生物液體中的稀有細(xì)胞的檢測、分離和分析的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用與稀有細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原結(jié)合的抗體從哺乳動物的生物液體中分離或富集稀有細(xì)胞的方法。將固定化抗體與包含稀有細(xì)胞以及多種其他細(xì)胞的生物液體一起溫育，以便形成抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體?？赏ㄟ^各種物理、化學(xué)和基因技術(shù)的任意一種對該復(fù)合體進行檢測或分離并隨后進行分析。DSMACC 26662004.07.13
【專利說明】生物液體中的稀有細(xì)胞的檢測、分離和分析

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于從生物液體中檢測、捕獲和分離稀有細(xì)胞以對其抗原性、表型和 遺傳特性進行分析的免疫學(xué)方法和試劑盒。具體而言，本發(fā)明提供了用于對母體血液中的 胎兒單核紅細(xì)胞（NRBC)進行檢測、捕獲、分離和分析的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 進行產(chǎn)前診斷以檢測胎兒的可能存在的染色體和基因異常使得父母和看護者能 夠開始監(jiān)控疾病或病癥的傾向早期治療。已經(jīng)建立了產(chǎn)前診斷的實踐，以檢測胎兒可能存 在的染色體和基因異常，因而使父母和照顧者能夠作出知情決定。在多種與生命相容的染 色體異常中（非整倍體21、18、13、X、Y) (1)，由于存在全部或部分的21號染色體多余拷貝 所導(dǎo)致的唐氏綜合癥（DS)，是最常見的引起智力遲緩的遺傳原因以及婦女尋求產(chǎn)前診斷的 主要原因（1，2)。盡管通過對由絨毛膜絨毛取樣（3)、羊水穿刺（3,4)或臍帶取樣（5)獲得 的胎兒組織進行核型分析從而確切檢測到染色體異常和單基因病是可能的，但是這些方法 是高度侵入性的，需要有技術(shù)的專業(yè)人員，并且有高風(fēng)險的流產(chǎn)（高至1% )和/或孕婦并 發(fā)癥（3-5)的傾向。約1%的活胎出生、2%的35周歲以上孕婦以及約50%的自發(fā)性妊娠 早期流產(chǎn)中會出現(xiàn)細(xì)胞基因紊亂￠)。在一百萬個活胎出生的人群中，單基因缺陷的發(fā)生率 約為 0· 36% (7)。
[0003] 為了最小化例如DS等疾病中的風(fēng)險，將這些侵入性但是確切的的檢測提供給通 過一系列篩查標(biāo)準(zhǔn)而被鑒定為具有胎兒染色體異常最高風(fēng)險的婦女。該組通常包括生產(chǎn)年 齡在35歲以上并且在妊娠一期和二期所進行的胎兒超聲檢查和母體血清標(biāo)記物篩查測試 中出現(xiàn)異常應(yīng)答的孕婦（8)。優(yōu)選的妊娠一期的篩查，包括對血清中的PAPP-A (妊娠相關(guān)血 漿蛋白A)、游離β-hCG(游離β -人絨毛膜促性腺激素）進行定量，以及頸項透明層的超 聲檢查，具有約90%的DS檢出率，但是代價是具有顯著意義的5%假陽性率（8)。對一期 篩查研究進行的最近匯總分析得出結(jié)論，在實踐中所能達(dá)到的靈敏度可能會顯著低于（約 80-84%)所報道的靈敏度。這種表現(xiàn)不佳的問題，特別是考慮到5%的篩查陽性率，總是 會導(dǎo)致高比率的不必要且昂貴的侵入性驗證測試，并因此增加妊娠發(fā)展的風(fēng)險。
[0004] 明顯的局限性是用于尋找替代策略的主要的社會、科學(xué)和經(jīng)濟動機。后者由 于DS發(fā)生率的上升而被強化，主要是由于懷孕時母體年齡增加的趨勢，而出生率并沒有 相對等的增加（10)。美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會（American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG)近期提出了指導(dǎo)原則，建議其成員對所有預(yù)期中的母親進行基因異 常的檢測（11)，這進一步暗示了對于可安全地對胎兒基因狀況進行特異性診斷的非侵入性 技術(shù)的需求未得到滿足。因此，非侵入性產(chǎn)前診斷的開發(fā)已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中最具進取性 爭議的領(lǐng)域之一（12)。預(yù)期候選策略會包含現(xiàn)有侵入性方法的所有優(yōu)點，以使得能將它們 能夠作為單獨運行的非侵入性診斷測試或被用作高精度的驗證測試以對當(dāng)前篩查實踐中 的大量假陽性進行分析（13)。此外，這種新的測試策略應(yīng)當(dāng)另外解決了分析、制造和操作中 的復(fù)雜性，使得該新的方法提供了可靠、簡便和經(jīng)濟有效的替代性方案。
[0005] 幾十年來，對于非侵入性替代方案的探索集中在對正常情況下可穿過胎盤屏障進 入母體循環(huán)系統(tǒng)中的胎兒基因材料的分離、鑒定以及隨后的分析之上。自從1893年關(guān)于 胎兒細(xì)胞檢測的首創(chuàng)性報道（14)以及稍晚一些的關(guān)于母體血液中胎兒無細(xì)胞DNA(15)和 RNA(16)檢測的報道以來，有兩種基于對胎兒細(xì)胞或無細(xì)胞胎兒基因材料進行分析的有前 途的方法受到了極大的關(guān)注。與無細(xì)胞的胎兒DNA或RNA相比，完整的胎兒細(xì)胞可以提供 獲取對于檢測染色體異常來說重要的完整胎兒基因材料以及對胎兒基因狀況進行更全面 評估（17)。由于在伴隨有染色體異常的母體中或在諸如先兆子癇等的疾病中胎兒細(xì)胞數(shù)目 相對增加（18)，可靠的分離方法可能會基于胎兒細(xì)胞計數(shù)和/或細(xì)胞檢測信號定量而使其 適合于新型非侵入性診斷方法的開發(fā)。
[0006] 很多顯著的挑戰(zhàn)會阻礙開發(fā)可靠的胎兒細(xì)胞分離方法。據(jù)報道的每毫升母體血液 大概一至兩個細(xì)胞的罕見事件發(fā)生率對于可再現(xiàn)分離具有足夠純度和產(chǎn)量的胎兒細(xì)胞而 言，已經(jīng)被認(rèn)為是難以逾越的障礙（18)。因此，一種成功的細(xì)胞分離策略會需要優(yōu)異的效 率、靈敏度和特異性。由于迄今為止已經(jīng)通過易于導(dǎo)致低產(chǎn)率和細(xì)胞損失的低效多步驟技 術(shù)獲得了所報道的數(shù)目，進入母體血液循環(huán)的胎兒細(xì)胞的數(shù)量可能要顯著高于原先人們所 相信的那樣。在各種候選胎兒細(xì)胞（19)(滋養(yǎng)層細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、有核紅細(xì)胞以及造血干 細(xì)胞）中，有核紅細(xì)胞（NRBC)，也被稱為成紅細(xì)胞（erythroblasts)，具有大部分所需要的 特征。胎兒NRBC具有有限的壽命和增殖能力，是單核的，攜帶胎兒染色體的代表性補充物 (complement),并始終存在于母體血液之中（17-20)。然而,對于胎兒成紅細(xì)胞生成的研究 已經(jīng)鑒定出了兩個不同的過程，開始發(fā)生于卵黃囊中（原始成紅細(xì)胞生成，產(chǎn)生原始成紅 細(xì)胞）以及隨后發(fā)生于胎兒肝臟和骨髓中（產(chǎn)生定型成紅細(xì)胞）（17)。原始和定型成紅細(xì) 胞兩者在母體循環(huán)系統(tǒng)中都已經(jīng)被檢測到，但是它們出現(xiàn)的確切時間、其相對數(shù)目以及在 整個孕期的分布情況還沒有被清楚地定義。然而，雖然原始成紅細(xì)胞是妊娠一期占據(jù)優(yōu)勢 地位的細(xì)胞類型，但它們會逐漸被能夠持續(xù)至整個期間的定型類所代替（17,20)。
[0007] 原始成紅細(xì)胞具有不同的形態(tài)學(xué)特征，即胞質(zhì)與細(xì)胞核的比例高，尺寸相對較大， 并且含有被稱為ε-球蛋白的胚胎型血球蛋白（17,20)。綜合以上，上述的特征和各種細(xì) 胞表面標(biāo)記物（如分化簇標(biāo)記物（⑶34、⑶35、⑶36、⑶45、⑶47、⑶71)，血型糖蛋白-A和 i_抗原）差異表達(dá)的知識（17, 20, 21)已經(jīng)將原始成紅細(xì)胞確定為理想的妊娠一期靶標(biāo)。
[0008] 胎兒血液中的ε -陽性成紅細(xì)胞從第7周開始線性地降低，在妊娠約14周時 數(shù)量可忽略不計（22)。另一方面，近期的報道表明定型成紅細(xì)胞在進入血液循環(huán)之前去 核（17)，如果該報道被證實，則妊娠一期原始成紅細(xì)胞將依然是唯一有用的靶標(biāo)。據(jù)報道 ε -球蛋白是高度特異性的原始胎兒成紅細(xì)胞鑒定標(biāo)識（20, 22)。
[0009] 當(dāng)前對于非侵入性產(chǎn)前診斷的方法是基于利用靶細(xì)胞的物理、結(jié)構(gòu)、形態(tài)和抗原 性屬性，到目前為止已利用了三個獨立步驟的步驟（22,23)。這些步驟是（1)，為了從母體 血液中富集胎兒細(xì)胞而設(shè)計的技術(shù)的開發(fā)；（2)，從所富集細(xì)胞的異源混合物中鑒定出胎兒 細(xì)胞；以及（3)，在對靶標(biāo)進行顯微操作之前和/或之后通過染色體熒光原位雜交（FISH)、 各種PCR技術(shù)和/或基因測序來對所鑒定的細(xì)胞進行基因分析（17,21-23)。為了使目前這 種復(fù)雜性、低效性和不一致性最小化，也已經(jīng)考慮到了將胎兒細(xì)胞的鑒定步驟與基于分子 遺傳學(xué)的診斷組合的方法（22)。
[0010] 近期的綜述認(rèn)為，目前胎兒細(xì)胞分離策略的不足之處是限制可靠的非侵入性產(chǎn)前 診斷方法開發(fā)的主要因素（18)。目前，研究最多的胎兒細(xì)胞富集方法包括選擇性紅細(xì)胞裂 解、密度梯度離心、電流分離、熒光激活細(xì)胞分選（FACS)以及磁激活細(xì)胞分選（MACS)的多 步驟組合（18, 23)。更加新型的替代性方法包括更加復(fù)雜的方法，其基于將微電子機械系 統(tǒng)（MEMS)和/或目前一些細(xì)胞富集方法的自動化操作與所鑒定細(xì)胞的形態(tài)差異、免疫表型 分型和/或顯微操作的組合（18, 24-28)。
