癌癥免疫治療的制作方法
【專利摘要】我們將多種TLR激動(dòng)劑配制入GVAX(工程化以分泌GM-CSF的經(jīng)致死性輻照的腫瘤細(xì)胞疫苗)。特別地，將在患者中發(fā)現(xiàn)是安全的GLA和R848、TLR4和TLR7/8激動(dòng)劑與GVAX配制(TEGVAX–代表TLR激動(dòng)劑增強(qiáng)的GVAX)，且該制劑在3種不同的臨床前模型包括可觸知的B16中有效產(chǎn)生抗腫瘤應(yīng)答。與對(duì)照相比，用TEGVAX治療的小鼠中這些抗腫瘤應(yīng)答與增加的能夠分泌在腫瘤微環(huán)境中循環(huán)的IFN的CD4和CD8T細(xì)胞，以及與顯著較高水平的p15E特異性CTL介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷相關(guān)。當(dāng)與抗-PD-1抗體組合時(shí)，TEGVAX能夠誘導(dǎo)建立的B16腫瘤的消退。
【專利說(shuō)明】癌癥免疫治療
[0001]本發(fā)明在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)的支持下完成。因此，根據(jù)基金號(hào)NIH K23-DE018464-02的條款，美國(guó)政府保留某些權(quán)利。
[0002]發(fā)明【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及癌癥治療領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及癌癥免疫治療。
[0004]發(fā)明背景
[0005]由于其在多種腫瘤類型中的安全性和可用性的廣泛歷史，被工程化以分泌GM-CSF的致死性輻照的腫瘤細(xì)胞疫苗(GVAX)是一種具有用于與免疫檢查點(diǎn)阻斷劑(blockade)抗體的組合治療的潛力的疫苗平臺(tái)。然而，由GVAX分泌的局部GM-CSF可以動(dòng)員髓樣前體細(xì)胞(myeloid precursor)成為巨曬細(xì)胞和樹突細(xì)胞,但這種細(xì)胞因子可能不會(huì)誘導(dǎo)它們的激活。因此，GVAX的主要限制是在免疫系統(tǒng)的傳入臂(afferent arm)中最佳腫瘤抗原呈遞必需的抗原呈遞細(xì)胞(APC)的激活。表型模擬(phenocopy)見(jiàn)于針對(duì)感染因子(infectiousagent)的疫苗中的穩(wěn)固免疫應(yīng)答的一個(gè)簡(jiǎn)單策略是，將多種TLR激動(dòng)劑與基于癌細(xì)胞的疫苗組合。在臨床上，已經(jīng)開發(fā)了用于癌癥患者的多種佐劑以增強(qiáng)癌癥疫苗的效價(jià)，并且這些佐劑中的許多典型地是TLR激動(dòng)劑。
[0006]關(guān)于非靶向TLR刺激的一種真正顧慮是腫瘤細(xì)胞中慢性TLR刺激的促癌癥發(fā)生結(jié)果(procarcinogenic consequence)。腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的TLR4受體的刺激已顯示促進(jìn)腫瘤發(fā)生。然而，造血區(qū)室(hematopoietic compartment)中的TLR信號(hào)傳導(dǎo)已顯示引起抗腫瘤應(yīng)答，其已被轉(zhuǎn)化為(translate into)多個(gè)臨床試驗(yàn)。為了祀向腫瘤微環(huán)境中的樹突細(xì)胞并測(cè)試腫瘤微環(huán)境中的TLR4刺激是否能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)促癌癥發(fā)生效應(yīng)，我們團(tuán)隊(duì)瘤內(nèi)注射了 LPS配制的GVAX，并發(fā)現(xiàn)TLR4配體吸附的GVAX(TLR4ligand absorbed GVAX)的瘤內(nèi)注射改善了三種不同的鼠(murine)模型中的體內(nèi)局部抗腫瘤應(yīng)答。
[0007]本領(lǐng)域?qū)Λ@得更安全和更有效的腫瘤治療存在持續(xù)性需求。
[0008]發(fā)明概述
[0009]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了可被用于治療癌癥患者的組合物。該組合物包括(a)表達(dá)細(xì)胞因子的、無(wú)增殖能力的(proliferation incompetent)、全癌細(xì)胞(wholecancer cell) ； (b)與人程序性死亡 I (Programmed Deathl, PD-1)特異性結(jié)合的抗-PD-1抗體；及(c)TLR(toll樣受體)激動(dòng)劑；其中用TLR激動(dòng)劑配制該全癌細(xì)胞。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種方法。向癌癥患者施用劑(agent)。該劑是:
(a)表達(dá)細(xì)胞因子的、無(wú)增殖能力的、全癌細(xì)胞；(b)與人程序性死亡I (PD-1)特異性結(jié)合的抗-PD-1抗體；及(c) TLR(toll樣受體)激動(dòng)劑；其中用TLR激動(dòng)劑配制該全癌細(xì)胞。用TLR激動(dòng)劑配制該全癌細(xì)胞。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種試劑盒，其包括以下劑:(a)表達(dá)細(xì)胞因子的、無(wú)增殖能力的、全癌細(xì)胞；(b)與人程序性死亡I (PD-1)特異性結(jié)合的抗-PD-1抗體；及(c)TLR(toll樣受體)激動(dòng)劑；其中用TLR激動(dòng)劑配制該全癌細(xì)胞。任選地，用TLR激動(dòng)劑配制該全癌細(xì)胞。
[0012] 這些實(shí)施方案和當(dāng)閱讀本說(shuō)明書時(shí)將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的其它實(shí)施方案，提供了技術(shù)。
[0013]附圖簡(jiǎn)述
[0014] 圖1A-1D.TEGVAX可增加引流淋巴結(jié)中激活的類漿細(xì)胞DC(pDC)和常規(guī)DC(cDC)。圖1A.從疫苗注射后第3天,在非荷瘤小鼠(non-tumor bearing mice)中，定量來(lái)自疫苗引流 LN 的 pDC 和 cDC 門控群體(gated population)的 CD86。IDC-1005 是 10% (w/v)角S烯水包油媒介物(vehicle)中的GLA和R848，且TEGVAX是用輻照的GVAX配制的IDC-1005。圖1B.相比GVAX，在疫苗注射后第3天，TEGVAX誘導(dǎo)增加的來(lái)自引流淋巴結(jié)的pDC上的⑶86和⑶80激活標(biāo)志物(*P〈0.05)。圖1C.相比GVAX，在疫苗注射后第3天，TEGVAX具有增加的來(lái)自引流淋巴結(jié)的cDC上的⑶86和⑶80激活標(biāo)志物(*P〈0.05)。圖1D.從用TEGVAX或GVAX注射后第3至7天，來(lái)自DLN的CD86+pDC和cDC。
[0015]圖2A-2D.相比GVAX，TEGVAX在多種動(dòng)物模型中誘導(dǎo)顯著的體內(nèi)抗腫瘤應(yīng)答。所有這些體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)都代表至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，且所有實(shí)驗(yàn)中每一組都由10只小鼠/組構(gòu)成。圖2A.用GVAX、TEGVAX(GVAX/IDC-1005)、和IDC-1005在對(duì)側(cè)肢中治療患有可觸知(palpable)的B16黑素瘤的小鼠，且每天測(cè)量腫瘤體積。IDC-1005是在10% (w/v)角鯊烯水包油乳劑中的GLA和R848。圖2B.在第7天、第14天和第28天(箭頭)，用疫苗和TLR激動(dòng)劑的多次注射治療可觸知的B16黑素瘤。圖2C.用IO6SCCFVn-GVAX在對(duì)側(cè)肢中治療可觸知的SCCFVII舌癌，并每天測(cè)量腫瘤。用TEGVAX治療的C3H/He0UJ小鼠消退，并且分別在第22天和第27天在不同的部位(箭頭)用30^￥115\104和1\105再攻擊這些小鼠(*P〈0.05 ;**P〈0.01)。在這些再攻擊的部位無(wú)腫瘤生長(zhǎng)。圖2D.用TEGVAX (GVAX和IDC-1005的I小時(shí)孵育)對(duì)比未孵育的GVAX和IDC-1005混合物進(jìn)行B16治療試驗(yàn)。相比未孵育組，孵育組具有顯著的抗腫瘤作用(*p〈0.05)。
