本發(fā)明屬于生物殺蟲劑領域；尤其是細菌性殺蟲劑、其基因、基因產物以及其使用方法。
參考序列表
本申請含有一個序列表，它通過EFS-Web以ASCII格式提交并且特此以全文引用的方式并入本文中。所述ASCII拷貝的名稱是MBI-203-0005-PCT_seq_ST25.txt并且大小是335個千字節(jié)。
背景技術：
活性紫色細菌
在2000年，從馬里蘭州(Maryland)的森林土壤中分離出了帶紫色細菌(PRAA4-1)(馬丁(Martin)等人，2004)。在初始篩選中，發(fā)現這種細菌對科羅拉多馬鈴薯甲蟲(Colorado potato beetle)和其它昆蟲害蟲有毒(馬丁等人，2007a)。所述分離物的進一步研究揭示出抗螨蟲、蛆、不同甲蟲物種、蚜蟲以及植物寄生線蟲以及其它植物害蟲的活性(馬丁等人，2007b，第2012/0100236 A1號美國專利申請公開)。在有關抗昆蟲的蛋白質活性劑的領域中，存在一些PRAA4-1蛋白質研究。
蛋白酶和昆蟲防治
蛋白酶具有靶向并且破壞昆蟲的必需蛋白質和組織的能力。植物經過自然進化，表達蛋白酶來免受蟲害。昆蟲捕食者也會在其毒液中產生蛋白酶，毒液導致死亡。蛋白酶已被鑒定為農業(yè)上防治昆蟲的重要殺昆蟲劑。
具有殺昆蟲活性的蛋白酶分為三大類：半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶。這幾類蛋白酶靶向中腸、表皮和血腔。中腸的圍食膜基質是用于昆蟲防治的理想標靶，因為它圍住并且保護中腸上皮細胞不受食物顆粒、消化酶和病原體的影響；此外還充當生化屏障(埃熱迪(Hegedus)等人，2009)。增效蛋白是由桿狀病毒表達的鋅金屬蛋白酶，有助于鱗翅目昆蟲中的核型多角體病毒感染(萊波雷(Lepore)等人，1996)。這些蛋白酶通過消化圍食膜基質的無脊椎腸粘蛋白促進鱗翅目幼蟲的感染，鱗翅目幼蟲的感染又促進中腸上皮細胞的感染(王(Wang)和格拉納多斯(Granados)，1997)。已在鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)和蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的基因組中鑒別到了桿狀病毒中所發(fā)現的增效蛋白基因的同源物(蓋勒韋(Galloway)等人，2005；哈賈杰-埃盧茲(Hajaij-Ellouze)等人，2006)。
植物半胱氨酸蛋白酶也展現出抗鱗翅目幼蟲的活性。木瓜乳汁和野生無花果樹中的半胱氨酸蛋白酶為防御各種鱗翅目幼蟲所必需的。當乳汁經過洗滌時或當葉子用半胱氨酸蛋白酶抑制劑處理時，對幼蟲的毒性丟失，表明防御可能歸因于乳汁中高濃度的半胱氨酸蛋白酶(康諾(Konno)等人，2004)。
靶向表皮的蛋白酶在昆蟲防治方面也很重要。表皮覆蓋了昆蟲的整個外部以及內部結構的一些內陷。表皮由蠟質上表皮、外表皮和內表皮構成，它們由蛋白質、脂質和幾丁質組成(哈里森(Harrison)和波恩(Bonning)，2010)。黑僵菌(Metarhizium anisopliae)和球孢白僵菌(Beauveria bassiana)對昆蟲的真菌感染通過以下發(fā)生：當真菌孢子在表皮上萌發(fā)時，形成可使各種酶(包括蛋白酶)穿透表皮的結構(弗瑞莫澤(Freimoser)等人，2003；卓(Cho)等人，2006)。由黑僵菌產生的一種著名的絲氨酸蛋白酶PR1A消化表皮并且在穿透中起至關重要的作用(圣萊格(St.Leger)等人，1987)。黑僵菌的克隆體經過工程改造含有額外的pr1a基因拷貝并且顯示出比野生型多殺死25％的煙草天蛾(圣萊格等人，1996)。球孢白僵菌也經過工程改造以表達黑僵菌PR1A蛋白酶并且展示出對馬尾松毛蟲(Masson's pine caterpillar/Dendrolimus punctatus)和大蠟螟(wax moth/Galleria mellonella)的幼蟲的毒性增強(陸(Lu)等人，2008)。
昆蟲的基底膜由蛋白質組成，蛋白質包圍著組織并且有助于從結構支撐到病毒屏障的各種功能。使用苜蓿丫紋夜蛾多核多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus；AcMNPV)評估三種潛在的基底膜降解蛋白。這種桿狀病毒經過工程改造以表達兩種脊椎動物金屬蛋白酶大鼠基質溶素和人類白明膠酶A以及果蠅組織蛋白酶L(ScathL)。ScathL蛋白酶展現出最佳的桿狀病毒活性。被感染的煙夜蛾幼蟲的中值存活時間相比于被野生型感染的幼蟲縮短了50％(哈里森和波恩，2001)。此數據支持以下觀點：在病毒中表達的蛋白酶具有穿過昆蟲基底膜的能力，昆蟲基底膜一般用作病毒屏障。早先報導鑒別出了果蠅幼蟲的成蟲盤的兩種易被組織蛋白酶L水解的基底膜蛋白(霍馬(Homma)和名取(Natori)，1996)。當將純化后的ScathL蛋白酶注射到血腔中時，它對各種昆蟲害蟲仍然有毒。純化后的蛋白酶在鱗翅目幼蟲中展現出與ScathL表達的桿狀病毒感染所看到的類似的黑化、死亡率和血淋巴蛋白酶活性(李(Li)等人，2008)。純化后的ScathL蛋白酶在體內和體外均造成基底膜破壞(唐(Tang)等人，2007；菲利普(Philip)等人，2007)。
節(jié)肢動物捕食者的毒液中也顯示出含有裂解基底膜的蛋白酶。一個實例是寄生蜂(parasitic wasp/Eulophus pennicornis)，其中在毒腺中鑒別到了3種金屬蛋白酶(EpMP1-3)。將重組性EpMP3注射到番茄蛾(Lacanobia oleracea)幼蟲的血腔中，造成顯著的死亡率，或存活幼蟲的發(fā)育和生長減弱(普萊斯(Price)等人，2009)。群居性兵蚜若蟲在其腸內產生毒性組織蛋白酶B蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)。蛋白酶經口排向敵人，并展現出殺昆蟲活性(沓掛(Kutsukake)等人，2008)。
從細菌嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophila)分離的蛋白酶已顯示抑制昆蟲免疫反應中所參與的抗細菌肽，使得昆蟲易受致病過程的影響(卡爾達(Caldas)等人，2002)。腸桿菌發(fā)光桿菌(Photorhabdus luminscense)已顯示可使廣泛范圍的昆蟲致病。這種細菌的基因組序列鑒定與毒性相關的基因，包括蛋白酶(迪紹(Duchaud)等人，2003)。
植物修飾也對蛋白酶作為殺昆蟲劑的用途感興趣。對降解基底膜的蛋白酶進行表征并且針對轉基因殺昆蟲方案進行工程改造，目標是研發(fā)出對昆蟲害蟲具有抗性的轉基因植物(第6,673,340號美國專利，哈里森和波恩，2004)。昆蟲腸道中的蛋白酶已顯示會影響蘇云金芽孢桿菌Cry殺昆蟲蛋白的效果。一些蛋白酶通過將Cry蛋白質從原毒素處理成毒性形式來活化Cry蛋白質。昆蟲毒素經過修飾以包含蛋白水解活化位點，目標是將這種修飾并入到轉化后的植物、植物細胞和種子中。昆蟲腸道蛋白酶裂解這些位點，在害蟲腸道內產生活性昆蟲毒素(第7,473,821號美國專利，阿巴德(Abad)等人，2009)。
幾丁質酶的殺昆蟲活性
幾丁質酶通過刺穿昆蟲中腸壁和降解昆蟲表皮而加快殺昆蟲活動。這些膜的降解使昆蟲暴露于病原體、其它殺昆蟲化合物和/或植物防御中。
幾丁質酶使結構多糖幾丁質水解，結構多糖幾丁質是2-乙酰氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖苷的線性均聚物，通過β-1→4鍵連接，是昆蟲的外骨骼和腸壁的組分。幾丁質酶歸類為家族18或家族19糖基水解酶。家族18幾丁質酶廣泛可見于細菌、植物和動物中；而家族19幾丁質酶主要可見于植物中(亨利薩塔(Henrissat)和巴洛赫(Bairoch)，1993)。在昆蟲中，幾丁質酶起蛻皮作用(塞繆爾斯(Samuels)和雷諾(Reynolds)，1993；梅宗多費爾(Merzendorfer)和齊莫赫(Zimoch)，2003)。
單獨的幾丁質酶顯示出一些殺昆蟲活性。發(fā)現來自粘質沙雷氏菌(Serretia marcenscens)的幾丁質酶對七齡大蠟螟幼蟲有毒(賴森科(Lysenk)，1976)。表達昆蟲幾丁質酶的轉基因植物顯示具有增強的昆蟲害蟲抗性。用編碼煙草天蛾(Manduca sexta)幾丁質酶的cDNA轉化煙草植物。用美洲煙葉蛾(Heliothis virescens)幼蟲侵擾這些轉基因植物的葉子。3周后發(fā)現，幾丁質酶陽性葉相比于幾丁質酶陰性葉，幼蟲生物質少并且飼料破壞小?？赡軒锥≠|酶的活性使得昆蟲更容易遭到植物防御(丁(Ding)等人，1997)。
昆蟲表皮提供物理屏障，用于保護昆蟲不受病原體或其它環(huán)境危害物的影響，并且主要由幾丁質構成(克拉默(Kramer)等人，1995)。昆蟲病原性真菌黑僵菌、蠶白僵菌(Beauvaria bassiana)、多形白僵菌(Beauvaria amorpha)、蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)和黃曲霉(Aspergillus flavus)全部分泌幾丁質酶來分解表皮并進入昆蟲宿主(圣萊格等人，1986，1992；坎波斯(Campos)等人，2005)。根據金姆(Kim)等人，含幾丁質酶的球孢白僵菌上清液對棉蚜(Aphis gossypii)成蟲有毒。然而，當用過量的幾丁質處理這些上清液以抑制真菌幾丁質酶的活性時，這種死亡率顯著降低，表明幾丁質酶在分解表皮和促進感染方面起不可或缺的作用(金姆等人，2010)。還從內寄生蜂甲腹繭蜂(Chelonus sp.)的毒液中分離出了幾丁質酶，其中幾丁質酶可能有助于毒液滲透幾丁質保護的獵物的防御(克里希南(Krishnan)等人，1994)。
圍住昆蟲中腸的圍食膜是另一種主要由幾丁質構成的保護昆蟲遠離病原體的屏障。任何可以穿過這種膜的酶都具有作為生物殺蟲劑的潛力(王和格拉納多斯，2001)。哈布納(Hubner)等人證明，瘧原蟲排出幾丁質酶以滲透蚊子的圍食膜(哈布納等人，1991)，并且沙哈布丁(Shahabuddin)等人證實，用阿洛氨菌素(allosamidin)抑制幾丁質酶足以防止瘧原蟲雞瘧原蟲(Plasmodium gallinaceum)穿過自由繁殖按蚊(Anopheles freeborni)的圍食膜。此外，在自由繁殖按蚊中腸的發(fā)育期間，添加來自灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)的外源性幾丁質酶防止形成圍食膜(沙哈布丁等人，1993)。這證明幾丁質酶可以分解圍食膜。雷格夫(Regev)等人使用大腸桿菌(E.coli)來表達粘質沙雷氏菌內切幾丁質酶ChiA，并用電子顯微鏡證實，暴露于內切幾丁質酶的灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)幼蟲展現出圍食膜刺穿(雷格夫等人，1996)。
因為幾丁質酶具有刺穿圍食膜的能力，所以內切幾丁質酶還顯示提高了蘇云金芽孢桿菌(Bt)的殺昆蟲活性。用經過Bt和幾丁質酶的經過稀釋的商業(yè)調配物的混合物處理的香脂冷杉(Abies balsamea)飼養(yǎng)的云杉卷葉蛾(Choristoneura fumiferana)幼蟲比僅用經過單獨的Bt處理的葉子飼養(yǎng)的幼蟲被殺死得快(斯米諾夫(Smirnoff)，1973)。低濃度的Bt和粘質沙雷氏菌幾丁質酶的混合物也導致灰翅夜蛾幼蟲的死亡率比單獨的Bt高(希合(Sheh)等人，1983)?？梢哉J為，這種協(xié)同效應歸因于幾丁質酶刺穿了昆蟲腸道的圍食膜壁，促進Bt孢子滲透到昆蟲中(斯米諾夫，1973)。
Yen-Tc是對于昆蟲褐新西蘭肋翅鰓角金龜(Costelytra zealandica)中的鼠疫食蟲動物(Yersinia entomophaga)的昆蟲病原性來說所需要的并且足夠的ABC型蛋白質，含有兩種家族18幾丁質酶，使它成為第一種經過鑒定并入有幾丁質酶的殺昆蟲毒素復合物。假設幾丁質酶負責分解圍食膜并且使中腸上皮細胞暴露于毒素。然而，幾丁質酶可以僅在具有相對中性的pH的中腸區(qū)域中具有活性(巴斯比(Busby)，2012)。
幾丁質酶還是一些昆蟲病毒的活性所不可或缺的。哈特溫(Hatwin)等人制造了缺乏幾丁質酶基因的苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)突變體。這種病毒通常造成宿主幼蟲液化，有助于病毒擴散。當粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)幼蟲被幾丁質酶陰性病毒感染時，不會出現這種液化。還證實了，AcMNPV幾丁質酶在昆蟲中腸的堿性條件下具有活性(哈特溫等人，1997))發(fā)現同一苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒的表達長角血蜱(Haemaphysalis longicornis)幾丁質酶的重組版本具有抗長角血蜱若蟲的生物殺螨活性(阿賽納(Assegna)等人，2006)。
Rhs樣基因編碼殺昆蟲毒素
rhs(重組熱點)基因家族最早在大腸桿菌中鑒別到。這些基因通過同源交換賦予染色體重排(林(Lin)等人，1984)。它們的大小是2到12kb，并且展現出長核心與短尖端。核心序列富含GC并且高度保守，但尖端序列GC稀少并且高度可變。它們編碼具有大核心域和短C端尖端域的蛋白質。蛋白質核心域是親水性的并且含有YD重復序列(杰克遜(Jackson)等人，2009)。Rhs蛋白能夠與細菌細胞表面相互作用并且結合到特異性配體(王(Wang)等人，1998)。雖然Rhs蛋白的功能仍然未知(希爾(Hill)等人，1994)，但是結構很重要，因為YD重復序列和高度保守序列類似于編碼由細菌產生的殺昆蟲毒素的rhs和rhs樣基因。
發(fā)光桿菌是異小桿線蟲科(Heterorhabditae family)線蟲的共生有機體。線蟲感染昆蟲并將細菌注入昆蟲血腔中。然后，細菌分泌毒素殺死昆蟲(弗羅斯特(Frost)等人，1997)。博文(Bowen)等人(1998)純化出了靶向昆蟲的與經口和可注射殺昆蟲毒性相關的高分子量蛋白質。在另一項研究中，博文等人(1998)使用高效液相色譜將這種蛋白質分離成四種毒素復合物(tc)，稱為Tca、Tcb、Tcc和Tcd，由tc基因座編碼(博文等人，1998)。沃特菲爾德(Waterfield)等人(2001)分析了tc基因在大腸桿菌中的重組表達以了解Tc蛋白的經口毒性。他們發(fā)現，在沒有tccC樣同源物的情況下，他們無法在大腸桿菌中恢復經口毒性。這些作者推斷，TccC參與了毒素分泌的活化。此外，氨基酸序列分析顯示，TccC和TccC樣蛋白具有高度保守的核心和高度可變的延伸部分。這種結構與rhs樣元件有相似之處(沃特菲爾德NR、博文DJ、費瑟斯頓JD(Fetherston JD)、佩里RD(Perry RD)和弗倫奇-康斯坦特RH(ffrench-Constant RH)，2001)。這種相似性表明TccC樣蛋白和Rhs蛋白在毒素遷移率和活化腸內菌科(Enterobacteriaceae family)方面共同具有舊作用(弗倫奇-康斯坦特R等人，2003)。
另一種微生物嗜蟲沙雷氏菌(Serratia entomophila)具有殺昆蟲活性，它靶向新西蘭草金龜(New Zealand grass grub)褐新西蘭肋翅鰓角金龜，并且造成琥珀病(amber disease)(格里蒙(Grimont)等人，1988)。嗜蟲沙雷氏菌的毒性與稱作琥珀病相關質粒(pADAP)的大型質粒有關(格雷爾(Glare)等人，1993)。赫斯特(Hurst)等人分析pADAP的突變誘發(fā)和核苷酸序列來了解它是如何賦予草金龜致病性的。他們發(fā)現，pADAP編碼負責琥珀病癥狀的三個基因sepA、sepB和sepC。所有三個基因都為致病性所需的，因為這些基因的突變會祛除琥珀病。他們說明了由sep基因編碼的蛋白質類似于由發(fā)光桿菌的殺昆蟲毒素復合物編碼的蛋白質。舉例來說，SepC和TccC的前680種氨基酸顯示出強相似性。此外，這個區(qū)域類似于大腸桿菌的rhs元件。sepC基因小于Rhs元件，但它編碼具有九種Rhs肽變異體的親水性蛋白質核心?；趕ep與tc基因之間的相似性，赫斯特等人推斷這些產物是一組新的殺昆蟲毒素的一部分(赫斯特等人，2000)。
原田(Harada)等人發(fā)現，玉米細菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii ssp.)DC283是感染蚜蟲的侵襲性病原體(原田等人，1996)。蚜蟲攝入細菌，DC283能夠在腸道中聚集并導致蚜蟲死亡。斯塔費里尼德(Stavrinides)等人進行了突變誘發(fā)篩選并且發(fā)現ucp1(你不能通過(you cannot pass))基因座負責DC283的毒性。ucp1基因序列的分析揭示出與Rhs蛋白家族的相似性。ucp1基因小于編碼RHS/YD蛋白的基因并且不具有結合YD重復序列的配體，但它具有保守的5'核心、非同源3'端，并且它是膜結合蛋白。這些結構相似性表明腸植物定殖體具有定殖于昆蟲宿主的遺傳能力。此外，ucp1與rhs基因之間的相似性表明rhs樣基因具有潛在的殺昆蟲活性(斯塔費里尼德等人，2010)。
盡管存在這些已知蛋白質，但是昆蟲可能會對表達這些已知基因的植物進化出抗性。因此，需要尋找具有殺昆蟲活性的新穎蛋白質。
技術實現要素：
一方面，本發(fā)明提供來自細菌活性紫色細菌的殺昆蟲蛋白質的核苷酸序列。這種細菌的分離和部分表征描述于例如第7,244,607號美國專利中。另外提供由活性紫色細菌殺昆蟲蛋白質編碼的多肽的氨基酸序列。
另一方面，本發(fā)明提供經分離核酸(例如，DNA、RNA、核酸類似物)，其包含活性紫色細菌殺昆蟲蛋白質序列、基因序列、其片段和或突變變異體。還提供了核酸載體(例如，質粒載體、病毒載體)，包括表達載體，其包含具有活性紫色細菌基因序列和/或其片段的核酸。例示性細菌載體包括(但不限于)根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、根瘤菌NGR234、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)和百脈根根瘤菌(Mesorhizobium loti)。
例示性病毒載體包括(但不限于)花椰菜花葉病毒(CaMV)、豌豆早枯病毒(PEBV)、菜豆莢斑點病毒(BPMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、蘋果潛隱球形病毒(ALSV)、煙草花葉病毒(TMV)、馬鈴薯病毒X、雀麥草花葉病毒(BMV)以及大麥條紋花葉病毒(BSMV)。
還提供了用以上核酸或載體轉染的細胞。這類細胞可以是植物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞或真菌細胞(例如，酵母)。還提供了包含已用以上核酸或載體轉染的細胞(植物細胞或其它細胞)的植物、來自所述植物的種子以及所述植物的后代。經過轉染的細菌細胞可以包括農桿菌(例如，根癌農桿菌)、根瘤菌、苜蓿中華根瘤菌和百脈根根瘤菌。還提供了包含核酸載體的昆蟲載體(例如，玻璃翅葉蟬(Homalodisca vitripennis/glassy-winged sharpshooter))，所述核酸載體本身包含活性紫色細菌序列。
在其它實施例中，提供由活性紫色細菌基因編碼的多肽。還提供了活性紫色細菌多肽的功能片段和活性紫色細菌多肽的經過保守取代的變異體。
在其它實施例中，提供包含一或多個經分離核酸的植物，所述經分離核酸包含活性紫色細菌基因序列和/或其片段。這些經分離核酸可以存在于植物外部或細胞內部或細胞之間。
在其它實施例中，提供包含一或多個核酸載體的植物，其中所述載體包含活性紫色細菌基因序列和/或其片段。所述載體可以存在于植物外部或內部。
在其它實施例中，提供包含一或多個活性紫色細菌多肽的植物。所述活性紫色細菌多肽可以存在于植物外部或內部。
還提供了包含活性紫色細菌多肽的一或多個功能片段和/或一或多個經過保守取代的變異體的植物。所述片段和/或經過保守取代的變異體可以存在于植物外部或內部。
還提供了上述植物的后代。另外提供來自上述植物和來自其后代的種子。
本文還披露了害蟲防治方法；例如用于調整植物中的害蟲侵擾的方法。這類害蟲可以是例如昆蟲、真菌、線蟲、螨蟲、蛾或蚜蟲。方法包括向植物內部或外部施用包含活性紫色細菌基因序列或其片段的核酸。其它方法包括向植物內部或外部施用活性紫色細菌多肽、或其片段、或其經過保守取代的變異體。
還提供了殺蟲(例如，殺昆蟲)組合物，其包含由活性紫色細菌基因編碼的核酸和/或多肽。這類組合物可以任選地包括其它天然產生的或人造的殺昆蟲劑或殺蟲劑。
本文尤其披露了以下實施例：
1.一種細胞，其包含具有異源啟動子的重組載體，所述異源啟動子操作性地連接到編碼與SEQ ID NO:1-3具有95％一致性的多肽的核苷酸。