[0011] 現(xiàn)在明顯，簡單、靈敏和特異的能夠?qū)崿F(xiàn)高效性和一致性的胎兒分離技術(shù)是用于 實際用途的非侵入性產(chǎn)前測試成功開發(fā)的首要事件。盡管用于精確地檢測基因和染色體異 常的下游技術(shù)（FISH、PCR和基因測序）是可用的，但后者仍然沒有得到實現(xiàn)這一事實反映 了目前可利用的細(xì)胞分離方法還有顯著不足（17，18,21，23)。
[0012] 仍然存在對于一種新型的、簡單、快速和可靠的胎兒NRBC分離技術(shù)的迫切需求， 以克服這種廣為人知的難以逾越的障礙（17,18, 20-28)。理想地，解決對檢測、分離和分析 胎兒NRBC的這些需求的試劑盒應(yīng)該低成本地制造很，同時保持高的分離靈敏度、特異性和 一致性。
[0013] 本發(fā)明提供了這樣一種新型的、簡單、快速和可靠的胎兒NRBC分離試劑盒，其基 于一種克服了這些障礙的技術(shù)。該試劑盒可以經(jīng)濟有效地制造，同時保持高的分離靈敏度、 特異性和一致性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明滿足了未被滿足的對于提供用于檢測、富集和分離生物液體中稀有細(xì)胞的 方法的可靠技術(shù)及相關(guān)方法的迫切需求。本發(fā)明進一步了提供了一種作為獨立試劑盒的組 成部分而行使功能的系統(tǒng)及相關(guān)的方法，所述試劑盒用于胎兒NRBC的分離、鑒定及隨后對 特異性的胎兒基因異常進行分析或測試任意一組胎兒基因異?；蛟\斷目標(biāo)的其他基因型 的存在。本發(fā)明還解決了在目前面臨類似的檢測和分析局限性問題的其他領(lǐng)域（例如循環(huán) 干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞）中對于可靠的稀有細(xì)胞分離方法未被滿足的需求。
[0015] 本發(fā)明提供了從哺乳動物生物液體中富集和/或分離稀有細(xì)胞的方法；該方法包 括：（i)提供固定在基質(zhì)上的抗體，所述基質(zhì)例如大平板（large plate)、陪替氏培養(yǎng)皿、 孔、微孔、載玻片、條、桿、珠或微陣列板或載玻片，其中所述抗體結(jié)合稀有細(xì)胞的細(xì)胞表面 抗原；（ii)使固定化的抗體與生物液體樣品接觸，其中所述液體中含有稀有細(xì)胞和多種其 他細(xì)胞；（iii)將固定化的抗體與體液樣品在適合于抗體與稀有細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原結(jié)合 的條件下溫育，以形成抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體；以及（iv)洗滌抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體以除 去未結(jié)合的細(xì)胞并提供固定化的抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體。
[0016] 本發(fā)明還提供了對生物液體中的稀有細(xì)胞進行檢測的方法；該方法包括：（i)提 供固定在基質(zhì)上的第一抗體，其中所述第一抗體結(jié)合稀有細(xì)胞的第一細(xì)胞表面抗原；（ii) 使固定化的第一抗體與生物液體樣品接觸，其中體液含有稀有細(xì)胞和多種其他細(xì)胞；（iii) 將固定化的第一抗體與體液樣品在適合于第一抗體與稀有細(xì)胞的第一細(xì)胞表面抗原結(jié)合 的條件下溫育，以形成第一抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體；（iv)洗滌第一抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體， 以除去未結(jié)合的細(xì)胞并提供分離的第一抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體；(V)將第一抗體-稀有細(xì) 胞復(fù)合體與結(jié)合稀有細(xì)胞的第二細(xì)胞表面抗原的第二抗體在適合于第二抗體與第二細(xì)胞 表面抗原結(jié)合的條件下溫育，以形成第一抗體-稀有細(xì)胞-第二抗體復(fù)合體；以及（Vi)檢 測第一抗體-稀有細(xì)胞-第二抗體復(fù)合體中的第二抗體，從而檢測體液樣品中稀有細(xì)胞的 存在。
[0017] 本發(fā)明進一步提供了對生物液體中的稀有細(xì)胞進行檢測的方法；該方法包括： (i) 提供固定在基質(zhì)上的第一抗體，其中第一抗體結(jié)合稀有細(xì)胞的第一細(xì)胞表面抗體； (ii) 使固定化的第一抗體與生物液體樣品接觸，其中體液含有稀有細(xì)胞和多種其他細(xì)胞； (iii) 將固定化的第一抗體與體液樣品在適合于抗體與稀有細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原結(jié)合的 條件下溫育，以形成第一抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體以及多種未結(jié)合的細(xì)胞；（iv)洗滌第一抗 體-稀有細(xì)胞復(fù)合體，以除去未結(jié)合的細(xì)胞；(V)裂解第一抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體的稀有細(xì) 胞，以形成含有稀有細(xì)胞特異性核酸序列的裂解物，并將裂解的細(xì)胞和與稀有細(xì)胞特異性 核酸序列互補的核酸探針在適合于核酸探針與稀有細(xì)胞特異性核酸序列雜交的條件下溫 育，以形成雙鏈復(fù)合體；以及（Vi)檢測該雙鏈復(fù)合體，從而檢測體液樣品中稀有細(xì)胞的存 在。
[0018] 本發(fā)明還提供了用于檢測和分離生物液體中的稀有細(xì)胞（例如母體血液中的胎 兒細(xì)胞）的試劑盒；所述試劑盒包括固定在基質(zhì)上的抗體，其中所述抗體對于稀有細(xì)胞的 細(xì)胞表面抗原是特異性的；以及適合于抗原抗體結(jié)合的緩沖溶液。
[0019] 本發(fā)明提供了估算每單位哺乳動物生物液體中稀有細(xì)胞數(shù)量的方法；該方法包 括：（i)提供固定在基質(zhì)上的抗體，其中所述抗體結(jié)合稀有細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原相；（ii)使 固定化的抗體與已知單位的生物液體樣品接觸，其中體液含有多種稀有細(xì)胞和多種其他細(xì) 胞；（iii)將固定化的抗體與所述單位的體液樣品在適合于抗體與稀有細(xì)胞的細(xì)胞表面抗 原結(jié)合的條件下溫育，以形成抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體；（iv)洗滌該抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體， 以除去未結(jié)合的細(xì)胞并提供固定化的抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體；以及（V)確定樣品中固定化 的抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體的數(shù)量，從而估算每單位液體樣品中稀有細(xì)胞的數(shù)量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1 :顯示了生物素化的4B9抗體的對比性結(jié)合動力學(xué)。將濃度增加的生物素化 4B9抗體與鏈親和素包被的磁性顆粒（來自于Invitrogen生物素結(jié)合劑，CELLECTIN和 FlowComp試劑盒）、右旋糖苷包被的納米顆粒（由StemCell technologies EasySep人生 物素陽性細(xì)胞篩選試劑盒提供）以及鏈親和素包被的微孔（Microwell-SA)在相同條件下 溫育30分鐘。洗滌之后，利用HRPO標(biāo)記的山羊抗-小鼠 IgM抗體檢測已結(jié)合的4B9并通 過比色法定量。
[0021] 圖2:顯示了從母體血液中分離的ε-陽性胎兒細(xì)胞的圖像。經(jīng)分離的細(xì)胞被固 定、透化并使用AMCA-標(biāo)記的小鼠抗-人ε-球蛋白抗體進行探測。通過在亮視野（BF) 下顯微觀察、檢測ε -球蛋白陽性響應(yīng)的熒光視野以及合成的合并圖像來獲得代表性的圖 像。
[0022] 圖3:顯示了從母體血液中分離的ε-陽性胎兒細(xì)胞的圖像。經(jīng)分離的細(xì)胞被固 定、透化并使用AMCA-標(biāo)記的小鼠抗-人ε-球蛋白抗體進行探測。通過在亮視野（BF)下 顯微觀察、檢測ε -球蛋白陽性響應(yīng)的熒光視野，以及合成的合并圖像來獲得代表性的圖 像。
[0023] 圖4:顯示了從母體血液中分離的ε-陽性胎兒細(xì)胞的圖像。經(jīng)分離的細(xì)胞被固 定、透化并使用AMCA-標(biāo)記的小鼠抗-人ε -球蛋白抗體進行探測。隨后利用TO-PRO對細(xì) 胞進行復(fù)染色。通過在亮視野（BF)下顯微觀察、顯示細(xì)胞核和ε-球蛋白陽性響應(yīng)的熒光 視野以及合成的合并圖像來獲得代表性的圖像。
[0024] 圖5:顯示了從男性妊娠中分離的胎兒NRBC的FISH圖像。使用4Β9(0)_涂覆的 載玻片從確認(rèn)懷孕30周男性妊娠的母體血液（5mL)中分離胎兒NRBC。探測經(jīng)分離細(xì)胞的 Y染色體（紅色）（在左欄中微弱地顯示）和X染色體（綠色），也顯示了合成的合并圖像。
[0025] 圖6 :為圖5中所顯示FISH圖像的放大合成圖像。Y染色體（紅色）點的微弱的 位于左下中心，X-染色體（綠色）點位于右上中心。
[0026] 圖7 :顯示了利用各種抗體對捕獲的細(xì)胞進行夾心式檢測的圖：通過與不同的檢 測抗體一起溫育來檢測4B9-捕獲的細(xì)胞。隨后針對ε-球蛋白對分離的細(xì)胞進行染色并 在顯微鏡下進行分析。
[0027] 圖8 :顯示了從母體血液中分離的胎兒細(xì)胞的Y染色體擴增。將從6名不同患者 的IOmL母體血液中分離的胎兒細(xì)胞放置于涂覆有4Β9抗體的兩個6cm平板或一個IOcm平 板上。收獲細(xì)胞，并利用兩個Y染色體特異性探針通過實時PCR分析DNA。男性對照DNA用 作陽性對照。數(shù)值表示循環(huán)閾值的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差（η = 3/樣品）。女性陰性對照DNA沒 有擴增（數(shù)據(jù)未顯示）。