[0016]圖3A-3D.TEGVAX治療增加了腫瘤壞死及腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞和APC。圖3A.收集來(lái)自每個(gè)治療組的B16腫瘤組織并用H&E染色。TEGVAX治療的腫瘤顯示增加的壞死灶數(shù)目(畫圓圈區(qū)域，20x)。圖3B.在20x放大倍率下，在10個(gè)獨(dú)立區(qū)域中定量用TEGVAX和GVAX治療的腫瘤組織中的壞死灶(**P〈0.01)。圖3C.每個(gè)治療組中冷凍的腫瘤組織用aCD4和a⑶8FITC綴合物染色，并用DAPI復(fù)染。在腫瘤微環(huán)境的腫瘤組織中，TEGVAX治療的B16黑素瘤具有增加的CD4和CD8細(xì)胞的浸潤(rùn)。圖3D.用免疫熒光顯微鏡在10個(gè)不同的視場(chǎng)隨機(jī)計(jì)數(shù)腫瘤浸潤(rùn)性⑶4、⑶8、和⑶86細(xì)胞。相比GVAX和IDC-1005治療的腫瘤，TEGVAX治療的B16腫瘤具有顯著增加的浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(*P〈0.05 ;**P〈0.01)。
[0017]圖4A-4D.TEGVAX誘導(dǎo)腫瘤中的ThI應(yīng)答，以及B7-H1表達(dá)的上調(diào)。圖4A.從治療的小鼠收集腫瘤引流淋巴結(jié)，并進(jìn)行來(lái)自CD4和CD8群體二者的IFNy的細(xì)胞內(nèi)染色。圖4B.定量了每個(gè)治療組中⑶4+IFN Y +和⑶8+IFN Y +的平均熒光強(qiáng)度。圖4C.收集治療的腫瘤組織，并用大鼠抗-小鼠B7-H1抗體染色，且抗-大鼠Cy3綴合物被用于評(píng)價(jià)B7-H1陽(yáng)性細(xì)胞。在40x放大倍率下，在10個(gè)不同的視場(chǎng)中進(jìn)行盲定量，并概述在圖4D.中。
[0018]圖5A-5D.TEGVAX的體內(nèi)抗腫瘤應(yīng)答是⑶4和⑶8T細(xì)胞二者依賴性的。圖5A.在疫苗治療期間，GKl.5 (⑶4耗竭)和2.43(⑶8耗竭)抗體二者被腹腔內(nèi)注射。圖5B.在TEGVAX和對(duì)照治療試驗(yàn)中，⑶4、⑶8細(xì)胞被分別耗竭。圖5C.Rag2_/_小鼠中TEGVAX的抗腫瘤應(yīng)答被消除。圖MyD88-/-和TRIF-/-雙敲除小鼠中，TEGVAX的抗腫瘤應(yīng)答被消除。在這些TLR信號(hào)傳導(dǎo)缺陷小鼠中，TEGVAX的體內(nèi)效應(yīng)與GVAX是相同的(**P〈0.01)。[0019]圖6A-B.TEGVAX治療的小鼠具有增加的腫瘤特異性CTL細(xì)胞的數(shù)目。在用疫苗和佐劑治療的B16荷瘤小鼠中進(jìn)行用P15E肽的體內(nèi)CTL和ELISP0T試驗(yàn)。圖6A.在來(lái)自每個(gè)治療組的疫苗治療后第25天進(jìn)行體內(nèi)CTL試驗(yàn)。使用下式計(jì)算P15E肽特異性殺傷:(l-CFSEft% /CFSE% ) XlOO0圖6Β.在第23天，來(lái)自每個(gè)治療組的脾細(xì)胞的ELISP0T試驗(yàn)。Ρ15Ε 肽脈沖進(jìn)入 T2kb APC (**Ρ〈0.01)。
[0020]圖7A-7C.TEGVAX/抗-PD-1治療可誘導(dǎo)建立的B16腫瘤的消退。圖7A.右圖顯示用疫苗和抗-PD-1的各種組合治療的建立的B16腫瘤的腫瘤生長(zhǎng)速率。圖7B.左圖顯示兩只小鼠-右邊的小鼠是用TEGVAX/抗-PD-1治療的小鼠之一，左邊的小鼠是用GVAX治療的小鼠之一。TEGVAX治療的小鼠沒(méi)有顯示任何消退。圓圈顯示腫瘤接種部位。箭頭顯示白癜風(fēng)的部位。圖7C.收集腫瘤引流淋巴結(jié)并定量來(lái)自⑶4、⑶8、和⑶llc+DC細(xì)胞的THl細(xì)胞因子。
[0021]圖8(補(bǔ)充的圖1)在TEGVAX治療的小鼠的腫瘤引流LN中增加的IL_12、TNF-α和IFN-α。收集了每個(gè)治療組中的腫瘤DLN并分析了⑶Ilc+細(xì)胞上的Thl細(xì)胞因子譜。相比GVAX或?qū)φ罩委熃M，TEGVAX治療的小鼠具有顯著增加的IL12、TNF_ a和IFN- a陽(yáng)性CDllc+細(xì)胞。
[0022]圖9(補(bǔ)充的圖2)TEGVAX誘導(dǎo)建立的CT26模型中的抗腫瘤應(yīng)答。將105CT26結(jié)腸癌細(xì)胞注射入足墊(footpad)，并用疫苗治療患有可觸知的腫瘤的小鼠。CT26-GVAX如Yoshimura等人(11)中描述的制備。相比單獨(dú)的CT26-GVAX或單獨(dú)的IDC-1005，TEGVAX顯著降低了小鼠CT 26結(jié)腸癌的生長(zhǎng)(**P〈0.01)
[0023]圖10A-B(補(bǔ)充的圖3)被配制入TEGVAX的多種TLR激動(dòng)劑具有最大的體內(nèi)抗腫瘤應(yīng)答。圖10A.患有可觸知的B16腫瘤的小鼠，用TEGVAX、GVAX、用R848配制的GVAX、或用GLA配制的GVAX治療。所有配制由在疫苗注射之前使B16-GVAX與在10% (w/v)角鯊烯水包油乳劑媒介物中的佐劑在4°C孵育I小時(shí)構(gòu)成(**P〈0.01)。圖10B.含有媒介物不含GVAX的單獨(dú)佐劑不具有體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。
[0024]圖11 (補(bǔ)充的圖 4)使用 Lipofectamine?2000 (Invitrogen)，用吸附的 GLA 和R848配制的TEGVAX具有與用水包油乳劑媒介物配制的TEGVAX可比的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)(**Ρ〈0.01)。
[0025]圖12(補(bǔ)充的圖5)TEGVAX增加了具有來(lái)自疫苗的替代腫瘤抗原(surrogatetumor antigen)內(nèi)源性內(nèi)吞Q點(diǎn)(Q_dot)的激活DC的數(shù)目。GVAX和TEGVAX被Qtracker655 (Invitrogen)標(biāo)記，并接種到小鼠的足墊中。3天后，收集引流胭LN (drainingpopliteal LN)，并用⑶3和⑶19抗體耗竭淋巴細(xì)胞。FACS分析定量來(lái)自疫苗的Q-點(diǎn)標(biāo)記的內(nèi)源性PDC和cDC。
[0026]發(fā)明詳述
[0027]我們已經(jīng)開發(fā)了最佳配制的癌癥疫苗組合ro-1阻斷劑可在治療上用于治療腫瘤的體內(nèi)證據(jù)。我們已經(jīng)收集了證明該組合方案可以有效地針對(duì)建立的免疫原性不良的腫瘤的證據(jù)。該組合方案的所有組分已在患者中經(jīng)單獨(dú)測(cè)試，并發(fā)現(xiàn)在臨床上是安全的。雖然 申請(qǐng)人:不打算受到任何提出的建議機(jī)制的約束，但是所公開的治療策略可通過(guò)適應(yīng)性免疫逃避起效。
[0028]患有不同癌癥的患者可被該組合方案治療。此類癌癥包括結(jié)腸直腸癌、呼吸消化鱗狀細(xì)胞癌(aero-digestive squamous cancer)、肺癌、腦癌、肝癌、胃癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、頭頸癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、乳腺癌、黑素瘤、前列腺癌、胰腺癌、和腎癌。這個(gè)列表意在是說(shuō)明性的而非限制性的。
