本申請(qǐng)要求于2014年9月4日提交的第62/045,591號(hào)美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，該專(zhuān)利的內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。

領(lǐng)域

本公開(kāi)涉及用于人T細(xì)胞或NK細(xì)胞活化和擴(kuò)增的可溶性單特異性抗體復(fù)合物的方法和組合物。

背景

宿主耐受性和適應(yīng)性免疫是人類(lèi)健康的復(fù)雜和關(guān)鍵組成部分。T淋巴細(xì)胞包含各種亞群，包括：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，其在維持宿主耐受性方面起重要作用；效應(yīng)子亞群，諸如根據(jù)環(huán)境刺激進(jìn)行免疫應(yīng)答的CD4+ T輔助細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞。

用于T細(xì)胞體外生長(zhǎng)和繁殖的方法基于許多不同的途徑。在一些情況下，通過(guò)使用輔助細(xì)胞和外源性生長(zhǎng)因子(諸如抗原遞呈細(xì)胞和IL-2)來(lái)活化和擴(kuò)增T細(xì)胞。這需要在T細(xì)胞活化和/或擴(kuò)增過(guò)程中存在和補(bǔ)充輔助細(xì)胞和生長(zhǎng)因子。

或者，用于T細(xì)胞的活化和擴(kuò)增的試劑由在固相表面(例如板或磁珠)上直接或間接固定抗CD3抗體的組合組成。除了由固定的抗CD3抗體提供的原代T細(xì)胞活化信號(hào)之外，還需要由抗CD28抗體提供的次級(jí)共刺激信號(hào)。還可以加入外源性生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子(諸如IL-2)來(lái)增強(qiáng)T細(xì)胞增殖。

抗CD3抗體是許多多克隆T細(xì)胞刺激方案中的關(guān)鍵組分。首先Dixon等人證實(shí)，固定的抗CD3可在不存在由T細(xì)胞受體進(jìn)行的同源抗原識(shí)別的情況下介導(dǎo)人T細(xì)胞活化和擴(kuò)增。抗CD3通過(guò)交聯(lián)T細(xì)胞表面上的T細(xì)胞受體復(fù)合物的組分來(lái)啟動(dòng)活化和增殖信號(hào)級(jí)聯(lián)放大；因此它們需要固定。隨后Baroja等人表明，來(lái)自固定或可溶性抗CD28刺激物的第二信號(hào)以及固定抗CD3是完全T細(xì)胞活化所需的。通過(guò)附著配體(諸如CD2、LFA-1)以及其它TNF家族成員(諸如CD137(4-1BB))提供的附加共刺激信號(hào)可以向T細(xì)胞提供附加的增殖或存活信號(hào)(Smith-Garvin等人)。

用于使用涂覆有固定抗CD3抗體的組織培養(yǎng)板進(jìn)行T細(xì)胞活化的商品可購(gòu)自Corning公司(BioCoat^TM T細(xì)胞活化板，產(chǎn)品目錄號(hào)354725)，并且由研究者使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法廣泛制備?？梢酝庠刺砑涌扇苄钥笴D28抗體來(lái)提供啟動(dòng)T細(xì)胞活化和增殖所需的共刺激信號(hào)(Kruisbeek等人)。

美國(guó)專(zhuān)利6,352,694描述了一種使用固定在4.5um直徑磁性顆粒上的抗CD3和抗CD28抗體進(jìn)行T細(xì)胞活化和擴(kuò)增的方法。

美國(guó)專(zhuān)利8,012,750B2描述了一種用于活化T細(xì)胞的可生物降解設(shè)備。類(lèi)似于先前的公開(kāi)，該方法使用間接包被有能夠結(jié)合和活化T細(xì)胞的抗體的可生物降解微球體。

美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)14/035,089描述使用具有固定抗CD3和/或抗CD28的柔性納米基質(zhì)來(lái)向T細(xì)胞提供活化信號(hào)。它們公開(kāi)了大小在1-500nm之間的葡聚糖基質(zhì)，所述葡聚糖基質(zhì)用作可模塑到具有固定的T細(xì)胞活化抗體的T細(xì)胞的表面上的柔性支架。

與固定抗體不同，可溶性抗體復(fù)合物可以向T細(xì)胞提供更溫和的活化信號(hào)。美國(guó)專(zhuān)利公布no.US 2007/0036783描述了可溶性雙特異性四聚抗體復(fù)合物(TAC)的使用，所述TAC由一種抗CD3抗體與第二抗CD28抗體復(fù)合而成，所述第二抗CD28抗體能夠啟動(dòng)T細(xì)胞活化和擴(kuò)增。它們聲稱(chēng)，與固定抗體方法相比，這種方法提供了更溫和的刺激，從而產(chǎn)生更少的活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。此申請(qǐng)的發(fā)明人并未充分證實(shí)四聚抗體復(fù)合物確實(shí)是可溶的并且在刺激過(guò)程中不吸附到培養(yǎng)塑料上。此外，其發(fā)明人特別指出雙特異性四聚抗體復(fù)合物的使用參與經(jīng)刺激的T細(xì)胞的活化和擴(kuò)增。