2.一種植物或植物部分，其包含一或多個根據實施例1所述的細胞或其后代或種子。
3.根據實施例2所述的植物或植物部分，其中所述植物部分選自由花粉、胚珠、花、芽、根、莖、絲、穗、耳穗以及葉組織組成的群組。
5.一種抗體，其結合到根據實施例1所述的多肽。
6.根據實施例1所述的細胞，其中所述細胞是細菌、哺乳動物或真菌細胞。
7.一種產生昆蟲抗性植物的方法，其包含將根據實施例1所述的重組載體轉化到植物細胞中的步驟。
8.一種防偽研磨種子，其具有根據實施例1所述的植物細胞作為來源指示。
9.一種殺蟲組合物，其包含(a)一或多個具有如SEQ ID NO:1-6中所闡述的序列的核酸和/或多肽和(b)載劑。
10.根據實施例9所述的殺蟲組合物，其中所述組合物是殺昆蟲劑。
11.根據實施例10所述的殺蟲組合物，其進一步包含第二殺蟲劑。
12.根據實施例11所述的殺蟲組合物，其中所述第二殺蟲劑是殺昆蟲劑。
13.一種用于調整植物中的害蟲侵擾的方法，所述方法包含使植物或植物部分與可有效調整所述害蟲侵擾的量的根據實施例9所述的殺蟲組合物接觸。
14.根據實施例13所述的方法，其中所述害蟲選自由昆蟲、真菌、線蟲、細菌和螨蟲組成的群組。
15.根據實施例14所述的方法，其中所述昆蟲包含粉紋夜蛾、甜菜夜蛾、草盲蝽或小菜蛾。
16.一種種子包衣材料，其包含根據實施例1所述的多肽，和載劑、稀釋劑或佐劑中的一或多種。
具體實施方式
除非另外指明，否則本發(fā)明實踐采用農業(yè)、植物分子生物學、昆蟲學、細胞生物學、分子生物學、生物化學、重組DNA領域和相關領域中在技術范圍內的標準方法和常規(guī)技術。這類技術在文獻中有描述并且因此可供本領域的普通技術人員使用。參見例如艾伯茨B.(Alberts,B.)等人,“細胞分子生物學(Molecular Biology of the Cell),”第5版,加蘭科學出版社(Garland Science),紐約州紐約(New York,NY),2008；富特D.(Voet,D.)等人“生物化學基本原理：分子水平的生命(Fundamentals of Biochemistry:Life at the Molecular Level),”第3版,約翰·威利父子公司(John Wiley&Sons),新澤西州霍博肯(Hoboken,NJ),2008；薩姆布魯克J.(Sambrook,J.)等人,“分子克隆實驗指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),”第3版,冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),2001；奧斯貝F.(Ausubel,F.)等人,“最新分子生物學實驗方法匯編(Current Protocols in Molecular Biology),”約翰·威利父子公司,紐約,1987和定期更新；格洛弗(Glover),DNA克隆實用方法(DNA Cloning:A Practical Approach),第I卷和第II卷,IRL出版社(1985),第III卷,IRL出版社(1987)；佩巴爾(Perbal),分子克隆實踐指南,約翰·威利父子公司(1984)；里格比(Rigby)(編),“基因工程(Genetic Engineering)”系列(學術出版社(Academic Press))；賽特洛(Setlow)和霍蘭德(Hollaender)(編),“基因工程：原理和方法(Genetic Engineering:Principles and Methods)”系列,普雷納姆出版社(Plenum Press)；蓋特(Gait)(編),寡核苷酸合成實用方法(Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach),IRL出版社(1984,1985)；?？怂固?Eckstein)(編)寡核苷酸和類似物實用方法(Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach),IRL出版社(1991)；哈梅斯(Hames)和希金斯(Higgins),核酸雜交實用方法(Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach),IRL出版社(1985)；哈梅斯和希金斯,轉錄與轉譯實用方法(Transcription and Translation:A Practical Approach),IRL出版社(1984)；B.布加南(B.Buchanan),W.格呂塞姆(W.Gruissem)和R.瓊斯(R.Jones)(編)“植物生物化學和分子生物學(Biochemistry and Molecular Biology of Plants),”威利(Wiley)(2002)以及“酶學方法(Methods in Enzymology)”系列,學術出版社,加利福尼亞州圣地亞哥(San Diego,CA)。以上所有參考文獻的披露內容出于描述相關領域中的方法和組合物的目的以全文引用的方式并入本文中。
當提供數值范圍時，應理解，除非上下文另外明確規(guī)定，否則在該范圍上下限之間的達到下限單位十分之一的每一中間值，以及所述范圍內的任何其它所述值或中間值都包括在其中。也包括更小的范圍。這些更小范圍的上限和下限也包括在其中，但不包括所述范圍中的任何特定排除的界限。
除非另外定義，否則本文中所用的所有技術和科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。盡管在本發(fā)明的操作或測試中也可以使用與本文中描述的方法和材料類似或等效的任何方法和材料，但是現在描述優(yōu)選方法和材料。
必須指出，除非上下文另外明確規(guī)定，否則如本文中和所附權利要求書中所用的單數形式“一”和“所述”包括復數個參考物。
如本文中所用，術語“構筑體”意指源自任何來源、能夠基因組整合或自主復制、包含多核苷酸分子的任何重組多核苷酸分子，如質粒、粘粒、病毒、自主復制多核苷酸分子、噬菌體或線性或環(huán)狀單鏈或雙鏈DNA或RNA多核苷酸分子，其中一或多個多核苷酸分子按功能上操作性方式連接，即可操作地連接。
如本文中所用，術語“可操作地連接”是指第一分子連接到第二分子，其中所述分子安排成第一分子影響第二分子的功能。兩個分子可以是或者可以不是單個連續(xù)分子的一部分，并且可以是相鄰的或者可以是不相鄰的。舉例來說，如果啟動子調整細胞中相關可轉錄多核苷酸分子的轉錄，那么啟動子可操作地連接于可轉錄多核苷酸分子。
構筑體可以包括本領域中已知的任何啟動子或前導序列。舉例來說，啟動子可以可操作地連接于異源非轉譯5'前導序列，如源自熱休克蛋白基因的前導序列(參見例如第5,659,122號美國專利和第5,362,865號美國專利)?；蛘?，前導序列可以可操作地連接于異源啟動子，如花椰菜花葉病毒35S轉錄啟動子(參見第5,352,605號美國專利)。
如本文中所用，術語“可轉錄多核苷酸分子”是指任何能夠被轉錄到RNA分子中的DNA分子，包括(但不限于)具有蛋白質編碼序列(SEQ ID NO:4-6)的那些和具有適用于基因抑制的序列的那些?！稗D基因”是指宿主細胞異源可轉錄多核苷酸分子和/或人工并入到宿主細胞基因組中的可轉錄多核苷酸分子。
啟動子可以可操作地連接于就啟動子分子而言是異源的可轉錄多核苷酸分子。如本文中所用，術語“異源”是指當兩個或更多個多核苷酸分子的組合通常不存在于自然界中時的此類組合。舉例來說，兩個分子可以源自不同物種和/或兩個分子可以源自不同基因，例如來自相同物種的不同基因或來自不同物種的相同基因。因此，如果此類組合通常不存在于自然界中，那么就可操作地連接的可轉錄多核苷酸分子而言，啟動子是異源的，即與該啟動子分子組合可操作地連接的可轉錄多核苷酸分子不是天然產生的。
可轉錄多核苷酸分子一般可以是任何為RNA轉錄物的表達所需的DNA分子。RNA轉錄物的這類表達可以引起所得mRNA分子的轉譯并且因此引起蛋白質表達?；蛘撸赊D錄多核苷酸分子可以設計成最終導致可以增強SEQ ID NO:1-3的蛋白質表達的特定基因或蛋白質的表達降低。這可以通過使用沿反義方向定向的可轉錄多核苷酸分子來實現。本領域的普通技術人員熟悉這類反義技術的使用。簡單來說，當反義可轉錄多核苷酸分子轉錄時，RNA產物與細胞內部的互補RNA分子雜交并且螯合。這種雙螺旋RNA分子不能通過細胞的轉譯機器轉譯成蛋白質并且在細胞中降解。任何基因都可以按這種方式進行負向調節(jié)。
多核苷酸和寡核苷酸
多核苷酸是核苷酸的聚合物，并且所述術語意味著涵蓋通過較大的多核苷酸的片段化產生的較小多核苷酸(片段)。術語多核苷酸和核酸涵蓋RNA和DNA，以及單鏈和雙鏈多核苷酸和核酸。多核苷酸還包括經修飾的多核苷酸和核酸，其含有如本領域中所知的堿基、糖或磷酸酯基的修飾。
寡核苷酸是短核酸，一般是DNA并且一般是單鏈。一般而言，寡核苷酸將短于200個核苷酸，更確切地說，短于100個核苷酸，最確切地說，50個核苷酸或更短。
經修飾的堿基和堿基類似物是本領域中已知的，例如能夠與天然產生的堿基形成胡斯坦(Hoogsteen)和反胡斯坦堿基對的那些。實例包括(但不限于)8-氧代-腺苷、假異胞苷、5-甲基胞苷、肌苷、2-氨基嘌呤以及各種吡咯并和吡唑并嘧啶衍生物。類似地，經修飾的糖殘基或類似物(例如2'-O-甲基核糖或肽核酸主鏈)也可以形成經修飾的堿基或堿基類似物的組分。參見例如孫(Sun)和海林(Helene)(1993)現代結構生物學評論(Curr.Opin.Struct.Biol.)3:345-356。能夠與多核苷酸進行任何類型的序列特異性相互作用的非核苷酸大分子適用于本文所披露的方法和組合物中。實例包括(但不限于)肽核酸、小溝結合劑和抗生素。能夠參與雙螺旋體或三螺旋體形成的新的經修飾堿基、堿基類似物、經修飾糖、糖類似物、經修飾磷酸酯和磷酸酯類似物可用于本領域中，并且適用于本文中所披露的方法和組合物中。
核酸和多肽的同源性和一致性
如本文在核酸和多肽的情況下所使用的“同源性”或“一致性”或“相似性”分別是指兩個多肽或兩個核酸分子之間基于氨基酸序列或核酸序列的比對的關系。同源性和一致性可以各自通過比較每個序列中可以出于比較目的比對的位置來進行測定。舉例來說，可以比較“參考序列”與“測試序列”。當參考序列的位置被測試序列中等效位置的相同堿基或氨基酸占據時，那么所述分子在那個位置是相同的；當等效位置被類似氨基酸殘基(例如，立體和/或電子性質類似)占據時，那么所述分子可以稱為在那個位置同源(類似)。兩個序列的親緣關系當表示為同源性/相似性或一致性的百分比時，是所比較序列所共用的位置處的相同或類似氨基酸的數量的函數。在比較兩個序列時，一個序列相比于另一個序列來說不存在殘基(氨基酸或核酸)或存在額外殘基都會降低一致性和同源性/相似性。
如本文中所用，術語“一致性”是指當比對兩個或更多個序列以使序列匹配達到最大(即考慮了間隙和插入)時，所述序列中在對應位置處的相同核苷酸或氨基酸殘基的百分比。一致性可以通過已知方法容易地計算，方法包括(但不限于)以下各者中所述的那些：計算分子生物學(Computational Molecular Biology),萊斯克A.M.(Lesk,A.M.)編,牛津大學出版社(Oxford University Press),紐約,1988；生物計算：信息學和基因組計劃(Biocomputing:Informatics and Genome Projects),史密斯D.W.(Smith,D.W.)編,學術出版社,紐約,1993；序列數據的計算機分析(Computer Analysis of Sequence Data),第I部分,格里芬A.M.(Griffin,A.M.)和格里芬H.G.(Griffin,H.G.)編,胡馬納出版社(Humana Press),新澤西州(New Jersey),1994；分子生物學中的序列分析(SequenceAnalysis in Molecular Biology),馮·海涅G.(von Heinje,G.),學術出版社,1987；以及序列分析引物(Sequence Analysis Primer),格里布科夫M.(Gribskov,M.)和德弗羅J.(Devereux,J.)編,M斯托克頓出版社(M Stockton Press),紐約,1991；以及卡里洛H.(Carillo,H.)和利普曼D.(Lipman,D.),SIAM應用數學雜志(SIAM J.Applied Math.),48:1073(1988)。設計用于測定一致性的方法以在所測試序列之間得到最高程度的匹配。此外，在公開可用的計算機程序中編碼用于測定一致性的方法。用于測定兩個序列之間的一致性的計算機程序方法包括(但不限于)GCG程序包(德弗羅等人(1984)核酸研究(Nucleic Acids Research)12:387)、BLASTP、BLASTN和FASTA(奧特查爾(Altschul)等人(1990)分子生物學雜志(J.Molec.Biol.)215:403-410；奧特查爾等人(1997)核酸研究25:3389-3402)。BLAST X程序可從NCBI和其它來源公開獲得。參見例如BLAST手冊(BLAST Manual),奧特查爾S.等人,NCBI NLM NIH馬里蘭州貝塞斯達(Bethesda,Md.)20894；奧特查爾等人(1990)分子生物學雜志215:403-410。還可以使用眾所周知的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm)來測定一致性。
關于序列比較，通常一個序列充當參考序列，讓一或多個測試序列與它進行比較。一般比對序列在指定區(qū)域內的最大對應關系，例如長度為至少約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更多個氨基酸或核苷酸的區(qū)域，并且所述區(qū)域可以長達參考氨基酸序列或參考核苷酸序列的全長。當使用序列比較算法時，將測試序列和參考序列輸入計算機程序中，必要時指定子序列座標，并且指定序列算法程序參數。接著，序列比較算法根據所指定的程序參數來計算測試序列相對于參考序列的序列一致性百分比。
適合于測定序列一致性百分比的算法的實例是BLAST和BLAST 2.0算法，它們分別描述于奧特查爾等人(1990)分子生物學雜志215:403-410和奧特查爾等人(1977)核酸研究25:3389-3402中。用于執(zhí)行BLAST分析的軟件可通過美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)在www.ncbi.nlm.nih.gov公開獲得。其它例示性算法包括ClustalW(希金斯等人(1994)核酸研究22:4673-4680)，可在www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html獲得。
在另一個實施例中，兩個核酸之間的序列一致性也可以在通過堿基配對介導的兩個多核苷酸彼此退火、重新結合或雜交方面加以描述。多核苷酸之間的雜交根據已知的并且領域公認的堿基配對特性進行，使得腺嘌呤與胸腺嘧啶或尿嘧啶進行堿基配對，并且鳥嘌呤與胞嘧啶進行堿基配對。核苷酸的允許它與第二核苷酸進行堿基配對的特性稱作互補性。因此，腺嘌呤與胸腺嘧啶和尿嘧啶互補，并且反之亦然；類似地，鳥嘌呤與胞嘧啶互補，并且反之亦然。沿著整個長度與靶序列互補的寡核苷酸或多核苷酸被稱為與靶序列完美互補、完美匹配或完全互補，并且反之亦然。兩個多核苷酸可以具有相關序列，其中兩個序列中的大部分堿基是互補的，但是一或多個堿基是非互補的或錯配的。在這種情況下，序列可以稱為大體上彼此互補。如果兩個多核苷酸序列的情況是兩者在除了一個核苷酸位置之外的所有核苷酸位置互補，那么所述序列彼此來說具有單核苷酸錯配。
術語“大體上相同”是指第一氨基酸序列與第二氨基酸序列之間的一致性使得第一和第二氨基酸序列共用共同結構域和/或共同功能活性，第一氨基酸序列含有足夠的或最小數量的i)與第二氨基酸序列中的所比對的氨基酸殘基相同或ii)為第二氨基酸序列中的所比對的氨基酸殘基的保守取代的氨基酸殘基。舉例來說，含有與如本文所披露的氨基酸序列(即，SEQ ID NO:1-3)具有至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的一致性的共同結構域的氨基酸序列稱為大體上相同的。在核苷酸序列的情況下，術語“大體上相同”在本文中用于指第一核酸序列含有足夠的或最小數量的與第二核酸序列中所比對的核苷酸相同的核苷酸，使得第一和第二核苷酸序列編碼具有共同功能或結構活性的多肽，或編碼共同結構多肽域或共同功能多肽活性。
在另一個實施例中，術語“同源性”描述序列相似性的基于數學計算的比較，所述比較用于鑒別具有類似功能或模體的基因或蛋白質。使用參考核苷酸或氨基酸序列(例如，如本文所披露的序列)作為“查詢序列”對公共數據庫進行搜索，以例如鑒別其它家族成員、相關序列或同源物。此類搜索可以使用奧特查爾等人(1990)分子生物學雜志215:403-410的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)進行?？梢杂肗BLAST程序，評分＝100，字長＝12進行BLAST核苷酸搜索，以獲得與參考核苷酸序列同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序，評分＝50，字長＝3進行BLAST氨基酸搜索，以獲得與參考氨基酸序列同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的間隙比對，可以如奧特查爾等人(1997)核酸研究25:3389-3402中所述采用間隙BLAST。當采用BLAST和間隙BLAST程序時，可以使用各別程序(例如，XBLAST和BLAST)的默認參數(參見萬維網ncbi.nlm.nih.gov)。
本發(fā)明的核酸和多核苷酸涵蓋與SEQ ID NO:4-6中的任何一個具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％一致的核苷酸序列的那些核酸和多核苷酸。
核苷酸類似物和氨基酸類似物是本領域中已知的。因此，本發(fā)明還涵蓋包含核苷酸類似物的核酸(即，SEQ ID NO:4-6)和包含氨基酸類似物的多肽(即，SEQ ID NO:1-3)。
可轉錄多核苷酸分子可以是農藝相關基因。如本文中所用，術語“農藝相關基因”是指當在特定植物組織、細胞或細胞類型中表達時提供與植物形態(tài)、生理學、生長、發(fā)育、產率、產物、營養(yǎng)概況、疾病或昆蟲/害蟲抗性和/或環(huán)境或化學耐受性相關的所要特征的可轉錄多核苷酸分子。農藝相關基因包括(但不限于)由SEQ ID NO:4-6編碼的昆蟲防治基因或其相關蛋白質SEQ ID NO:1-3，它們編碼產率蛋白、抗脅迫蛋白、發(fā)育控制蛋白、組織分化蛋白、分生組織蛋白、環(huán)境反應蛋白、衰老蛋白、激素反應蛋白、脫落蛋白、源蛋白、下落蛋白(sink protein)、花控制蛋白、種子蛋白、除草劑抗性蛋白、疾病抗性蛋白、脂肪酸生物合成酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、殺蟲蛋白或任何其它試劑，如靶向特定抑制基因以增強SEQ ID NO:1-3的蛋白質表達的反義或RNAi分子。農藝相關基因的產物可以在植物內起作用，以便在植物生理學或代謝后造成影響或者可以充當以植物為食的害蟲的食物中的殺蟲劑。
如本文中所用，“對照植物”意指不含重組DNA的植物，所述重組DNA表達賦予增強性狀的蛋白質。對照植物用于鑒別和選擇具有增強性狀的植物。合適的對照植物可以是用于產生轉基因植物的親本品系的非轉基因植物，例如不含重組DNA。在一些情況下，合適的對照植物可以是不含重組DNA的半合子轉基因植物品系的后代，稱為陰性分離體。
如本文中所用，“增強性狀”意指轉基因植物的如下特征，包括(但不限于)增強的農藝性狀，其特征在于增強的昆蟲抗性、增強的植物形態(tài)、生理學、生長和發(fā)育、產率、營養(yǎng)強化、疾病或害蟲抗性、或環(huán)境或化學耐受性。在本發(fā)明的更具體方面，增強性狀選自由以下組成的增強性狀的群組：增強的水使用效率、增強的耐寒性、增加的產率、增強的氮使用效率、增強的種子蛋白以及增強的種子油。在本發(fā)明的一個方面，增強性狀是增加的產率，包括在非脅迫條件下的增加的產率和在環(huán)境脅迫條件下的增加的產率。脅迫條件可以包括例如干旱、幽暗、真菌疾病、病毒疾病、細菌疾病、昆蟲侵擾、線蟲侵擾、低溫暴露、熱暴露、滲透脅迫、降低的氮養(yǎng)分有效性、降低的磷養(yǎng)分有效性以及高植物密度?！爱a率”可能受到多種性質的影響，包括(但不限于)植物高度、莢果數量、莢果在植物上的位置、節(jié)間數量、莢果落粒的發(fā)生率、谷粒大小、結瘤固氮效率、營養(yǎng)同化效率、對生物和非生物脅迫的抗性、碳同化、植物構型、對倒伏的抗性、種子發(fā)芽百分比、幼苗活力以及幼體性狀。產率還會受到發(fā)芽效率(包括在脅迫條件下的發(fā)芽)、生長速率(包括在脅迫條件下的生長速率)、耳穗數量、每耳穗的種子數量、種子大小、種子組成(淀粉、油、蛋白質)以及種子填充特征的影響。