[0029]全癌細(xì)胞針對(duì)治療接受者(recipient)可以是同種異體的、同基因的、或自體的。通常，它們可通過(guò)保留它們的免疫原性和它們的代謝活性的技術(shù)被處理以使得它們無(wú)增殖能力。一種通常使用的技術(shù)是輻照此類細(xì)胞。通常，使用患者具有的相同的一般類型的腫瘤細(xì)胞。例如，患有黑素瘤的患者通常將被施用無(wú)增殖能力的黑素瘤細(xì)胞。該細(xì)胞可天然地表達(dá)和分泌細(xì)胞因子或用指導(dǎo)此表達(dá)和分泌的核酸通過(guò)轉(zhuǎn)染表達(dá)和分泌細(xì)胞因子。一種合適的細(xì)胞因子是GM-CSF。例如，腫瘤細(xì)胞可表達(dá)編碼GM-CSF的轉(zhuǎn)基因，如美國(guó)專利號(hào)5，637，483,5, 904，920,6, 277，368 和 6，350，445，以及美國(guó)專利公布號(hào) 20100150946 中描述的，每一篇文獻(xiàn)都通過(guò)引用明確被并入。用于治療胰腺癌的表達(dá)GM-CSF、遺傳修飾的癌細(xì)胞的一個(gè)實(shí)例，在美國(guó)專利號(hào)6，033，674和5，985，290中描述，這兩篇文獻(xiàn)都通過(guò)引用明確被并入本文?？梢允褂闷渌?xì)胞因子?？杀皇褂玫暮线m的細(xì)胞因子包括刺激樹突細(xì)胞誘導(dǎo)、募集和/或成熟的細(xì)胞因子。此類細(xì)胞因子包括，但不限于，以下的一種或多種:GM-CSF、0)40配體、11^-12、0(^3、0(^20、和 0(^21。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽是具有免疫調(diào)節(jié)活性并與GenBank登錄號(hào)AAA52122.1具有至少約85%氨基酸序列同一性的細(xì)胞因子或片段。
[0030]根據(jù)一個(gè)可選的實(shí)施方案，細(xì)胞因子通過(guò)表達(dá)和分泌一種或多種細(xì)胞因子的失活的旁觀細(xì)胞(bystander cell)遞送。旁觀細(xì)胞可提供所有刺激樹突細(xì)胞的誘導(dǎo)、募集和/或成熟的細(xì)胞因子，或可補(bǔ)充由失活的腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。表達(dá)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的旁觀細(xì)胞系在美國(guó)專利號(hào)6, 464, 973和8, 012, 469, Dessureault等人,Ann.Surg.0ncol.14:869-84，2007，和 Eager 和 Nemunaitis, Mol.Ther.12:18-27，2005 中描述，每一篇文獻(xiàn)都通過(guò)引用明確被并入。
[0031]適于在治療方案和組合物和試劑盒中使用的抗體，包括任何與程序性死亡-1(PD-1)特異性結(jié)合的抗體?？杀皇褂玫目贵w的示例性類型包括但不限于人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體、抗體結(jié)合片段、和雙抗體。通常，抗體基本上由一個(gè)免疫球蛋白基因或多個(gè)免疫球蛋白基因或其片段編碼。抗體能夠特異性結(jié)合抗原或表位。參見(jiàn)，例如Fundamental Immunology,第三版，ff.E.Paul編著，RavenPress, N.Y.(1993) ；ffilson(1994) ；J.1mmunol.Methodsl75:267-273 ；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods25:85_97?？贵w通常與抗原或表位特異性結(jié)合。特異性結(jié)合發(fā)生于對(duì)應(yīng)的抗原或表位，即使在蛋白質(zhì)和其它生物制劑的異種群體的存在下?？贵w的特異性結(jié)合表明其以實(shí)質(zhì)上大于與不相關(guān)的抗原結(jié)合的親和力與其靶抗原或表位結(jié)合。親和力中的相對(duì)差異通常為至少25%較高、更通常為至少50%較高、最通常為至少100%。例如，相對(duì)差異可以是至少2x、至少5x、至少10x、至少25x、至少50x、至少100x、至少ΙΟΟΟχ。
[0032]Toll樣受體(TLR)是感知微生物產(chǎn)物和/或啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)家族。TLR激活樹突細(xì)胞(DC)。TLR是保守的跨膜分子，含有富含亮氨酸重復(fù)的胞外域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)TIR.(Toll/IL-1R)結(jié)構(gòu)域。TLR識(shí)別微生物中的不同結(jié)構(gòu)，通常被稱為“PAMP” (病原體相關(guān)分子模式)。與TLR結(jié)合的配體引起誘導(dǎo)產(chǎn)生參與炎癥和免疫的因子的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。[0033]可用于這些受體的示例性激動(dòng)劑包括，但不限于脂蛋白、脂多肽、肽聚糖、酵母聚糖、脂多糖、奈瑟氏球菌孔蛋白、鞭毛蛋白、抑制蛋白、神經(jīng)酰胺半乳糖脂(galactoceramide)、胞壁酰二肽、吡喃葡萄糖基脂質(zhì) A(glucopyranosyl lipid A,GLA)、和瑞喹莫德(R848)。肽聚糖、脂蛋白、和脂磷壁酸是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞壁組分。脂多糖由大多數(shù)細(xì)菌表達(dá)。鞭毛蛋白是由病原細(xì)菌和共生細(xì)菌分泌的細(xì)菌鞭毛的結(jié)構(gòu)組分。神經(jīng)酰胺半乳糖脂(a-GalCer)是天然殺傷T(NKT)細(xì)胞的活化劑。胞壁酰二肽是所有細(xì)菌共有的生物活性肽聚糖基序。此類激動(dòng)劑通過(guò)Toll樣受體介導(dǎo)先天免疫激活。激動(dòng)劑對(duì)其同源受體(cognate receptor)的特異結(jié)合通常用術(shù)語(yǔ)親和力表示。本發(fā)明的配體可以以約IO4IVTi和約IO8M-1之間的親和力結(jié)合。親和力根據(jù)Kd = koff/kon(koff是解離速率常數(shù)、kon是締合速率常數(shù)、且Kd是平衡常數(shù))被計(jì)算。可使用單一或多種激動(dòng)劑。
[0034]在人類中，已經(jīng)鑒定了 10種TLR。在細(xì)胞表面上表達(dá)的TLR包括TLR-1、TLR-2、TLR-4、TLR-5和TLR-6，而TLR-3、TLR-7/8、和TLR-9在ER區(qū)室表達(dá)。基于不同的TLR表達(dá)模式，可鑒定人樹突細(xì)胞亞組(subset)。通過(guò)舉例的方式，當(dāng)被刺激時(shí)，DC的髓樣或“常規(guī)”亞組(mDC)表達(dá)TLR1-8，且產(chǎn)生激活標(biāo)志物(例如⑶80、⑶86、MHC I和II類、CCR7)、促炎細(xì)胞因子、和趨化因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這種刺激和導(dǎo)致的表達(dá)的結(jié)果是抗原特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞致敏(priming)。這些DC獲得占據(jù)抗原的增強(qiáng)的能力，并將它們以適當(dāng)?shù)男问匠蔬f至T細(xì)胞。相反，當(dāng)激活時(shí)，DC的類漿細(xì)胞亞組(pDC)僅表達(dá)TLR7和TLR9，而導(dǎo)致NK細(xì)胞以及T細(xì)胞的激活。由于垂死的腫瘤細(xì)胞可負(fù)面影響DC功能，已表明，在癌癥治療的免疫治療方法中用TLR激動(dòng)劑激活的DC可有利于致敏抗腫瘤免疫。還表明，使用輻照和化療成功治療乳腺癌需要TLR4激活。
[0035]本領(lǐng)域已知的且可用于本發(fā)明的TLR激動(dòng)劑包括，但不限于以下:
[0036]Pam3Cys, TLR-1/2 激動(dòng)劑；
[0037]CFA, TLR-2 激動(dòng)劑；
[0038]MALP2, TLR-2 激動(dòng)劑；
[0039]Pam2Cys, TLR-2 激動(dòng)劑；