發(fā)明概要

本發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一種用于使用可溶性單特異性四聚抗體復(fù)合物來(lái)體外活化和擴(kuò)增原代人T細(xì)胞或NK細(xì)胞的方法。具體地，本發(fā)明人已經(jīng)確定，與使用雙特異性四聚抗體復(fù)合物相比，使用可溶性單特異性四聚抗體復(fù)合物導(dǎo)致更大的T細(xì)胞活化。本發(fā)明人還已經(jīng)確定，與在不存在可溶性單特異性四聚抗體復(fù)合物的情況下培養(yǎng)的NK細(xì)胞相比，使用可溶性單特異性四聚抗體復(fù)合物導(dǎo)致NK細(xì)胞活化的改善。

可溶性單特異性TAC具有優(yōu)于固定抗體方法的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樵跀U(kuò)增后不需要去除大的磁性顆粒，并且可以洗滌細(xì)胞以去除任何未結(jié)合的可溶性TAC復(fù)合物；也不需要專(zhuān)門(mén)的涂覆有抗體的板或基質(zhì)。

因此，本公開(kāi)涉及一種用于活化T細(xì)胞或NK細(xì)胞的方法，該方法包括用包含至少一種可溶性單特異性復(fù)合物的組合物培養(yǎng)含有T細(xì)胞或NK細(xì)胞的樣品，其中每種可溶性單特異性復(fù)合物包含兩個(gè)結(jié)合蛋白，這兩個(gè)結(jié)合蛋白連接并結(jié)合至T細(xì)胞或NK細(xì)胞上的相同抗原。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含至少兩種不同的單特異性抗體復(fù)合物，其中一種單特異性抗體復(fù)合物結(jié)合至T細(xì)胞或NK細(xì)胞上的第一抗原，而另一種單特異性抗體復(fù)合物結(jié)合至T細(xì)胞或NK細(xì)胞上的第二抗原。任選地，所述組合物包含至少三種不同的單特異性抗體復(fù)合物，其中第一單特異性抗體復(fù)合物結(jié)合至T細(xì)胞或NK細(xì)胞上的第一抗原，第二單特異性抗體復(fù)合物結(jié)合至T細(xì)胞或NK細(xì)胞上的第二抗原，而第三單特異性抗體復(fù)合物結(jié)合至T細(xì)胞或NK細(xì)胞上的第三抗原。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述結(jié)合至T細(xì)胞或NK細(xì)胞上的抗原的結(jié)合蛋白是抗體或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，可溶性單特異性復(fù)合物是四聚抗體復(fù)合物(TAC)。在一個(gè)實(shí)施方案中，TAC由來(lái)自一個(gè)物種的兩個(gè)抗體與來(lái)自第二物種的兩個(gè)抗體分子結(jié)合構(gòu)成，所述第二物種的兩個(gè)抗體分子結(jié)合至所述第一動(dòng)物物種的抗體的FC部分。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的方法用于活化T細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括用組合物培養(yǎng)含有T細(xì)胞的樣品，該組合物包含一種結(jié)合至T細(xì)胞上的第一抗原的單特異性抗體復(fù)合物和另一種結(jié)合至T細(xì)胞上的第二抗原的單特異性抗體復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一抗原選自CD3、CD28、CD2、CD7、CD11a、CD26、CD27、CD30L、CD40L、OX-40、ICOS、GITR、CD137、以及HLA-DR，而第二抗原為選自CD3、CD28、CD2、CD7、CD11a、CD26、CD27、CD30L、CD40L、OX-40、ICOS、GITR、CD137、以及HLA-DR的不同抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一抗原是CD3。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二抗原是CD28。在一個(gè)實(shí)施方案中，第三抗原是CD2。

在一個(gè)實(shí)施方案中，T細(xì)胞活化是增強(qiáng)的T細(xì)胞增殖、增強(qiáng)的細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或增強(qiáng)的T細(xì)胞表達(dá)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)描述了使用靶向人CD3、CD28和CD2的可溶性單特異性四聚抗體復(fù)合物，來(lái)誘導(dǎo)人T細(xì)胞的最佳體外多克隆活化和擴(kuò)增。在此類(lèi)實(shí)施方案中，組合物包含靶向CD3、CD28和CD2的三種不同的可溶性單特異性復(fù)合物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的方法用于活化NK細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括用組合物培養(yǎng)含有NK細(xì)胞的樣品，該組合物包含一種結(jié)合至NK細(xì)胞上的第一抗原的單特異性抗體復(fù)合物和另一種結(jié)合至NK細(xì)胞上的第二抗原的單特異性抗體復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一抗原選自CD335、CD2、NKG2D、NKp44、NKp30、CD16、LFA-1、以及CD27，而第二抗原為選自CD335、CD2、NKG2D、NKp44、NKp30、CD16、LFA-1、以及CD27的不同抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一抗原是CD335。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二抗原是CD2。