[0028] 循環(huán)胎兒細(xì)胞是胎兒基因材料的全部來源。然而，仍然存在從母體血液中可靠和 連續(xù)地分離并具備高度靈敏度和特異性的迫切需求。

【具體實施方式】
[0029] 本發(fā)明提供了雙位點"夾心式"稀有細(xì)胞分離技術(shù)、方法和平臺，包括一種或多種 細(xì)胞捕獲抗體與一種或多種用于細(xì)胞檢測/鑒定的抗體的成對組合。在某些實施方式中， 本發(fā)明的夾心式細(xì)胞分離和分析技術(shù)利用了特異性捕獲與非特異性檢測的組合、非特異性 捕獲與特異性檢測的組合，或本領(lǐng)域技術(shù)人員可直接意識到的其它任意合適的組合。這種 新型、高效和可靠的技術(shù)能夠容易地被配置成獨立的手動稀有細(xì)胞分離和分析試劑盒或改 裝成與常規(guī)實驗室應(yīng)用相兼容的自動化設(shè)備。因此，在一個實施方式中，本發(fā)明為捕獲、分 離和檢測（及鑒定）母體血液中胎兒有核紅細(xì)胞（NRBC)的無縫單步驟方法提供了一種 簡單、快速、可靠以及經(jīng)濟有效的技術(shù)，并提供了非侵入性產(chǎn)前診斷在胎兒基因異常中的應(yīng) 用。
[0030] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供了從哺乳動物的生物液體（例如血液、血漿、羊 水、尿液或來自絨毛膜絨毛取樣（CVS)活組織檢查的細(xì)胞懸浮液）中分離或富集稀有細(xì)胞 的方法；該方法包括：（i)提供固定在基質(zhì)上的抗體，所述基質(zhì)可以是任意合適的基質(zhì)，例 如玻璃或塑料表面，其可以是顆粒、珠（所述顆粒和珠可以是含有金屬的顆?；蛑樽?；或磁 性顆?；虼胖椋?、平板、陪替氏培養(yǎng)皿、孔、微孔、載玻片、條或桿的表面；其中抗體結(jié)合稀有 細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原，抗體對于細(xì)胞表面抗原是選擇性或特異性的；稀有細(xì)胞可以是任意 的稀有細(xì)胞，例如母體血液樣品中的胎兒細(xì)胞，稀有細(xì)胞抗原可以是任意稀有細(xì)胞抗原，例 如胎兒細(xì)胞上的人胎兒有核RBC抗原的特異性4B9抗體；（ii)使固定化的抗體與生物液體 樣品接觸，其中體液包含稀有細(xì)胞和多種其他細(xì)胞；（iii)將固定化抗體與體液樣品在適 合于抗體和稀有細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原結(jié)合的條件下溫育，以形成抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體； 以及（iv)洗滌抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體，以除去未結(jié)合的細(xì)胞并提供固定化的抗體-稀有細(xì) 胞復(fù)合體。
[0031] 在另一個的實施方式中，本發(fā)明提供了對生物液體（例如血液、血漿、羊水、尿液 或來自絨毛膜絨毛取樣（CVS)活組織檢查的細(xì)胞懸浮液）中的稀有細(xì)胞進行檢測方法； 其中該方法包括：（i)提供固定在基質(zhì)上的第一抗體，其中第一抗體特異性地或選擇性地 結(jié)合稀有細(xì)胞的第一細(xì)胞表面抗原；（ii)使固定化的第一抗體與生物液體樣品接觸，其中 體液含有稀有細(xì)胞和多種其他細(xì)胞；（iii)將固定化的第一抗體與體液樣品在適合于第一 抗體與稀有細(xì)胞的第一細(xì)胞表面抗原結(jié)合的條件下溫育，以形成第一抗體-稀有細(xì)胞復(fù) 合體；（iv)洗滌第一抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體，以除去未結(jié)合的細(xì)胞并提供分離出的第一抗 體-稀有細(xì)胞復(fù)合體；(V)將第一抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體與結(jié)合稀有細(xì)胞中第二細(xì)胞表面 抗原的第二抗體在適合于第二抗體與第二細(xì)胞表面抗原結(jié)合的條件下溫育，以形成第一抗 體-稀有細(xì)胞-第二抗體復(fù)合體，并可選地洗滌第一抗體-稀有細(xì)胞-第二抗體復(fù)合體，以 除去未結(jié)合的第二抗體；其中第一抗體和第二抗體可以是不同的抗體，或者作為選擇，第一 抗體和第二抗體可以是針對相同抗原的抗體或可以是相同的抗體；(vi)檢測第一抗體-稀 有細(xì)胞-第二抗體復(fù)合體中的第二抗體（可利用任意合適的可檢測標(biāo)記，例如熒光標(biāo)記、酶 標(biāo)記、放射性同位素標(biāo)記、化學(xué)反應(yīng)交聯(lián)劑或生物素標(biāo)記對其進行可檢測地標(biāo)記），從而檢 測體液樣品中稀有細(xì)胞的存在。
[0032] 在一個實施方式中，第一抗體是抗體4B9。在另外的實施方式中，第二抗體是胎兒 細(xì)胞表面抗原特異性的；作為選擇，第二抗體可以是對胎兒細(xì)胞表面抗原具有選擇性的抗 體。在另外的實施方式中，第二抗體是胎兒ε-球蛋白、⑶36、⑶71或⑶47特異性的。在 另一個實施方式中，第二抗體是血型糖蛋白A或i-抗原特異性的。
[0033] 在另外的實施方式中，本發(fā)明提供了一種方法，其中通過將第一抗體-稀有細(xì) 胞-第二抗體復(fù)合體與特異性結(jié)合第二抗體的帶有可檢測標(biāo)記的第三抗體（例如酶標(biāo)記抗 體，如用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體）在適合于抗體結(jié)合的條件下溫育，以形 成第一抗體-稀有細(xì)胞-第二抗體-第三抗體復(fù)合體；洗滌抗體-稀有細(xì)胞-第二抗體-第 三抗體復(fù)合體；檢測帶有可檢測標(biāo)記的第三抗體；從而檢測樣品中的稀有細(xì)胞。
[0034] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了對生物液體中的稀有細(xì)胞（例如胎兒細(xì)胞） 進行檢測的方法，其可以是生物液體，例如人類或動物的血液、血漿、羊水、尿液、或來自絨 毛膜絨毛取樣（CVS)活組織檢查的細(xì)胞懸浮液，其中所述方法包括：（i)提供固定在基質(zhì)上 的第一抗體，其中第一抗體與稀有細(xì)胞的第一細(xì)胞表面抗原結(jié)合；（ii)使固定化的第一抗 體與生物液體樣品接觸，其中體液含有稀有細(xì)胞和多種其他細(xì)胞；（iii)將固定化的第一 抗體與體液樣品在適合于抗體與稀有細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原結(jié)合的條件下溫育，以形成第一 抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體以及多種未結(jié)合的細(xì)胞；（iv)洗滌第一抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體，以 除去未結(jié)合的細(xì)胞；(V)裂解第一抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體中的稀有細(xì)胞，以形成含有稀有細(xì) 胞特異性核酸序列的裂解物，并將裂解的細(xì)胞和與稀有細(xì)胞特異性核酸序列互補的核酸探 針在適合于核酸探針與稀有細(xì)胞特異性核酸序列雜交的條件下溫育，以形成雙鏈復(fù)合體； 以及（vi)通過任意合適的方法檢測該雙鏈復(fù)合體，例如利用核酸探針的核酸雜交或者通 過熒光原位雜交（FISH)，從而檢測體液樣品中稀有細(xì)胞的存在。稀有細(xì)胞特異性核酸序列 可以是任意的稀有細(xì)胞特異性核酸序列，例如染色體異常特有的核酸序列。染色體異?？?以是任意的基因異常，例如單基因異常，如單核苷酸多態(tài)性（SNP)。在一個實施方式中，稀有 細(xì)胞特異性核酸序列是患癌傾向的特征。
[0035] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了用于對生物液體中的稀有細(xì)胞（例如母體血 液樣品中的胎兒細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原）進行捕獲、檢測或分離的試劑盒，其中所述試劑盒 包括：（i)固定在基質(zhì)（例如玻璃或塑料表面）上的第一抗體，其中所述抗體對稀有細(xì)胞的 細(xì)胞表面抗原具有特異性或選擇性；以及（ii)適合于抗原抗體結(jié)合的緩沖溶液。在一個實 施方式中，試劑盒包括適合于與生物液體中的稀有細(xì)胞結(jié)合的抗體，其中所述生物液體是 血液、血漿、羊水、尿液或來自絨毛膜絨毛取樣（CVS)活組織檢查的細(xì)胞懸浮液。
[0036] 在一個實施方式中，稀有細(xì)胞是母體血液樣品中的胎兒細(xì)胞，且所述胎兒細(xì)胞是 胎兒有核紅細(xì)胞（NRBC)。在另一個實施方式中，第一抗體是4B9。在另一個實施方式中，試 劑盒進一步包括對稀有細(xì)胞的第二細(xì)胞表面抗原具有特異性或選擇性的第二抗體，其中所 述第二抗體沒有被固定。在一個實施方式中，第二抗體是抗體4B9。在另一個實施方式中， 第二抗體是⑶36或⑶71特異性抗體；或⑶36和⑶71特異性抗體的混合物。試劑盒也可 包括用于對細(xì)胞核進行染色的核酸特異性熒光染料。
[0037] 在另一個實施方式中，稀有細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原是腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原，并 且第一抗體對腫瘤細(xì)胞特異性細(xì)胞表面抗原具有特異性，其中第一抗體可以是帶有可檢測 標(biāo)記的抗體。在一個實施方式中，第二抗體是對CD36或CD71具有特異性的抗體；或?qū)D36 和CD71具有特異性的抗體的混合物；作為選擇，第二抗體可以是對血型糖蛋白A或i-抗原 具有特異性的抗體；在另一個替代性方案中，第二抗體對CD36、CD71、CD47、血型糖蛋白A、 i_抗原或胎兒ε-球蛋白是特異性的。在一個實施方式中，試劑盒可以包括與稀有細(xì)胞的 基因互補的核酸探針，并且基質(zhì)是適合于進行直接雜交分析（例如適合于對稀有細(xì)胞進行 熒光原位雜交（FISH)分析的核酸探針）使用的基質(zhì)。