[0040]FSL-1，TLR-2 激動(dòng)劑；
[0041]Hib-OMPC, TLR-2 激動(dòng)劑；
[0042]聚肌苷酸:聚胞苷酸(polyribosinic:polyribocytidicacid, Poly 1: C), TLR-3激動(dòng)劑；
[0043]聚腺苷酸-聚尿苷酸(poly AU)，TLR-3激動(dòng)劑；
[0044]用聚-L-賴氨酸和羧甲基纖維素穩(wěn)定的聚肌苷胞-聚胞苷酸(Hiltonol?)，TLR-3激動(dòng)劑；
[0045]單磷?；|(zhì)(MPL)，TLR-4激動(dòng)劑；
[0046]LPS，TLR-4 激動(dòng)劑；
[0047]細(xì)菌鞭毛蛋白，TLR-5激動(dòng)劑；
[0048]唾液酸化-Tn (STn)，與一些人癌細(xì)胞上的MUCl粘蛋白相關(guān)的碳水化合物和TLR-4激動(dòng)劑；
[0049]咪喹莫特，TLR-7激動(dòng)劑；
[0050] 瑞喹莫德，TLR-7/8激動(dòng)劑；[0051]洛索立賓，TLR-7/8激動(dòng)劑；及
[0052]未甲基化的CpG 二核苷酸(CpG-ODN)，TLR-9激動(dòng)劑。
[0053]全癌細(xì)胞與TLR激動(dòng)劑的制劑呈現(xiàn)為增強(qiáng)的功效的促成因素(contributingfactor)。制劑可以在諸如4°C溫度下一起孵育諸如1/4、1/2、1、2、3、5、10、24小時(shí)的時(shí)間段?？蛇x地，可以采用在親脂性劑或乳化劑存在下的結(jié)合。此類劑在本領(lǐng)域是公知的。
[0054]可以設(shè)想各種給藥方案，同時(shí)或錯(cuò)開時(shí)間(staggered timing)、單一或多種劑、單個(gè)周期或多個(gè)周期。
[0055]向癌癥患者施用治療劑的方法不同。示例性的方法包括但不限于皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)、腫瘤內(nèi)、腹腔內(nèi)、舌下、和硬膜外施用?？梢韵蛉?、哺乳動(dòng)物、哺乳類受試者、動(dòng)物、獸醫(yī)受試者、安慰劑受試者、研究受試者、或?qū)嶒?yàn)受試者施用。典型地，劑諸如外源配體、試劑、安慰劑、小分子、藥劑、治療劑、診斷劑或組合物與受試者在適當(dāng)?shù)慕馄蕦W(xué)位置相接觸。施用可以是用于治療、藥代動(dòng)力學(xué)研究、診斷分析、研究、安慰劑或?qū)嶒?yàn)方法的目的。根據(jù)本發(fā)明的劑可以，但并非不需要，作為單一組合物施用。雖然作為單一組合物施用被本發(fā)明設(shè)想，劑可作為分開的施用被遞送至單一受試者，施用可在相同或不同的時(shí)間、并且施用可通過(guò)相同施用途徑或不同施用途徑。在一些情況下，劑實(shí)際上可以在受試者的身體內(nèi)相互接觸，體內(nèi)形成組合物。
[0056]上述公開總體描述了本發(fā)明。本文公開的所有參考文獻(xiàn)通過(guò)引用被明確并入?？赏ㄟ^(guò)參考以下特定實(shí)施例獲得更完整的理解，其在本文被提供僅用于說(shuō)明的目的并不預(yù)期限制本發(fā)明的范圍 。
實(shí)施例
[0057]為了評(píng)價(jià)多種TLR激動(dòng)劑在臨床環(huán)境中誘導(dǎo)全身性抗腫瘤免疫的能力，我們用GVAX配制了吡喃葡萄糖基脂質(zhì)A (GLA-TLR4激動(dòng)劑)和瑞喹莫德(TLR7/8激動(dòng)劑)，并研究了它們?cè)诳捎|知的B16模型中的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。GLA是顯示具有比單磷?；|(zhì)A強(qiáng)的TLR4激動(dòng)劑的合成的六酰化分子，其目前正作為癌癥疫苗中的TLR4激動(dòng)劑佐劑經(jīng)受臨床試驗(yàn)。R848是被發(fā)現(xiàn)與咪喹莫特(TLR7激動(dòng)劑)相比產(chǎn)生50-100倍細(xì)胞因子應(yīng)答的TLR7/8激動(dòng)劑，且該劑也已通過(guò)了患者中安全性的I期試驗(yàn)。我們將已在患者中被單獨(dú)地測(cè)試為臨床上安全的這些佐劑組合，以配制TLR激動(dòng)劑增強(qiáng)的GVAX (TEGVAX)，并在建立的腫瘤環(huán)境中檢查它們激活A(yù)PC和提高抗腫瘤T細(xì)胞的潛能。
[0058]Li等人和Curran等人均表明，抗_PD_1和細(xì)胞疫苗可被組合以誘導(dǎo)體內(nèi)抗腫瘤應(yīng)答，但該報(bào)告利用非可觸知的腫瘤接種方法，該方法可能不會(huì)建模具有建立的腫瘤組織的臨床環(huán)境。Curran等人還將抗-CTLA-4與抗-PD-1和疫苗組合，但由于在臨床前和臨床研究中與易普利姆瑪(ipilimumab)相關(guān)的毒性，我們選擇抗-PD-1阻斷劑。由于我們專注于開發(fā)可在腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生顯著干擾素應(yīng)答的安全疫苗，我們采用了嚴(yán)格的模型以測(cè)試TEGVAX和抗-PD-1對(duì)可觸知的、建立的B16腫瘤的組合治療。
[0059]實(shí)施例1
[0060]材料和方法
[0061]小鼠和試劑:6-8周齡雌性 C57BL/6、Balb/c、及 C3H/He0UJ 小鼠(Jackson 實(shí)驗(yàn)室)根據(jù) Johns Hopkins Hospital (JHH)Animal Care and Use Committee 被飼養(yǎng)。C57BL/6MyD88 / TRIF / 和 B6 (Cg) Rag2tml (Rag2 / )小鼠分別獲自 Franck Housseau 博士和 Fan Pan 博士(JHH)。B16 和 B16GVAX 細(xì)胞在含有 10 % AFCS、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100U/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。Cytofix/Cytoperm試劑盒和抗體購(gòu)自BDBioscience。CDllc+細(xì)胞通過(guò)抗小鼠 CDllc microBeads (MACS, Miltenyi Biotec)被分離。每2天一次(共5次)腹腔內(nèi)注射200 μ g/劑量的⑶4耗竭GKl.5抗體(⑶4cbpletingGKl.5antibody)以及 CD8 耗竭 2.43 (CD8cbpleting2.43) (Bio X Cell)。表達(dá)阻斷抗-PD-1抗體的雜交瘤(克隆G4)獲自Charles Drake博士(JHH)。
[0062]在10% (w/v)角S烯水包油乳劑(Immune Design)中制備lmg/ml的吡喃葡萄糖基脂質(zhì) A (GLA)和 0.2mg/ml 的瑞喹莫德(R848)。IDC-1005 是 lmg/ml GLA 和 0.2mg/mL R848在乳劑媒介物中的混合物。接種前，將IDC-1005與輻照的GVAX細(xì)胞在4°C孵育0.5-2小時(shí)。用IDC-1005配制的GVAX被標(biāo)記為TEGVAX。在某些情況下，用Lipofectamine使不含乳劑媒介物的GLA和R848被吸附進(jìn)入GVAX細(xì)胞，并洗滌4次以除去未吸附的TLR激動(dòng)劑和轉(zhuǎn)染子。
[0063]腫瘤治療試驗(yàn):C57BL/6小鼠在腳墊中被注射1_5χ104Β16?？捎|知的腫瘤形成之后(5-10天)，將100 μ IlO6的用或未用IDC-1005配制的B16GVAX皮下注射到對(duì)側(cè)肢。對(duì)照組注射媒介物。對(duì)于所有這些實(shí)驗(yàn)，使用10只小鼠/組。通過(guò)可比的方法，將SCCFVII/SF細(xì)胞和CT26細(xì)胞分別用于C3H/He0UJ小鼠和Balb/c小鼠(28)。以與B16相同的方式將先前制備的輻照的106SCCFVII/SF-GVAX用于SCCFVII模型(3)。對(duì)于CT26模型，轉(zhuǎn)導(dǎo)GM-CSF的CT26細(xì)胞被用作CT26GVAX(11)。對(duì)于所有疫苗，測(cè)定GM-CSF的滴度以確保GM-CSF表達(dá)水平介于50-500ng/106細(xì)胞/24小時(shí)范圍內(nèi)。每天測(cè)量腫瘤。在某些情況下，接種前用Qtracker655 (Invitrogen)標(biāo)記GVAX。對(duì)于F1D-1實(shí)驗(yàn),腫瘤是可觸知的之后，每周兩次腹腔內(nèi)注射100 μ g/小鼠/注射連同疫苗治療。