在一個(gè)實(shí)施方案中，NK細(xì)胞活化是增強(qiáng)的NK細(xì)胞增殖、增強(qiáng)的細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或增強(qiáng)的NK細(xì)胞表達(dá)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)描述了使用靶向人CD335和CD2的可溶性單特異性四聚抗體復(fù)合物，來(lái)誘導(dǎo)人NK細(xì)胞的體外活化和擴(kuò)增。在此類(lèi)實(shí)施方案中，組合物包含靶向CD335和CD2的兩種不同的可溶性單特異性復(fù)合物。

根據(jù)以下詳細(xì)描述，本公開(kāi)的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見(jiàn)。然而，應(yīng)當(dāng)理解，雖然指示了本公開(kāi)的優(yōu)選實(shí)施方案，但是詳細(xì)描述和具體實(shí)例僅以說(shuō)明的方式給出，因?yàn)橥ㄟ^(guò)此詳細(xì)描述，在本公開(kāi)的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改將變得對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)。

附圖簡(jiǎn)述

圖1示出了在培養(yǎng)7天后，使用特異于CD3或CD28的單特異性TAC的混合物或使用抗CD3和CD28的雙特異性TAC的混合物，通過(guò)CFSE染料稀釋法評(píng)估的人T細(xì)胞增殖的結(jié)果。

圖2示出了使用可溶性單特異性TAC組合物和人T活化劑CD3/CD28珠粒、使用未處理或封閉的組織培養(yǎng)板進(jìn)行的T細(xì)胞活化和增殖的結(jié)果。

圖3示出了在用可溶性單特異性TAC組合物或人T活化劑CD3/CD28珠粒刺激后進(jìn)行的短期細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子產(chǎn)生測(cè)定的結(jié)果。

圖4示出在21天時(shí)期內(nèi)使用可溶性單特異性CD3、CD28和CD2 TAC或人T活化劑CD3/CD28珠粒擴(kuò)增的T細(xì)胞的代表性圖像。

圖5示出了使用可溶性單特異性CD3、CD28和CD2 TAC或人T活化劑CD3/CD28珠粒的21天T細(xì)胞擴(kuò)增的結(jié)果。

圖6A示出在用或不用單特異性CD335/CD2 TAC刺激的情況下，在補(bǔ)充有IL-2的ImmunoCult-XF培養(yǎng)基中維持的NK細(xì)胞的純度。圖6B示出了在用或不用單特異性CD335/CD2 TAC刺激的情況下，所維持的細(xì)胞總數(shù)的變化。與在500IU/mL的IL-2存在下單獨(dú)培養(yǎng)NK細(xì)胞相比，在500IU/mL的IL-2存在下用NKp46(CD335)和CD2 TAC混合物刺激后觀(guān)察到了增強(qiáng)的NK細(xì)胞活化。

具體實(shí)施方式

本公開(kāi)提供了一種使用單特異性復(fù)合物(諸如四聚抗體復(fù)合物)來(lái)體外活化和擴(kuò)增人T細(xì)胞或自然殺傷(NK)細(xì)胞的方法。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供了一種活化T細(xì)胞的方法，該方法包括用包含至少一種可溶性單特異性復(fù)合物的組合物培養(yǎng)含有T細(xì)胞的樣品，其中每種可溶性單特異性復(fù)合物包含兩個(gè)結(jié)合蛋白，這兩個(gè)結(jié)合蛋白連接并結(jié)合至T細(xì)胞上的相同抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)還提供了一種活化NK細(xì)胞的方法，該方法包括用包含至少一種可溶性單特異性復(fù)合物的組合物培養(yǎng)含有NK細(xì)胞的樣品，其中每種可溶性單特異性復(fù)合物包含兩個(gè)結(jié)合蛋白，這兩個(gè)結(jié)合蛋白連接并結(jié)合至NK細(xì)胞上的相同抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，在IL-2和/或一種或多種其它細(xì)胞因子(諸如IL-7或IL-15)的存在下培養(yǎng)NK細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，T細(xì)胞或NK細(xì)胞是人細(xì)胞。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“可溶性單特異性復(fù)合物”是指包含兩個(gè)結(jié)合蛋白的復(fù)合物，該兩個(gè)結(jié)合蛋白彼此直接或間接連接并結(jié)合至相同的抗原。這兩個(gè)結(jié)合蛋白是可溶的并且不固定在表面、顆?；蛑榱Ｉ?。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白結(jié)合至T細(xì)胞上的相同抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白結(jié)合至NK細(xì)胞上的相同抗原。