植物的增加的產率可以用多種方式測量，包括測試重量、每株植物的種子數量、種子重量、每單位面積的種子數量(例如，每英畝的種子或種子重量)、每英畝的蒲式耳數、每英畝的噸數、每英畝的噸數、每公頃的千克數。舉例來說，玉米產率可以按每單位生產面積的帶殼玉米粒的產量來測量，以蒲式耳/英畝或公噸/公頃計，常常在已按約15.5％水分針對水分調整的基礎上報告。增加的產率是由對關鍵生化化合物(如氮、磷和碳水化合物)的利用改良或對環(huán)境脅迫(如冷、熱、干旱、鹽漬以及害蟲或病原體的攻擊)的反應改良引起的。
保守取代和功能片段
在比較氨基酸序列時，不相同的殘基位置可以通過保守氨基酸取代不同。保守氨基酸取代是指具有類似側鏈的殘基的互換性。舉例來說，具有脂肪族側鏈的一組氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族羥基側鏈的一組氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族側鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側鏈的一組氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；并且具有含硫側鏈的一組氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。相對于參考多肽序列，僅相差保守取代的測試多肽序列表示參考序列的“經過保守取代的變異體”。
蛋白質、多肽或核酸的“功能片段”是序列與全長蛋白質、多肽或核酸不相同，但仍保留與全長蛋白質、多肽或核酸相同的功能的蛋白質、多肽或核酸。功能片段可以具有比對應的天然分子多、少或相同數量的殘基，和/或可以含有一或多個氨基酸或核苷酸取代。用于測定核酸功能(例如，編碼功能、與另一個核酸雜交的能力)的方法是本領域中已知的。類似地，用于測定蛋白質功能的方法也是已知的。舉例來說，多肽的DNA結合功能可以例如通過過濾結合、電泳遷移率改變或免疫沉淀分析測定。參見奧斯貝等人的同前文獻。一種蛋白質與另一種蛋白質相互作用的能力可以例如通過共免疫沉淀、雙雜合分析或遺傳和生化上的互補測定。參見例如菲爾茨(Fields)等人(1989)自然(Nature)340:245 246；第5,585,245號美國專利和PCT WO 98/44350。
功能片段通常保留至少50％的多肽活性或功能。在一些實施例中，功能片段保留至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的多肽活性或功能。
多肽的功能片段可以包括基本上不改變多肽活性或功能的保守氨基酸取代(相對于天然多肽序列)。術語“保守氨基酸取代”是指基于某些共同結構和/或性質給氨基酸分組。就共同結構來說，氨基酸可以分成以下各組：具有非極性側鏈的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)；具有不帶電極性側鏈的氨基酸(絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸和半胱氨酸)；以及具有帶電極性側鏈的氨基酸(賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和組氨酸)。含有芳香族側鏈的一組氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在脯氨酸、色氨酸和組氨酸中存在雜環(huán)側鏈。在含有非極性側鏈的氨基酸組內，含有短烴側鏈的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)可以與具有較長的非烴側鏈的氨基酸(蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)區(qū)別開來。在具有帶電極性側鏈的氨基酸組內，酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)可以與具有堿性側鏈的氨基酸(賴氨酸、精氨酸和組氨酸)區(qū)別開來。
用于定義個別氨基酸的共同性質的功能方法是為了分析同源生物體的對應蛋白質之間氨基酸改變的標準化頻率(舒爾茨G.E.(Schulz,G.E.)和R.H.斯戈默(R.H.Schirmer),蛋白質結構原理(Principles of Protein Structure),施普林格出版社(Springer-Verlag),1979)。根據這類分析，可以定義各組氨基酸，其中一個組內的氨基酸優(yōu)先在同源蛋白質中彼此取代，并且因此對整體蛋白質結構具有類似影響(舒爾茨G.E.和R.H.斯戈默的同前文獻)。根據這種類型的分析，“保守氨基酸取代”是指一個氨基酸殘基取代另一個共用氨基酸側鏈的化學和物理性質(例如，電荷、大小、疏水性/親水性)的氨基酸殘基。以下是共用某些化學和/或物理性質的氨基酸殘基的實例：
(i)含有帶電基團的氨基酸，由Glu、Asp、Lys、Arg和His組成，
(ii)含有帶正電基團的氨基酸，由Lys、Arg和His組成，
(iii)含有帶負電基團的氨基酸，由Glu和Asp組成，
(iv)含有芳族基的氨基酸，由Phe、Tyr和Trp組成，
(v)含有氮環(huán)基的氨基酸，由His和Trp組成，
(vi)含有大脂肪族非極性基團的氨基酸，由Val、Leu和Ile組成，
(vii)含有弱極性基團的氨基酸，由Met和Cys組成，
(viii)含有小殘基的氨基酸，由Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln和Pro組成，
(ix)含有脂族基的氨基酸，由Val、Leu、Ile、Met和Cys組成，以及
(x)含有羥基的氨基酸，由Ser和Thr組成。
某些“保守取代”可以包括在以下各組氨基酸殘基內的取代：gly、ala；val、ile、leu；asp、glu；asn、gln；ser、thr；lys、arg；以及phe、tyr。
因此，如上文所舉例說明，氨基酸的保守取代對本領域的技術人員來說是已知的并且一般可以在不改變所得分子的生物活性或功能的情況下完成。本領域的技術人員還認識到，一般來說，多肽非必需區(qū)域中的單一氨基酸取代基本上不改變生物活性。參見例如沃森(Watson)等人,“基因的分子生物學(Molecular Biology of the Gene),”第4版,1987,本杰明/卡明斯出版公司(The Benjamin/Cummings Pub.Co.),加利福尼亞州門洛帕克(Menlo Park,CA),第224頁。
本發(fā)明多肽涵蓋相較于如SEQ ID NO:1-3中所闡述的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多個氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)的多肽?？梢员蝗〈陌被釟埢梢晕挥诜歉叨缺Ｊ氐臍埢恢?。一般技術人員將了解，基于活性位點的位置和/或與相關蛋白質的同源性，蛋白質將耐受在其某些氨基酸殘基處的取代、缺失和/或插入，且不顯著改變其整體物理和化學性質。
本發(fā)明多肽涵蓋具有與SEQ ID NO:1-3中所示的多肽中的任何一個至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％一致的氨基酸序列的多肽。
RNA抑制
調節(jié)蛋白質表達的小RNA包括miRNA和ta-siRNA。miRNA是小(通常約21個核苷酸)RNA，它通過結合到靶蛋白的信使RNA，引起靶蛋白信使RNA不穩(wěn)定或抑制靶蛋白信使RNA的轉譯，最終引起靶蛋白減少，從而具有調整靶基因的表達的能力。艾倫(Allen)和卡林頓(Carrington)在美國專利申請公開US 2006/0174380A1中披露了ta-siRNA構筑體的設計和構筑以及其在調整轉基因植物細胞中的蛋白質方面的用途，所述公開以引用的方式并入本文中。這類小RNA的表達或抑制是本發(fā)明的宜參考miRNA的使用來加以說明的方面。
可以使用重組DNA構筑體，通過各種手段修飾天然miRNA的活性。通過增加miRNA的表達，例如在時間上或在空間上，可以增強對天然靶基因的表達的調整。用于抑制靶蛋白的表達的替代性基因抑制方法可以包括使用重組DNA構筑體，它產生一種合成miRNA，所述合成miRNA被設計成用于結合到靶蛋白信使RNA上的天然或合成miRNA識別位點。
通過降低miRNA的表達，可以減弱對天然靶基因的調整，促使靶蛋白(如SEQ IDNO:1-3)的表達增強。更確切地說，可以通過抑制結合到從靶蛋白的天然基因轉錄的信使RNA中的識別位點的miRNA的活性來增強靶蛋白的表達?？梢栽O計若干類型的重組DNA構筑體來抑制miRNA的活性。
舉例來說，產生大量具有miRNA識別位點的RNA的重組DNA構筑體可以用作天然miRNA的誘餌，使具有miRNA識別位點的內源性信使RNA在無天然miRNA干擾的情況下轉譯成靶蛋白。產生具有經修飾的miRNA識別位點(例如具有在位置10和/或11在21mer miRNA識別位點中的關于天然miRNA不成對的核苷酸)的RNA的重組DNA構筑體可以用來螯合自然表達的miRNA，從而減少通常在miRNA結合到識別位點時發(fā)生的裂解。不成對的核苷酸可以例如通過位置10與11之間的額外核苷酸或通過位置10和11處的核苷酸取代產生。
此外，可以產生如下重組DNA構筑體，它產生的RNA可以在植物中被加工成可以結合內源性miRNA識別位點，但不能夠誘導mRNA裂解的合成小RNA(miRNA樣)，這是因為小RNA經過修飾，例如通過具有在位置10和/或11的經修飾的核苷酸或具有缺失，所述缺失在小RNA與miRNA識別位點配對，在位置10與11之間產生凸起。所得合成小RNA是裂解阻斷劑，可以減少內源性miRNA結合并且從而阻斷所保護的miRNA目標位點的裂解，增強靶蛋白的表達。
被設計成用于產生蛋白質的經修飾信使RNA的重組DNA構筑體也可以用于從不再受天然miRNA調整的異源信使RNA表達蛋白質，其中天然miRNA識別位點經過修飾以對調節(jié)天然基因的同源miRNA的結合具有抗性。
通過增強miRNA的表達或通過增強miRNA結合編碼靶蛋白的RNA的能力來增強miRNA下調內源性蛋白質的活性。設計一種編碼RNA的重組DNA，所述RNA編碼miRNA或miRNA敏感性信使RNA，其編碼添加有miRNA結合位點的蛋白質，從而增強miRNA活性，促使對靶mRNA和同源蛋白質的抑制增強。使用美國專利申請公開US 2009/0070898A1中所披露的方法設計編碼RNA的重組DNA，所述RNA編碼miRNA或miRNA敏感性RNA。
一些(如果不是很多)miRNA調整多個蛋白質的表達或生化路徑。抑制或增強特定蛋白質的表達所提供給植物的增強性狀不如通過調整miRNA水平改變路徑中的酶活性來得多。因此，本發(fā)明的一些方面通過在植物細胞中使用可產生提高水平的miRNA的重組DNA構筑體增強miRNA活性來實現。本發(fā)明的其它方面通過在轉基因植物細胞中使用可產生降低水平或活性的miRNA的重組DNA構筑體降低miRNA活性來實現。
活性紫色細菌核酸
還提供了編碼活性紫色細菌基因的核苷酸序列和功能性RNA分子(例如，rRNA、tRNA)的核苷酸序列(SEQ ID NO:4-6)。還提供了包含這些序列的核酸。還提供了活性紫色細菌基因序列的片段。這類片段的長度是10個或更多個、25個或更多個、50個或更多個、75個或更多個、100個或更多個、200個或更多個、500個或更多個、或1,000個或更多個核苷酸。還提供了具有與上述序列50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％一致的序列的核酸。本文中所披露的核酸可以是DNA或RNA，并且可以是單鏈或雙鏈。還提供了包含與上述序列互補的核苷酸序列的核酸作為在嚴格條件下雜交到上述核酸的核酸。
本發(fā)明還提供多核苷酸，其包含編碼本文中所披露的多肽序列中的任一個的核苷酸序列。這類多核苷酸的核苷酸序列與編碼本文中所披露的多肽中的任一個的核酸的連續(xù)序列至少70％(例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％)一致。一致性百分比是基于所比較的序列中較短的序列?？梢圆捎靡阎绦?，如BLASTN(2.0.8)(奧特查爾等人(1997)核酸研究25:3389-3402)，使用默認參數并且不使用過濾器來進行序列比較。由于遺傳密碼的簡并，所以核酸序列一致性(例如編碼相同氨基酸序列的兩個不同多核苷酸之間)可能低于氨基酸序列一致性百分比。
編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸中的核酸序列的實例可見于SEQ ID NO:4-6中。也可以在表達載體中提供這些核酸序列(參見下文)。
活性紫色細菌多肽和蛋白質
本發(fā)明提供由活性紫色細菌基因組編碼的蛋白質的氨基酸序列，以及包含所述氨基酸序列(即，SEQ ID NO:1-3)的多肽。還提供了所述多肽的功能片段和經過保守取代的變異體。另外，還提供了本文中所披露的多肽的不保留功能的片段并且所述片段適用作例如用于制造抗體的表位。這類片段的長度是4個或更多個、10個或更多個、25個或更多個、50個或更多個、75個或更多個、100個或更多個、200個或更多個、500個或更多個、或1,000個或更多個氨基酸。
本發(fā)明還提供了一種多肽，它包含與如本文中所披露的多肽的連續(xù)序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.9％一致的氨基酸序列。一致性百分比是基于所比較的序列中較短的序列。用于測定多肽序列一致性程度的方法是本領域中已知的。
本發(fā)明多肽可以包括源自SEQ ID NO:1-3中的任一個的氨基酸序列，其進一步包含異源氨基酸序列。這類多肽可以是融合蛋白，如含有表位標簽、純化標簽和/或可檢測標記的融合蛋白。融合蛋白可以任選地在異源序列與活性紫色細菌氨基酸序列之間包括連接子序列。融合蛋白的制造方法是本領域中已知的。其它異源元件和例示性融合蛋白更詳細地描述于下文中。
含有異源元件的例示性多肽可以包括myc和/或His6標簽并且可以任選地包括側接連接子序列。
本發(fā)明多肽進一步涵蓋連接到報告多肽(例如熒光蛋白)和/或結合到分子的多肽。結合到多肽的分子可以是載體分子或有助于傳遞本發(fā)明多肽和/或增加本發(fā)明多肽的半衰期的部分。
本發(fā)明多肽可以通過任何合適的方法產生，包括重組和非重組方法(例如，化學合成)。本發(fā)明多肽可以通過本領域中已知的固相合成方法制備，(例如，Fmoc-或t-Boc化學法)，如梅里菲爾德(Merrifield)(1963)美國化學學會雜志(J.Am.Chem.Soc.)85:2149和分子生物學方法(Methods in Molecular Biology),第35卷:肽合成方案(Peptide Synthesis Protocol)所述的方法。
應注意，本發(fā)明多肽還可以含有額外元件，如可檢測標記，例如放射性標記、熒光標記、生物素標記、免疫可檢測標記(例如，血球凝集素(HA)標簽、多組氨酸標簽)等。可以通過各種方法(例如，以融合多肽形式)提供額外元件以促進本發(fā)明多肽的表達(例如N端蛋氨酸和/或用于促進宿主細胞中的表達的異源信號序列)和/或分離(例如，生物素標簽、免疫可檢測標簽)。多肽還可以任選地通過共價或非共價連接固定于載體上。
本發(fā)明多肽的分離和純化可以根據本領域中已知的方法實現。術語“經分離”打算意指化合物(例如多肽或多核苷酸)與它在自然界中所伴隨的所有或一些組分分離?！敖浄蛛x”還指化合物在制造(例如，化學合成、重組表達、培養(yǎng)基等)期間與它所伴隨的所有或一些組分分離的狀態(tài)。
舉例來說，根據本發(fā)明的多肽可以從已經經過基因修飾以表達本發(fā)明多肽的細胞溶解產物中、從細胞培養(yǎng)基中或從合成的反應混合物中分離。分離另外可以通過免疫親和力純化實現，免疫親和力純化一般涉及使樣品與特異性結合到多肽表位的抗體(任選地固定)接觸，洗滌以去除非特異性結合的材料，并且洗脫特異性結合的多肽。經分離多肽可以進一步通過透析和蛋白質純化中通常采用的其它方法純化，例如金屬螯合色譜、離子交換和尺寸排阻。
同源物
在又另一個實施例中，本發(fā)明提供獲得本文中所披露的活性紫色細菌基因的片段的同源物和由本文中所披露的ORF編碼的蛋白質的同源物的方法。具體地說，通過使用本文中所披露的核苷酸和氨基酸序列作為探針或作為引物，并且使用如PCR克隆和菌落/噬菌斑雜交等技術，本領域的普通技術人員可以獲得所述同源物。這類同源物可以從任何生物體獲得；例如色素桿菌屬的其它種或其它細菌。
在另一個實施例中，可以通過例如手動比較氨基酸序列，或通過使用基于計算機的工具，使用已知的基于同源性的搜索算法，如通常已知的并且被稱為BLAST、FASTA和史密斯-沃特曼的那些算法來鑒別同源物?？梢允褂镁植啃蛄斜葘Τ绦?例如BLAST)搜索序列數據庫，尋找類似序列，并使用總計預期值(E值)測量序列堿基相似性。因為針對特定生物體具有最佳E值的蛋白質命中(hit)可能不一定是直系同源物，例如具有相同功能，或者不一定是唯一的直系同源物，所以使用倒易移位查詢(reciprocal query)來過濾針對直系同源物鑒別具有顯著E值的命中序列。倒易移位查詢需要搜索來自基礎生物體的氨基酸序列數據庫中類似于查詢蛋白質的序列的顯著命中。當倒易移位查詢的最佳命中是查詢蛋白質本身或由物種形成后復制的基因編碼的蛋白質時，命中可以被鑒定為是直系同源物。由適用于本發(fā)明轉基因植物中的DNA編碼的同源物的另一方面是由于在天然序列中缺失或插入一或多個氨基酸而不同于所披露蛋白質的那些蛋白質。
抗體、檢測方法、試劑盒
還提供了選擇性結合由活性紫色細菌基因(如SEQ ID NO:1-3)編碼的蛋白質或多肽片段的抗體。這類抗體另外可以包含可檢測標記和/或連接到固體載體。這類抗體包括單克隆和多克隆抗體。還提供了產生上述單克隆抗體的融合瘤。
在其它實施例中，本發(fā)明提供鑒別測試樣品的方法，所述測試樣品源自細胞，所述細胞表達本文中所披露的ORF中的一或多個或其同源物。這類方法包含在允許本領域技術人員判定樣品是否含有ORF(或其一部分)或由其產生的產物的條件下，將測試樣品與一或多種本發(fā)明抗體或活性紫色細菌基因的一或多個片段一起培育。
在其它實施例中，提供含有執(zhí)行上述分析所需的試劑的試劑盒。具體地說，本文提供一種分區(qū)試劑盒，它被設計成用于以緊密約束容納一或多個容器，其包含：(a)第一容器，包含抗體中的一種或本發(fā)明的活性紫色細菌基因片段中的一種；和(b)一或多個包含以下中的一或多個的其它容器：洗滌試劑、能夠檢測結合抗體的存在情況的試劑或能夠檢測雜交核酸的存在情況的試劑。
使用本文中所披露的經分離蛋白質，本發(fā)明進一步提供獲得并且鑒別能夠結合到由活性紫色細菌ORF編碼的蛋白質的試劑的方法。具體地說，這類試劑包括抗體(上文所述)、肽、碳水化合物、藥學制劑等。這類方法包含以下步驟：(a)使試劑與由本文中所披露的ORF中的一種編碼的經分離蛋白質接觸；和(b)判定試劑是否結合到所述蛋白質。用于檢測蛋白質-蛋白質結合的方法是本領域中已知的并且包括例如過濾結合、免疫沉淀、雙雜合分析、凝膠阻滯以及報告亞單位互補(reporter subunit complementation)。參見例如美國專利5,503,977和5,585,245；菲爾茨(Fields)等人(1989)自然340:245-247；白(Bai)等人(1996)酶學方法(Meth.Enzymol.)273:331-347以及羅(Luo)等人(1997)生物技術(BioTechniques)22:350-352。
載體
關于使用重組技術產生多肽的實施例，方法可以涉及任何合適的構筑體和任何合適的宿主細胞，它可以是原核或真核細胞(例如細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、植物宿主細胞、昆蟲宿主細胞或經過培養(yǎng)的哺乳動物宿主細胞)。用于將遺傳物質引入到宿主細胞中的方法是本領域中已知的并且包括例如生物射彈、轉化、電穿孔、脂質體轉染、結合、磷酸鈣共沉淀等。轉移方法可以經過選擇，從而實現所引入的編碼多肽的核酸的穩(wěn)定表達?？梢蕴峁┚幋a多肽的核酸作為可遺傳的游離元件(例如，質粒)或可以對它進行基因整合。