[0038] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了估算每單位哺乳動物生物液體中稀有細(xì)胞數(shù) 量的方法，例如母體生物液體（例如血液）中的胎兒細(xì)胞，如胎兒有核紅細(xì)胞（NRBC)，其中 所述方法包括：（i)提供固定在基質(zhì)上的抗體，其中所述抗體結(jié)合稀有細(xì)胞的細(xì)胞表面抗 原；（ii)使固定化的抗體與已知單位的生物液體樣品接觸，其中體液含有多種稀有細(xì)胞和 多種其他細(xì)胞；（iii)將固定化的抗體與所述單位的體液樣品在適合于抗體與稀有細(xì)胞的 細(xì)胞表面抗原結(jié)合的條件下溫育，以形成抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體；（iv)洗滌該抗體-稀有 細(xì)胞復(fù)合體，以除去未結(jié)合的細(xì)胞，并提供固定化的抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體；以及（V)檢測 樣品中固定化的抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體的數(shù)量，從而估算每單位生物液體樣品中稀有細(xì)胞 的數(shù)量。在一個實施方式中，利用細(xì)胞核特異性染色來檢測固定化的抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合 體。
[0039] 在一個實施方式中，生物液體是血液、血漿、羊水、尿液或來自絨毛膜絨毛取樣 (CVS)活組織檢查的細(xì)胞懸浮液。在另一個實施方式中，當(dāng)每單位樣品液體中的稀有細(xì)胞數(shù) 量超出正常范圍時，該方法可用作疾病或病癥的診斷或預(yù)兆，或者指示疾病或病癥的臨床 狀況，例如胎兒遺傳疾病或病狀或孕婦的妊娠并發(fā)癥，如先兆子癇。在另一個實施方式中， 疾病或病癥是癌癥。
[0040] 在本發(fā)明方法的一個實施方式中，將對在胎兒NRBC質(zhì)膜上表達(dá)的表位具有特異 性的小鼠單克隆抗體（抗體4B9)涂布在大表面固體支持物上。在本發(fā)明的某些實施方式 中，固體支持物可以是膠體金屬顆粒（例如膠體金顆粒）、磁性顆粒（例如含鐵金屬顆粒）、 磁板、磁套、磁棒、聚合物珠、醫(yī)療和機械微裝置表面、醫(yī)療和機械微電子裝置表面以及醫(yī)療 和機械微電子傳感器表面?？墒褂糜脠蟾娣肿訕?biāo)記的4B9抗體來完成對被特異性捕獲的胎 兒NRBC的檢測和/或鑒定。作為選擇，4B9或者一種或多種具有相似特異性的抗體可以與 針對已知或尚待發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞表面和/或內(nèi)部胎兒NRBC鑒定生物標(biāo)記物的一種或多種抗體 進行任意可能的夾心式組合使用。例如，4B9或其它抗-胎兒NRBC抗體可以作為捕獲或檢 測抗體與一種或多種特異性或非特異性胎兒NRBC檢測抗體組合使用。這種組合包括通過 帶有適當(dāng)標(biāo)記的針對特異性（例如，胎兒ε -球蛋白）和/或非特異性（例如細(xì)胞表面糖血 型蛋白Α，和/或i-抗原）胎兒NRBC生物標(biāo)記物的抗體來對4Β9-捕獲的胎兒NRBC進行檢 測。可能的胎兒NRBC捕獲/檢測抗體組合包括4B9/抗CD36、4B9/抗CD7U4B9/抗CD47、 抗 CD36/4B9、抗 CD71/4B9、抗 CD47/4B9、;抗 CD36/ 抗 CD47、抗 CD36/ 抗 CD71、抗 CD36/ 抗糖 血型蛋白A、抗CD36/抗i-抗原。胎兒NRBC的檢測/區(qū)分還可包括細(xì)胞核染色并可擴大到 包括針對其它可容易獲得的胎兒NRBC分化生物標(biāo)記物的抗體的其它合適的夾心式組合。
[0041] 本發(fā)明提供了一種對生物來源中的目標(biāo)循環(huán)稀有細(xì)胞（例如來自母體血液的循 環(huán)胎兒有核RBC)進行檢測、分離和分析的單步驟、連續(xù)的和無縫的可靠方法。能夠通過 本發(fā)明的方法從生物液體中分離的稀有細(xì)胞的其它示例包括能夠從獲自絨毛膜絨毛取樣 (CVS)的活組織檢查樣品的細(xì)胞懸浮液中分離得到的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞、由羊水穿刺獲得的 羊水中的羊水細(xì)胞以及尿液樣品中的白細(xì)胞，例如來自于患有疾病或病癥如尿道感染的患 者。
[0042] 如本文所使用的，稀有細(xì)胞是具有在其所處細(xì)胞群體的大多數(shù)細(xì)胞中都不存在的 至少一種特征性細(xì)胞抗原的細(xì)胞。作為選擇，稀有細(xì)胞可具有與其所處細(xì)胞群體中的大多 數(shù)細(xì)胞的同源抗原不同的特征性的抗原。例如，稀有細(xì)胞的特征性細(xì)胞抗原可以是細(xì)胞表 面抗原、細(xì)胞質(zhì)抗原或細(xì)胞核抗原。稀有細(xì)胞的特征性抗原可以是在細(xì)胞群體的大多數(shù)細(xì) 胞中沒有發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞成分的抗原，或者其可以是在細(xì)胞群體的大多數(shù)細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)的細(xì) 胞成分的抗原性變體。例如，被抗體4B9結(jié)合的NRBC抗原在未懷孕成人的成熟紅細(xì)胞中不 存在。
[0043] 稀有細(xì)胞可以是癌癥細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞、腺瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞或其它任意的癌癥細(xì) 胞。稀有癌癥細(xì)胞可以是血液樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，或生物液體正常細(xì)胞群體中的稀有 癌癥細(xì)胞；生物液體可以是任意的生物液體，包括但不限于源自組織活組織檢查的細(xì)胞懸 浮液。
[0044] 稀有細(xì)胞可表現(xiàn)為生物液體中細(xì)胞群體的約IO2至約IO4個、約IO 3至約IO5個、 約IO4至約IO6個、約IO 5至約IO7個、約IO6至約IO8個、約IO7至約IO 9個、約IO8至約101° 個細(xì)胞中的一個細(xì)胞。生物液體可以是任意的生物液體，例如但不限于血液、血漿或尿液； 或者生物液體可以是獲自組織樣品例如活組織檢查樣品的細(xì)胞懸浮液。
[0045] 如本文所使用的，哺乳動物可以是任意的哺乳動物，例如但不限于人類或動物；動 物可以是任意的動物，例如非人靈長類動物，例如黑猩猩、大猩猩或猩猩；動物可以是伴侶 動物，例如狗或貓；或者動物可以是家畜，例如奶牛、綿羊、豬或山羊；動物也可以是動物園 里的動物，例如熊、老虎或獅子。
[0046] 在本發(fā)明方法的一個實施方式中，胎兒NRBC的分離特別地涉及將母體血液 (5-10mL)與涂覆有4B9抗體的細(xì)胞分離基質(zhì)一起進行短時間（例如30-60分鐘）溫育。在 洗滌以除去未結(jié)合的細(xì)胞之后，將固定化的胎兒NRBC與用合適的檢測基團標(biāo)記的4B9抗體 溫育30-60分鐘。由于4B9抗體對于胎兒NRBC的高特異性，通過使用經(jīng)標(biāo)記的4B9或針對 上述其他特異性或非特異性NRBC標(biāo)志物的經(jīng)過合適標(biāo)記的抗體能夠容易地實現(xiàn)該策略的 高分離效率、已實施的洗滌步驟以及對經(jīng)分離細(xì)胞的組合檢測/鑒別。除了允許組合胎兒 NRBC的捕獲、檢測和鑒定之外，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適且易于利用的染色體、 基因和分子試驗，該技術(shù)還與直接對結(jié)合到分離基質(zhì)的細(xì)胞進行的指定分析程序相兼容。
[0047] 作為選擇，分離細(xì)胞的高純度和大數(shù)量使得可容易獲得單個胎兒NRBC以進行顯 微操作或從固相基質(zhì)上去除全部被捕獲的胎兒NRBC群以進行下游的基因和分子測試。這 種新型的夾心式細(xì)胞捕獲、分離、鑒定技術(shù)可容易地用于從人或動物的生物液體（例如血 液、羊水和尿液）中分離稀有細(xì)胞群體的常規(guī)應(yīng)用；還可用于從來自于活組織檢查的人或 動物細(xì)胞懸浮液中分離任意的稀有細(xì)胞。特異性分離的細(xì)胞可用于研究、評估細(xì)胞對于藥 物制劑的響應(yīng)，或用于指示疾病，例如染色體和基因異常、孕婦妊娠并發(fā)癥以及多種癌癥 等。僅有的要求是選擇性或特異性結(jié)合指定靶細(xì)胞的抗體的獲得和/或開發(fā)。本發(fā)明另外 的適應(yīng)性修改是其作為診斷方法的應(yīng)用，所述方法是基于監(jiān)控稀有細(xì)胞（例如與胎兒和/ 或孕婦并發(fā)癥的發(fā)生相關(guān)的胎兒NRBC)循環(huán)數(shù)量的改變。據(jù)報道，在諸如唐氏綜合癥（DS) 和先兆子癇等病癥中，有更多的胎兒細(xì)胞進入到母體血液中。先兆子癇是一種在妊娠第20 周（二期后期或三期）之后將會發(fā)展高血壓和蛋白尿的妊娠病癥。在這種病癥中，對獲自 疑似以及懷孕匹配的正常妊娠中的每單位母體血液中分離的胎兒NRBC數(shù)量的相對變化進 行的對比性分析可用于診斷，并且在預(yù)測這些病癥的發(fā)生方面也是具有價值的。
[0048] 在雙位點"夾心式"方法中，與特異性和/或非特異性胎兒NRBC表面抗原反應(yīng)的 抗體的配對組合是本發(fā)明重要的設(shè)計組成部分。到目前為止，本領(lǐng)域?qū)τ谔杭?xì)胞分離的 狀況通常集中在相對復(fù)雜的多步驟細(xì)胞富集方法上，這些方法不具備足夠的靈敏度，易于 導(dǎo)致產(chǎn)率不良和/或顯著的細(xì)胞損失，并給出不一致的結(jié)果。此外，所報道的方法通常靶向 非特異性和/或在靶細(xì)胞在成熟過程中表達(dá)量改變的胎兒細(xì)胞標(biāo)記物（17,18, 20-28)。