在一個(gè)實(shí)施方案中，這兩個(gè)結(jié)合蛋白是相同的結(jié)合蛋白并且結(jié)合至抗原上的相同表位。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“雙特異性復(fù)合物”是指包含兩種不同結(jié)合蛋白的復(fù)合物，該兩種不同結(jié)合蛋白彼此直接或間接連接，其中每種結(jié)合蛋白結(jié)合至T細(xì)胞或NK細(xì)胞上的不同抗原。

術(shù)語(yǔ)“活化T細(xì)胞”包括但不限于誘導(dǎo)T細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)從T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，以及誘導(dǎo)T細(xì)胞擴(kuò)增。

“T細(xì)胞上的抗原”可以是活化T細(xì)胞的任何抗原，包括但不限于CD3、CD28、CD2、CD7、CD11a、CD26、CD27、CD30L、CD40L、OX-40、ICOS、GITR、CD137、以及HLA-DR。

術(shù)語(yǔ)“活化NK細(xì)胞”包括但不限于誘導(dǎo)NK細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)從NK細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，以及誘導(dǎo)NK細(xì)胞的擴(kuò)增。

“NK細(xì)胞上的抗原”可以是活化NK細(xì)胞的任何抗原，包括但不限于CD335、CD2、NKG2D、NKp44、NKp30、CD16、LFA-1以及CD27。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，結(jié)合蛋白是抗體或其片段。可以使用的抗體片段包括來(lái)自重組來(lái)源和/或在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生的Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv和dsFv片段?？贵w或抗體片段可以來(lái)自任何物種，包括小鼠、大鼠、兔子、倉(cāng)鼠和人。嵌合抗體衍生物，即組合非人動(dòng)物可變區(qū)和人恒定區(qū)的抗體分子，也被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。嵌合抗體分子可包括例如人源化抗體，該人源化抗體包含來(lái)自小鼠、大鼠或其它物種的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及人恒定區(qū)。常規(guī)方法可用于制備嵌合抗體。(參見(jiàn)例如Morrison等人；Takeda等人，Cabilly等人，美國(guó)專(zhuān)利No.4,816,567；Boss等人，美國(guó)專(zhuān)利No.4,816,397；Tanaguchi等人，歐洲專(zhuān)利公布EP171496；歐洲專(zhuān)利公布0173494，英國(guó)專(zhuān)利GB 2177096B)。人源化抗體的制備描述于EP-B 10 239400中。人源化抗體也可以商業(yè)化生產(chǎn)(Scotgen公司，英國(guó)米德?tīng)柸怂箍?，特威克南冬青?號(hào)(Scotgen Limited，2 Holly Road，Twickenham，Middlesex，Great Britain))。預(yù)期在人受試者中嵌合抗體比相應(yīng)的非嵌合抗體具有更低的免疫原性。人源化抗體可以例如如WO 00/61635中所述進(jìn)一步穩(wěn)定化。

結(jié)合至T細(xì)胞抗原或NK細(xì)胞抗原的抗體或其片段可商購(gòu)或可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員制備。

在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合至相同抗原的兩個(gè)抗體或其片段直接連接?？贵w的直接連接可以通過(guò)將一個(gè)抗體與另一個(gè)抗體化學(xué)偶聯(lián)來(lái)制備，例如通過(guò)使用N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)抗體在可溶性單特異性復(fù)合物中間接連接?！伴g接連接”是指兩種抗體彼此不直接共價(jià)連接，而是通過(guò)連接部分如免疫復(fù)合物附接。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)制備四聚抗體復(fù)合物間接連接兩種抗體?？梢酝ㄟ^(guò)將結(jié)合至相同抗原并且是相同動(dòng)物物種的單克隆抗體與大約等摩爾量的第二動(dòng)物物種的單克隆抗體混合來(lái)制備四聚抗體復(fù)合物，所述第二動(dòng)物物種的單克隆抗體針對(duì)所述第一動(dòng)物物種的抗體的Fc-片段。第一和第二抗體還可以與約等摩爾量的第二動(dòng)物物種的單克隆抗體的F(ab′)2片段反應(yīng)，該第二動(dòng)物物種的單克隆抗體的F(ab′)2片段針對(duì)第一動(dòng)物物種的抗體的Fc-片段。(參見(jiàn)Lansdorp的美國(guó)專(zhuān)利No.4,868,109，其通過(guò)引用并入本文，以用于描述四聚抗體復(fù)合物及其制備方法)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含至少兩種不同的單特異性復(fù)合物，每種單特異性復(fù)合物結(jié)合至T細(xì)胞上的不同抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含至少兩種不同的可溶性單特異性復(fù)合物，并且所述至少兩種不同的可溶性單特異性復(fù)合物中的各者結(jié)合至選自CD3、CD28、CD2、CD7、CD11a、CD26、CD27、CD30L、CD40L、OX-40、ICOS、GITR、CD137、以及HLA-DR的不同抗原。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，一種單特異性復(fù)合物將結(jié)合CD3，而第二種單特異性復(fù)合物將結(jié)合CD28。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含至少三種不同的可溶性單特異性復(fù)合物，每種可溶性單特異性復(fù)合物結(jié)合至T細(xì)胞上的三種不同抗原之一。在此類(lèi)實(shí)施方案中，沒(méi)有兩種單特異性復(fù)合物會(huì)結(jié)合至相同的抗原。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述組合物包含三種不同的可溶性單特異性復(fù)合物，一種特異于CD3，第二種特異于CD28，以及第三種特異于CD2。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，在可溶性單特異性復(fù)合物存在下的T細(xì)胞活化大于使用包含兩種不同結(jié)合蛋白或抗體(每種結(jié)合蛋白或抗體結(jié)合至T細(xì)胞上的不同抗原)的雙特異性復(fù)合物的T細(xì)胞活化。