[0064]DC激活分析:在疫苗治療后3-7天，收集來(lái)自荷瘤或幼稚的(naive)小鼠的脾和引流淋巴結(jié)(DLN)。將研碎的脾在含有DNA酶 I (Roche)和 Liberase Blendzyme2 (20, OOOMandlU/ml) (Roche)的介質(zhì)中消化。通過(guò)耗竭⑶3+和⑶19+獲得富集DC的群體，并針對(duì)⑶IIc+和B220+門控。這些通過(guò)使用⑶80、⑶86、⑶40和MHCII抗體的多色FACS分析被評(píng)價(jià)。
[0065]ELISP0T 分析:ELISP0T 板(MultiScreenms 過(guò)濾板，Millipore)用小鼠IFN- Y Ab (MabTech)包覆 24 小時(shí)，且 T2kb 細(xì)胞用 10 μ g/ml 的 P15E (KSPffFTTL)肽脈沖過(guò)夜。將來(lái)自脾的IO6脾CD8細(xì)胞一式三份鋪板，以與脈沖的或未脈沖的105T2kb細(xì)胞共培養(yǎng),或用I μ M PMA和10ng/ml離子霉素刺激作為陽(yáng)性對(duì)照。在第3天，加入生物素化的抗小鼠IFN-YAb(MabTech)和鏈霉親和素-HRP。使用AEC底物試劑(BD)顯影斑點(diǎn)，并使用ELISP0T 酶標(biāo)儀(Immunospot)分析。
[0066]體內(nèi)CTL 分析:用 0.5μ M和 5μ M CFSE(Molecular Probes)標(biāo)記脾細(xì)胞。5μΜCFSE標(biāo)記的細(xì)胞用10 μ g/ml P15E (KSPffFTTL)肽脈沖。0.5 μ M CFSE標(biāo)記的細(xì)胞用β -半乳糖苷酶(β-gal) (TPHPARIGL)肽脈沖。用這些細(xì)胞的1:1混合物靜脈注射小鼠，并在24小時(shí)后分離脾細(xì)胞 ，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析。使用下式計(jì)算抗原特異性殺傷:(1-cfsep15E%
/CFSE0_半乳糖苷酶) XlOOο
[0067]免疫組織化學(xué):用丙酮固定10 μ m厚的冷凍切片，并用I % BSA在室溫封閉30分鐘。對(duì)于石蠟包埋的組織，在如上所述的I % BSA封閉前，將切片固定在4%多聚甲醛中。α⑶4、α⑶8、α⑶86FITC綴合物和α⑶45和α Β7-Η1—抗在4°C孵育I小時(shí)。在某些情況下，Cy3綴合物抗體被用作二抗。DAPI用作核復(fù)染劑。在X40的放大倍率下，定量了10個(gè)隨機(jī)選擇的視場(chǎng)中的陽(yáng)性細(xì)胞。在IHC切片被染色以及隨機(jī)標(biāo)記(JF)后，盲法進(jìn)行(LH)陽(yáng)性染色的定量。顯微鏡是Nikon, Eclipse E800。相機(jī)是Nikon, DS-QiIMc。軟件是NIS-Element AR3.0。
[0068]細(xì)胞因子分析:收集的DC用Golgistop?(BD)蛋白質(zhì)運(yùn)輸莫能菌素(proteintransport monensin)和LPS0.1 μ g/ml孵育5小時(shí)。針對(duì)抗小鼠CDllc、CD86、MHCI1、IL_12、IFNa和TNFa表達(dá)染色DC，且在用Cytokit的膜透化作用后，針對(duì)抗小鼠IL_2、IFNa、IFN Y , TNF a表達(dá)染色收集的淋巴細(xì)胞。沖洗抗體后，通過(guò)FACS分析獲取數(shù)據(jù)。
[0069]實(shí)施例2
[0070]多種TLR激動(dòng)劑增強(qiáng)的GVAX(TEGVAX)相比GVAX增加引流淋巴結(jié)中激活的常規(guī)樹突細(xì)胞和類漿細(xì)胞樹突細(xì)胞兩者
[0071]為了進(jìn)一步增加由GVAX產(chǎn)生的抗腫瘤應(yīng)答，我們將GLA和R848與GVAX組合，并測(cè)試該TEGVAX制劑是否會(huì)增加非荷瘤小鼠的DLN中激活的樹突細(xì)胞的數(shù)目。相比GVAX，TEGVAX能夠增強(qiáng)來(lái)自疫苗接種部位的DLN中的樹突細(xì)胞的激活表型(圖1)。分析了類漿細(xì)胞DC(pDC)和常規(guī)DC(cDC)兩者，且TEGVAX治療組的兩個(gè)群體都顯示增強(qiáng)的⑶80和⑶86激活標(biāo)志物的表達(dá)(圖1A-C)。在佐劑注射后第3天，門控的DC顯示增加的激活標(biāo)志物峰值，并且這持續(xù)直至第7天(圖1D)。最后，為了評(píng)價(jià)這些激活的DC是否提供用于抗腫瘤應(yīng)答的合適的細(xì)胞因子環(huán)境，來(lái)自引流淋巴結(jié)的CDllc+細(xì)胞的細(xì)胞因子譜還表明IL-12、IFNa、TNFa的增加的數(shù)目，其可以使T細(xì)胞組分(T-cell r印ertoire)傾向?qū)hI應(yīng)答(補(bǔ)充的圖1)。
[0072]實(shí)施例3
[0073]建立的腫瘤的TEGVAX治療顯著降低體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)速率
[0074]我們最初在治療模型中用建立的B16腫瘤測(cè)試了我們的TEGVAX。當(dāng)接種的B16腫瘤是可觸知的時(shí)(通常在第7-10天)，我們用TEGVAX、GVAX、GLA/R848 (IDC-1005)、和媒介物對(duì)照在對(duì)側(cè)肢皮下治療荷瘤小鼠。如圖2A所示，接受TEGVAX的小鼠僅一次治療就顯示顯著較低的腫瘤生長(zhǎng)速率。單獨(dú)的GVAX和單獨(dú)的TLR激動(dòng)劑兩者具有一些適度的益處，但組合治療產(chǎn)生了最好的體內(nèi)抗腫瘤應(yīng)答。當(dāng)我們比較TEGVAX與GVAX的制劑與單獨(dú)的GLA或與單獨(dú)的R848時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)將GLA/R848制劑組合入GVAX具有最好的抗腫瘤應(yīng)答(補(bǔ)充的圖2A)。
[0075]為了進(jìn)一步提高抗腫瘤應(yīng)答，我們用多種TEGVAX治療進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并發(fā)現(xiàn)多種TEGVAX治療的小鼠都沒(méi)有表現(xiàn)出可見(jiàn)于未治療的小鼠中的指數(shù)增長(zhǎng)(圖2B)。由于激活的DC在該時(shí)間點(diǎn)的下降的水平，每7天一次注射TEGVAX(圖1D)。這些TEGVAX治療的具有郁積型腫瘤(smoldering tumor)的小鼠,用105B16細(xì)胞在不同于原發(fā)腫瘤部位的部位被接種，并且，在這些小鼠中，沒(méi)有腫瘤在第二部位生長(zhǎng)，表明針對(duì)后續(xù)B16攻擊的體內(nèi)免疫(數(shù)據(jù)未示出)。我們還在C3H小鼠的SCCFVII鱗狀細(xì)胞癌模型中以及在Balb/c小鼠的CT26結(jié)腸癌模型中測(cè)試了 TEGVAX，具有可比的結(jié)果，表明該抗腫瘤應(yīng)答適用于多種腫瘤組織學(xué)，并且不依賴于鼠背景(圖2C)(補(bǔ)充的圖3)。對(duì)于SCCFVII模型，單一 TEGVAX治療實(shí)際上誘導(dǎo)了腫瘤的完全消退。再次，在這些小鼠中用SCCFVII腫瘤細(xì)胞的再攻擊沒(méi)有顯示腫瘤在第二部位生長(zhǎng)的證據(jù)。