[0049] 在一個實施方式中，本發(fā)明將新型單克隆抗體（美國專利7858757B2中描述的抗 體4B9)的特異性胎兒NRBC識別性質(zhì)與雙位點"夾心式"設(shè)計組合使用，提供了一種從母體 血液中分離胎兒NRBC的高效且方便的方法。在這種新穎的設(shè)計中，識別特異性細(xì)胞表面表 位的4B9抗體被涂覆在合適的反應(yīng)表面上，并利用與能夠易于定量/檢測的標(biāo)記共價或非 共價偶聯(lián)的4B9抗體檢測特異性捕獲的胎兒NRBC細(xì)胞。由于夾心式細(xì)胞分離方法固有的 靈活性，允許依次進行細(xì)胞捕獲、細(xì)胞洗滌以除去未結(jié)合的細(xì)胞以及細(xì)胞檢測，特異性捕獲 抗體例如4B9可備選地與針對特異性（例如抗ε-球蛋白）或非特異性（例如糖血型蛋白 A、i-蛋白、⑶47)胎兒NRBC標(biāo)記物的一種或多種檢測抗體配對使用。
[0050] 結(jié)合相同或不同胎兒NRBC表面抗原的捕獲或檢測抗體的組合（例如4B9/4B9或 4B9/抗糖血型蛋白-A抗體）為本發(fā)明的技術(shù)增加了新的另一個方面的特異性和精確性。 所提供的細(xì)胞捕獲/檢測策略不限于配對的抗體組合，并可以容易地配置為包括一種或多 種捕獲抗體與針對內(nèi)部和/或外部胎兒NRBC標(biāo)識物的一種或多種檢測Abs的組合。
[0051] 使用抗體-涂覆的大表面平板或含有抗體的固體支持物（例如易于利用的顯微載 玻片和陪替氏培養(yǎng)皿）具有幾個優(yōu)點。除了促進更緊密的接觸以及提供增加的細(xì)胞捕獲容 量和親和力非依賴性反應(yīng)動力學(xué)（30)之外，它們還允許將多個所需的步驟統(tǒng)一到一個用 于使誤差最小化和提高一致性的簡單和連續(xù)的過程中。由于本發(fā)明的方法將細(xì)胞捕獲、洗 滌以除去未結(jié)合的細(xì)胞、細(xì)胞檢測（鑒定）以及分析的步驟組合到適合于手動和自動化應(yīng) 用的無縫平臺系統(tǒng)中，這個單一形式的系統(tǒng)是極為有利的。
[0052] 由于需要進行不同形式的細(xì)胞富集、鑒定和/或分離的多步驟方法容易造成累積 誤差和細(xì)胞損失，從而使得如果不是不可能，但很難開發(fā)出高效的連續(xù)性細(xì)胞分離方法 (18)，而這種統(tǒng)一的過程具有公認(rèn)的操作上的好處。本發(fā)明可以提供為單獨的基于抗體的 胎兒NRBC分離試劑盒以用于通常的下游用途，或者提供為完整的胎兒NRBC分離和分析試 劑盒。設(shè)計的靈活性允許將利用不同特異性的抗體的細(xì)胞分離平臺整合在夾心式細(xì)胞捕獲 /檢測方法中，這提供了本發(fā)明對研究和/或臨床所關(guān)注的任意循環(huán)稀有細(xì)胞進行分離和 分析的廣泛適用性。
[0053] 患者群體和樣品
[0054] 從妊娠8至12周的一期妊娠者（22-45周歲）以及經(jīng)超聲確認(rèn)二期男性妊娠者中 收集外周血。還從未懷孕婦女中收集血液樣品。懷孕和未懷孕婦女的樣品獲自Dr. Jonathan Herman，Long Island Jewish Medical Centre，NY.。男性受試對象的試樣獲自 KellBenx， Great River，NY的自愿人員。在獲得供血者的知情同意書之后，將所有的試樣收集在含有 EDTA的血液采集管中。所有的血液樣品在收集后的24小時之內(nèi)使用。
[0055] 材料
[0056] 辣根過氧化物酶（HRP)和鏈親和素獲自ScrippsLaboratories，San Diego, CA。硫 代-NHS-LC-LC生物素、硫代-NHS-SS-生物素、NHS-PG12-生物素和NHS-SS-PG12-生物素； 二硫鍵斷裂物、二硫蘇糖醇（DTT)和TCEP溶液；山羊抗小鼠 IGM(u)、兔抗小鼠 IGM(u)、山羊 抗小鼠，F(xiàn)ab2 ;FC 受體阻斷劑獲自 ThermoFisher Scientific (www. Thermofisher, com)。EPS 微陣列顯微載玻片、Superfrost Gold顯微鏡載玻片、Screw載玻片帽夾；Fisher牌100mm 和60mm陪替氏培養(yǎng)皿，以及平底6孔非組織培養(yǎng)板來自于ThermoFisher。
[0057] 用鏈親和素涂覆的Dynabead?生物素結(jié)合劑磁珠 ；CELLectin Biotin Binder試 劑盒，其包含通過DNA連接子用鏈親和素（以提供用于釋放結(jié)合至生物素化抗-細(xì)胞抗體 的細(xì)胞的DNA酶切割位點）涂覆的磁珠；以及Dynabead? FlowComp Flexi，Part A和Part B，包含用修飾的鏈親和素涂覆的磁性顆粒的試劑盒、DSB-X生物素抗體標(biāo)記試劑盒以及用 于將結(jié)合至DSB-X生物素化抗-細(xì)胞抗體的細(xì)胞釋放出來的基于D-生物素的釋放劑均獲 自Invitrogen (www. invtrogen. com)。熱失活胎牛血清、RPMI培養(yǎng)基1640、不含興或緩的 D-PBS以及純化的小鼠 IgM獲自Invitrogen。
[0058] 包含右旋糖苷涂覆的使用雙特異性四抗體復(fù)合體（TAC)的磁性納米顆粒（可同 時識別與抗-細(xì)胞抗體連接的右旋糖酐和生物素分子）的EasySep?人生物素陽性細(xì)胞選 擇試劑盒獲自 StemCell Technologies (www. stemcell, com)。SuperEpoxy?載玻片獲自 Arrayit Corporation (Sunnyvale, CA. 94089)。表面活化的Nexterion?載玻片 H 和 P 獲自 SCHOTT North America Inc.，Louisville，KY.40228。
[0059] 小鼠 IgG溶液、小鼠血清、山羊IgG溶液和山羊血清獲自Equitech-Bio, Inc.， Kerrville，TX. 78028。四甲基聯(lián)苯胺（TMB)微孔過氧化物酶底物系統(tǒng)來自Neogen Corporation, Lexington KY。FITC (異硫氰酸突光素 ）、AMCA (7-氨基-4-甲基香豆 素-3-乙酸）、Alexa Fluor? 350 以及 Dylight350 來自于 Invitrogen 和 Thermo Scientific。 細(xì)胞核染色所用的TO-Pro獲自Invitrogen。針對⑶36、⑶71和糖血型蛋白A的市售 抗體來自于Invitrogen。識別胎兒ε球蛋白的抗體來自于Fitzgerald Industries International (www. Fitzgeral-fii. com)。將所購抗體用檢測探針進行預(yù)標(biāo)記或使用廠商 的操作說明進行內(nèi)部標(biāo)記。
[0060] 用于進行FISH(突光原位雜交）的試劑和試劑盒來自于Aneu Vysion(www. abbottmolecular. com)。其他所有的化學(xué)試劑都是最高品質(zhì)的，獲自Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO 或 Amresco，Inc.，Solon，OH。八孔微量滴定（微孔）板和架是 Griner Internatl. , Germany 的產(chǎn)品。
[0061] 抗體
[0062] 分泌單克隆抗體4B9的雜交瘤克隆已保藏在德國微生物菌種保藏中心 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ,不倫瑞克 (fcaunschweig), Germany)，保藏登記號為 DSM ACC 2666,保藏日為 2004 年 7 月 13 日。
[0063] 抗-胎兒NRBC抗體可以是單克隆、多克隆或任意其他胎兒NRBC結(jié)合劑組合。對 由稀有細(xì)胞（例如胎兒NRBC)表達(dá)的各種表面和/或內(nèi)部抗原決定簇具有廣譜性或?qū)Ｓ行?結(jié)合親和力的適當(dāng)?shù)碾p位點"夾心式"細(xì)胞捕獲和檢測和/或鑒定結(jié)合伴侶可以用于本發(fā) 明的方法中。這些也可基于市售抗體及所報道的表達(dá)和特異性的配對選擇。例如，識別胎 兒NRBC的市售和專利抗體的清單包括但不限于與細(xì)胞表面分化標(biāo)記物簇（CD)，例如CD36、 ⑶71、⑶47反應(yīng)的抗體以及針對糖血型蛋白A、i_抗原和ε球蛋白的抗體。
[0064] 制備單克隆以及多克隆抗體的方法業(yè)已成熟[Harlow Ε.等人，1988Antibodies. New York，Cold Spring Harbor Laboratory]。可根據(jù)由 P.Tijssen 編著的業(yè)已成熟 的標(biāo)準(zhǔn)實驗室程序"Practice and Theory of Enzyme Immunoassays"（In Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Eds :R. H. Burdon 和 P. H. van Kinppenberg ;Elsevier Publishers Biomedical Division，1985)來制備單克隆抗體，其 基于 Kohler 和 Milstein 最初的技術(shù)（Kohler G. ,Milstein C.Nature256 :495,1975)。也 可通過本領(lǐng)域已知的其他方法來生產(chǎn)抗體，包括但不限于用特異性DNA進行免疫。
[0065] 對于配對抗體的選擇需要特別考慮的是，捕獲抗體（涂覆在固體支持物上）和檢 測抗體（與檢測標(biāo)記相連接）同時結(jié)合至在胎兒NRBC分化生物標(biāo)記物表面上表達(dá)的相同 或不同決定簇上的能力。胎兒NRBC捕獲/檢測結(jié)合伴侶也可包括抗體片段、嵌合抗體、人 源化抗體、通過對現(xiàn)存抗體進行重建而開發(fā)的抗體和細(xì)胞結(jié)合肽、合成抗體、合成結(jié)合劑、 重組抗體以及通過篩選噬菌體展示文庫和其他類似的表達(dá)和選擇系統(tǒng)所選擇的肽和蛋白 質(zhì)結(jié)合劑。