含有T細(xì)胞的樣品可以是希望活化其中的T細(xì)胞的任何樣品，包括但不限于全血、含有T細(xì)胞的單采血液成分樣品或外周血單核細(xì)胞，純化的原代人T細(xì)胞或永生化的人T細(xì)胞系。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含至少兩種不同的單特異性復(fù)合物，每種單特異性復(fù)合物結(jié)合至NK細(xì)胞上的不同抗原。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，一種單特異性復(fù)合物將結(jié)合CD335，而第二種單特異性復(fù)合物將結(jié)合CD2。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含至少兩種不同的可溶性單特異性復(fù)合物，每種可溶性單特異性復(fù)合物結(jié)合至NK細(xì)胞上的兩種不同抗原之一。在此類(lèi)實(shí)施方案中，沒(méi)有兩種單特異性復(fù)合物會(huì)結(jié)合至相同的抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含至少兩種不同的可溶性單特異性復(fù)合物，并且所述至少兩種不同的可溶性單特異性復(fù)合物的各者結(jié)合至選自CD335、CD2、NKG2D、NKp44、NKp30、CD16、LFA-1以及CD27的不同抗原。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述組合物包含兩種不同的可溶性單特異性復(fù)合物，一種特異于CD335，第二種特異于CD2。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含特異于選自NKG2D、NKp44、NKp30、CD16、LFA-1和CD27的抗原的至少一種附加可溶性單特異性復(fù)合物。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，在可溶性單特異性復(fù)合物存在下的NK細(xì)胞活化大于在不存在可溶性單特異性復(fù)合物的情況下的NK細(xì)胞活化。

含有NK細(xì)胞的樣品可以是希望活化其中的NK細(xì)胞的任何樣品，包括但不限于全血，含有NK細(xì)胞的單采血液成分樣品或外周血單核細(xì)胞，純化的原代人NK細(xì)胞或永生化的人NK細(xì)胞系。

組合物

本公開(kāi)還包括包含至少一種可溶性單特異性復(fù)合物的組合物，其中所述可溶性單特異性復(fù)合物包含兩個(gè)結(jié)合蛋白，這兩個(gè)結(jié)合蛋白連接并結(jié)合至T細(xì)胞或NK細(xì)胞上的相同抗原。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含兩個(gè)可溶性單特異性復(fù)合物，其中一個(gè)可溶性單特異性復(fù)合物結(jié)合至T細(xì)胞或NK細(xì)胞上的一個(gè)抗原，而第二可溶性單特異性復(fù)合物結(jié)合至T細(xì)胞或NK細(xì)胞上的不同抗原。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含三個(gè)可溶性單特異性復(fù)合物，其中每個(gè)復(fù)合物結(jié)合至T細(xì)胞上的不同抗原。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗原是CD3、CD28和CD2。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含兩個(gè)可溶性單特異性復(fù)合物，其中每個(gè)復(fù)合物結(jié)合至NK細(xì)胞上的不同抗原。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗原是CD335和CD2。

用途

本公開(kāi)包括活化的T細(xì)胞或NK細(xì)胞的所有用途，包括但不限于它們?cè)谥委熤械挠猛尽?/p>

本公開(kāi)的方法和組合物可用于體外擴(kuò)增T細(xì)胞或NK細(xì)胞以用于體內(nèi)治療需要T細(xì)胞或NK細(xì)胞的任何疾病或病癥，包括但不限于過(guò)繼性免疫治療癌癥、急性或持續(xù)性病原體感染(病毒、真菌、細(xì)菌、寄生蟲(chóng))，調(diào)節(jié)疫苗效力，或免疫抑制自身免疫疾病或移植物抗宿主病。