[0076] TEGVAX的抗腫瘤效應(yīng)依賴于TEGVAX的制劑。當(dāng)我們用GVAX和GLA/R848治療荷瘤小鼠而未在注射前共孵育I小時(shí)時(shí)，無(wú)抗腫瘤效應(yīng)被記錄(圖2D)。我們認(rèn)為共孵育時(shí)間可允許用角鯊烯油乳劑媒介物使疏水TLR激動(dòng)劑吸附進(jìn)入GVAX，并且該制劑對(duì)于TEGVAX的抗腫瘤應(yīng)答是必要的。為了測(cè)試這一點(diǎn)，我們用Lipofectamine將GLA和R848吸附進(jìn)入GVAX，并洗滌細(xì)胞以除去未吸附的佐劑/轉(zhuǎn)染子，并且我們發(fā)現(xiàn)由轉(zhuǎn)染方法產(chǎn)生的TEGVAX與由用親脂性媒介物的延長(zhǎng)孵育方法產(chǎn)生的TEGVAX在它們的抗腫瘤功效方面是可比的(補(bǔ)充的圖4)。
[0077]實(shí)施例4
[0078]TEGVAX增加腫瘤微環(huán)境中淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，且這與腫瘤壞死的誘導(dǎo)、局部ThI應(yīng)答、及腫瘤上增加的B7-H1表達(dá)相關(guān)
[0079]我們檢查了在我們的治療分析完成時(shí)收集的腫瘤組織，并檢查了腫瘤微環(huán)境的淋巴細(xì)胞。與那些用GVAX或?qū)φ罩委煹男∈笙啾龋M織學(xué)分析顯示用TEGVAX治療的那些小鼠中顯著增加的局灶性壞死的區(qū)域(圖3A、B)。用⑶4和⑶8抗體的免疫組織化學(xué)顯示TEGVAX治療的腫瘤在腫瘤組織中具有豐富的浸潤(rùn)性CD4和CD8細(xì)胞(圖3C、D)。當(dāng)我們檢查腫瘤引流淋巴結(jié)時(shí)，我們注意到，相比GVAX或?qū)φ罩委?，TEGVAX治療的小鼠具有增加的IFN Y +⑶4和⑶8。為了測(cè)試這些增加的ThI細(xì)胞是否與腫瘤細(xì)胞上的B7-H1上調(diào)有關(guān)，我們?nèi)旧[瘤組織，并發(fā)現(xiàn)相比GVAX和媒介物治療的小鼠，TEGVAX還顯著增加B7-H1的表達(dá)(圖 4C)。
[0080]實(shí)施例5
[0081]TEGVAX的抗腫瘤應(yīng)答依賴于⑶4和⑶8細(xì)胞兩者，以及MyD88/TRIF信號(hào)傳導(dǎo)
[0082]為了評(píng)價(jià)T細(xì)胞對(duì)TEGVAX的抗腫瘤應(yīng)答是否是重要的，我們用⑶4和CD8耗竭進(jìn)行疫苗治療分析。當(dāng)⑶4或⑶8T細(xì)胞耗竭時(shí)，TEGVAX治療效應(yīng)被消除，表明⑶4和⑶8淋巴細(xì)胞二者對(duì)抗腫瘤免疫應(yīng)答的重要性。使用Rag2K0小鼠的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)結(jié)果(圖5A、B、C)。
[0083]由于多種TLR激動(dòng)劑被用作TEGVAX的制劑組分，我們?cè)噲D確定TLR信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于疫苗作用是否是關(guān)鍵的。用MyD88/TRIF雙敲除小鼠進(jìn)行B16荷瘤小鼠的TEGVAX治療。再次，TEGVAX的抗腫瘤效應(yīng)在這些小鼠中被完全消除，確認(rèn)了 TEGVAX的抗腫瘤效應(yīng)依賴于TLR信號(hào)傳導(dǎo)(圖OT)。
[0084]實(shí)施例6
[0085]TEGVAX增加腫瘤特異性pl5E特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的數(shù)目
[0086]由于用TEGVAX的抗腫瘤效應(yīng)與激活的DC相關(guān)的明確的體內(nèi)證據(jù)，我們還檢查了免疫系統(tǒng)的效應(yīng)臂(effector arm)?；贐16腫瘤中免疫顯性pl5E抗原的表達(dá),我們進(jìn)行了體內(nèi)CTL試驗(yàn)以定量分泌pl5E特異性IFNy的CTL的水平(圖6)。如圖6所示，在當(dāng)TEGVAX治療組與其它對(duì)照組的生長(zhǎng)速率存在明顯的分離的第21天時(shí)(圖1)，相比GVAX或其它對(duì)照小鼠，用TEGVAX治療的小鼠的脾中存在增加的pl5E特異性CTL的殺傷活性(圖6A)。還用以pl5E肽脈沖T2kb細(xì)胞作為APC對(duì)來(lái)自治療組和對(duì)照組中的每一個(gè)的⑶8T細(xì)胞進(jìn)行ELISP0T試驗(yàn)。這兩個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)表明用TEGVAX治療的小鼠中增加的腫瘤特異性(抗-P15E) CTL的數(shù)目和活性(圖6B)。[0087]實(shí)施例7
[0088]與抗-PD-1抗體組合的TEGVAX可誘導(dǎo)建立的B16腫瘤的消退
[0089]由于TEGVAX增加pl5E_特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞以及產(chǎn)生IFN Y的⑶8細(xì)胞的數(shù)目的能力，我們將TEGVAX與免疫檢查點(diǎn)通路Β7-Η1/Η)-1的阻斷劑相組合。I3D-1在激活的T細(xì)胞上表達(dá)且其配體B7-H1在腫瘤細(xì)胞上的共定位與抗-PD-1阻斷劑的臨床療效相關(guān)，該配體87-!11被分泌正^^的T細(xì)胞 上調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)暗示了支持的適應(yīng)性免疫耐受機(jī)制是，抗-PD-1阻斷劑理想地適于與可產(chǎn)生強(qiáng)大的ThI應(yīng)答的疫苗相組合。在我們的鼠模型中，TEGVAX增加了分泌IFNy的T細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞上上調(diào)的B7-H1的表達(dá)兩者(圖4)。當(dāng)抗-PD-1抗體治療與TEGVAX組合時(shí)，在50%的治療的小鼠中記錄到建立的B16腫瘤的消退(圖7A)。在響應(yīng)組合治療的這些小鼠中，記錄到白癜風(fēng)，如圖7B中所示。用單獨(dú)的抗I3D-1或抗I3D-1與GVAX —起治療的小鼠相對(duì)于單獨(dú)的GVAX治療，腫瘤生長(zhǎng)速率無(wú)改善。相比用單獨(dú)的TEGVAX或抗-PD-1，這些體內(nèi)腫瘤治療試驗(yàn)與從用TEGVAX和抗-PD-1治療的小鼠的腫瘤DLN中收集的增加的ThI細(xì)胞因子的協(xié)同作用相關(guān)(圖7C)。
[0090]實(shí)施例8
[0091]討論
[0092]在此報(bào)告中，我們用TLR4 (GLA)和TLR7/8 (R848)激動(dòng)劑配制了 GVAX，并在3個(gè)不同的鼠模型中證明相比單獨(dú)的GVAX或單獨(dú)的TLR激動(dòng)劑，體內(nèi)抗腫瘤應(yīng)答的顯著增強(qiáng)。我們證明，這些佐劑增加了激活的類漿細(xì)胞DC(pDC)以及常規(guī)DC(cDC)的數(shù)目。這些體內(nèi)抗腫瘤應(yīng)答是T細(xì)胞依賴的，且相比GVAX治療組，TEGVAX治療組中B16模型中的腫瘤特異性pl5E特異性T細(xì)胞升高。關(guān)于這些實(shí)驗(yàn)，我們使用了針對(duì)建立的B16腫瘤的治療模型，該B16腫瘤是在它們成為可觸知的之后則不能被已知的疫苗制劑治療的免疫原性差的腫瘤。隨著反復(fù)的TEGVAX治療，腫瘤傾向于顯示“郁積型”生長(zhǎng)速率，如圖2中所示的。對(duì)于SCCFVII模型，僅用TEGVAX的單一治療誘導(dǎo)可觸知的腫瘤的消退。對(duì)于CT26結(jié)腸癌模型，對(duì)可觸知的病變的TEGVAX治療也表現(xiàn)出體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)(補(bǔ)充的圖3)。TEGVAX治療與在腫瘤引流淋巴結(jié)中增加的IFNY+CD4和⑶8細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞上增加的B7-H1表達(dá)相關(guān)。當(dāng)TEGVAX與抗-PD-1阻斷劑組合時(shí)，我們觀察到建立的B16腫瘤的消退，如圖7中所示的。