[0066] 可通過已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來產(chǎn)生針對整個胎兒NRBC、針對胎兒NRBC亞級分（例如分 離的細(xì)胞膜、分離的細(xì)胞核和分離的質(zhì)膜）；針對胎兒NRBC前體和/或胎兒干細(xì)胞；針對胎 兒細(xì)胞可溶性蛋白、肽和糖蛋白；針對其他相關(guān)抗原性分子的結(jié)構(gòu)已知或未知的多克隆或 單克隆抗體。其他的合適的免疫用抗原包括但不限于合成肽、專門設(shè)計的分子和胎兒NRBC 抗原模擬結(jié)構(gòu)?？衫脴?biāo)準(zhǔn)免疫和采血程序在多個物種中產(chǎn)生抗體，包括但不限于小鼠、大 鼠、兔、山羊、綿羊、驢、馬和雞?？赏ㄟ^業(yè)已成熟并廣泛使用的標(biāo)準(zhǔn)抗體純化方案來對動物 的采集血或雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基進行分級分離和純化。
[0067] 實施例
[0068] 無細(xì)胞 4B9ELISA
[0069] 本發(fā)明一個實施方式中的4B9ELISA包括將4B9抗體直接或間接涂覆在固體支持 物上，使用用辣根過氧化物酶體（HRPO)標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgM(Fab) 2來檢測結(jié)合的4B9， 并使用HRPO底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB)對反應(yīng)進行比色定量。然而在直接涂覆中，通過與檢 測抗小鼠抗體-HRPO綴合物溫育（0. 025ug/ml測定緩沖液；IOmM NaPO4, pH7. 4,含有8. 8g NaCl、0. 5g BSA、0. 5mL吐溫-20以及2. 5mL生物防腐劑proclin/L)來檢測4B9,而間接涂 覆則涉及將未標(biāo)記的或生物素化的4B9(10ug/mL)分別與二抗或用鏈親和素涂覆的支持物 預(yù)先溫育。
[0070] 通常，在幾乎相同的條件下（即抗體體積（50uL/反應(yīng)）、檢測緩沖液體積（IOOuL/ 反應(yīng)）和60分鐘振蕩或混合溫育），對微量滴定孔、試驗管中的磁性顆粒以及16孔分區(qū)組 件（Grace Bio labs)中的載玻片進行比較評估。在用ELISA洗滌緩沖液（0.05mM Tris， pH7. 4,含有0.05%吐溫-20)洗滌四次并加入檢測抗體-HRPO綴合物（lOOuL/測定）之后， 如上所述洗滌每個反應(yīng)支持物并與lOOuLTMB底物溫育10分鐘。在使用磁性顆粒和分區(qū)載 玻片的情況下，隨后將IOOuL反應(yīng)過的底物轉(zhuǎn)移至干凈的微量滴定孔中。接著向所有孔中 加入IOOuL/孔的終止溶液（0. 2M硫酸）并在450nm和620nm處進行對比性雙波長吸光度 測量。如上所述對涂覆在陪替氏培養(yǎng)皿或六孔組織培養(yǎng)平板上的抗體進行優(yōu)化和評估，除 了各種試劑所使用的體積更大。
[0071] 用于將抗體或鏈親和素涂覆在微量滴定孔或其它支持物上的通常程序如先前所 描述（31-34)。市售獲得的磁性顆粒大多用鏈親和素或抗-小鼠 IgM涂覆。根據(jù)生產(chǎn)商的 操作說明洗滌珠（25uL含有I X IO7個珠），并將其與濃度不斷增加的生物素化4B9或未標(biāo) 記的4B9抗體溫育。將結(jié)合珠的抗體重懸浮于IOOuL檢測緩沖液中并與IOOuL抗-小鼠 IgM-HRPO綴合物溫育，如上所述對反應(yīng)進行定量。根據(jù)先前公布的方法（31-34)或生產(chǎn)商 的操作說明將已經(jīng)被功能化以用于共價或非共價蛋白標(biāo)記的市售載玻片偶聯(lián)至抗體或鏈 親和素。為了整個活化表面的標(biāo)記，將載玻片固定在單孔載玻片組件（Grace Bio-lab)中 并與涂覆抗體或鏈親和素的4mL/載玻片溫育。對于比較性試驗，將載玻片劃分進16孔組 件中，并向每個孔加入IOOuL濃度增加的生物素化4B9或未標(biāo)記的4B9抗體。溫育和洗滌 之后，加入IOOuL/孔的抗小鼠 IgM-HRPO綴合物并如上所述對反應(yīng)進行定量。使用合適體 積的涂覆和封閉緩沖液如上所述將抗體或鏈親和素涂覆在陪替氏培養(yǎng)皿或六孔組織培養(yǎng) 平板上。對于比較性評估，如對于磁性顆粒和載玻片所描述，對廣泛使用的涂覆有鏈親和素 或第二抗體的透明八孔平板（Griner Bio-One, Microclon600高結(jié)合）進行類似的4B9結(jié) 合檢測。
[0072] 作為選擇，可以使用相同抗體或不同抗體對如上所述或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合 適的固體表面進行部分涂覆和單獨處理，使得被抗-胎兒細(xì)胞抗體捕獲的陽性細(xì)胞可以與 作為非特異性結(jié)合量度的被無關(guān)抗體捕獲的細(xì)胞進行對比。后者可以通過用例如正常小鼠 IgM或相當(dāng)?shù)姆翘禺愋约?xì)胞捕獲抗體（例如抗糖血型蛋白-A)包被預(yù)定的區(qū)段來完成。例 如，使用供應(yīng)商（例如Grace-Bio-Lab)提供的各種多孔玻片組件可以容易地將載玻片劃 分成兩個、四個或更多個區(qū)段/孔，并且所有的孔或孔的組合或載玻片的部分是用相同的 抗-胎兒細(xì)胞抗體或用特異性和非特異性（對照）抗體在獨立的孔中或載玻片的獨立部分 中進行涂覆。
[0073] 在某些實施方式中，對載玻片的預(yù)定區(qū)段或部分，或者對各種固相基質(zhì)上的微點、 微孔或以已知的SBS/ANSI形式存在的微陣列（例如96、384、1536等點陣列）進行涂覆。在 其他實施方式中，對整個固相表面上進行涂覆。具有電勢的預(yù)定涂覆區(qū)域可用于對分離的 基質(zhì)進行細(xì)胞定位、細(xì)胞鑒定和細(xì)胞移動/轉(zhuǎn)移的自動化和/或手動掃描。
[0074] 可利用例如由Arrayit Corporation所提供的用于涂覆顯微鏡載玻片（www. arrayit.com)的各種點微陣列打印裝置，或者通過對特殊制造的微板（例如那些可由 Curiox Biosystems (www. curiox. com)可得到的）上物理性產(chǎn)生的微陣列孔（96、384、1536 等）進行涂覆，來完成對各種表面的涂覆。涂覆有抗體的以標(biāo)準(zhǔn)SBS/ANSI兼容性微板形式 存在的微陣列點（或通過將涂覆的支持物置于SBS/ANSI兼容性載體中）極大地促進了各 個過程的自動化。通過將能夠進行液體處理、溫育以及洗滌的各種微板兼容性儀器與通過 各種物理和/或非接觸性方式（例如基于聲波的分散機或其它合適的手段）進行細(xì)胞染 色、可視化/鑒定和/或轉(zhuǎn)移以用于下游的染色體和基因分析的自動化能力相組合，可對后 者進行輔助。
[0075] 檢測抗體與HRPO的偶聯(lián)步驟如所述進行（31-34)。偶聯(lián)反應(yīng)涉及用Sulfo-SMCC 進行的酶活化和用已被2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷活化的抗-小鼠檢測抗體進行隨后的反應(yīng)。根 據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序來進行生物素-抗體偶聯(lián)（34)。
[0076] 對這種簡單的定量ELISA系統(tǒng)進行對比性評估，即評估4B9與（a)廣泛使用的液 相磁性顆粒，（b)廣泛使用的微量滴定孔以及（c)大表面固相支持物（例如顯微鏡載玻片、 陪替氏培養(yǎng)皿和大六孔組織培養(yǎng)平板）的結(jié)合特性。ELISA促進了對所公開的細(xì)胞分離技 術(shù)和平臺的演變具有重要意義的很多方面的快速發(fā)展、優(yōu)化和比較性評估，如果可能確定 的話，這是極其困難的。后者包括但不限于（1)，4B9在各種濃度（0.5-40ug/mL)下以及在 各種涂覆緩沖液（磷酸鹽，PH6. 5,磷酸鹽，pH8. 0,硼酸鹽，pH8. 5,碳酸鹽，pH9. 1)下對于各 種支持物的非共價（被動）或共價結(jié)合性質(zhì)的比較性評估；（2)，在各種濃度（l_40ug/ml) 下在上述緩沖液中涂覆到各種支持物上的抗-物種抗體（例如山羊抗-小鼠 IgM)的非共 價結(jié)合性質(zhì)和4B9結(jié)合能力；（3)用五種不同的生物素標(biāo)記制劑（見材料）以各種摩爾比 (10-400摩爾生物素/摩爾抗體）進行標(biāo)記的增加量的4B9抗體與各種市售的和/或人工 內(nèi)部涂覆鏈親和素的支持物的結(jié)合；以及（4)增加量的未標(biāo)記4B9與最佳涂覆的第二抗體 (例如，山羊抗-小鼠 IgM)與各種支持物的結(jié)合。
[0077] 細(xì)胞捕獲
[0078] 可使用標(biāo)準(zhǔn)非共價或共價結(jié)合方法將捕獲抗體非共價地涂覆于、共價地偶聯(lián)至或 連接至各種固相支持物上。該固體支持物可以是試管、珠、微粒、濾紙、各種膜、玻璃濾器、載 玻片、玻璃或硅芯片、磁性納米和微米顆粒、磁棒、磁套以及微流體、微電子和微磁性機械細(xì) 胞分離系統(tǒng)和設(shè)備、各種玻璃或塑料室，或其它的本領(lǐng)域已知的材料和支持物的形式。后者 也可包括各種用于插入至患者循環(huán)系統(tǒng)以進行體內(nèi)細(xì)胞采集的醫(yī)療儀器。
[0079] 細(xì)胞釋放
[0080] 涂覆有特異性抗體、親和素、鏈親和素或其修飾物，或抗-物種抗體以及親和結(jié)合 劑（例如蛋白-A或蛋白-G)的微米顆粒和納米顆粒在細(xì)胞分離領(lǐng)域占據(jù)主導(dǎo)地位。這些 方法通常包括具有期望特異性的鏡磁性標(biāo)記的抗體，將磁性化的抗體與靶標(biāo)樣品（例如母 體血液）進行溫育，以及當(dāng)將強磁體放置于溫育室外面時保留靶標(biāo)細(xì)胞（正向選擇）或不 期望的細(xì)胞（負(fù)向選擇）（18)。
[0081] 盡管免疫磁性細(xì)胞分選（MACS)方法相對便利、便宜并且易于操作，但據(jù)報道該技 術(shù)傾向于具有幾個顯著的局限性，包括低效、低產(chǎn)率、細(xì)胞俘獲、珠與珠之間的相互作用或 凝聚、細(xì)胞損傷、不一致性以及與免疫染色方法之間存在自動熒光干擾。為了改進其性能， 已經(jīng)采用了幾種也傾向于導(dǎo)致顯著誤差、細(xì)胞損失和不一致性的樣品預(yù)處理富集方法（過 濾、密度梯度分離、差別化細(xì)胞裂解或具有或不具有負(fù)向免疫選擇的基于大小的分離）（18， 23,29)〇