以下非限制性實(shí)施例說(shuō)明了本公開(kāi)：

實(shí)施例1

與雙特異性CD3/CD28 TAC的混合物相比，單特異性CD3 TAC和CD28 TAC在人T細(xì)胞中誘導(dǎo)更大的增殖(圖1)。通過(guò)首先混合等體積的抗CD3抗體和抗CD28抗體來(lái)制備CD3/CD28雙特異性TAC。在加入等體積的大鼠抗小鼠IgG1后形成雙特異性TAC。所得TAC混合物含有25％的單特異性抗CD3 TAC，25％的單特異性抗CD28 TAC和50％的雙特異性抗CD3/抗CD28 TAC(參見(jiàn)Lansdorp的美國(guó)專(zhuān)利No.4,868,109，其通過(guò)引用并入本文，以用于描述四聚抗體復(fù)合物及其制備方法、)。

通過(guò)將等體積的抗CD3抗體或抗CD28抗體與等體積的大鼠抗小鼠IgG1混合來(lái)制備CD3 TAC和CD28 TAC單特異性混合物。將所得單特異性TAC以1∶1的比率混合以制備由50％抗CD3 TAC和50％抗CD28 TAC組成的CD3和CD28單特異性TAC混合物。

使用RosetteSep^TM(STEMCELL技術(shù)公司，加拿大溫哥華(STEMCELL Technologies Inc.，Vancouver，Canada))，通過(guò)陰性富集從新鮮人全血中富集人T細(xì)胞。富集的CD4+ T細(xì)胞用1uM CFDA-SE的最終濃度標(biāo)記。標(biāo)記后將CFSE標(biāo)記的T細(xì)胞重懸浮于XVIVO-15培養(yǎng)基(龍沙公司，瑞士巴塞爾(Lonza，Basel，Switzerland))中。

將96孔平底組織培養(yǎng)板用含1％人血清白蛋白(HSA)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)在4℃下封閉過(guò)夜。向1％HSA封閉的孔中，在0.5ug/mL最終的單特異性CD3和CD28 TAC或CD3/CD28雙特異性TAC的存在下培養(yǎng)CFSE標(biāo)記的細(xì)胞。不向培養(yǎng)物中添加外源IL-2。將樣品在具有5％CO2的潮濕的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天。培養(yǎng)7天后，用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)評(píng)價(jià)樣品的CFSE染料稀釋(細(xì)胞增殖的指標(biāo))以及CD4和CD8的表達(dá)。

結(jié)果表明，與雙特異性CD3/CD28 TAC相比，單特異性CD3和CD28 TAC誘導(dǎo)更大的CD4+和CD8+ T細(xì)胞增殖。未受刺激的CD4+和CD8+ T細(xì)胞分別經(jīng)歷最小增殖，1.2％和1.5％。與雙特異性TAC的27.4％增殖相比，用單特異性TAC刺激的CD4+ T細(xì)胞增殖54.7％。與雙特異性TAC的15.9％增殖相比，用單特異性TAC刺激的CD8+ T細(xì)胞增殖33.0％。結(jié)果表明，單獨(dú)的單特異性TAC能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，并且含有25％單特異性CD3和CD28TAC和50％雙特異性TAC的混合物在誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖方面效率較低，如在培養(yǎng)7天后用CFSE染料稀釋法所評(píng)估的。

實(shí)施例2

溶性單特異性CD2TAC與CD3和CD28TAC組合誘導(dǎo)人T細(xì)胞的最佳活化(圖2)。如實(shí)施例1所述制備單特異性TAC。使用抗人CD3制備抗CD3特異性的單特異性TAC。使用抗人CD28制備單特異性抗CD28 TAC。使用抗人CD2制備單特異性抗CD2 TAC。將CFSE標(biāo)記的經(jīng)純化的人T細(xì)胞與單特異性TAC的各種組合或與人T活化劑CD3/CD28珠粒一起在未處理或用1％HSA封閉的96孔板中培養(yǎng)。在XVIVO-15培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估以下項(xiàng)對(duì)T細(xì)胞增殖的組合效應(yīng)(CFSE染料稀釋)：i)單獨(dú)的抗CD3 TAC，ii)抗CD3 TAC和抗CD28 TAC，或iii)抗CD3 TAC、抗CD28 TAC和抗CD2 TAC。在培養(yǎng)的第6天使用Guava ViaCount測(cè)定進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

在培養(yǎng)細(xì)胞之前，96孔組織培養(yǎng)板的各孔未經(jīng)處理或用含1％HSA的PBS在4℃下封閉過(guò)夜。在培養(yǎng)細(xì)胞之前用PBS洗滌各孔。HSA將防止抗體復(fù)合物固定到組織培養(yǎng)塑料上，從而確保刺激由懸浮液中的可溶性TAC介導(dǎo)。