還可以使用病毒載體進行本文中所披露的核酸的克隆和表達。例示性植物病毒載體包括花椰菜花葉病毒(CaMV)、豌豆早枯病毒(PEBV)、菜豆莢斑點病毒(BPMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、蘋果潛隱球形病毒(ALSV)、煙草花葉病毒(TMV)、馬鈴薯病毒X、雀麥草花葉病毒(BMV)以及大麥條紋花葉病毒(BSMV)。
可以使用其它載體在非植物生物體中表達活性紫色細菌多肽序列。這些載體包括原核克隆載體(例如，pBR322、pUC、噬菌體λ)、真菌載體(例如，酵母2微米質粒)、昆蟲克隆載體(例如，桿狀病毒)以及哺乳動物載體(例如，SV40)。
適合轉移編碼多肽的核酸的載體的組成可以不同。整合載體可以是條件復制型或自殺質粒、噬菌體等。構筑體可以包括各種元件，包括例如啟動子、可選擇遺傳標記(例如，賦予抗生素抗性的基因，例如新霉素(neomycin)、G418、甲氨蝶呤(methotrexate)、氨芐青霉素(ampicillin)、卡那霉素(kanamycin)、紅霉素(erythromycin)、氯霉素(chloramphenicol)或健大霉素(gentamycin))、復制起點(用于促進宿主細胞中的復制，例如細菌宿主細胞)等。載體的選擇取決于各種因素，如期望繁殖的細胞的類型和繁殖的目的。某些載體適用于擴增和制造大量所要DNA序列。其它載體適合于在細胞中表達蛋白質。其它載體適合于在完整的動物或植物的細胞中轉移和表達。適當載體的選擇完全在本領域的技術范圍內。多種此類載體是可商購的。
所用載體可以是基于游離質粒的表達載體，所述游離質粒含有可選擇抗藥性標記和在不同的宿主細胞中實現自主復制的元件。載體在本領域的普通技術人員眾所周知的眾多出版物中有充分描述，所述出版物包括例如分子生物學短方案(Short Protocols in Molecular Biology),(1999)F.奧斯貝等人編,威利父子公司(Wiley&Sons)。載體可以實現編碼本發(fā)明多肽的核酸的表達，可以實現本發(fā)明核酸的繁殖，或實現這兩者。
構筑體可以通過例如將相關多核苷酸插入到構筑體主鏈中來制備，通常是借助于連接到載體中的已裂解的限制酶位點的DNA連接酶。或者，可以通過同源重組或位點特異性重組，或通過一或多種擴增方法(例如，PCR)插入所要核苷酸序列。通常通過將同源性區(qū)域連接到所要核苷酸序列的側接序列上的載體來實現同源重組，同時可以通過使用有助于位點特異性重組(例如，cre-lox、att位點等)的序列實現位點特異性重組。含有這類序列的核酸可以通過例如寡核苷酸的連接或通過聚合酶鏈反應，使用包含同源性區(qū)域和所要核苷酸序列的一部分的引物來添加。
關于相關多肽的表達，可以采用表達盒。因此，本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明核酸的重組性表達載體。表達載體可以提供轉錄和轉譯調控序列，并且還可以實現誘導型或組成型表達，其中將編碼區(qū)可操作地放置在轉錄起始區(qū)(例如，啟動子、增強子)以及轉錄和轉譯終止區(qū)的轉錄控制下。這些控制區(qū)域可以是活性紫色細菌基因組與生俱來的，或可以源自外源性來源。因此，來自外源性來源的控制區(qū)域可以被視為可操作地連接于編碼本發(fā)明多肽的核酸的異源元件。一般來說，轉錄和轉譯調控序列可以包括(但不限于)啟動子序列、操縱基因序列、核糖體結合位點、轉錄開始和停止序列、轉譯開始和停止序列、聚腺苷酸化位點以及增強子或活化子序列。啟動子可以是組成型或誘導型，并且可以是強組成型啟動子(例如，T7啟動子、SP6啟動子等)。
可以在本文中所披露的重組構筑體中使用的例示性植物調控序列包括組成型啟動子，如CaMV 19S和35S啟動子以及來自編碼肌動蛋白或泛素的基因的那些?；蛘?，還可以使用經過調節(jié)的啟動子，如經過化學調節(jié)的啟動子(例如，經過四環(huán)素調節(jié))；和傷口誘導型啟動子(在傷口位點和在植物病原性感染位點表達)。在其它實施例中，啟動子可以是組織特異性的(例如，指定在根、葉、花、花序中表達)和/或時間調節(jié)型(例如，指定在幼苗中表達)。
用于植物細胞中的其它啟動子已有描述。參見例如斯坦福(Stanford)等人(1989)分子遺傳學與普通遺傳學(Mol.Gen.Genet.)215:200-208；許(Xu)等人(1993)植物分子生物學(Plant Molec.Biol.)22:573-588；羅格曼(Logemann)等人(1989)植物細胞(PlantCell)1:151-158；羅爾邁爾(Rohrmeier)和萊勒(Lehle)(1993)植物分子生物學22:783-792；費雷克(Firek)等人(1993)植物分子生物學22:129-142以及華納(Warner)等人(1993)植物雜志(Plant J.)3:191-201。
共同植物轉譯起始序列(即，核糖體結合位點)已經由喬希(Joshi)(1987)核酸研究15:6643-6653和克隆科技公司(Clontech)目錄1993/1994,第210頁描述。
表達載體一般具有便利的限制位點，其位于啟動子序列附近以實現編碼相關蛋白質的核酸序列的插入?？梢源嬖诳稍诒磉_宿主中操作的可選擇標記以促進含有載體的細胞的選擇。另外，表達構筑體可以包括其它元件。舉例來說，表達載體可以具有一個或兩個復制系統(tǒng)，從而允許它例如在用于表達的植物或昆蟲細胞中和在用于克隆和擴增的原核宿主中得以維持。另外，表達構筑體可以含有可選擇標記基因以選擇經過轉化的宿主細胞。選擇基因是本領域中已知的并且取決于所用宿主細胞而改變。
本文中提供的表達載體含有上述核酸和/或多核苷酸。這類表達載體可以含有啟動子(例如，T7啟動子、T3啟動子、SP6啟動子、大腸桿菌RNA聚合酶啟動子、lac啟動子和其衍生物、tac啟動子、trp啟動子、阿拉伯糖誘導型PBAD啟動子、L-鼠李糖誘導型rhaPBAD啟動子、噬菌體λ啟動子(例如PL)、CMV啟動子、SV40啟動子、PGK啟動子、EF-1α啟動子)、操縱基因、轉錄終止信號(例如，SV40終止信號)、剪接位點(例如，SV40剪接位點、β-血球蛋白剪接位點)、核糖體結合位點、信號序列(例如，免疫球蛋白κ信號序列)、表位標簽(例如，myc、FLAG)、純化標簽(例如，His6)、復制起點和藥物選擇標記。編碼連接子氨基酸和/或包含限制酶識別位點的連接子序列或任何其它類型的連接子序列也可以可操作地連接到存在于本文中所披露的載體中的編碼本發(fā)明多肽的核酸。
粘粒庫可以通過本領域中已知的方法制備。參見例如馬尼亞迪斯(Maniatis)等人分子克隆實驗指南.冷泉港出版社,第2版,1989和薩姆布魯克等人，2001。這類文庫可以用于細胞、或上清液、全細胞培養(yǎng)液、無細胞溶解產物、或源自細胞的提取物的基于序列的篩選和任何類型的功能性篩選。用于除草劑篩選、酶活性、抗癌活性等的高通量生物分析是本領域中已知的并且描述于文獻中。另外參見其中的實例7-11。
宿主細胞
本發(fā)明進一步涵蓋含有外源性多核苷酸的重組宿主細胞。所述多核苷酸可以包含如本文中所披露的活性紫色細菌基因的一或多個片段，或可以編碼本發(fā)明多肽中的一或多個。宿主細胞可以是原核的(例如，細菌)或真核的(例如，酵母、昆蟲、哺乳動物)。宿主還可以是合成細胞。
在某些實施例中，宿主細胞是微生物。合適的微生物是能夠定殖于植物組織(例如根、莖、葉、花、內部以及表面上)或根圍的那些微生物，以此方式它們開始與昆蟲害蟲接觸。一些宿主微生物還能夠定殖于昆蟲害蟲的腸道，并且能夠從一只昆蟲傳遞到另一只昆蟲。宿主微生物還可以定殖于植物害蟲的腸道和體表。宿主細胞還可以用作用于制造活性紫色細菌蛋白質或用于制造一或多種通過活性紫色細菌蛋白質的活動產生的化合物的微生物工廠，所述化合物如肽、脂質、脂肽、糖蛋白、次級代謝物、抗生素以及小有機化合物。
適合于異源表達的革蘭氏陰性微生物包括：大腸桿菌(例如，大腸桿菌K12、大腸桿菌BL21)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)(例如熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、桔黃假單胞菌(Psuedomonas aurantiaca)、金色假單胞菌(Psuedomonas aureofaciens)、防御假單胞菌(Psuedomonas protegens))、腸桿菌屬(Enterobacter sp.)(例如陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae))以及沙雷氏菌屬(Serratia sp.)。例示性大腸桿菌菌株包括大腸桿菌BL21和大腸桿菌K12用于常規(guī)表達。其它用于更專門的目的的大腸桿菌菌株是呈現蛋白酶缺乏的大腸桿菌菌株(BL21-B838)和過度表達膜蛋白質的大腸桿菌菌株，如BL21衍生物DE3、C41(DE3)和C43(DE3)。
用于在大腸桿菌中高水平表達異源蛋白質的方法是已知的并且包括(a)IPTG誘導方法，(b)自誘導方法，以及(c)高細胞密度IPTG誘導方法。參見例如薩瓦欣木加姆(Sivashanmugam)等人(2009)。
適合于異源表達的革蘭氏陽性微生物包括芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)(例如，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、蠟樣芽孢桿菌)和鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)。使用桿菌作為表達宿主的一個優(yōu)勢是這個屬的成員產生孢子，孢子提供調配物較佳的穩(wěn)定性和較長的保存期限?；诰薮笱挎邨U菌和枯草芽孢桿菌的表達系統(tǒng)可購自MoBiTec(德國)。使用在木糖操縱子的啟動子的控制下，相關核苷酸序列可以在巨大芽孢桿菌中表達。
適合于異源表達的真菌微生物包括木霉屬(Trichoderma sp.)、粘帚霉(Gliocadium)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)?？梢酝ㄟ^原生質體介導的轉化，使用聚乙二醇(PEG)或通過基于電穿孔的方法，將異源DNA引入絲狀真菌中。粒子轟擊是另一種已成功用于轉化真菌細胞的方法。
用于轉化釀酒酵母的方法和組合物是本領域中已知的。舉例來說，可以在誘導型啟動子(如GAL1)和CYC1終止子的控制下，將核酸克隆到合適的載體(例如，YES載體(加利福尼亞州卡爾斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))中，并且使它在釀酒酵母中表達?？梢詼y試所得細胞的所期望的活性或蛋白質表達情況。
異源表達還可以在其它酵母物種中進行(杰弗里斯(Jeffries)等人，2010)，如巴斯德畢赤酵母、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、陸地酵母(Arxula adenivorans)以及解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。巴斯德畢赤酵母的轉化可以通過使用商業(yè)試劑盒實現，所述商業(yè)試劑盒如PichiaPink表達系統(tǒng)(加利福尼亞州卡爾斯巴德的英杰公司)、畢赤酵母屬經典蛋白質表達系統(tǒng)或Pichia GlycoSwitch(用于糖基化蛋白質)(亞利桑那州土桑的技術研究公司(Research Corporation Technologies,Tucson,AZ))。關于酵母巴斯德畢赤酵母或多形漢遜酵母的轉化，還可以使用電穿孔。
在某些實施例中，使用能夠在植物組織內存活并且復制的非致病性共生細菌(即，內寄生菌)或能夠定殖于葉圈或根圍中的非致病性共生細菌(即，體表寄生菌)。這類細菌包括農桿菌屬(Agrobacterium)、產堿桿菌屬(Alcaligenes)、固氮螺菌屬(Azospirillum)、固氮菌屬(Azotobacter)、桿菌屬(Bacillus)、棍狀桿菌屬(Clavibacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文菌屬(Erwinia)、黃桿菌屬(Flavobacter)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、根瘤菌屬(Rhizobium)、沙雷氏菌屬(Serratia)、鏈霉菌屬以及黃單胞菌屬(Xanthomonas)的細菌。
還可以使用共生真菌(如木霉屬(Trichoderma)和粘帚霉屬(Gliocladium))作為用于本文中所披露的序列的繁殖和/或表達的宿主。
調配物和殺蟲組合物
本發(fā)明提供包含本文中所披露的核酸和多肽的殺蟲(例如，殺昆蟲)組合物和調配物。
“害蟲”是增加植物的死亡率和/或減緩、妨礙或以其它方式改變植物生長的生物體(原核、真核或古生菌)。害蟲包括(但不限于)線蟲、昆蟲、真菌、細菌和病毒。
如本文中所定義的“殺蟲劑”是源自生物產品或化學物質的增加植物害蟲的死亡率和/或抑制植物害蟲的生長速率的物質。殺蟲劑包括(但不限于)殺線蟲劑、殺昆蟲劑、除草劑、植物殺真菌劑、植物殺細菌劑以及植物殺病毒劑。
如本文所定義的“生物殺蟲劑”是具有殺蟲性質的微生物。
“殺蟲組合物”是包含殺蟲劑和任選地一或多種其它組分的調配物。其它組分包括(但不限于)溶劑(例如，乙酸戊酯、四氯化碳、二氯化乙烯；煤油、二甲苯、松樹油以及EPA清單4a和4b中列出的其它物質等)、載劑(例如，有機面粉、胡桃殼面粉、樹皮)、粉狀礦物(硫、硅藻土、板狀硅石、石灰、石膏滑石、葉蠟石)、粘土(綠坡縷石、膨潤土、高嶺土、火山灰以及EPA清單4a和4b中列出的其它物質)、穩(wěn)定劑、乳化劑(例如，堿性皂、有機胺、長鏈醇的硫酸鹽和如海藻酸鹽、碳水化合物、膠狀物、脂質以及蛋白質等材料，以及EPA清單4a和4b中列出的其它物質)、表面活性劑(例如，EPA清單4a和4b中列出的那些物質)、抗氧化劑、防曬液、第二化學或生物殺蟲劑(例如，殺昆蟲劑、殺線蟲劑、殺螨劑、除藻劑、殺真菌劑、殺細菌劑)、除草劑和/或抗生素。
如本文中所定義的“載劑”是惰性有機或無機材料，活性成分與它混合或調配可有助于將活性成分施用到植物或其它待處理的物體，或有助于活性成分的儲存、運輸和/或處置。
如本文中所披露的殺蟲組合物適用于調整植物中的害蟲侵擾。如本文中所定義的術語“調整”用于意指改變害蟲侵擾的量或害蟲侵擾擴散的速率。一般來說，這類改變是降低侵擾的程度和/或比率和/或擴散。
如本文中所定義的術語“害蟲侵擾”是害蟲以造成有害影響的量存在，所述有害影響包括宿主群體的疾病或感染或在生長系統(tǒng)中出現不當的野草。例示性植物害蟲包括(但不限于)螨蟲(例如，棉葉螨(Tetranychus urticae)(二斑葉螨))、果蠅(例如，櫻桃果蠅(Drosophila suzukii)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster))、蒼蠅(例如，家蠅(Muscadomestica))、蛛形綱動物(例如，壁虱屬(Acari spp.))、根蛆(花蠅屬(Anthomyidae spp.)，例如甘藍菜根蛆)、蚜蟲(例如，桃蚜(Myzus persicae)(桃蚜(green peach aphid)))、個木虱屬(Triozidae spp.)(例如，馬鈴薯尖翅木虱(馬鈴薯木虱(Bactericera cockerelli)))、甲蟲(擬步甲屬(Tenebrionidae spp.)，例如枯葉甲蟲(黑菌蟲(Alphitobius diaperinus)))、蛆(例如白蠐螬(圓頭無斑犀金龜(Cyclocephala lurida)))、南方假面金龜子(歐洲切根鰓金龜(Rhizotrogus majalis))、日本甲蟲(日本麗金龜(Popillia japonica))幼蟲、葡萄黑象甲(黑葡萄耳象(Otiorhyncus sulcatus))幼蟲、東方甲蟲(東方麗金龜(Anomala orientalis))幼蟲、圣甲蟲(例如，金龜子屬(Scarabaeidae spp.))、線蟲(例如，根節(jié)線蟲(根結線蟲屬(Meloidogyne spp.)))、真菌、細菌以及各種植物病毒，例如煙草花葉病毒、番茄斑萎病毒、番茄黃化曲葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯病毒Y、花椰菜花葉病毒、非洲木薯花葉病毒、李痘病毒、雀麥草花葉病毒、馬鈴薯病毒X、柑桔衰退病毒、大麥黃矮病毒、馬鈴薯卷葉病毒以及番茄叢矮病毒。
如本文中所披露的殺蟲組合物可以出于預防或調整目的使用。當以預防方式提供時，在任何侵擾癥狀之前提供組合物。組合物的預防性投與用以預防、減弱任何后續(xù)感染或侵擾的發(fā)作或降低發(fā)作率。當出于調整目的提供時，在感染或侵擾跡象開始時(或在開始后不久)提供。化合物的調整性投與用以減弱感染或侵擾的病理癥狀和增加恢復速率。
可以采用其它方法來控制作用的持續(xù)時間?？梢酝ㄟ^用聚合物復合或吸收組合物組分中的一或多種來實現控制釋放。為了控制釋放，可以通過選擇適當大分子(例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯化合物、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素、或魚精蛋白、硫酸鹽)和大分子的濃度以及并入方法來練習控制傳遞。通過控制釋放制劑來控制作用的持續(xù)時間的另一種可能的方法是將如本文中所披露的組合物并入到聚合物材料粒子中，所述聚合物材料如聚酯、聚氨基酸、水凝膠、聚(乳酸)或乙烯乙酸乙烯酯共聚物?；蛘?，代替將這些組合物并入到聚合物粒子中，可能例如通過凝聚技術或通過界面聚合使這些材料陷入所制備的微膠囊中，例如分別陷入羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中；或者使這些材料陷入膠質傳遞系統(tǒng)中，例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、納米粒子和納米膠囊或粗乳液中。這類技術是本領域中已知的。
如本文中所披露的殺蟲組合物(例如，殺蟲毒素)可以通過所選擇的活性紫色細菌基因序列在適合實驗室規(guī)模、中試規(guī)模和生產規(guī)模的發(fā)酵的異源宿主中表達而產生(例如，大腸桿菌、假單胞菌屬、酵母等)。毒素可以通過本領域中已知的發(fā)酵程序，使用異源宿主產生，并且直接調配，或在從發(fā)酵培養(yǎng)液中提取并純化毒素之后進行調配。調配物可以包括活細胞或非活細胞。
本文中所披露的殺蟲組合物可以按任何方式調配。非限制性調配物實例包括(但不限于)可乳化濃縮物(EC)、可濕性粉劑(WP)、可溶性液體(SL)、氣霧劑、超低體積濃縮溶液(ULV)、可溶性粉劑(SP)、微膠囊、水分散粒劑、流體(FL)、微乳液(ME)、納米乳液(NE)等。在本文中所述的調配物中的任一個中，活性成分的百分比在0.01％到99.99％范圍內。殺蟲劑調配物的詳細說明可見于以下各者中：柯克·奧思默化工百科全書(Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology)；諾爾斯A(Knowles,A).2005.作物保護產品調配物的新發(fā)展(New Developments in Crop Protection Product Formulation),Agrow報導,英國倫敦(London,UK)；瓦肯堡W.范(Valkenburg,W.van)(編)1973,殺蟲劑調配物(Pesticide Formulation),馬塞爾·德克爾(Marcel Dekker),美國紐約(New York,USA)；諾爾斯D.A.(編)1998,農業(yè)化學調配物的化學和技術(Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations),克呂維爾科學出版社(Kluwer Academic Publishers),荷蘭多德勒克(Dordrecht,the Netherlands)。
粉末和粉塵調配物
這些調配物是通常含有0.1-25％活性成分的單一調配物。然而，視效能和特定應用而定，可以使用較高濃度的活性成分。殺蟲劑毒素與固體載劑、優(yōu)選小粒度固體載劑混合。固體載劑可以包括：硅酸鹽粘土(例如，綠坡縷石、膨潤土、火山灰、蒙脫土、高嶺土、滑石、硅藻土等)、碳酸鹽(例如，方解石、白云石等)、合成物(沉淀二氧化硅、煙霧狀二氧化硅等)、經過研磨的植物性藥材(例如，玉米棒屑、稻殼、椰子殼等)、有機面粉(例如，胡桃殼面粉、樹皮等)或粉狀礦物(例如，硫、硅藻土、板狀硅石、石灰、石膏滑石、葉蠟石等)。粉塵調配物中所用的惰性成分還可以來自EPA惰性清單中針對常規(guī)調配物的4a(www.epa.gov/opprd001/inerts/inerts_list4Acas.pdf)和針對有機調配物的4b(www.epa.gov/opprd001/inerts/inerts_list4Bname.pdf)中列出的那些惰性成分。小粒度可以通過將活性成分與載劑混合并在碾磨機中粉碎來實現。粉塵定義為粒度小于100微米；并且隨著粒度增加，調配物的毒性降低。在選擇粉塵調配物時，應考慮其相容性、精細度、容積密度、流動性、磨損性、可吸收性、比重以及成本。例示性粉塵調配物提供于表1中。