[0082] 已經(jīng)開發(fā)出了通過在顆粒和所采用的抗體之間引入可切割性連接以將捕獲的細(xì) 胞從磁性顆粒上分離下來的策略。涉及可取代的生物素標(biāo)記或通過競爭性抗體解離抗體 的替代性策略也已經(jīng)被開發(fā)出并能市售得到（Invitrogen ;Miltenyi Biotech ;Stem cell technologies)〇
[0083] 抗體4B9與可切割（二硫鍵連接）的生物素（例如Sulfo-NHS-SS和 NHS-SS-PG12-生物素）、包含在Invitrogen Biotin結(jié)合劑試劑盒中的DXB-X-生物素以及 Invitrogen CELLectin試劑盒聯(lián)合使用。在將4B9偶聯(lián)至鏈親和素涂覆的孔中或相應(yīng)的試 劑盒提供的磁性顆粒上之后，將固體支持物-4B9復(fù)合體與濃度增加的切割或置換試劑溫 育30分鐘。接著洗滌固體支持物，并使用上述的無細(xì)胞4B9ELISA進行反應(yīng)。通過將經(jīng)處 理測試中剩余的信號以及未處理的對照測試中產(chǎn)生的總信號進行比較，可容易地確定出 抗體釋放系統(tǒng)的效率。
[0084] 捕獲細(xì)胞的檢測和鑒定
[0085] 用于檢測捕獲細(xì)胞的抗體能夠用于細(xì)胞檢測及鑒定的雙重目的。后者是可能的， 具體是通過使用兩步免疫反應(yīng)步驟（31-35)，其中由特異性抗體捕獲靶標(biāo)分子，隨后進行洗 滌步驟以除去未附著的分子，并利用特異性/或非特異性檢測抗體對特異性捕獲的分子進 行檢測。在兩步捕獲/檢測形式中，特異性捕獲的血液分子可被非特異性或廣泛反應(yīng)性的 檢測抗體所檢測這一事實（36)，是本發(fā)明方法的優(yōu)點與靈活性的進一步證明，這是由于利 用非特異性細(xì)胞檢測抗體也可準(zhǔn)確地檢測特異性捕獲的細(xì)胞。
[0086] 通過從母體血液中捕獲胎兒細(xì)胞，洗滌以除去未附著的細(xì)胞，并用特異性和/或 非特異性檢測抗體檢測捕獲的細(xì)胞，研究了上述構(gòu)想在胎兒NRBC分離中的應(yīng)用。在一系列 的兩步法"夾心式"平行實驗中，由固相4B9抗體所捕獲的胎兒NRBC在洗滌之后，用經(jīng)標(biāo)記 的4B9或者用廣泛識別表達(dá)于各種胎兒甚至母體血液細(xì)胞上的表面標(biāo)記物的另一種經(jīng)標(biāo) 記抗體（例如與GPH-A、⑶36、⑶71或⑶47具有反應(yīng)性的抗體）進行檢測。在第二次洗滌 步驟之后，還針對ε-球蛋白對分離的細(xì)胞進行染色并在顯微鏡分析。在所有情況中，還對 用檢測抗體染色的分離細(xì)胞進行ε -球蛋白染色，證實了該技術(shù)的特異性并將特異性捕獲 /檢測的細(xì)胞鑒定為胎兒原始NRBC。由于ε-球蛋白僅對原始胎兒細(xì)胞具有特異性（17， 20,22)并且4Β9對于原始和成熟細(xì)胞均具有特異性，檢測出未被ε-球蛋白染色的胎兒細(xì) 胞是可能的。然而，在妊娠一期的母體血液中，原始NRBC是占據(jù)優(yōu)勢地位的細(xì)胞類型，一直 到妊娠12周（20)。
[0087] 利用檢測抗體對4Β9捕獲胎兒細(xì)胞進行表面染色以及利用ε -球蛋白抗體進行細(xì) 胞質(zhì)染色的結(jié)果一致，這具有重大的意義。這個觀察結(jié)果第一次證實和確認(rèn)利用簡單的兩 步法夾心式方法能夠?qū)ρh(huán)稀有細(xì)胞進行有效地捕獲、檢測和鑒定，以提供高度靈敏、特異 性和可再現(xiàn)的用于對循環(huán)血液分子進行定量的免疫測定。
[0088] 檢測抗體可以直接偶聯(lián)到報告分子上或通過次級檢測系統(tǒng)間接檢測。后者可能 基于幾種不同原理的任意一個或組合，所述原理包括但不限于經(jīng)抗體標(biāo)記的抗-物種抗體 以及其他形式的免疫學(xué)或非免疫學(xué)橋接和信號擴增系統(tǒng)（例如生物素-鏈親和素技術(shù)，蛋 白-A和蛋白-G介導(dǎo)的技術(shù)或核酸探針/抗-核酸探針等）。用于直接或間接抗體偶聯(lián)的 標(biāo)記可以是任意的已報道的可檢測分子。合適的報告分子可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的 免疫細(xì)胞化學(xué)、分子生物學(xué)、光學(xué)、熒光以及電子顯微鏡、細(xì)胞免疫分型、細(xì)胞分選、流式細(xì) 胞術(shù)、細(xì)胞可視化、檢測、計數(shù)和/或信號輸出定量領(lǐng)域所已知的那些。
[0089] 合適的標(biāo)記的實例包括但不限于突光團、發(fā)光標(biāo)記、金屬復(fù)合體、放射性同位素、 生物素、鏈親和素、酶或其他檢測標(biāo)記及標(biāo)記的組合，例如酶和發(fā)光底物。合適的酶及其底 物的示例包括堿性磷酸酶、辣根過氧化酶、β -半乳糖苷酶、螢光素酶以及本領(lǐng)域已知的其 他檢測系統(tǒng)。可以標(biāo)記并同時或依次使用一種以上具有特異性和/或非特異性的抗體，以 增強細(xì)胞檢測、鑒定和/或特異性。在此應(yīng)用中，用本領(lǐng)域已知的具有不同且可區(qū)分的信 號輸出性質(zhì)、檢測信號、光譜或熒光發(fā)射光譜的不同標(biāo)記對每個抗體進行標(biāo)記。在免疫細(xì) 胞化學(xué)和細(xì)胞檢測顯微術(shù)領(lǐng)域中廣泛使用的合適標(biāo)記的實例包括但不限于FITC(異硫氰 酸突光素 ）、AMCA (7_ 氛基 _4_ 甲基香?素-3_ 乙酸）、Alexa Fluor488、Alexa Fluor594、 Alexa Fluor350、DyLight350、藻紅蛋白、別藻藍(lán)蛋白。用于檢測細(xì)胞核的染色劑包括 Hoechst33342、LDS751、TO-PRO 和 DAPI。
[0090] 胎兒NRBC分離免疫測定
[0091] 根據(jù)本發(fā)明一個實施方式的胎兒NRBC分離檢驗提供了雙位點"夾心式"免疫測 定，以第一溫育步驟、洗滌和第二溫育步驟的兩步法"順序"過程來實施。在該檢驗中，將 合適量的洗滌過的全血加入到用4B9直接或間接（通過鏈親和素或二抗）預(yù)先涂覆的盤 (IOmL/盤）、6孔組織培養(yǎng)平板（3mL/孔）或載玻片（IOmL/塑料載玻片容器中的2片載 玻片）中，并在持續(xù)不斷地輕微混合下溫育60分鐘。溫育之后，輕輕吸出血液，用合適量 的PBS(GIBC0 DPBS)洗滌溫育室或載玻片五次。接著用適當(dāng)稀釋的檢測抗體4B9或任意 其他鏡適當(dāng)標(biāo)記的胎兒NRBC鑒定檢測抗體如上所述進行溫育。如上溫育和洗滌之后，分 離的細(xì)胞準(zhǔn)備進一步進行處理。根據(jù)所建立和報道的程序（20, 22, 23)，此過程的示例包括 但不限于固定、透化和免疫探測胎兒NRBC鑒定標(biāo)記物（例如ε-球蛋白）以及細(xì)胞核復(fù) 染色。作為選擇，可以利用所建立的方法（21，37)和從供應(yīng)商處購買得到的試劑（例如， AneuVysion (www. abbottmolecular. com))，通過FISH (突光原位雜交）對細(xì)胞進行染色體 分析，以指示特異性的染色體和基因異常。
[0092] 也可通過顯微操作或通過將整個細(xì)胞群從基質(zhì)或支持物上剝離來除去細(xì)胞，以根 據(jù)易于利用和已知的方法來進行下游的染色體、分子和基因測序技術(shù)。后者包括但不限 于檢測非整倍體（21、18、13、X和Y)的FISH、用于非整倍體的QF-PCR、Array-CGH或利用 幾個商業(yè)公司的廣泛使用的市售試劑、試劑盒和設(shè)備的用于檢測基因突變或多態(tài)性的基因 組測序，其中。實例包括 BioReferenc Laboratories、Abbott，s Aneuvysion、GenomeDX、 Gen-Probe、Signature Labs、Ambry Genetics、Invitrogen、Beckman、Bio-Rad、Molecular Devices、Applied Biosciences 和 Illumina Inc〇
[0093] 米集在EDTA管中的全血（母體血液/非妊娠出血/雄性血）于2000rpm(Beckman Allegra)下離心10分鐘。棄去血漿級分，并將細(xì)胞層以1+2體積比重懸浮于緩沖液#1中 (不含Ca 2+和Mg2+的PBS，具有0. 1 % BSA、5mMEDTA、2. 5% FC受體阻遏物），輕輕混勻，并如 上所述進行離心。重新洗滌細(xì)胞層2次，并在使用前重懸浮至原血體積。
[0094] 利用發(fā)表的方法（31)用抗體或蛋白以10ug/mL涂覆緩沖液（50mM硼酸鈉，PH8. 5) 的濃度對固體支持物進行涂覆。簡而言之，將支持物與適量體積的涂覆捕獲抗體或蛋白 質(zhì)溶液在室溫下溫育過夜。隨后洗滌經(jīng)涂覆支持物一次：支持物洗滌緩沖液（IOmM KP04， pH7. 4)，并在適當(dāng)體積的封閉溶液（具有1 % BSA的洗滌緩沖液）中溫育1小時。在使用 前，用洗滌緩沖液洗滌一次或者在封閉緩沖液中儲藏于4°C最多1周?？梢詫⒖贵w或蛋白 質(zhì)涂覆在各種支持物上，并以即時使用的干燥形式提供。利用購自幾家商業(yè)公司（例如 Invitrogen (www. invitrogen. com)和 Thermo Scientific (www. piercenet. com))的試劑和 試劑盒，可以容易地進行4B9檢測抗體以及其他合適的檢測和/或驗證抗體與各種熒光探 針（例如FITC)的偶聯(lián)。
[0095] 細(xì)胞染色和分析方法
[0096] 細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的免疫熒光、免疫酶促和細(xì)胞化學(xué)染色的方法目前業(yè)已 成熟并且普遍市售的。這包括根據(jù)已建立和報道的程序（20,22,23)進行固定、透化、對胎 兒NRBC鑒定標(biāo)記物（例如⑶抗原、GPH-A、I抗原和胎兒ε -球蛋白）進行探測以及進行 細(xì)胞核復(fù)染色。通過FISH進行染色體染色的技術(shù)也是業(yè)已成熟的（21，37)，市售的試劑和 試劑盒也是普遍可獲得的[AneuVysion(www. abbottmolecular. com)]。用于下游基因和/ 或分子測試的技術(shù)也可普遍獲得。后者包括但不限于用于非整倍體的QF-PCR、Array-CGH 或利用可普遍獲得的市售試劑、試劑盒和設(shè)備對于所有基因畸形的基因組測序。