人活化劑CD3/CD28珠粒(樣品5號(hào)和10號(hào))不受孔預(yù)處理的影響并且誘導(dǎo)高水平的CD4+ T細(xì)胞增殖和CD8+ T細(xì)胞增殖。當(dāng)用于T細(xì)胞擴(kuò)增時(shí)，各板處理樣之間的第6天總存活細(xì)胞類(lèi)似。單獨(dú)的CD3TAC不足以誘導(dǎo)T細(xì)胞擴(kuò)增(樣品2號(hào)和6號(hào))；而當(dāng)不處理孔時(shí)(樣品3號(hào))，CD3和CD28單特異性TAC的組合可以誘導(dǎo)高水平的T細(xì)胞增殖。與具有相同刺激的未處理孔相比較時(shí)，當(dāng)在1％HSA封閉的孔(樣品8號(hào))中使用CD3和CD28TAC時(shí)，T細(xì)胞的增殖顯著下降，并且第6天的總活細(xì)胞從1.09E6降低至2.46E5個(gè)細(xì)胞。相比之下，類(lèi)似于人T活化劑CD3/CD28珠粒，CD3、CD28和CD2單特異性TAC的組合受到用HSA封閉孔的影響最小(樣品4號(hào)和9號(hào))。總的來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明，CD3和CD28單特異性TAC的板固定影響其在活化T細(xì)胞方面的有效性。然而，如果使用CD3、CD28和CD2單特異性TAC的組合來(lái)刺激T細(xì)胞，則此以可溶性方式與板固定和單特異性TAC功能無(wú)關(guān)地發(fā)生。人T活化劑CD3/CD28珠粒也不受板預(yù)處理的影響，因?yàn)榭笴D3抗體和抗CD28抗體固定在珠粒表面上。

實(shí)施例3

可溶性單特異性CD3、CD28和CD2 TAC能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子(圖3)。將RosetteSep^TM富集的人T細(xì)胞在可溶性單特異性TAC構(gòu)建體的各種組合或人T活化劑CD3/CD28珠粒的存在下培養(yǎng)4小時(shí)(圖3)。將布雷菲德菌素A(Brefeldin A)加入到培養(yǎng)物中以允許細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子積累，并在培養(yǎng)后用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行評(píng)估。收獲培養(yǎng)物，并在固定和透化后對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記物和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。

結(jié)果表明，在刺激4小時(shí)后，單獨(dú)的CD3 TAC不誘導(dǎo)T細(xì)胞中的IL-2或IFNγ細(xì)胞因子產(chǎn)生(樣品1號(hào))。CD3和CD28 TAC的組合分別誘導(dǎo)2.4％的CD4+ T細(xì)胞和2.45％的CD8+ T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2(樣品2號(hào))。CD3和CD28 TAC還誘導(dǎo)0.5％的CD4+ T細(xì)胞和1.0％的CD8+ T細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ。與單獨(dú)的CD3和CD28 TAC相比，CD3、CD28和CD2單特異性TAC的組合誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生更高水平的IL-2和IFNγ(樣品3號(hào))。人T活化劑CD3/CD28珠粒誘導(dǎo)與CD3、CD28和CD2的組合相似的IL-2水平，但誘導(dǎo)更高水平的IFNγ(樣品4號(hào))?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明，與單獨(dú)的CD3和CD28 TAC相比，CD3、CD28和CD2單特異性TAC的組合能夠誘導(dǎo)CD4+ T細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞產(chǎn)生更高水平的細(xì)胞因子；而人T活化劑CD3/CD28珠粒誘導(dǎo)更高水平的IFNγ。IL-2有助于誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和分化，而IFNγ是參與誘導(dǎo)抗病毒免疫應(yīng)答的效應(yīng)細(xì)胞因子。

實(shí)施例4

在21天的時(shí)期中，CD3、CD28和CD2單特異性TAC刺激的T細(xì)胞與人T活化劑CD3/CD28珠粒刺激的T細(xì)胞相比的代表性圖像(10倍和20倍放大)(圖4)。將EasySep^TM富集的人T細(xì)胞與人T活化劑CD3/CD28珠粒以1∶1的珠粒比細(xì)胞比率，或與0.5ug/mL最終的CD3、CD28和CD2單特異性TAC在30U/mL重組人IL-2的存在下培養(yǎng)。監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物中的細(xì)胞生長(zhǎng)，并將細(xì)胞濃度維持在0.5-2×10E6個(gè)細(xì)胞/mL。在培養(yǎng)的第7天和第17天用人T活化劑CD3/CD28珠?；騿翁禺愋訡D3、CD28和CD2 TAC再刺激T細(xì)胞。