表1
粉塵調配物還可以由以1-10％添加到1:1有機填料/滑石組合中的粉塵濃縮物(例如，40％活性成分、5％穩(wěn)定劑、20％二氧化硅、35％碳酸鎂)制備。
粉塵調配物被用作針對爬行昆蟲的接觸粉末(CP)或追蹤粉末(TP)。
具有高流動性的粉塵調配物可以在溫室中通過氣動設備施用。
顆粒和球粒調配物
殺蟲毒素以液體形式施加到多孔材料粗顆粒(例如，粘土、胡桃殼、蛭石、硅藻土、玉米棒、綠坡縷石、蒙脫土、高嶺土、滑石、硅藻土、方解石、白云石、二氧化硅、稻殼、椰子殼等)。顆?；蚯蛄？梢允撬稚⑿缘?，并且可以通過擠出(針對具有低水溶性的殺蟲活性劑)、聚集或噴霧干燥形成。顆粒還可以用殺蟲毒素的基于溶劑的溶液包覆或浸漬。載劑粒子可以選自EPA惰性清單中針對常規(guī)調配物的4a(www.epa.gov/opprd001/inerts/inerts_list4Acas.pdf)和針對有機調配物的4b(www.epa.gov/opprd001/inerts/inerts_list4Bname.pdf)中列出的那些載劑粒子?；钚猿煞挚梢员惠d劑材料吸收或被包覆在顆粒表面上。粒度可以按直徑在250到1250微米(0.25mm到2.38mm)之間變化。調配物通常含有2到10％濃度的毒劑。顆粒以10kg/ha的比例施用到水中或植物輪生體中或土壤中。通過施用到土壤中，使用內吸殺昆蟲劑的顆粒調配物來防治刺吸口器式害蟲和土壤害蟲。輪生體涂藥用于防治如高粱、玉米和甘蔗等作物的鉆蛀性害蟲。這些類型的調配物減少了漂移并且允許較慢地釋放殺蟲組合物。
顆粒殺蟲劑最常用于向土壤施用化學藥品來防治野草、火蟻、線蟲和在土壤中生活的昆蟲或用于通過根吸收到植物中。顆粒調配物有時通過飛機或直升機施用以使漂移降到最低或穿過茂密的植被。施用后，顆粒緩慢地釋放出活性成分。一些顆粒需要土壤水分來釋放活性成分。顆粒調配物還用于防治蚊子幼蟲和其它水生害蟲。顆粒被用于農業(yè)、建筑、觀賞、草坪、水生、公用線路以及公共衛(wèi)生(咬蟲)害蟲防治作業(yè)中。
顆粒調配物的施用一般呈萌芽前除草劑形式或作為土壤殺昆蟲劑直接施用并且并入到植物所生長的土壤或其它固體基質中。顆?；蚯蛄＿€可以施用在犁溝內。顆粒常用于施用到水中，如灌水稻田中。
典型的顆粒調配物包括(w/w％)1-40％活性成分、1-2％穩(wěn)定劑、0-10％樹脂或聚合物、0-5％表面活性劑、0-5％粘合劑并且用載劑材料補足到100％。
可濕性粉劑調配物
可濕性粉劑是當用水稀釋時產生相當穩(wěn)定的懸浮液的粉末狀調配物。它通過摻合殺蟲劑與稀釋劑(如綠坡縷石)、表面活性劑以及輔助材料(如磺酸鈉鹽)來調配。任選地添加粘著劑以改良在植物和其它表面上的保持力?？梢酝ㄟ^混合殺蟲毒素(10-95％)與固體載劑，外加1-2％用于改良可懸浮性的表面活性劑來制備可濕性粉劑。調配物的總組成包括呈固體形式的活性成分(5.0-75％)、陰離子分散劑和陰離子或非離子濕潤劑。
可濕性粉劑調配物的典型實例包括10-80％活性成分、1-2％濕潤劑(例如，苯磺酸鹽、萘磺酸鹽、脂肪族磺基丁二酸鹽、脂肪醇乙氧基化物等)、2-5％分散劑(例如，木素磺酸鹽、萘磺酸鹽-甲醛縮合物等)以及0.1-1％消泡劑(例如，isopar M(埃克森/美孚(Exxon/Mobil)))，用惰性填料或載劑(例如，硅藻土、二氧化硅等)補足到100％。
可乳化濃縮物(EC)調配物
這些調配物是經過濃縮的殺蟲劑調配物，含有有機溶劑和用于促進用水乳化的表面活性劑。當將EC調配物噴灑到植物部分上時，溶劑快速蒸發(fā)，留下水也被蒸發(fā)掉了的毒素沉積物。殺昆蟲劑調配物中的例示性乳化劑包括堿性皂、有機胺、長鏈醇的硫酸鹽和如海藻酸鹽、碳水化合物、膠狀物、脂質和蛋白質等材料。乳化劑可以選自EPA惰性清單中針對常規(guī)調配物的4a(www.epa.gov/opprd001/inerts/inerts_list4Acas.pdf)和針對有機調配物的4b(www.epa.gov/opprd001/inerts/inerts_list4Bname.pdf)中列出的那些乳化劑。
溶液調配物
溶液調配物是經過濃縮的液體殺蟲劑調配物，它可以直接使用，或者在可溶性濃縮物的情況下需要稀釋。可溶性濃縮物和溶液是在水中完全混溶的基于水或溶劑的混合物。
溶液濃縮物調配物的典型實例包括20-70％活性成分、5-15％濕潤劑、5-10％防凍劑，并且用水或水可混溶的溶劑補足到100％。
視殺蟲毒素的性質和穩(wěn)定性而定，溶液調配物可以任選地包括增稠劑、防腐劑、防沫劑、pH緩沖液、UV屏蔽劑等。
氣霧劑和熏蒸劑調配物
在殺昆蟲氣霧劑中，毒素以大小在0.1到50微米范圍內的細小粒子形式懸浮于空氣中，呈濃霧或薄霧形式。這通過燃燒毒素或通過加熱汽化毒素而實現。溶解于液化氣中的毒劑如果通過小孔釋放，那么可以引起毒劑粒子隨著所釋放氣體的快速蒸發(fā)而在空氣中浮動。
在環(huán)境溫度下可揮發(fā)并且毒性極強的化合物稱為熏蒸劑。熏蒸劑一般通過昆蟲的氣管系統(tǒng)進入昆蟲。熏蒸劑用于防治儲存箱、建筑物中的昆蟲害蟲和土壤中的某些昆蟲和線蟲。大部分熏蒸劑是液體，保存在罐中或桶中，并且常常包含兩種或更多種氣體的混合物?；蛘?，在存在水分的情況下，可以從由磷化鋁和碳酸銨組成的片劑產生膦或磷化氫氣體。使用熏蒸劑的優(yōu)勢是，熏蒸劑由于氣體的滲透性和分散性，所以可以到達其它化學藥品不容易靠近的位點。常用熏蒸劑是EDCT、甲基溴、磷化鋁和氫氰酸。
肥料混合物中的調配物
肥料混合物可以通過向化肥中添加如本文中所披露的殺昆蟲組合物或通過將組合物直接撒在肥料上來制造。肥料混合物按常規(guī)施肥時間施用，提供植物養(yǎng)分并且防治土壤昆蟲。在例示性肥料調配物中，將尿素(2％溶液)與殺昆蟲組合物混合并向植物噴灑以供應氮和實現有效害蟲防治。
作為毒餌的調配物
毒餌由對害蟲物種具有吸引力的基礎或載劑材料和相對較小數量的化學毒劑組成。毒餌用于防治果蠅、咀嚼口器昆蟲、金針蟲、土壤中的白蠐螬、家中的害蟲、地里的老鼠以及鼻涕蟲。這些調配物適用于噴霧施用困難的情況。干式誘餌中常用的基質是用水和糖蜜濕潤的麥麩。關于吸果夜蛾的防治，使用含毒素的發(fā)酵糖溶液或糖蜜。
用于種子處理的調配物
種子處理包括在播種之前任選地與其它生物活性、拮抗或共生劑組合將殺蟲組合物施用到種子的表面。本文中披露的殺蟲毒素、蛋白質和/或化合物可以針對種子處理按以下模式中的任一種調配：干粉、水可成漿粉末、液體溶液、可流動濃縮物或乳液、乳液、微膠囊、凝膠或水分散性顆粒；或可以在種植之前通過噴霧到種子上而施用到種子上。
在干粉的情況下，活性成分類似于可濕性粉劑加以調配，但要添加例如礦物油的粘著劑而非濕潤劑。舉例來說，按照由那達古瑪(Nandakumar)等人(2001)所描述的方法，在無菌條件下混合1kg經過純化的滑石粉末(經過12小時除菌)、15g碳酸鈣和10g羧甲基纖維素。蛋白質、核酸懸浮液或表達這些的生物體按1:2.5的比率混合(懸浮液，干式混合)并且陰干產物，將水分含量降低到20-35％。
組合物可以呈液體、凝膠或固體形式。
可以通過將固體載劑懸浮于活性成分的溶液中，并且在溫和條件下干燥懸浮液，如室溫下蒸發(fā)或在65℃或更低溫度下真空蒸發(fā)，來制備固體組合物。關于液體組合物，可以將活性成分溶解于合適的載劑或溶劑中。
組合物可以包含用凝膠囊封的活性成分。這類用凝膠囊封的材料可以通過將凝膠形成劑(例如，明膠、纖維素或木質素)與包含一或多種如本文中所披露的核酸和/或多肽和任選地第二殺蟲劑或除草劑的組合物混合；并且誘導試劑形成凝膠來制備。
組合物可以另外包含用于以下目的的表面活性劑：乳化、分散、濕潤、擴散、整合、控制崩解、穩(wěn)定活性成分以及改良流動性或緩蝕。在一個具體實施例中，表面活性劑為非植物毒性的非離子表面活性劑，優(yōu)選屬于EPA清單4B。在另一個具體實施例中，非離子表面活性劑為聚氧化乙烯(20)單月桂酸酯。表面活性劑的濃度可以在總調配物的0.1-35％之間的范圍內，例如5-25％。分散劑和乳化劑(如非離子、陰離子、兩性以及陽離子分散劑和乳化劑)的選擇和用量由組合物的性質和試劑促進組合物分散的能力決定。
包含微生物的調配物
如上文所闡述的殺蟲組合物可以與微生物組合。微生物可以是植物生長促進劑。合適的微生物包括(但不限于)：芽孢桿菌屬(例如，堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、蘇云金芽孢桿菌、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌)、擬青霉屬(Paecilomyces sp.)(淡紫擬青霉(P.lilacinus))、巴斯德菌屬(Pasteuria sp.)(穿刺巴斯德菌(P.penetrans))、假單胞菌屬、芽孢短桿菌屬(Brevabacillus sp.)、輪枝菌屬(Lecanicillium sp.)、白粉寄生孢菌屬(Ampelomyces sp.)、酵母菌屬(Pseudozyma sp.)、鏈霉菌屬(比基尼鏈霉菌(S.bikiniensis))、哥斯達黎加鏈霉菌(S.costaricanus)、阿維鏈霉菌(S.avermitilis)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia sp.)、木霉菌屬(Trichoderma sp.)、粘帚霉屬、阿維菌素(avermectin)、漆斑菌屬(Myrothecium sp.)、擬青霉屬(Paecilomyces spp.)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)、線蟲捕捉菌屬(Arthrobotrys sp.)、綠腐病菌屬(Chlorosplenium sp.)、螺菌屬(Neobulgaria sp.)、輪層菌屬(Daldinia sp.)、曲霉菌屬(Aspergillus sp.)、毛殼菌屬(Chaetomium sp.)、溶桿菌屬(Lysobacter sp.)、紙狀粒毛盤菌(Lachnum papyraceum)、亞厚孢輪枝孢(Verticillium suchlasporium)、少孢節(jié)叢孢菌(Arthrobotrys oligospora)、厚孢輪枝菌(Verticillium chlamydosporium)、洛斯里被毛孢(Hirsutella rhossiliensis)、厚垣孢普可尼亞菌(Pochonia chlamydosporia)、糙皮側耳菌(Pleurotus ostreatus)、發(fā)光類臍菌(Omphalotus olearius)、月夜菌(Lampteromyces japonicas)、短波單胞菌屬(Brevudimonas sp.)、內生真菌屬(Muscodor sp.)、光桿狀菌屬(Photorhabdus sp.)以及伯克氏菌屬(Burkholderia sp.)。從這類微生物獲得或衍生的藥劑也可以與本文中所披露的殺蟲核酸和多肽組合使用。
包含第二殺蟲劑的調配物
如上文所闡述的殺蟲組合物可以與第二殺蟲劑(例如，殺線蟲劑、殺真菌劑、殺昆蟲劑、除藻劑、殺螨劑或殺細菌劑)組合。這類試劑可以是具有殺真菌、殺細菌、殺線蟲、殺螨和/或殺昆蟲活性的天然油或油產品(例如，石蠟油、茶樹油、檸檬草油、丁香油、肉桂油、柑桔油、迷迭香油、除蟲菊(pyrethram))。此外，殺蟲劑可以是單一位點抗真菌劑，它可以包括(但不限于)苯并咪唑、去甲基化抑制劑(DMI)(例如，咪唑、哌嗪、嘧啶、三唑)、嗎啉、羥基嘧啶、苯氨基嘧啶、硫代磷酸酯、醌外部抑制劑、喹啉、二甲酰亞胺、甲酰亞胺、苯基酰胺、苯氨基嘧啶、苯基吡咯、芳香族烴、肉桂酸、羥基苯胺、抗生素、多氧菌素、酰胺、鄰苯二甲酰亞胺、苯環(huán)型化合物(二甲苯基丙氨酸)；選自由咪唑、哌嗪、嘧啶和三唑(例如，聯苯三唑醇(bitertanol)、腈菌唑(myclobutanil)、戊菌唑(penconazole)、丙環(huán)唑(propiconazole)、三唑酮(triadimefon)、糠菌唑(bromuconazole)、環(huán)丙唑醇(cyproconazole)、烯唑醇(diniconazole)、腈苯唑(fenbuconazole)、己唑醇(hexaconazole)、戊唑醇(tebuconazole)、氟醚唑(tetraconazole))組成的群組的去甲基化抑制劑、腈菌唑、鄰氨基苯甲酸二酰胺(例如，氯蟲苯甲酰胺(chlorantranilipole))以及醌外部抑制劑(例如，嗜球果傘素(strobilurin))。嗜球果傘素可以包括(但不限于)嘧菌酯(azoxystrobin)、醚菌酯(kresoxim-methyl)或肟菌酯(trifloxystrobin)。在又一具體實施例中，抗真菌劑是醌，例如喹氧靈(quinoxyfen)(5,7-二氯-4-喹啉基4-氟苯基醚)。抗真菌劑也可以衍生自虎杖(Reynoutria)提取物。
殺真菌劑也可以是多位點非無機化學殺真菌劑，選自由以下組成的群組：氯腈、喹喔啉、磺酰胺、膦酸酯、亞磷酸酯、二硫代氨基甲酸酯、氯烷基硫代物(chloralkythios)、苯基吡啶胺以及氰基乙酰胺肟。
如上文所指出，組合物可以進一步包含殺昆蟲劑。殺昆蟲劑可以包括(但不限于)阿維菌素、Bt(例如，蘇云金芽孢桿菌變種庫斯塔克(kurstaki))、印度楝樹油(neem oil)、多殺菌素(spinosad)、伯克氏菌屬(例如，如WO2011/106491中所闡述)、昆蟲病原真菌(如球孢白僵菌)以及化學殺昆蟲劑，包括(但不限于)有機氯化合物、有機磷化合物、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯(pyrethroid)、除蟲菊酯(pyrethrin)和新煙堿(neonicotinoid)。
如上文所指出，組合物可以進一步包含殺線蟲劑。這種殺線蟲劑可以包括(但不限于)阿維菌素；微生物產物，如生物群系(堅強芽孢桿菌)、巴斯德菌屬；和有機產物，如皂素。
用于調整害蟲侵擾的方法
因此，根據本發(fā)明，提供用于調整植物中的害蟲侵擾的方法。方法包含向植物或向土壤或植物所生長的基質中施用殺蟲組合物，它包含如本文中所披露的核酸；即SEQ IDNO:4-6中的任一個。
用于調整植物中的害蟲侵擾的其它方法包含向植物或向土壤或植物所生長的基質中施用殺蟲組合物，它包含如本文中所披露的多肽；即SEQ ID NO:1-3中的任一個。
當用作生物昆蟲防治劑時，由活性紫色細菌基因組編碼的殺昆蟲毒素可以通過活性紫色細菌核苷酸序列在能夠表達所述核苷酸序列的異源宿主細胞中表達來產生。在一個實施例中，將一或多個活性紫色細菌核苷酸序列插入到適當表達盒中，所述表達盒包含例如啟動子和轉錄終止信號。視啟動子和/或外部刺激而定，核苷酸序列的表達可以是組成型或誘導型的。在某些實施例中，表達毒素的細胞是微生物，如病毒、細菌或真菌。
在某些實施例中，如桿狀病毒的病毒經過工程改造在其基因組中含有活性紫色細菌核苷酸序列。這類重組病毒可以在感染適合于病毒復制和表達核苷酸序列的適當真核細胞之后表達大量的例如殺昆蟲毒素。由此產生的殺昆蟲毒素被用作殺昆蟲劑。或者，使用經過工程改造包括核苷酸序列的桿狀病毒體內感染昆蟲并且通過表達殺昆蟲毒素或通過病毒感染與殺昆蟲毒素的表達組合來殺死昆蟲。
因此，上文所闡述的包含活性紫色細菌核酸和多肽的組合物可以用作殺蟲劑。具體來說，如上文所闡述的組合物可以單獨地或與一或多種如本文中所闡述的第二殺蟲物質組合用作例如殺昆蟲劑和殺線蟲劑。
具體地說，可以使用上文所闡述的方法防治的線蟲包括(但不限于)寄生線蟲，如根節(jié)線蟲、胞囊線蟲和根腐線蟲，包括(但不限于)種子蟲癭線蟲(維氏線蟲(Afrina wevelli))、翦股穎線蟲(剪股穎粒線蟲(Anguina agrostis))、芽蟲癭線蟲(粒線蟲屬(Anguina spp.))、種子蟲癭線蟲(粒線蟲屬、阿姆辛克粒線蟲(A.amsinckiae)、香脂粒線蟲(A.balsamophila)、小麥粒線蟲(A.tritici))、羊茅葉蟲癭線蟲(禾草粒線蟲(A.graminis))、小麥穗瘤病(ear-cockle)(或小麥蟲癭)線蟲(小麥粒線蟲)、芽和葉(或葉面)線蟲(滑刃線蟲屬(Aphelenchoides spp.)、次薄滑刃線蟲(A.subtenuis))、秋海棠葉(或蕨類、或春季萎縮病、或草莓葉面、或草莓線蟲、或夏季矮稈)線蟲(草莓芽線蟲(A.fragariae))、蕨類植物線蟲(歐樂斯滑刃線蟲(A.olesistus))、水稻線蟲(白尖病線蟲(A.oryzae))、醋栗線蟲(里貝斯滑刃線蟲(A.ribes))、黑醋栗(或菊花)線蟲(菊葉芽滑刃線蟲(A.ritzemabosi))、菊花葉面或葉線蟲(菊葉芽滑刃線蟲)、稻干尖線蟲病(rice white-tip)(或春季萎縮病或草莓芽)線蟲(水稻干尖線蟲(A.besseyi))、食真菌(蘑菇)線蟲(堆肥滑刃線蟲(Aphelenchoides composticola))、麗皮胞囊屬(Atalodera spp.)(金銀花麗皮胞囊(Atalodera lonicerae)、尤麗線蟲(Atalodera ucri))、棘線蟲(spine nematode)(變異刺線蟲(Bakernema variabile))、刺線蟲(刺線蟲屬(Belonolaimus spp.)、細長刺線蟲(B.gracilis)、長尾刺線蟲(B.longicaudatus))、松材線蟲(傘滑刃屬(Bursaphalenchus spp.)、松材線蟲(B.xylophilus)、擬松材線蟲(B.mucronatus))、固著線蟲(sessile nematode)(固著線蟲屬(Cacopaurus spp.)、頂花線蟲(C.epacris)、鼠疫線蟲(C.pestis))、莧菜胞囊線蟲(莧菜線蟲(Cactodera amaranthi))、樺木胞囊線蟲(樺木線蟲(C.betulae))、仙人掌胞囊線蟲(仙人掌皮線蟲(C.cacti))、愛沙尼亞胞囊線蟲(愛沙尼亞線蟲(C.estonica))、索氏胞囊線蟲(Thorne's cyst nematode)(索氏線蟲(C.thornei))、虎杖胞囊線蟲(韋西仙人掌胞囊線蟲(C.weissi))、環(huán)線蟲(環(huán)線蟲屬(Criconema spp.))、棘線蟲(環(huán)線蟲屬、西韋爾環(huán)線蟲(C.civellae)、戴科林線蟲(C.decalineatum)、具刺腹片線蟲(C.spinalineatum))、環(huán)線蟲(艾克斯線蟲(Criconemella axeste)、彎曲小環(huán)線蟲(C.curvata)、巨大環(huán)線蟲(C.macrodora)、微細小環(huán)線蟲(C.parva))、環(huán)線蟲(輪線蟲屬(Criconemoides spp.)、檸檬輪線蟲(C.citri)、斯摩利輪線蟲(C.simile))、棘線蟲(傘狀線蟲(Crossonema fimbriatum))、桉樹囊線蟲(桉樹線蟲(Cryphodera eucalypti))、芽、莖干和球莖線蟲(莖線蟲屬(Ditylenchus spp.)、水稻莖線蟲(D.angustus)、起絨草莖線蟲(D.dipsaci)、腐爛莖線蟲(D.destructor)、中型指環(huán)蟲(D.intermedius))、蘑菇菌柱線蟲(蘑菇莖線蟲(D.myceliophagus))、錐線蟲(錐線蟲屬(Dolichodorus spp.)、異頭錐線蟲(D.heterocephalus)、雙頭花序錐線蟲(D.heterocephalous))、矛線蟲(矛線蟲屬(Dorylaimus spp.))、矮化線蟲(多變線蟲(Geocenamus superbus))、胞囊線蟲(黃金線蟲屬(Globodera spp.))、蓍草球形胞囊線蟲((G.achilleae))、西洋耆草胞囊線蟲((G.millefolii))、蘋果胞囊線蟲((G.mali))、白馬鈴薯胞囊線蟲(馬鈴薯白線蟲(G.pallida))、金線蟲(馬鈴薯金線蟲(G.rostochiensis))、煙草胞囊線蟲(煙草胞囊線蟲(G.tabacum))、奧斯本胞囊線蟲(Osborne's cyst nematode)(煙草上胞囊線蟲(G.tabacum solanacearum))、茄屬植物胞囊線蟲(弗吉尼亞煙草胞囊線蟲(G.tabacum virginiae))、扣針線蟲(細針線蟲屬(Gracilacus spp.)、艾達麗細針線蟲(G.idalimus))、螺旋線蟲(螺旋線蟲屬(Helicotylenchus spp.)