讀取吸光度值(OD值)；依據(jù)標準濃度重氮氨苯脒吸光度值(OD值)的梯度變化，繪制重氮氨苯脒抑制標準曲線；每個樣品做4孔，按logit-log法作圖，計算重氮氨苯脒含量；根據(jù)各孔的值進行數(shù)理統(tǒng)計，求其平均值，如果樣品為牛奶，則可直接作為檢測結(jié)果，如果樣品為動物肉類或內(nèi)臟，則需將平均值擴大10倍后作為檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及動物源性食品中藥物殘留的檢測方法，具體是一種動物源性食品中重氮氨苯脒免疫學快速檢測方法。該方法將樣液加入到空白的酶標條中，再加入抗血清溶液，振蕩混和均勻后置37℃濕盒，然后吸取反應(yīng)液加入到已包被的酶標條中，37℃濕盒內(nèi)反應(yīng)，PBST清洗；再每孔加入羊抗兔HRP-IgG溶液置37℃反應(yīng)；然后加入底物溶液TMB，于37℃濕盒反應(yīng)10min分鐘，再加2moL/L硫酸終止液靜置后，在酶聯(lián)免疫檢測儀上讀取吸光度值；依據(jù)標準濃度重氮氨苯脒吸光度值的梯度變化，繪制重氮氨苯脒抑制標準曲線；每個樣品做4孔，按logit-log法作圖，計算重氮氨苯脒含量。本發(fā)明方法操作簡便、測量準確、靈敏度高、成本低廉。
文檔編號G01N33/543GK101813696SQ20101014230
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日
發(fā)明者周洪斌, 朱金連, 李平, 肖震 申請人:鎮(zhèn)江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術(shù)中心