[0093]GLA和R848最初被選擇，因?yàn)橄啾绕渌黅LR激動(dòng)劑，這些佐劑顯著誘導(dǎo)增強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞因子譜，并且兩者都在患者中被測(cè)試是安全的。TLR4激動(dòng)劑GLA，在其激活鼠和人樹突細(xì)胞的能力方面與單磷酰脂質(zhì)A(MPL)進(jìn)行比較，且GLA被認(rèn)為在體內(nèi)和體外增加多種ThI型細(xì)胞因子方面是更有效的。TLR7/8激動(dòng)劑R848，也被發(fā)現(xiàn)相對(duì)于咪喹莫特在增加I型IFN譜方面具有顯著改善。因此，我們的關(guān)于建立的腫瘤的體內(nèi)結(jié)果，證明了 TEGVAX作為癌癥疫苗的高轉(zhuǎn)化潛力。有趣的是，當(dāng)我們檢查治療的小鼠的腫瘤微環(huán)境時(shí)，我們注意到相比GVAX，TEGVAX治療的小鼠中來(lái)自腫瘤引流淋巴結(jié)的⑶4和⑶8細(xì)胞的增加的IFN Y水平以及來(lái)自腫瘤的增加的B7-H1表達(dá)(圖4)。
[0094]因此，我們的臨床前研究是測(cè)試疫苗與抗-PD-1阻斷劑的組合治療的很好的場(chǎng)所。B7-H1的誘導(dǎo)對(duì)腫瘤細(xì)胞的重要性及其與淋巴細(xì)胞上的ro-1的接合作為關(guān)鍵的免疫逃避機(jī)制，在臨床前模型中被證實(shí)，且B7-H1表達(dá)在臨床上與多種癌癥類型較差的預(yù)后相關(guān)。對(duì)于患有晚期黑素瘤、肺癌、和腎癌的患者，用阻斷抗-PD-1抗體的單一治療導(dǎo)致顯著的存活益處，且同時(shí)進(jìn)行的組織學(xué)分析證明B7-H1和IFNy的表達(dá)與對(duì)ro-Ι阻斷劑的應(yīng)答之間的強(qiáng)的相關(guān)性。在上皮組織以及B16-F10腫瘤細(xì)胞中，IFN Y可誘導(dǎo)B7-H1表達(dá)。累加地，這些發(fā)現(xiàn)結(jié)果支持適應(yīng)性耐受機(jī)制，由此抗-PD-1阻斷劑能夠通過(guò)部分經(jīng)由IFNy誘導(dǎo)腫瘤上的B7-H1解開其駐留腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的抗腫瘤功效，駐留腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)其自身的抑制。因此，抗-PD-1阻斷劑理想地適于與誘導(dǎo)IFNy的疫苗的組合治療。圖7中顯示的用TEGVAX/抗-PD-1治療時(shí)建立的B16的消退，為抗-PD-1治療與適當(dāng)?shù)囊呙缃M合的臨床試驗(yàn)提供體內(nèi)臨床前理由。
[0095]以前的報(bào)道表明，抗-PD-1、抗-CTLA-4和疫苗的組合，可促進(jìn)抗腫瘤應(yīng)答，但它們的體內(nèi)試驗(yàn)涉及對(duì)不可觸知的、非建立的B16腫瘤開始治療。我們的治療試驗(yàn)要嚴(yán)格的多，其中我們?cè)贐16接種后7-10天開始治療，在該時(shí)間點(diǎn)上大多數(shù)免疫治療是失敗的。此外，我們不需要將抗-PD-1與其它免疫檢查點(diǎn)阻斷劑抗體結(jié)合以證明建立的腫瘤的消退。
[0096]當(dāng)我們檢查來(lái)自腫瘤的引流淋巴結(jié)時(shí)，TEGVAX和抗_PD_1組合的協(xié)同效應(yīng)被證實(shí)。腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)的收集是不可行的，因?yàn)橄说哪[瘤或小的腫瘤尺寸不能采樣用于流式細(xì)胞術(shù)的足夠的細(xì)胞。然而，相比單獨(dú)的TEGVAX或抗-PD-1治療組中的適度提高，來(lái)自胭淋巴結(jié)的⑶4和⑶8淋巴細(xì)胞兩者和⑶Ilc+樹突細(xì)胞展示IL-2、IL-12和IFN-Y表達(dá)水平的數(shù)倍增加(圖7C)。這些ThI細(xì)胞因子與相比TEGVAX和PD-1治療組TEGVAX/抗-PD-1治療組中pl5E特異性CTL的增加的數(shù)目相關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0097]從轉(zhuǎn)化的角度來(lái)看，易普利姆瑪與3-4級(jí)毒性和治療相關(guān)死亡的獨(dú)立的報(bào)道相關(guān)，因此抗-CTLA-4抗體的添加可能不是改善我們的體內(nèi)結(jié)果的第一選擇。然而，由于免疫檢查點(diǎn)分子的許多家族中顯著的冗余，以及臨床級(jí)檢查點(diǎn)阻斷抗體的可用性，存在向抗-PD-1治療增加其它免疫檢查點(diǎn)阻斷抗體的可能性。由于增加的IFNy可潛在地上調(diào)腫瘤微環(huán)境中的B7-H1的可能性，可選的方法是使用可與抗-PD-1組合的安全的疫苗增加腫瘤特異性CTL的水平。對(duì)于本研究的目的，我們選擇了具有TLR4和TLR7/8活性的兩種TLR激動(dòng)劑，但其它TLR激動(dòng)劑(鞭毛蛋白、CpG、等)或其它PAMP分子是否可以進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤應(yīng)答還不清楚。最后，應(yīng)重申的是，TEGVAX的所有組分已在患者中經(jīng)測(cè)試是安全的。由于其自身作為有效的抗腫瘤劑的證明，與抗-PD-1抗體組合的TEGVAX具有用于臨床試驗(yàn)的高轉(zhuǎn)化潛力。
[0098]我們先前證明了使用LPS配制的GVAX的瘤內(nèi)注射的體內(nèi)應(yīng)答，但現(xiàn)在我們報(bào)道了用TLR4和TLR7/8激動(dòng)劑兩者配制的GVAX作為治療劑的有效得多的應(yīng)答。在這些治療模型中，相比全身性注射，作為瘤內(nèi)注射的基礎(chǔ)的機(jī)理是不同的，但累加地，這些實(shí)驗(yàn)證明，瘤內(nèi)注射或全身性注射用細(xì)胞疫苗配制的TLR激動(dòng)劑將不可能具有促癌癥發(fā)生作用。腫瘤細(xì)胞中的MyD88-NF-K B信號(hào)傳導(dǎo)通路已顯示具促癌癥發(fā)生后果。然而，TLR激動(dòng)劑已清楚地顯示激活樹突細(xì)胞中的MyD88-TRIF通路以致敏用于抗腫瘤應(yīng)答的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。在本報(bào)道中，配制入GVAX的TLR激動(dòng)劑可刺激引流淋巴結(jié)中的DC，且在我們的全身性治療模型中未能夠證明任何不利的促癌癥發(fā)生作用。
[0099]GVAX以及在一些模型中TLR激動(dòng)劑自身，具有腫瘤生長(zhǎng)速率中的早期適度的影響，但在所有被研究的鼠模型中，TEGVAX組與對(duì)照組之間具有明確的分離。我們還將TEGVAX與GLA/GVAX和R848/GVAX進(jìn)行比較，且清楚的是，TEGVAX組合了 TLR4和TLR7/8兩者的活性，具有最佳的體內(nèi)抗腫瘤應(yīng)答(補(bǔ)充的圖2)。對(duì)于B16實(shí)驗(yàn)，有活力的B16腫瘤細(xì)胞被皮下注射在遠(yuǎn)離最初的腫瘤接種或疫苗接種的部位，且未記錄到腫瘤生長(zhǎng)。類似地，對(duì)于SCCFVII模型，再攻擊實(shí)驗(yàn)顯示僅單一的TEGVAX治療后就沒(méi)有腫瘤長(zhǎng)出(圖2C)。