、非洲螺旋線蟲(H.africanus)、雙角螺旋線蟲(H.digonicus)、雙宮螺旋線蟲(H.dihystera)、刺桐螺旋線蟲(H.erythrinae)、多色帶螺旋線蟲(H.multicinctus)、帕拉葛螺旋線蟲(H.paragirus)、假強壯螺旋線蟲(H.pseudorobustus)、茄真螺旋線蟲(H.solani)、斯皮卡螺旋線蟲(H.spicaudatus))、擬鞘線蟲(半輪線蟲屬(Hemicriconemoides spp.)、雙形半輪線蟲(H.biformis)、加利福尼亞半輪線蟲(H.californianus)、奇氏擬鞘線蟲(H.chitwoodi)、佛羅里達半輪線蟲(H.floridensis)、韋森(H.wessoni))、鞘線蟲(鞘線蟲屬(Hemicycliophora spp.)、花生鞘線蟲(H.arenaria)、生物圈鞘線蟲(H.biosphaera)、馬加洛蒂鞘線蟲(H.megalodiscus)、帕爾瓦娜鞘線蟲(H.parvana)、博蘭加鞘線蟲(H.poranga)、謝里鞘線蟲(H.sheri)、擬鞘線蟲(H.similis)、條紋鞘線蟲(H.striatula))、胞囊線蟲(異皮線蟲屬(Heterodera spp.))、杏仁胞囊線蟲(杏仁線蟲(H.amygdali))、燕麥(或谷類)胞囊線蟲(小麥禾谷胞囊線蟲(H.avenae))、菖蒲(或木豆)胞囊線蟲(大豆胞囊線蟲(H.cajani))、百慕大草(或心形或瓦倫丁(Valentine))胞囊線蟲((H.cardiolata))、胡蘿卜胞囊線蟲((H.carotae))、甘藍菜胞囊線蟲或蕓苔根結線蟲(十字花科異皮線蟲(H.cruciferae))、香附子(或莎草)胞囊線蟲(莎草胞囊線蟲(H.cyperi))、日本胞囊線蟲(旱稻胞囊線蟲(H.elachista))、無花果(或無花果屬或橡膠)胞囊線蟲(無花果胞囊線蟲(H.fici))、鼬瓣花胞囊線蟲(鼬瓣花胞囊線蟲(H.galeopsidis))、大豆胞囊線蟲(甘氨酸線蟲(H.glycines))、苜蓿根(或豌豆胞囊)線蟲(豌豆異皮線蟲(H.goettingiana))、蕎麥胞囊線蟲(格拉頓尼線蟲(H.graduni))、大麥胞囊線蟲(大麥胞囊線蟲(H.hordecalis))、蛇麻子胞囊線蟲(蛇麻草胞囊線蟲(H.humuli))、地中海谷類(或小麥)胞囊線蟲(大麥胞囊線蟲(H.latipons))、胡枝子胞囊線蟲(胡枝子胞囊線蟲(H.lespedezae))、堪薩斯胞囊線蟲(Kansas cyst nematode)(長領胞囊線蟲(H.longicolla))、谷物根結線蟲或燕麥胞囊線蟲(主要異皮線蟲(H.major))、草胞囊線蟲(瑪尼線蟲(H.mani))、苜蓿胞囊線蟲(藥物線蟲(H.medicaginis))、莎草(或蛾)胞囊線蟲(莫蒂異皮線蟲(Heterodera mothi))、水稻胞囊線蟲(水稻胞囊線蟲(H.oryzae))、阿姆河(Amu-Darya)(或駱駝刺胞囊)線蟲(奧辛那線蟲(H.oxiana))、酸模屬草胞囊線蟲(羅西線蟲(H.rosii))、酸模胞囊線蟲(盧米西線蟲(H.rumicis))、糖用甜菜胞囊線蟲(甜菜胞囊線蟲(H.schachtii))、柳樹胞囊線蟲(柳樹胞囊線蟲(H.salixophila))、紗球草胞囊線蟲(斯卡蘭蒂線蟲(H.scleranthii))、苣荬菜胞囊線蟲(苣荬菜線蟲(H.sonchophila))、塔吉克胞囊線蟲(tadzhik cyst nematode)(塔吉克線蟲(H.tadshikistanica))、土庫曼胞囊線蟲(土庫曼線蟲(H.turcomanica))、三葉草胞囊線蟲(三葉草線蟲(H.trifolii))、蕁麻胞囊線蟲(蕁麻線蟲(H.urticae))、尤斯蒂諾夫胞囊線蟲(ustinov cyst nematode)(斯蒂諾夫線蟲(H.ustinovi))、豇豆胞囊線蟲(豇豆線蟲(H.vigni))、玉米胞囊線蟲(玉蜀黍線蟲(H.zeae))、稻根線蟲(潛根線蟲屬(Hirschmanniella spp.)、貝氏潛根線蟲(H.belli)、刻尾潛根線蟲(H.caudacrena)、纖細潛根線蟲(H.gracilis)、水稻潛根線蟲(H.oryzae))、矛線蟲(紐帶線蟲屬(Hoplolaimus spp.))、哥倫比亞線蟲(哥倫比亞紐帶線蟲(H.columbus))、科布斯矛線蟲(Cobb's lance nematode)(帽狀紐帶線蟲(H.galeatus))、冠頭矛線蟲(泰蘭線蟲(H.tylenchiformis))、假根節(jié)線蟲(禾本科高臀線蟲(Hypsoperine graminis))、針線蟲(長針線蟲屬(Longidorus spp.)、非洲長針線蟲(L.africanus)、硫長針線蟲(L.sylphus))、環(huán)線蟲(異盤大莖線蟲(Macroposthonia xenoplax)(＝異盤中環(huán)線蟲(Mesocriconema xenoplax)))、囊狀線蟲(擬根結線蟲屬(Meloidodera spp.))、松囊狀線蟲(佛羅里達擬根結線蟲(M.floridensis))、塔吉克囊狀線蟲(塔吉克擬根結線蟲(M.tadshikistanica))、囊體線蟲(半穿刺屬(Meloidoderita spp.))、矮化線蟲(默林屬(Merlinius spp.)、短小節(jié)紋線蟲(M.brevidens)、圓錐體線蟲(M.conicus)、大線蟲(M.grandis)、微小線蟲(M.microdorus))、根節(jié)線蟲(根結線蟲屬、高粱根結線蟲(M.acronea)、花生根結線蟲(M.arenaria)、甘藍根結線蟲(M.artiellia)、保魯根結線蟲(M.brevicauda)、山茶根結線蟲(M.camelliae)、卡羅萊納根結線蟲(M.carolinensis)、奇特伍德根結線蟲(M.chitwoodi)、短小根結線蟲(M.exigua)、禾谷根結線蟲(M.graminicola)、北方根結線蟲(M.hapla)、西班牙根結線蟲(M.hispanica)、南方根結線蟲(M.incognita)、南方根結線蟲高弓(M.incognita acrita)、印度根結線蟲(M.indica)、無飾根結線蟲(M.inornata)、爪哇根結線蟲(M.javanica)、克苦亞根結線蟲(M.kikuyuensis)、科嫩西根結線蟲(M.konaensis)、蘋果根結線蟲(M.mali)、小結根結線蟲(M.microtyla)、納西根結線蟲(M.naasi)、奧瓦利根結線蟲(M.ovalis)、懸鈴木根結線蟲(M.platani)、凱西亞根結線蟲(M.querciana)、薩薩里根結線蟲(M.sasseri)、塔吉克根結線蟲(M.tadshikistanica)、泰晤士根結線蟲(M.thamesi))、矢車菊線蟲(矢車菊線蟲(Mesoanguina picridis))、花旗松線蟲(花旗松線蟲(Nacobbodera chitwoodi))、假根節(jié)線蟲(異常珍珠線蟲(Nacobbus aberrans)、貝塔珍珠線蟲(N.batatiformis)、背側珍珠線蟲(N.dorsalis))、酸醬線蟲(腐生線蟲(Panagrellus redivivus))、啤酒線蟲(西路西亞線蟲(P.silusiae))、針線蟲(擬長針線蟲(Paralongidorusmicrolaimus))、螺旋線蟲(異盤旋屬(Pararotylenchus spp.))、粗短根線蟲(阿利斯線蟲(Paratrichodorus allius)、較小擬毛刺線蟲(P.minor)、胼胝擬毛刺線蟲(P.porosus)、腎形擬毛刺線蟲(P.renifer))、扣針線蟲(針線蟲屬(Paratylenchus spp.)、布拉達針線蟲(P.baldaccii)、布科文針線蟲(P.bukowinensis)、彎曲針線蟲(P.curvitatus)、雙花針線蟲(P.dianthus)、伊拉針線蟲(P.elachistus)、鉤針線蟲(P.hamatus)、霍德曼尼針線蟲(P.holdemani)、伊塔針線蟲(P.italiensis)、美麗針線蟲(P.lepidus)、那努斯針線蟲(P.nanus)、新鈍頭針線蟲(P.neoamplycephalus)、擬針線蟲(P.similis))、病變(或草原)線蟲(短體屬(Pratylenchus spp.)、艾倫短體線蟲(P.alleni)、短尾短體線蟲(P.brachyurus)、咖啡短體線蟲(P.coffeae)、鈴蘭短體線蟲(P.convallariae)、刻痕短體線蟲(P.crenatus)、弗萊克短體線蟲(P.flakkensis)、全體短體線蟲(P.goodeyi)、六裂短體線蟲(P.hexincisus)、洛賽短體線蟲(P.leiocephalus)、米尼短體線蟲(P.minyus)、繆斯短體線蟲(P.musicola)、落選短體線蟲(P.neglectus)、穿刺短體線蟲(P.penetrans)、草地根腐線蟲(P.pratensis)、斯克里布納短體線蟲(P.scribneri)、索氏短體線蟲(P.thornei)、傷殘短體線蟲(P.vulnus)、玉米短體線蟲(P.zeae))、莖干蟲癭線蟲(莖干蟲癭線蟲(Pterotylenchus cecidogenus))、草胞囊線蟲(草胞囊線蟲(Punctodera punctate))、矮化線蟲(銳利線蟲(Quinisulcius acutus)、具頭五溝線蟲(Q.capitatus))、穿孔線蟲(穿孔線蟲屬(Radopholus spp.))、香蕉根線蟲(香蕉穿孔線蟲(R.similis))、水稻根線蟲(水稻穿孔線蟲(R.oryzae))、紅色環(huán)(或椰子或椰子樹)線蟲(椰子紅環(huán)腐線蟲(Rhadinaphelenchus cocophilus))、腎形腎狀線蟲(腎形線蟲屬(Rotylenchulus spp.)、普通腎形線蟲(R.reniformis)、微小腎狀線蟲(R.parvus))、螺旋線蟲(盤旋屬(Rotylenchus spp.)、布氏盤旋線蟲(R.buxophilus)、克氏盤旋線蟲(R.christiei)、強狀盤旋線蟲(R.robustus))、索氏矛線蟲(同形節(jié)石線蟲(R.uniformis))、親水線蟲(Sarisodera hydrophylla)、螺旋線蟲(盾線蟲屬(Scutellonema spp.)、布拉盾線蟲(S.blaberum)、短尾盾線蟲(S.brachyurum)、隉盾線蟲(S.bradys)、懷氏盾線蟲(S.clathricaudatum)、克里斯蒂盾線蟲(S.christiei)、科尼盾線蟲(S.conicephalum))、草根蟲癭線蟲(小麥根癭線蟲(Subanguina radicicola))、圓囊狀線蟲(圓囊狀線蟲(Thecavermiculatus andinus))、粗短根線蟲(毛刺線蟲屬(Trichodorus spp.)、克里斯蒂毛刺線蟲(T.christiei)、庫如毛刺線蟲(T.kurumeensis)、帕奇毛刺線蟲(T.pachydermis)、原始毛刺線蟲(T.primitivus))、醋線蟲(或線蟲)(醋線蟲(Turbatrix aceti))、矮化(或口針)線蟲(矮化線蟲屬(Tylenchorhynchus spp.)、農地矮化線蟲(T.agri)、飾環(huán)矮化線蟲(T.annulatus)、阿斯矮化線蟲(T.aspericutis)、克萊頓矮化線蟲(T.claytoni)、伊布里矮化線蟲(T.ebriensis)、華麗矮化線蟲(T.elegans)、金色矮化線蟲(T.golden)、格拉西矮化線蟲(T.graciliformis)、馬丁矮化線蟲(T.martini)、馬舒德矮化線蟲(T.mashhoodi)、微小矮化線蟲(T.microconus)、裸矮化線蟲(T.nudus)、歐拉矮化線蟲(T.oleraceae)、盤尼希矮化線蟲(T.penniseti)、普尼希矮化線蟲(T.punensis))、柑桔線蟲(半穿刺線蟲(Tylenchulus semipenetrans))、以及劍線蟲(劍線蟲屬(Xiphinema spp.)、美洲劍線蟲(X.americanum)、貝克劍線蟲(X.bakeri)、巴西劍線蟲(X.brasiliense)、短頸劍線蟲(X.brevicolle)、錢伯斯劍線蟲(X.chambersi)、麥考歲劍線蟲(X.coxi)、土壤劍線蟲(X.diversicaudatum)、標準劍線蟲(X.index)、標明劍線蟲(X.insigne)、尼格劍線蟲(X.nigeriense)、太平洋劍線蟲(X.radicicola)、塞塔劍線蟲(X.setariae)、瓦格劍線蟲(X.vulgarae)、單條劍線蟲(X.vuittenezi))。
通過上文所闡述的方法防治的植物病原性昆蟲包括(但不限于)來自以下目的非蚊科昆蟲幼蟲：(a)鱗翅目，例如長翅卷蛾屬(Acleris spp.)、褐帶卷蛾屬(Adoxophyes spp.)、透翅蛾屬(Aegeria spp.)、夜盜蟲屬(Agrotis spp.)、棉樹葉蟲(Alabama argillaceae)、淀粉蟲屬(Amylois spp.)、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、黃卷蛾屬(Archips spp.)、帶卷蛾屬(Argyrotaenia spp.)、丫紋夜蛾屬(Autographa spp.)、玉米莖蛀褐夜蛾(Busseola fusca)、粉斑螟蛾(Cadra cautella)、桃小食心蟲(Carposina nipponensis)、禾草螟屬(Chilo spp.)、色卷蛾屬(Choristoneura spp.)、葡萄果蠹蛾(Clysia ambiguella)、縱卷葉野螟屬(Cnaphalocrocis spp.)、云卷蛾屬(Cnephasia spp.)、細卷蛾屬(Cochylis spp.)、鞘蛾屬(Coleophora spp.)、大菜螟(Crocidolomia binotalis)、蘋果異形小卷蛾(Cryptophlebia leucotreta)、小卷蛾屬(Cydia spp.)、桿草螟屬(Diatraea spp.)、蘇丹棉鈴蟲(Diparopsis castanea)、鉆夜蛾屬(Earias spp.)、粉斑螟屬(Ephestia spp.)、花小卷蛾屬(Eucosma spp.)、葡萄螟蛾(Eupoecilia ambiguella)、黃毒蛾屬(Euproctis spp.)、切夜蛾屬(Euxoa spp.)、小食心蟲屬(Grapholita spp.)、云霧廣翅小卷蛾(Hedya nubiferana)、實夜蛾屬(Heliothis spp.)、菜螟(Hellula undalis)、美國白蛾(Hyphantria cunea)、番茄蠹蛾(Keiferia lycopersicella)、旋紋潛葉蛾(Leucoptera scitella)、潛葉細蛾屬(Lithocollethis spp.)、葡萄漿果小卷蛾(Lobesia botrana)、毒蛾屬(Lymantria spp.)、潛蛾屬(Lyonetia spp.)、天幕毛蟲屬(Malacosoma spp.)、甘藍夜蛾(Mamestra brassicae)、煙草天蛾(Manduca sexta)、秋尺蛾屬(Operophtera spp.)、歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、超小卷蛾屬(Pammene spp.)、褐卷蛾屬(Pandemis spp.)、冬夜蛾(Panolis flammea)、紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella)、馬鈴薯塊莖蛾(Phthorimaea operculella)、菜青蟲(Pieris rapae)、菜粉蝶屬(Pieris spp.)、小菜蛾(Plutella xylostella)、小白巢蛾屬(Prays spp.)、白禾螟屬(Scirpophaga spp.)、蛀莖夜蛾屬(Sesamia spp.)、長須卷蛾屬(Sparganothis spp.)、夜蛾屬(Spodoptera spp.)、透翅蛾屬(Synanthedon spp.)、異舟蛾屬(Thaumetopoea spp.)、卷蛾屬(Tortrix spp.)、粉紋夜蛾和巢蛾屬(Yponomeuta spp.)；(b)鞘翅目，例如叩甲屬(Agriotes spp.)、花象屬(Anthonomus spp.)、甜菜隱食甲(Atomaria linearis)、甜菜莖跳甲(Chaetocnema tibialis)、根頸象屬(Cosmopolites spp.)、象蟲屬(Curculio spp.)、皮蠹屬(Dermestes spp.)、根螢葉甲屬(Diabrotica spp.)、植食瓢蟲屬(Epilachna spp.)、Eremnus屬、馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata)、稻水象屬(Lissorhoptrus spp.)、鰓角金龜屬(Melolontha spp.)、鋸谷盜屬(Orycaephilus spp.)、耳象屬(Otiorhynchus spp.)、斑象屬(Phlyctinus spp.)、弧麗金龜屬(Popillia spp.)、蚤跳甲屬(Psylliodes spp.)、谷蠹屬(Rhizopertha spp-)、金龜子科(Scarabeidae)、谷象屬(Sitophilus spp.)、麥蛾屬(Sitotroga spp.)、擬步行蟲屬(Tenebrio spp.)、擬谷盜屬(Tribolium spp.)和斑皮蠹屬(Trogoderma spp.)；(c)直翅目，例如蠊屬(Blatta spp.)、小蠊屬(Blattella spp.)、螻蛄屬(Gryllotalpa spp.)、馬德拉蜚蠊(Leucophaea maderae)、飛蝗屬(Locusta spp.)、大蠊屬(Periplaneta spp.)和沙漠蝗屬(Schistocerca spp.)；(d)等翅目，例如散白蟻屬(Reticulitermes spp.)；(e)嚙蟲目，例如書虱屬(Liposcelis spp.)；(f)虱目，例如血虱屬(Haematopinus spp.)、長腭虱屬(Linognathus spp.)、人虱屬(Pediculus spp.)、癭綿蚜屬(Pemphigus spp.)和根瘤蚜(Phylloxera spp.)；(g)食毛目，例如畜虱屬(Damalinea spp.)和嚙毛虱屬(Trichodectes spp.)；(h)纓翅目，例如花薊馬屬(Frankliniella spp.)、Hercinotnrips屬、帶薊馬屬(Taeniothrips spp.)、南黃薊馬(Thrips palmi)、煙薊馬(Thrips tabaci)和非洲桔梗薊馬(Scirtothrips aurantii)；(i)異翅目，例如臭蟲屬(Cimex spp.)、可可瘤盲蜂(Distantiella theobroma)、棉紅蝽屬(Dysdercus spp.)、美洲蝽屬(Euchistus spp.)、扁盾蝽屬(Eurygaster spp.)、稻緣蝽屬(Leptocorisa spp.)、綠蝽屬(Nezara spp.)、擬網蝽屬(Piesma spp.)、紅獵蝽屬(Rhodnius spp.)、可可褐盲蝽(Sahlbergella singularis)、黑蝽屬(Scotinophara spp.)和錐蝽屬(Tniatoma spp.)；(j)同翅目，例如軟毛粉虱(Aleurothrixus floccosus)、菜粉虱(Aleyrodes brassicae)、腎圓盾蚧屬(Aonidiella spp.)、蚜科(Aphididae)、蚜屬(Aphis spp.)、薄圓盾介殼蟲屬(Aspidiotus spp.)、煙粉虱(Bemisia tabaci)、蠟蚧屬(Ceroplaster spp.)、黑褐圓盾蚧(Chrysomphalus aonidium)、橙褐圓盾蚧(Chrysomphalus dictyospermi)、褐軟蚧(Coccus hesperidum)、微葉蟬屬(Empoasca spp.)、蘋果棉蚜(Eriosoma larigerum)、斑葉蟬屬(Erythroneura spp.)、賈第蟲屬(Gascardia spp.)、灰飛虱屬(Laodelphax spp.)、水土堅蚧(Lecanium corni)、牡蠣蚧屬(Lepidosaphes spp.)、長管蚜屬(Macrosiphus spp.)、瘤蚜屬(Myzus spp.)、黑尾葉蟬屬(Nephotettix spp.)、褐飛虱屬(Nilaparvata spp.)、環(huán)翅卷蛾屬(Paratoria spp.)、癭綿蚜屬(Pemphigus spp.)、動性球菌屬(Planococcus spp.)、擬白輪盾介殼蟲屬(Pseudaulacaspis spp.)、粉蚧屬(Pseudococcus spp.)、木虱屬(Psylla spp.)、棉蚧(Pulvinaria aethiopica)、齒盾蚧屬(Quadraspidiotus spp.)、縊管蚜屬(Rhopalosiphum spp.)、珠蠟蚧屬(Saissetia spp.)、帶葉蟬屬(Scaphoideus spp.)、二叉蚜屬(Schizaphis spp.)、芒蚜屬(Sitobion spp.)、溫室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)、非洲木虱(Trioza erytreae)和柑橘尖盾階(Unaspis citri)；(k)膜翅目，例如頂切葉蟻屬(Acromyrmex)、切葉蟻屬(Atta spp.)、莖蜂屬(Cephus spp.)、松葉蜂屬(Diprion spp.)、松葉蜂科(Diprionidae)、云杉葉蜂(Gilpinia polytoma)、實葉蜂屬(Hoplocampa spp.)、毛蟻屬(Lasius spp.)、小家蟻(Monomorium pharaonis)、新松葉蜂屬(Neodiprion spp.)、火蟻屬(Solenopsis spp.)和胡蜂屬(Vespa spp.)；(l)雙翅目，例如伊蚊屬(Aedes spp.)、高粱芒蠅(Antherigona soccata)、花園毛蚊(Bibio hortulanus)、紅頭麗蠅(Calliphora erythrocephala)、實蠅屬(Ceratitis spp.)、金蠅屬(Chrysomyia spp.)、庫蚊屬(Culex spp.)、黃蠅屬(Cuterebra spp.)、寡毛實蠅屬(Dacus spp.)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、廁蠅屬(Fannia spp.)、胃蠅屬(Gastrophilus spp.)、舌蠅屬(Glossina spp.)、皮蠅屬(Hypoderma spp.)、虱蠅屬(Hyppobosca spp.)、斑潛蠅(Liriomyza spp.)、綠蠅屬(Lucilia spp.)、黑潛蠅屬(Melanagromyza spp.)、蠅屬(Musca spp.)、狂蠅屬(Oestrus spp.)、痿蚊屬(Orseolia spp.)、瑞典麥稈蠅(Oscinella frit)、甜菜潛葉蠅(Pegomyia hyoscyami)、草種蠅屬(Phorbia spp.)、蘋果實蠅(Rhagoletis pomonella)、尖眼蕈蚊屬(Sciara spp.)、螫蠅屬(Stomoxys spp.)、虻屬(Tabanus spp.)、螗蜩屬(Tannia spp.)和大蚊屬(Tipula spp.)；(m)蚤目，例如角葉蚤屬(Ceratophyllus spp.)和印鼠客蚤(Xenopsylla cheopis)；以及(n)纓尾目，例如衣魚(Lepisma saccharina)。