人T活化劑CD3/CD28珠粒和單特異性CD3、CD28和CD2 TAC刺激的培養(yǎng)物誘導(dǎo)相似的T細(xì)胞增殖和擴(kuò)增特征。可以在培養(yǎng)物中清楚地看到人T活化劑CD3/CD28珠粒中所使用的4.5um珠粒。與人T活化劑CD3/CD28珠粒相比，TAC刺激的培養(yǎng)物不需要因?yàn)榧?xì)胞大小的珠粒可干擾下游分析(諸如流式細(xì)胞術(shù))而在任何下游功能測(cè)定之前去除珠粒。

實(shí)施例5

與CD3、CD28和CD2單特異性TAC相比，使用人T活化劑CD3/CD28珠粒長(zhǎng)期培養(yǎng)和擴(kuò)增人T細(xì)胞(圖5)。將1×10E6個(gè)EasySep^TM富集的人T細(xì)胞與人T活化劑CD3/CD28珠粒以1∶1的珠粒比細(xì)胞比率，或與0.5ug/mL最終的CD3、CD28和CD2單特異性TAC在30U/mL重組人IL-2的存在下培養(yǎng)。監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物中的細(xì)胞生長(zhǎng)，并將細(xì)胞濃度維持在0.5-2×10E6個(gè)細(xì)胞/mL。在培養(yǎng)的第7天和第17天用人T活化劑CD3/CD28珠?；騿翁禺愋訡D3、CD28和CD2 TAC刺激T細(xì)胞，并按固定間隔時(shí)間用新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。

在第0天，將1×10E6個(gè)EasySep^TM富集的T細(xì)胞接種到24孔組織培養(yǎng)板中并用人T活化劑CD3/CD28珠?；騿翁禺愋訡D3、CD28和CD2 TAC刺激。在指定的時(shí)間點(diǎn)使用臺(tái)盼藍(lán)、用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)總細(xì)胞和活細(xì)胞。結(jié)果表明，TAC刺激的培養(yǎng)物導(dǎo)致培養(yǎng)21天后的總T細(xì)胞擴(kuò)增和存活的T細(xì)胞增加。

實(shí)施例6

使用EasySep人NK細(xì)胞分離試劑盒(STEMCELL技術(shù)公司，產(chǎn)品目錄號(hào)17955)、通過(guò)陰性富集來(lái)分離人NK細(xì)胞。將分離的NK細(xì)胞(CD45+ CD3- CD56+)在補(bǔ)充有500IU/mL重組人IL-2的無(wú)血清和無(wú)異源ImmunoCult-XF培養(yǎng)基(STEMCELL技術(shù)公司，產(chǎn)品目錄號(hào)10981)中以1x10⁶個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度培養(yǎng)。NK細(xì)胞不接受附加刺激(無(wú)刺激)或用每種抗體的最終濃度為0.5ug/mL的CD335/CD2單特異性TAC復(fù)合物刺激。在第3天、第6天、第8天、第10天和第13天，使用體細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Nucelocounter)計(jì)數(shù)總存活細(xì)胞，并用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估NK細(xì)胞純度。通過(guò)加入補(bǔ)充有500IU/mL IL-2的新鮮ImmunoCult-XF培養(yǎng)基將培養(yǎng)物維持在約1×10^6個(gè)細(xì)胞/毫升。

如圖6A所示，使用EasySep分離并在補(bǔ)充有IL-2的ImmunoCult-XF培養(yǎng)基中維持的NK細(xì)胞從第0天至第6天的純度從84.5％增加到94％，而與它們是否接受任何附加刺激無(wú)關(guān)。將NK細(xì)胞的純度維持在相似水平，直到培養(yǎng)的第13天。

如圖6B所示，用單特異性CD335/CD2 TAC復(fù)合物刺激的NK細(xì)胞在第8天和第10天之間細(xì)胞數(shù)目增加，并持續(xù)到第13天，在第13天的時(shí)間點(diǎn)在CD335/CD2刺激的培養(yǎng)物中的NK細(xì)胞的數(shù)目增加了1.72倍。

雖然已經(jīng)參照目前被認(rèn)為是優(yōu)選實(shí)施例的內(nèi)容描述了本公開(kāi)，但是應(yīng)當(dāng)理解本公開(kāi)不限于所公開(kāi)的實(shí)施例。相反，本公開(kāi)旨在覆蓋包括在所附權(quán)利要求書(shū)的精神和范圍內(nèi)的各種修改和等效布置。

所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)通過(guò)引用整體并入本文，其程度如同每個(gè)單獨(dú)的出版物、專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)被特定地和單獨(dú)地指示為通過(guò)引用整體并入。

在說(shuō)明書(shū)中提及的參考文獻(xiàn)的完整引文

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