[0100]我們認(rèn)為TLR4和TLR7/8兩種刺激的組合，可以增加cDC以及pDC 二者以誘導(dǎo)T細(xì)胞穩(wěn)固地致敏為抗腫瘤T細(xì)胞，該抗腫瘤T細(xì)胞負(fù)責(zé)TEGVAX的體內(nèi)抗腫瘤作用。用MyD88-TRIF雙敲除小鼠進(jìn)行TEGVAX治療試驗(yàn)，且抗腫瘤作用被完全消除(圖4C)。MyD88是TLR7/8信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵介導(dǎo)者(mediator)，且TRIF和MyD88兩者均是TLR4信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵的下游介導(dǎo)者。當(dāng)我們檢查引流淋巴結(jié)CDllc+細(xì)胞時(shí)，我們注意到相比對(duì)照，TEGVAX治療組中增加的ThI細(xì)胞因子表達(dá)(圖5)。CDllc和這些ThI細(xì)胞因子的點(diǎn)陣圖提供以下信息:雙陽(yáng)性中的增加主要源自CDllc+群體中的移位(shift)，表明TLR激動(dòng)劑的添加主要誘導(dǎo)了 APC至淋巴結(jié)的增加的運(yùn)輸，而不是增加基于每個(gè)細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。為此，我們用Q-點(diǎn)標(biāo)記了 TEGVAX，并定量引流淋巴結(jié)中通過(guò)細(xì)胞至細(xì)胞轉(zhuǎn)移被Q-點(diǎn)標(biāo)記的內(nèi)源APC(補(bǔ)充的圖5)。對(duì)于pDC和cDC兩者的群體，存在數(shù)量上更多的用Q-點(diǎn)標(biāo)記的激活的DC，與我們以下的假設(shè)相一致:TLR佐劑增加腫瘤和引流淋巴結(jié)之間循環(huán)的激活的DC數(shù)目，其中它們可以致敏T細(xì)胞。
[0101]我們以前的關(guān)于吸附LPS的GVAX的工作證明，TLR4激動(dòng)劑吸附進(jìn)入細(xì)胞疫苗對(duì)于體內(nèi)抗腫瘤功效是關(guān)鍵的。我們推測(cè)，GLA和R848吸附進(jìn)入GVAX對(duì)于觀察到的TEGVAX的增強(qiáng)的抗腫瘤應(yīng)答也是關(guān)鍵的。當(dāng)我們簡(jiǎn)單地共注射了 GLA和R848佐劑與GVAX而沒(méi)有任何孵育時(shí)，不存在體內(nèi)抗腫瘤應(yīng)答(圖2D)。只有當(dāng)TLR激動(dòng)劑和GVAX與親脂性媒介物孵育一小時(shí)，我們才獲得能夠誘導(dǎo)針對(duì)B16模型的局部應(yīng)答以及誘導(dǎo)針對(duì)SCCFVII模型的消退的TEGVAX制劑。為了進(jìn)一步測(cè)試這一點(diǎn)，我們使用不含角鯊烯水包油乳劑的Lipofectamine，用GLA和R848配制了 GVAX，并在B16模型中證明了可相比的體內(nèi)抗腫瘤應(yīng)答(補(bǔ)充的圖4)。因此，以后工作的一個(gè)方面，涉及TEGVAX制劑的進(jìn)一步優(yōu)化。
[0102]累加地，本 報(bào)道證明，作為治療性疫苗，TEGVAX提供了超越GVAX的顯著改善，其可以顯著增強(qiáng)腫瘤特異性T細(xì)胞的致敏，即使針對(duì)已建立的腫瘤，并且它是待被加入癌癥患者中與抗-PD-1阻斷抗體或其它形式的免疫檢查點(diǎn)阻斷劑的組合治療的優(yōu)越的候選物。
【權(quán)利要求】
1.一種組合物，所述組合物包括: 表達(dá)細(xì)胞因子的、無(wú)增殖能力的、全癌細(xì)胞； 與人程序性死亡I (PD-1)特異性結(jié)合的抗-PD-1抗體；及 TLR(toll樣受體)激動(dòng)劑； 其中用所述TLR激動(dòng)劑配制所述全癌細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述細(xì)胞因子是GM-CSF(粒細(xì)胞單核細(xì)胞刺激因子)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述全癌細(xì)胞是所述患者自體的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中用TLR7/8激動(dòng)劑配制所述全癌細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中用TLR4激動(dòng)劑配制所述全癌細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中用TLR4和TLR7/8激動(dòng)劑配制所述全癌細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述TLR激動(dòng)劑選自由以下構(gòu)成的組:GLA、R848、和其組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述癌細(xì)胞是黑素瘤細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中用乳劑媒介物配制所述TLR激動(dòng)劑和全腫瘤細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中用Lipofectamine?配制所述TLR激動(dòng)劑和全腫瘤細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中用陽(yáng)離子脂質(zhì)配制所述TLR激動(dòng)劑和全腫瘤細(xì)胞。
12.—種方法，所述方法包括: 向癌癥患者施用以下的免疫治療劑: 表達(dá)細(xì)胞因子的、無(wú)增殖能力的、全癌細(xì)胞； 與人程序性死亡I (PD-1)特異性結(jié)合的抗-PD-1抗體；及 TLR(toll樣受體)激動(dòng)劑； 其中用所述TLR激動(dòng)劑配制所述全癌細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述細(xì)胞因子是GM-CSF(粒細(xì)胞單核細(xì)胞刺激因子)。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述全癌細(xì)胞是所述患者自體的。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中用TLR7/8激動(dòng)劑配制所述全癌細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中用TLR4激動(dòng)劑配制所述全癌細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中用TLR4和TLR7/8激動(dòng)劑配制所述全癌細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述TLR激動(dòng)劑選自由以下構(gòu)成的組:GLA、R848、和其組合。
19.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述全癌細(xì)胞是黑素瘤細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中用乳劑媒介物配制所述TLR激動(dòng)劑和全腫瘤細(xì)胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法,其中用Lipofectamine?配制所述TLR激動(dòng)劑和全腫瘤細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中用陽(yáng)離子脂質(zhì)配制所述TLR激動(dòng)劑和全腫瘤細(xì)胞。
23.—種試劑盒，所述試劑盒包括以下劑: 表達(dá)細(xì)胞因子的、無(wú)增殖能力的、全癌細(xì)胞； 與人程序性死亡I (PD-1)特異性結(jié)合的抗-PD-1抗體；及 TLR(toll樣受體)激動(dòng)劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的試劑盒，還包括用于施用和/或配制所述劑的說(shuō)明書。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的試劑盒，還包括乳劑媒介物。
26.根據(jù)權(quán)利要求2 3所述的試劑盒,還包括Lipofectamine?。
27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的試劑盒，還包括陽(yáng)離子脂質(zhì)。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103957939SQ201280055855
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月19日
【發(fā)明者】Y·J·金, D·M·帕多略, J·傅 申請(qǐng)人:約翰霍普金斯大學(xué)