本文中所披露的殺蟲組合物可以進一步用于防治十字花科植物跳甲(條跳甲屬(Phyllotreta spp.))、根蛆(地種蠅屬(Delia spp.))、甘藍莢象甲(龜象屬(Ceutorhynchus spp.))以及油料種子作物中的蚜蟲，油料種子作物如芥花(油菜)、芥菜籽和其雜交體，以及水稻和玉米。在具體實施例中，昆蟲是夜蛾屬的成員，更確切地說是甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、桃蚜、小菜蛾或美洲蝽屬(Euschistus sp.)。
提供如本文中所披露的有效殺蟲防治量的殺蟲組合物的施用。所述殺蟲組合物單獨地或與另一種殺蟲物質組合，以有效害蟲防治或殺蟲量施用。有效量定義為單獨或與另一種殺蟲物質組合的殺蟲組合物的足以預防或調整害蟲侵擾的數量。有效量和比率會受到所存在的害蟲物種、害蟲生長階段、害蟲種群密度以及環(huán)境因素(如溫度、風速、雨、當日時間和季節(jié)性)的影響?？梢酝ㄟ^實驗室或現場測試確定在特定情況中將在有效范圍內的量。
施用方法
本文中所披露的殺蟲組合物當用于調整害蟲侵擾的方法中時，可以使用本領域中已知的方法施用。具體地說，這些組合物可以通過噴霧、浸漬、施用到植物周圍的生長基質(例如，土壤)、施用到根區(qū)、在種植之前浸漬根部、以草皮或浸液形式施用到植物、通過灌溉或作為土壤顆粒而施用到植物或植物部分。在本文上下文中，植物應理解為意指所有植物和植物群體，如所需和非所需的野生植物或作物植物(包括天然產生的作物植物)。作物植物可以是通過常規(guī)植物育種和優(yōu)化方法、通過生物技術和基因工程方法、或通過這些方法的組合獲得的植物，包括受植物育種者權利保護或不受其保護的轉基因植物和植物品種。植物部分應理解為意指植物在地上和地下的所有部分和器官，如芽、葉、花和根，可以提及的實例是葉子、針葉、稈、莖、花、果實體、果實、種子、根、塊莖和根莖。植物部分還包括收獲的物質，以及無性和有性繁殖物質，例如插條、塊莖、根莖、分枝和種子。
施用可以是外部施用(例如通過噴霧、霧化或噴涂)或內部施用(例如，通過注射、轉染或使用昆蟲載體)。當內部施用時，組合物可以是細胞內組合物或細胞外組合物(例如，存在于植物的維管系統(tǒng)中、存在于細胞外空隙中)。
用上文闡述的組合物處理植物和植物部分可以直接進行或通過使組合物通過例如浸沒、噴霧、蒸發(fā)、霧化、分散、噴涂或注射來對植物的周圍環(huán)境、生境或儲存空間起作用。在對種子施用組合物的情況下，可以在種植種子之前，使用本領域中已知的方法按一或多個涂層形式對種子施用組合物。
如本文中所披露的殺蟲組合物還可以例如作為種子包衣對種子施用。在制造種子包衣時可以使用不同的粘附物(“粘著劑”)，包括例如甲基纖維素、海藻酸鹽、角叉菜膠和聚乙烯醇。將粘附物溶解于水中，達到介于1-10％之間的百分比，并且在對種子施用之前在室溫下儲存。將種子在粘附物溶液(3ml/100粒種子)中浸泡15分鐘，舀出并且在塑料袋中與有機物質(1.5g/100粒種子)混合并劇烈震蕩。這個過程也可以使用種子包衣機實現自動化。
關于用如本文中所披露的組合物引發(fā)種子，將種子浸泡在兩倍種子體積的無菌蒸餾水中，所述無菌蒸餾水含有細菌/蛋白質/核酸懸浮液或滑石調配物(干式調配物)(視種子大小而定，每千克種子4-10g)，并且在25±2℃下培育12-24小時。然后流掉懸浮液，使種子陰干30分鐘并用于播種。
組合物還可以用作土壤改良劑，例如與載劑(如滑石調配物)組合。用于土壤改良劑的調配物還可以包括粘土、乳化劑、表面活性劑和穩(wěn)定劑，如本領域中已知。關于基于滑石的調配物的制備，按照由那達古瑪等人(2001)所描述的方法，在無菌條件下混合1kg經過純化的滑石粉末(經過12小時滅菌)、15g碳酸鈣和10g羧甲基纖維素。蛋白質、核酸懸浮液或表達這些的生物體按1:2.5的比率混合(懸浮液，干式混合)并且陰干產物，將水分含量降低到20-35％。
關于土壤改良劑，視作物而定，可以在播種時和/或在萌芽之后的不同時間或這兩者，以介于2.5-10Kg ha-1之間的比率施用調配物(例如，滑石調配物)。
本文中所披露的組合物也可以使用本領域中已知的方法施用到土壤中。參見例如USDA網站naldc.nal.usda.gov/download/43874/pdf，于2013年2月20日訪問。這類方法包括(但不限于)熏蒸、滴灌或化學灌溉、撒施顆粒或噴霧劑、土壤合并(例如，施用顆粒)、土壤浸透、種子處理和拌種以及裸根浸漬。
植物轉化
本文中所披露的核酸可以使用多種植物轉化技術中的任一種引入到植物中并且任選地在植物中表達。植物的轉化可以用單一DNA物種或多個DNA物種(即，共轉化)進行。
在某些實施例中，活性紫色細菌蛋白質或多肽(例如，毒素)在植物中表達并保護植物遠離昆蟲害蟲。舉例來說，如本文中所披露的核苷酸序列可以插入到表達盒中，表達盒可以任選地穩(wěn)定整合到植物的染色體中。在某些實施例中，核苷酸序列被包括在非致病性自我復制病毒中。根據本發(fā)明轉化的植物可以是單子葉植物或雙子葉植物并且包括(但不限于)玉米、小麥、大麥、黑麥、甘薯、豆、豌豆、菊苣、萵苣、甘藍菜、花椰菜、椰菜、蕪菁、蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、胡椒、芹菜、筍瓜、南瓜、大麻、綠皮西葫蘆、蘋果、梨、柑橘、甜瓜、李子、櫻桃、杏子、草莓、木瓜、鱷梨、芒果、香蕉、苜蓿、水稻、馬鈴薯、茄子、桃子、棉花、胡蘿卜、煙草、高粱、油桃、糖用甜菜、甘蔗、葵花、大豆、番茄、菠蘿、葡萄、覆盆子、黑莓、黃瓜、擬南芥以及木本植物，如針葉樹和落葉樹。
一旦將所要核苷酸序列引入到特定植物物種中，所述核苷酸序列就可以在該物種中繁殖，或者使用傳統(tǒng)的育種技術轉移到同一物種的其它品種，確切地說包括商業(yè)品種。
DNA可以通過使用多種本領域公認的方法引入植物細胞中。本領域的普通技術人員將了解，方法的選擇可以取決于定為轉化目標的植物的類型。合適的植物細胞轉化方法如下。
農桿菌屬介導的轉化
植物中主要的DNA轉移方法是農桿菌屬介導的轉化。天然的活的土壤細菌根癌農桿菌能夠感染各種植物物種，導致冠癭病(Crown Gall disease)。當根癌農桿菌感染細胞時，它轉移了其T-DNA的拷貝，T-DNA是其Ti(誘導腫瘤的)質粒上所攜帶的一小段DNA。T-DNA通過兩個(不完美的)25堿基對重復序列側接。這些邊界內所含的任何DNA都將被轉移到宿主細胞中。朱潘(Zupan)和贊布里斯基(Zambriski)，1995。Ti質粒上的T-DNA區(qū)段可以用連接到適當調控序列的轉基因替換。然后可以使用含有包含外源性核苷酸序列的Ti質粒的重組根癌農桿菌感染再生細胞或原生質體(即，無壁球形植物細胞)的培養(yǎng)物。可以在Ti質粒構筑體中包括標記基因，如編碼抗生素抗性的標記基因，使得可能選擇出已被細菌轉化的細胞。通過標準方法，對所選細胞進行細胞到植物的再生。參見例如朱潘和贊布里斯基(1995)以及瓊斯(Jones)等人(2005)植物方法(Plant Methods)。
可以使用根癌農桿菌相對容易地轉化多個雙子葉植物物種。欣奇(Hinchee)等人,生物技術(Biotechnology)6:915-921(1988)。關于玉米轉化的說明，另外參見石田(Ishida)等人,自然·生物技術(Nature Biotechnology)14:745-750(1996年6月)。
生物射彈傳遞
這種方法也稱為“粒子轟擊”，涉及使用“基因槍”將DNA分子直接“射擊”到受體植物組織中。用相關DNA涂布鎢珠或金珠(它們小于植物細胞本身)，點火穿過停止屏，通過氦氣加速，到達植物組織中。粒子通過植物細胞，把DNA留在內部。這種方法可以成功地用于單子葉和雙子葉物種?？梢允褂脴擞浕?如編碼抗生素抗性的標記基因)選擇經過轉化的組織。所有細胞都含有轉基因拷貝的完整植物可以使用購自威斯康星州麥迪遜的阿格雷斯圖公司(Agracetus,Inc.(Madison,WI))和特拉華州威爾明頓的杜邦公司(Dupont,Inc.(Wilmington,DE))的裝置，從培養(yǎng)液中的全能轉化細胞再生(諾丁漢(Nottingham)，1998)。
生物射彈植物轉化方法是本領域中已知的。參見例如桑福德(Sanford)等人,第4,945,050號美國專利；麥凱布(McCabe)等人,生物技術6.923-926(1988)；魏辛格(Weissinger)等人,遺傳學年評(Annual Rev Genet.)22-421-477(1988)；桑福德等人,粒子科學與技術(Particulate Science and Technology)5.27-37(1987)(洋蔥)；斯瓦伯(Svab)等人,美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87-8526-8530(1990)(煙草葉綠體)；赫里斯圖(Christou)等人,植物生理學(Plant Physiol)87,671-674(1988)(大豆)；麥凱布等人,生物技術6.923-926(1988)(大豆)；克萊因(Klein)等人,美國國家科學院院刊,85:4305-4309(1988)(玉米)；克萊因等人,生物技術6,559-563(1988)(玉米)；克萊因等人,植物生理學91,440-444(1988)(玉米)；弗羅姆(Fromm)等人,生物技術8:833-839(1990)；戈登·卡姆(Gordon-Kamm)等人,植物細胞(Plant Cell)2:603-618(1990)(玉米)；科齊埃爾(Koziel)等人,生物技術11:194-200(1993)(玉米)；島本(Shimamoto)等人,自然338:274-277(1989)(水稻)；赫里斯圖(Christou)等人,生物技術9:957-962(1991)(水稻)；達塔(Datta)等人,生物技術8.736-740(1990)(水稻)；歐洲專利申請EP 0 332 581(果園草和其它早熟禾亞科植物(Pooideae))；瓦西爾(Vasil)等人,生物技術11:1553-1558(1993)(小麥)；威克斯(Weeks等人,植物生理學102:1077-1084(1993)(小麥)；萬(Wan)等人,植物生理學104:37-48(1994)(大麥)；亞內(Jahne)等人,理論與應用遺傳學(Theor.Appl.Genet.)89:525-533(1994)(大麥)；翁貝克(Umbeck)等人,生物技術5:263-266(1987)(棉花)；卡薩斯(Casas)等人,美國國家科學院院刊90:11212-11216(1993年12月)(高粱)；薩默斯(Somers)等人,生物技術10:1589-1594(1992年12月)(燕麥)；托伯特(Torbert)等人,植物細胞報告(Plant Cell Reports)14:635-640(1995)(燕麥)；威克斯等人,植物生理學102:1077-1084(1993)(小麥)；常(Chang)等人,WO 94/13822(小麥)以及內拉(Nehra)等人,植物雜志(The Plant Journal)5:285-297(1994)(小麥)。
用于通過微彈轟擊將重組DNA分子引入到玉米中的方法可見于科齊埃爾等人,生物技術11:194-200(1993)；希爾等人,Euphytica 85:119-123(1995)；以及科齊埃爾等人,紐約科學院年報(Annals of the New York Academy of Sciences)792:164-171(1996)中。
原生質體轉化和其它方法
用于將核酸分子引入到植物中的另一種方法是如EP 0 292 435中針對玉米所披露的原生質體轉化方法。用于植物中的基因轉移的其它傳遞系統(tǒng)包括電穿孔(里格斯(Riggs)等人,美國科學院院刊83,5602-5606(1986))、微注射(克勞斯威(Crossway)等人,生物技術4,320-334(1986))、碳化硅介導的DNA轉移、直接基因轉移(帕什科夫斯基(Paszkowski)等人,EMBO J.3.2717-2722(1984)；哈亞希莫托(Hayashimoto)等人,植物生理學93.857-863(1990)(水稻))。
色素體轉化
在另一個實施例中，如本文中所披露的核苷酸序列被直接轉化到色素體(例如，葉綠體)的基因組中。色素體轉化的優(yōu)點包括色素體表達細菌基因且細菌序列無大量修飾的能力，和色素體在單一啟動子的控制下表達多個開放閱讀框的能力。色素體轉化技術描述于第5,451,513號、第5,545,817號和第5,545,818號美國專利；第WO 95/16783號PCT申請；以及麥克布賴德(McBride)等人(1994)美國國家科學院院刊91,7301-7305中。
基礎的葉綠體轉化技術涉及使用例如生物射彈或原生質體轉化(例如，氯化鈣或PEG介導的轉化)，將側接有可選擇標記的克隆色素體DNA區(qū)域與相關基因一起引入到合適的靶組織中。1到1.5kb側接區(qū)稱為靶向序列，有助于與色素體基因組同源重組，從而實現色素體基因組的特定區(qū)域的置換或修飾。首先，采用葉綠體16S rRNA和rpsl2基因中賦予大觀霉素和/或鏈霉素抗性的點突變作為轉化可選標記(斯瓦伯Z.等人(1990)美國國家科學院院刊87,8526-8530；斯托布J.M.(Staub,J.M.)和馬利加P.(Maliga,P.)(1992)植物細胞(Plant Cell)4,39-45)；從而以每100次轟擊目標葉大約一個的頻率產生穩(wěn)定同質轉化體。在這些標記之間存在克隆位點允許創(chuàng)建用于引入外來基因的色素體靶向載體。斯托布J.M.和馬利加P.(1993)EMBO J.12:601-606。通過用顯性可選標記替換隱性rRNA或r蛋白抗生素抗性基因，轉化頻率大幅增加，所述顯性可選標記是編碼大觀霉素解毒酶氨基糖苷-3'腺苷?；D移酶的細菌AADA基因。斯瓦伯Z.和馬利加P.(1993)美國國家科學院院刊90:913-917。以前，這種標記成功地用于綠藻萊茵衣藻的色素體基因組的高頻轉化。戈特斯密特·克萊蒙特M.(Goldschmidt-Clermont,M.)(1991)核酸研究19:4083-4089。
適用于色素體轉化的其它可選標記是本領域中已知的并且涵蓋在本發(fā)明的范圍內。通常，在轉化之后需要大約15-20個細胞分裂周期來達到同質狀態(tài)。相較于核基因，通過同源重組將基因插入到每個植物細胞中所存在的圓形色素體基因組的所有數千拷貝中的色素體表達利用巨大拷貝數優(yōu)勢來實現可以容易地超過總可溶性植物蛋白的10％的表達水平。因此，在某些實施例中，將如本文中所披露的核苷酸序列插入到靶向色素體的載體中并被轉化到所要植物宿主的色素體基因組中。獲得含有相關核苷酸序列的色素體基因組的同種植物，并且所述植物能夠高水平表達核苷酸序列。
高效轉染(Magnifection)
高效轉染是一種瞬時表達方法，它基于使用農桿菌從全身性傳遞到植物細胞中的病毒RNA復制子表達。這種方法允許以每千克新鮮葉生物質最多5g的產量產生重組蛋白，這接近了蛋白質表達的生物極限。如此高的產量是可能的，因為這種方法具有瞬時特性，瞬時特性允許使用源自RNA病毒(如煙草花葉病毒(TMV)或馬鈴薯病毒X)的非常有效的擴增子，且不限制生物質積累，生物質積累發(fā)生在感染之前。參見例如馬里約內(Marillonnet)等人(2005)自然·生物技術.23(6):718-723。
用于植物基因工程的方法和組合物的其它披露提供于伯奇JA(Bircher JA)(編)“植物染色體工程改造方法和方案(Plant Chromosome Engineering:Methods and protocols).”分子生物學方法(Methods in Molecular Biology),第701卷,斯普林格出版社(Springer Science)+商業(yè)媒體,2011中。
轉基因植物和種子
源自植物細胞的轉基因植物可以生長產生具有相比于對照植物來說增強性狀的轉基因植物，并且產生本發(fā)明的轉基因種子和單倍體花粉。具有增強性狀的這類植物通過針對增強性狀選擇經過轉化的植物或后代種子來鑒別。為了效率，選擇方法被設計成用于評估多個轉基因植物(事件)，包括重組DNA，例如從2到20或更多個轉基因事件的多個植物。從本文中提供的轉基因種子生長的轉基因植物展現出有助于提高產量的改良農藝性狀或提高植物價值的其它性狀，所提高的植物價值包括例如改良種子質量。備受關注的是具有增強的水利用率、增強的耐寒性、增加的產量、增強的氮利用率、增強的種子蛋白質和增強的種子油的植物。轉基因植物包括(但不限于)玉米、大豆、棉花、芥花、苜蓿、小麥、水稻、甘蔗、糖用甜菜種子、小米、大麥、花生、木豆、高粱、蔬菜(包括(但不限于)椰菜、花椰菜、甘藍菜、蘿卜、大白菜、甜瓜、西瓜、黃瓜、葫蘆、南瓜、筍瓜、胡椒、番茄、茄子、洋蔥、胡蘿卜、四季豆、甜玉米、豌豆、干菜豆、秋葵、菠菜、韭菜、萵苣和茴香)、葡萄、漿果(包括藍莓、黑莓、覆盆子、桑椹、博伊森莓等)、櫻桃和相關果樹(包括(但不限于)李子、桃子、杏子、奇異果、石榴、芒果、無花果)、果樹(包括(但不限于)橙子、檸檬、酸橙、血橙、葡萄柚等)、堅果樹(包括(但不限于)椰子、胡桃(英國胡桃和黑胡桃)、山核桃、杏仁、榛子、巴西果、山核桃、橡果等)、葵花、其它產油籽植物或其任何組合。
植物生長促進
本文中所披露的組合物，尤其是活性紫色細菌核酸和多肽，可以用于調整或更確切地說促進植物生長，所述植物例如作物，如水果(例如，草莓)、蔬菜(例如，番茄、筍瓜、胡椒、茄子)、谷類作物(例如，大豆、小麥、水稻、玉米)、樹、花、觀賞植物、灌木(例如，棉花、玫瑰)、球莖植物(例如，洋蔥、大蒜)、藤本植物(例如，葡萄藤)以及草皮(例如百慕大草、肯塔基藍草、羊茅草)。組合物還可以用于調整植物種子的發(fā)芽。
活性紫色細菌核酸和多肽或其調配產物可以單獨使用或與一或多種如下所述的其它組分組合使用，如生長促進劑和/或抗植物病原性劑，在生長季節(jié)期間按預定順序和施用間隔以罐式混合或按某種程序(依序施用，稱作輪作)使用。當以比產品標簽上所推薦的低的濃度與以上所提到的產品組合使用時，在某些實施例中，兩種或更多種產品(其中之一是本文中所披露的所述組合物)的組合功效大于每種個別組分的效果的總和。因此，通過這兩種(或更多種)產品之間的協(xié)同作用增強了效果，并且降低了在植物病原性菌株中發(fā)展出殺蟲劑抗性的風險。
組合物可以通過在移植時的根部浸漬施用，確切地說通過在將水果或蔬菜移植入土壤中之前，將水果或蔬菜的根部浸漬在所述組合物的懸浮液(按體積計約0.25％到約1.5％，并且更確切地說約0.5％到約1.0％)中用所述組合物處理水果或蔬菜。
或者，可以通過滴灌或其它灌溉系統(tǒng)施用組合物。確切地說，組合物可以注入滴灌系統(tǒng)中。在具體實施例中，按濃度為1×108CFU/mL的溶液以約11到約4夸脫/英畝的比例施用組合物。
在又另一個實施例中，組合物可以溝內施用的形式添加。確切地說，可以在種植時使用經過校準以傳遞2-6加侖/英畝的總輸出的噴嘴將組合物以溝內噴霧的形式添加?？梢詫娮旆胖迷诜N植機上的開溝器中，使得殺蟲劑施用與種子落入犁溝中是同時的。
如本領域中已知的那樣制備所披露的組合物與例如固體或液體佐劑的混合物。舉例來說，可以通過均勻混合和/或研磨活性成分連同增量劑制備混合物，所述增量劑例如溶劑、固體載劑以及在適合情況下的表面活性化合物(表面活性劑)。組合物還可以含有其它成分以便獲得其它所要效果，所述其它成分例如穩(wěn)定劑、粘度調節(jié)劑、粘合劑、佐劑以及肥料或其它活性成分。
與植物生長促進劑組合
本文中所披露的組合物可以與其它生長促進劑組合使用，所述生長促進劑例如合成或有機肥料(例如，呈顆粒狀或液體形式的磷酸二銨)；堆肥茶；海藻提取物；單獨或與例如IBA(吲哚丁酸)和NAA(萘乙酸)的植物生長調節(jié)劑組合用于對移植物進行生根激素處理的植物生長激素，例如IAA(吲哚乙酸)；以及促進生長的微生物，例如甲基營養(yǎng)生物、PPFM(粉紅著色兼性甲基營養(yǎng)生物)、芽孢桿菌屬、假單胞菌、根瘤菌以及木霉菌。
種子處理劑/種衣劑
本文中所披露的組合物還可以與種衣劑組合使用。這類種衣劑包括(但不限于)乙二醇、聚乙二醇、殼聚糖、羧甲基殼聚糖、泥煤苔、樹脂和蠟或具有單一位點、多位點或未知作用模式的化學殺真菌劑或殺細菌劑。
本文中所述的種子處理方法可以結合任何植物物種和/或其種子使用。然而，在各種實施例中，所述方法結合在農藝學上重要的植物物種的種子使用，具體來說，所述種子可以是玉米、花生、芥花/油菜籽、大豆、葫蘆、十字花科植物、棉花、甜菜、水稻、高粱、糖用甜菜、小麥、大麥、黑麥、葵花、番茄、甘蔗、煙草、燕麥以及其它植物和產葉作物的種子。在一些實施例中，種子是玉米、大豆或棉籽。種子可以是轉基因種子，從轉基因種子可以生長出轉基因植物并且轉基因種子并入了轉基因事件，轉基因事件賦予例如對特定除草劑或除草劑組合的耐受性、增加的疾病抗性、增強的對脅迫的耐受性和/或增強的產量。轉基因種子包括(但不限于)玉米、大豆和棉花的種子。
抗植物病原性劑
本文中所披露的組合物還可以與其它抗植物病原性劑組合使用，所述抗植物病原性劑例如植物提取物、生物殺蟲劑、無機作物保護劑(例如銅)、表面活性劑(例如鼠李醣脂；甘地(Gandhi)等人,2007)，或具有殺蟲特性的天然油，例如石蠟油和茶樹油，或具有單一位點、多位點或未知作用模式的化學殺真菌劑或殺細菌劑。如本文中所定義，“抗植物病原性劑”是調整植物病原體，確切地說導致植物的土傳疾病的病原體的生長，或者防止植物被植物病原體感染的試劑。植物病原體包括(但不限于)真菌、細菌、放線菌和病毒。
抗植物病原性劑可以是單一位點抗真菌劑，其可以包括(但不限于)苯并咪唑、去甲基化抑制劑(DMI)(例如咪唑、哌嗪、嘧啶、三唑)、嗎啉、羥基嘧啶、苯氨基嘧啶、硫代磷酸酯、醌外部抑制劑、喹啉、二甲酰亞胺、甲酰亞胺、苯基酰胺、苯氨基嘧啶、苯基吡咯、芳香族烴、肉桂酸、羥基苯胺、抗生素、多氧菌素、酰胺、鄰苯二甲酰亞胺、苯環(huán)型化合物(二甲苯基丙酸胺)。在更具體的實施例中，抗真菌劑是去甲基化抑制劑，其選自由以下組成的群組：咪唑、哌嗪、嘧啶以及三唑(例如，聯苯三唑醇、腈菌唑、戊菌唑、丙環(huán)唑、三唑酮、糠菌唑、環(huán)丙唑醇、烯唑醇、腈苯唑、己唑醇、戊唑醇、氟醚唑)。在最具體的實施例中，抗真菌劑是腈菌唑。在又一個具體實施例中，抗真菌劑是醌外部抑制劑(例如，嗜球果傘素)。嗜球果傘素可以包括(但不限于)嘧菌酯、醚菌酯或肟菌酯。在又一個具體實施例中，抗真菌劑是醌，例如喹氧靈(5,7-二氯-4-喹啉基4-氟苯基醚)。
在又一個實施例中，殺真菌劑是多位點非無機化學殺真菌劑，其選自由以下組成的群組：氯腈、喹喔啉、磺酰胺、膦酸酯、亞磷酸酯、二硫代氨基甲酸酯、氯烷基硫代物、苯基吡啶胺以及氰基乙酰胺肟。
在又一個實施例中，抗植物病原性劑可以是鏈霉素、四環(huán)素、氧四環(huán)素、銅或春日霉素。
生物修復
活性紫色細菌基因組編碼尤其參與磷、鐵和芳香族化合物的代謝的基因。參見例如上表6。這類基因和其基因產物可以用于生物修復方法中。舉例來說，與金屬輸送、金屬累積、有機化合物的降解和其它代謝物轉化相關的基因和序列可以工程改造到植物中，目的是向土壤、泥沙、水和其它被污染的基質的生物修復中施用經過轉化的植物。已知印度芥菜(芥菜(Brassica juncea))、葵花(向日葵(Helianthus annus))、番茄和鵝掌楸(北美鵝掌楸(Liriodendron tulipifera))的轉化方案。參見例如亞彭(Eapen)和德索薩(D'Souza)(2005)；梅洛·法里亞斯(Mello-Farias)和查韋斯(Chavez)(2008)。
可以用編碼細胞色素P450的基因轉化植物來提高所述植物對特定的有機和無機污染物的抗性。用編碼谷胱甘肽結合中所涉及的酶(例如，谷胱甘肽S轉移酶)的核酸轉化可以提高異型生物質的去毒速率?？梢允褂帽磉_細菌硝基還原酶的植物對硝酸酯有機化合物(如炸藥)進行去毒。
轉基因植物于植物修復應用的用途已例如由阿比希拉(Abhilash)等人(2009)；范·阿肯(Van Aken)等人(2010)；多提(Doty)(2008)和馬采克(Macek)等人(2008)描述。
下表2表示本發(fā)明關于活性紫色細菌蛋白質的額外信息。
表2
如本說明書和權利要求書中所用，單詞“包含(comprising)”(和包含的任何形式，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和具有的任何形式，例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(和包括的任何形式，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有”(和含有的任何形式，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括性或開放式的并且不排除其它未列出的要素或方法步驟。
如本文所用的術語“或其組合”是指在所述術語前面所列項目的所有排列和組合。舉例來說，“A、B、C或其組合”打算包括以下各項中的至少一個：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果在特定情況下順序是重要的，那么還有BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。繼續(xù)這個例子，明確地包括含有一或多個項目或術語的重復的組合，例如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。熟練技術人員應理解，除非另外從上下文顯而易見，否則通常不存在對任何組合中的項目或術語的數量的限制。
本文中所披露和要求的所有組合物和/或方法都可以根據本披露在無不當實驗的情況下制造和執(zhí)行。雖然本發(fā)明的組合物和方法已就優(yōu)選實施例描述過了，但是本領域的普通技術人員清楚，組合物和/或方法以及本文中所述方法的步驟或步驟的順序可以改變，且不脫離本發(fā)明的概念、精神和范圍。本領域的技術人員所清楚的所有這類類似取代和修改都視為在由所附權利要求書限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念內。
實例
實例1：細胞生長和DNA提取
使活性紫色細菌PRAA-1在26℃下在以150rpm旋轉的1L燒瓶中的200ml LB培養(yǎng)液中生長24-48小時。通過離心收集培養(yǎng)液中的生物質。
使用MoBio Power微生物Maxi-DNA提取試劑盒(MoBio目錄號122223-25)提取基因組DNA。在1.5ml洗脫緩沖液(包括在試劑盒中)中洗脫DNA。為了評定DNA質量和數量，將10uL等分試樣加載到1.5％瓊脂糖凝膠中并在100V下電泳30分鐘。使用EZ視覺加載染料，用UV透照器使DNA可視化。回收到超過100μg DNA。
實例2：DNA序列測定和組裝
使用HiSeq 2000(加利福尼亞州圣地亞哥的伊路米那(Illumina,San Diego,CA))，按100bp的序列讀數，雙端測序(pair ended)，按最小40×的覆蓋率對準，測定DNA序列。最終數據由兩組呈FASTQ形式的雙端樣品組成，提供大約200×的基因組覆蓋率。
使用四個FASTAQ文件進行組裝。使用FASTQC對FASTAQ序列進行質量控制，并且通過使用BWA比較兩組前10,000對與初始組裝的重疊群來計算各對之間的平均距離。李(Li)和德賓(Durbin)(2009)生物信息學(Bioinformatics)25(14):1754-1760。然后使用TrimGalore(英國劍橋的巴布拉哈姆生物信息學公司(Babraham Bioinformatics,Cambridge,UK))產生兩組高質量雙端測序和針對那些序列的四個單一讀數文件，其搭配物讀數在Q2上剪裁之后低于至少50個核苷酸的質量閾值。
使用射線匯編器(Ray assembler)v2.0.0組裝序列讀數。布瓦韋爾(Boisvert)等人(2010)計算生物學雜志(J Comput Biol.)17(11):1519-1533。以19-63的kmer范圍滴定kmer大??；在19、21、31、41、47、49和63下產生成功組裝。使用SSPACE v1.1，使用通過射線分析產生的超長序列片段(scaffold)上的所有可用讀數進行進一步超長序列片段分析。博澤爾(Boetzer)等人(2011)生物信息學27(4):578-579。使用GapFiller連接空隙，最大迭代二十個步驟。博澤爾和皮羅瓦諾(Pirovano)(2012)基因組生物學(Genome Biol.)13(6):R56。使用CONTIGuator，e值為1e-10，使所得超長序列片段針對紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)ATCC 12742的參考基因組進行映射。加拉爾迪尼(Galardini)等人(2011)生物學和醫(yī)學的源代碼(Source Code Biol.Med.)6:11。
為了確認重疊群和超長序列片段的順序，使用ACT手動檢查比對?？ǜ?Carver)等人(2008)生物信息學24(23):2672-2676。使用BWA(李和德賓，同前文獻)，按種子長度19將初始數據集映射回活性紫色細菌序列。
這種方法產生4,690,330個堿基的高質量基因組，其中重疊群中總共145,992個堿基不匹配參考基因組(紫色色桿菌)并且42個空隙中有4,264個不確定的核苷酸(N)。假重疊群中的空隙的后續(xù)填充關閉了42個空隙中的8個并且使假重疊群延伸到4,704,820個堿基，其中大部分空隙是在位置2,153,178-2,153,283(105個堿基)和2,474,439-2,474,486(47個堿基)中僅剩余2個空隙的單一‘N’位置。
實例3：針對粉紋夜蛾殺昆蟲劑活性篩選蛋白質
蛋白質Scott 1-3(分別為Seq ID No:4-6)通過標準FPLC程序分級。
將飼料板儲存在生物分析冷凍機(4℃)中的帶蓋子容器中。所有功效測試全部以每培養(yǎng)板最少六個稀釋和兩個稀釋復制(孔)以及每個稀釋總共最少40個孔進行。使用去離子水作為陰性對照。連續(xù)稀釋所有候選蛋白質和標準蛋白質，最少六個稀釋(即16％、8％、4％、2％、1％和0.05％)。從最低稀釋開始，用移液管移取100μL每種稀釋處理到每個孔中。將培養(yǎng)板移到含小風扇的通風櫥中。打開風扇并將風扇按孔中的液體能受到氣流影響的角度指向培養(yǎng)板。充分干燥各孔，以便新生幼蟲可以被放置到每個孔中而不會溺水。僅將最先通過的早期二齡粉紋夜蛾用于96孔板。使用細筆刷，將單一小幼蟲從其飼養(yǎng)區(qū)移到孔中。繼續(xù)侵擾，直到所有孔中都有幼蟲。使用牙簽或其它小的尖頭工具在每個孔上方的蓋子上戳一個小孔用于通風。將培養(yǎng)板放置在溫度控制在26℃下的腔室中，并且在添加昆蟲之后3到4天記下死亡率。通過檢查每個孔中的幼蟲確定昆蟲死亡率。然后確定每個稀釋的平均死亡率。表3到6顯示通過Scott 1-3(SEQ ID NO:4-6)的量實現的粉紋夜蛾的死亡率。
表3(Scott1；SEQ ID No:1或4)
表4(scott2；SEQ ID No:2或5)
表5(scott3，SEQ ID No:3或6)
實例4：用農桿菌屬轉化番茄(番茄(Solanum lycopersicum))
根據沙瑪M.K.(Sharma,M.K.)等人2009.“簡單有效的農桿菌屬介導的番茄轉化程序(A simple and efficient Agrobacterium-mediated procedure for transformation of tomato).”生物科學雜志(Journal of Biosciences)34:423-433改編以下程序。
培養(yǎng)基和溶液
表6中描述了各種培養(yǎng)基的組成。將除瓊脂之外的培養(yǎng)基組分根據表6組合并且使用1N KOH調整到pH 5.8，然后添加植物組織培養(yǎng)級瓊脂。在二甲亞砜(DMSO)中制備BAP(6-芐基氨基嘌呤)和玉米素的儲備溶液。在去離子水中制備抗生素儲備溶液并進行過濾滅菌。使農桿菌屬菌株AGL1在含有100mg/l利福平和50mg/l卡那霉素的YEM瓊脂或培養(yǎng)液上生長。
制備農桿菌屬
經過相關基因(例如，SEQ ID NO:1-6中所披露的基因中的任一個)轉化的根癌農桿菌在含利福平和卡那霉素的YEM培養(yǎng)基中生長，在28℃下以200rpm震蕩培養(yǎng)液72h。通過離心使細胞球粒化，洗滌并再懸浮于WS培養(yǎng)基中。通過測量OD600測定細菌密度并且通過用WS培養(yǎng)基稀釋將最終細胞濃度調整到約108個細胞/毫升。
植物轉化
通過切除頂端和底部收集10天子葉的中間部分(0.7×1.0cm)。將所述部分在28℃下在M1培養(yǎng)基上預培養(yǎng)48小時，使近軸表面直接接觸培養(yǎng)基。
選擇健康的外植體并在農桿菌屬懸浮液中培育30分鐘，每10分鐘倒轉。在無菌紙巾上吸干外植體并使外植體返回到M1瓊脂(每培養(yǎng)板50-80個外植體)，再持續(xù)72小時。然后在WS培養(yǎng)基中洗滌外植體4-5次，在無菌紙巾上吸干并轉移到含有1mg/L反玉米素的SM中進行再生(每再生培養(yǎng)板20-25個外植體)。
再生板在28℃下在16/8的光/暗循環(huán)下培育。通過愈傷組織的發(fā)展證明再生。每15天選擇再生外植體并將其轉移到新鮮的SM培養(yǎng)基中。
可以從愈傷組織切下再生芽并轉移到RM培養(yǎng)基。
選擇高度至少2英寸并且具有發(fā)達根系的組培苗轉移到盆中。種植基質由與1:1:1蛭石:珍珠巖:泥炭蘚1:1混合的盆栽土組成。
表6
實例5：創(chuàng)建包含來自活性紫色細菌的殺昆蟲基因的轉基因大豆植物
將成熟的大豆種子在鐘罩內在通風櫥下用氯氣進行表面滅菌。將種子保持在100×20mm皮氏培養(yǎng)皿中，皮氏培養(yǎng)皿含有通過將100ml的4％次氯酸鈉傾倒到燒杯中并且添加5ml的12N鹽酸產生的氯氣。在滅菌之后，將種子放置在發(fā)芽培養(yǎng)基(GM；MS基本鹽與維生素、3％蔗糖、0.8％植物瓊脂以及1mg/L BAP，從再生實驗優(yōu)化，pH 5.8)上。村重和斯科格，1962。使種子在熒光或黑暗下在24±1℃下發(fā)芽5-7天以比較轉化頻率。
本文所述的方法是由張(Zhang)等人(1999)植物細胞、組織和器官培養(yǎng)液(PlantCell,Tissue and Organ Culture)56:37-46所描述的方法的修改版。通過用11號手術刀切割下胚軸作水平切片獲得兩個子葉外植體。接著去除下胚軸并且在子葉節(jié)點區(qū)表面作十條劃痕。將外植體在已經工程改造包含相關基因的根癌農桿菌的懸浮液中浸沒30分鐘，所述相關基因例如編碼殺昆蟲蛋白或殺昆蟲化合物的合成中所涉及的蛋白質的基因。有關例示性相關基因的清單，參見以上表2。在浸沒之后，將十個外植體隨機放置在無菌濾紙上，無菌濾紙放置在100×20mm皮氏培養(yǎng)皿中的固體共培養(yǎng)基(CM；甘伯格B5基本鹽與維生素、3％蔗糖、20mM MES、3.3mM L-半胱氨酸、1mM二硫蘇糖醇、0.1mM乙酰丁香酮、0.8％植物瓊脂，pH 5.4)(岡堡(Gamborg)等人，1968)上，并且在24±1℃下在黑暗條件下培育5天。
在共培養(yǎng)5天之后，在液體芽誘導培養(yǎng)基(SIM；甘伯格B5基本鹽與維生素、3％蔗糖、3mM MES、1.67mg/L BAP、250mg/L頭孢噻肟，pH 5.7)中簡單洗滌外植體以去除外植體上的過量根癌農桿菌。然后前14天將外植體轉移到不含PPT的固化SIM中以刺激芽誘導，之后在含有5mg/L PPT的新鮮SIM上再次培養(yǎng)外植體以選擇經過轉化的芽。修整外植體的器官性芽，并且然后轉移到芽伸長培養(yǎng)基(SEM；MS基本鹽與維生素、3％蔗糖、3mM MES、0.5mg/L赤霉酸、50mg/L天冬酰胺、1mg/L玉米素、0.1mg/L吲哚-3-乙酸、250mg/L頭孢噻肟、50mg/L萬古霉素、0.8％植物瓊脂、5mg/L PPT，pH 5.7)。每14天將外植體轉移到新的SEM培養(yǎng)基，并且將存活的芽種植在根誘導培養(yǎng)基(RIM；MS基本鹽與維生素、3％蔗糖、1mg/L萘乙酸、0.8％植物瓊脂，pH 5.7)上并生長直到發(fā)展出根。在適應環(huán)境之后，將轉基因植物移植到盆栽土中并維持在溫室中。通過PCR進行選擇。此外參見李(Lee)等人(2011)韓國社會應用生物化學雜志(J.of Korean Soc.Appl.Biol.Chem.)54:37-45。
實例6：針對粉紋夜(Cabbage Loopers)(粉紋夜蛾(Trichoplusia ni))(CL)、草盲蝽(豆莢草盲蝽)、甜菜夜蛾(Beet armyworms)(甜菜夜蛾(Spodoptera exigua))(BAW)和小菜蛾(Diamondback Moth)(小菜蛾(Plutella xylostella))(DBM)殺昆蟲活性篩選蛋白質
通過強陽離子交換和疏水相互作用色譜部分純化蛋白質。使用經過BSA校準的Invitrogen Quant-iT或Qubit分析估算蛋白質濃度。除非另外指出，否則提交以下各者進行生物分析：scott1(SEQ ID NO:1或4)5mg/mL、scott2(SEQ ID NO:2或5)1mg/mL和scott3(SEQ ID NO:3或6)1mg/mL總蛋白質量。在pH 6的20mM MES中或在pH 7.5的20mM Tris中緩沖蛋白質。Scott2外加最多5mM ZnCl2和CaCl2。
基于飼料覆蓋生物分析測試針對粉紋夜蛾(相比于實例3重復)、甜菜夜蛾和小菜蛾的活性。將適當的人工昆蟲飼料分配到標準96孔板的每個孔中并使其干燥。在飼料固化之后，用移液管移取100μL處理液到適當數量的孔中并使其干燥。將單一1齡幼蟲傳遞到96孔板的每個孔中。在處理之后4天記下死亡率。
基于人工飼料生物分析如下測試針對草盲蝽的活性：通過組合適當量的草盲蝽人工飼料和儲備處理溶液制備飼料包。將混合物渦旋并均勻分配到飼料包中。將10-12只2齡或3齡草盲蝽若蟲放置到皮氏培養(yǎng)皿中，蓋上網蓋并用石蠟膜密封。在暴露于經處理飼料之后4天記下死亡率。
功效表示為處理后4天的死亡率百分比。結果(一式兩份)用死亡率％表示，顯示于表7中。Scott1按4.9mg/mL制備用于第一草盲蝽分析。Scott3按0.42mg/mL制備用于第一草盲蝽分析并且按0.82mg/mL制備用于第一粉紋夜蛾分析。
表7
本文中所述和所要求的發(fā)明內容不應限制在本文所披露的具體方面的范圍內，因為這些方面本意是示意性的。任何等效方面都打算屬于本發(fā)明的范圍內。實際上，根據前述說明，本領域的普通技術人員將清楚本文中所展示和描述的方法和組合物的各種修改。這些修改也打算包括在所附權利要求書的范圍內。在有矛盾的情況下，將以本披露(包括定義)為準。