[0097] 在本發(fā)明的一個實施方式中，根據(jù)已建立的方法，利用用DyLight350或Alexa Fluor350標(biāo)記的單克隆抗體對4B9捕獲的細(xì)胞進行胎兒ε -球蛋白染色。簡而言之，在完 成洗滌步驟之后，用冰冷的甲醇（_20°C )固定捕獲的細(xì)胞10分鐘，并利用4%甲醛在室溫 下固定10分鐘。洗滌之后，細(xì)胞用〇. 1 % Triton X-100于PBS中透化（室溫下5分鐘）， 用PBS中的1% BSA封閉，并在相同的緩沖液中與經(jīng)標(biāo)記的抗ε -球蛋白抗體溫育（室溫下 2小時或4°C下過夜）。對于細(xì)胞核的復(fù)染色，加入合適體積的PBS中的4uMT0-PR0-l溶液， 用箔片蓋住溫育反應(yīng)，室溫下溫育10分鐘。隨后，用PBS洗滌細(xì)胞一次并進行分析。按照制 造商的試劑和試劑盒使用說明來進行染色體FISH (AneuVysion，見www. abbottmolecular. com)。
[0098] DNA 分離和 PCR
[0099] 對3毫升全血進行雙離心，在4°C下于1500rpm離心10分鐘，隨后于3700rpm離 心10分鐘。使用QIAamp小試劑盒（Qiagen)按照廠商的說明從血楽中分離不含細(xì)胞（CFF) 的胎兒DNA。取10微升用于Y染色體確定。對于基因組DNA分析，將捕獲的細(xì)胞從分離平 臺中剝落到DPBS中，轉(zhuǎn)移到離心管中，并于5000rpm離心5分鐘，將細(xì)胞球團匯集到一個管 中。離心之后，將細(xì)胞球團重懸浮于21uL的5mM Tris，pH8. 0中，通過三個冷凍/解凍循環(huán) 裂解。使用 ChelexlOO (Sigma Chemical Co, St. Louis，MO)分離基因組 DNA 并重懸浮于 5mM Tris，pH8.0中。利用ABI St印OnePlus RT-PCR系統(tǒng)根據(jù)廠商的操作說明對SRY、DYS14和 β -肌動蛋白進行實時PCR(RT-PCR)。SRY的引物和探針的序列為：
[0100] 正向引物：5' -TGGCGATTAAGTC AAATTCGC-3'
[0101] 反向引物：5，-CCCCCTAGTACCCTGACAATGTATT-3，；以及
[0102] 檢測探針：5，-(FAM)AGCAGTAGAGCAGTCAGGGAGGCAGA(BHQl)-3，
[0103] DYS14的引物和探針的序列為：
[0104] 正向引物：5' -CATCCAGAGCGTCCCTGG-3，
[0105] 反向引物：5' -TTCCCCTTTGTTCCCCAAA-3'
[0106] 檢測探針：5，- (HEX) CGAAGCCGAGCTGCCCATCA (BHQ) -3 '
[0107] 肌動蛋白的引物和探針的序列為：
[0108] 正向引物：5，-GCGCCGTTCCGAAAGTT-3，
[0109] 反向引物：5，-CGGCGGATCGGCAAA-3，；以及
[0110] 檢測探針：5，-NED-ACCGCCGAGACCGCGTC(MGB)-3 ' (De Kok JB, Wiegerinck ET, Giesendorf BA, Swinkels Dff. 2002Rapid genotyping of single nucleotide polymorphisms using novel minor groove binding DNA oligonucleotides(MGB probes). Hum Mutatl9 :554-559) ICR 程序是 50°C 2 分鐘，95°C 10 分鐘，50 個循環(huán)的 95°C 15 秒和60°C I分鐘。所有的分析進行三個重復(fù)，在所有重復(fù)中，Ct (循環(huán)閾值）< 40被認(rèn)為 是陽性的。
[0111] 分離的可再現(xiàn)性
[0112] 由于較高的分離效率及使用便利性，隨后的分離涉及用4B9Ab直接涂覆的陪替氏 培養(yǎng)皿。
[0113] 表1 :從血樣中分離胎兒原始成紅細(xì)胞

【權(quán)利要求】
1. 從哺乳動物的生物液體中分離或富集稀有細(xì)胞的方法，所述方法包括： (i) 提供固定在基質(zhì)上的抗體，所述基質(zhì)例如大平板、陪替氏培養(yǎng)皿、孔、微孔、載玻片、 條、桿、珠或微陣列板或微陣列載玻片，其中所述抗體結(jié)合所述稀有細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原； (ii) 使固定化的抗體與生物液體樣品接觸，其中體液包含所述稀有細(xì)胞和多種其他細(xì) 胞； (iii) 將固定化的抗體與體液樣品在適合于所述抗體與所述稀有細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原 結(jié)合的條件下溫育，以形成抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體；以及 (iv) 洗滌所述抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體，以除去未結(jié)合的細(xì)胞并提供固定化的抗體-稀 有細(xì)胞復(fù)合體。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗體對胎兒細(xì)胞表面抗原是特異性的。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述胎兒細(xì)胞表面抗原是胎兒有核紅細(xì)胞抗原。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述抗體是抗體4B9。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物液體是血液、血漿、羊水、尿液或來自絨毛 膜絨毛取樣（CVS)活組織檢查的細(xì)胞懸浮液。
7. 對生物液體中的稀有細(xì)胞進行檢測的方法，所述方法包括： (i) 提供固定在基質(zhì)上的第一抗體，其中所述第一抗體結(jié)合所述稀有細(xì)胞的第一細(xì)胞 表面抗原； (ii) 使固定化的第一抗體與生物液體樣品接觸，其中體液包含所述稀有細(xì)胞和多種其 他細(xì)胞； (iii) 將固定化的第一抗體與體液樣品在適合于所述第一抗體與所述稀有細(xì)胞的第一 細(xì)胞表面抗原結(jié)合的條件下溫育，以形成第一抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體； (iv) 洗滌所述第一抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體，以除去未結(jié)合的細(xì)胞并提供分離的第一抗 體-稀有細(xì)胞復(fù)合體； (V)將所述第一抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體與結(jié)合所述稀有細(xì)胞的第二細(xì)胞表面抗原的第 二抗體在適合于所述第二抗體與所述第二細(xì)胞表面抗原結(jié)合的條件下溫育，以形成第一抗 體-稀有細(xì)胞-第二抗體復(fù)合體；以及 (Vi)檢測所述第一抗體-稀有細(xì)胞-第二抗體復(fù)合體中的所述第二抗體，從而檢測所 述體液樣品中所述稀有細(xì)胞的存在。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述生物液體是血液、血漿、羊水、尿液或來自絨毛 膜絨毛取樣（CVS)活組織檢查的細(xì)胞懸浮液。
9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述第一抗體對胎兒細(xì)胞表面抗原是特異性的。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述第一抗體是抗體4B9。
11. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述第二抗體對胎兒細(xì)胞表面抗原是特異性的。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述第二抗體對胎兒e-球蛋白、⑶36、⑶71或 ⑶47是特異性的。
13. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述第一抗體對⑶36、⑶71或⑶47是特異性的。
14. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述第二抗體是抗體4B9。
15. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中通過將所述第一抗體-稀有細(xì)胞-第二抗體復(fù)合 體與特異性結(jié)合所述第二抗體的帶有可檢測性標(biāo)記的第三抗體在適合于抗體結(jié)合的條件 下溫育，以形成第一抗體-稀有細(xì)胞-第二抗體-第三抗體復(fù)合體；洗滌所述抗體-稀有細(xì) 胞-第二抗體-第三抗體復(fù)合體；檢測所述帶有可檢測標(biāo)記的第三抗體；從而檢測所述樣 品中的所述稀有細(xì)胞。
16. 對生物液體中的稀有細(xì)胞進行檢測的方法，所述方法包括： (i) 提供固定在基質(zhì)上的第一抗體，其中所述第一抗體結(jié)合所述稀有細(xì)胞的第一細(xì)胞 表面抗體； (ii) 使固定化的第一抗體與生物液體樣品接觸，其中體液包含所述稀有細(xì)胞和多種其 他細(xì)胞； (iii) 將固定化的第一抗體與所述體液樣品在適合于所述抗體與所述稀有細(xì)胞的細(xì)胞 表面抗原結(jié)合的條件下溫育，以形成第一抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體以及多種未結(jié)合的細(xì)胞； (iv) 洗滌所述第一抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體，以除去所述未結(jié)合的細(xì)胞； (v) 裂解所述第一抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體中的稀有細(xì)胞，以形成包含稀有細(xì)胞特異性 核酸序列的裂解物，并將裂解的細(xì)胞和與所述稀有細(xì)胞特異性核酸序列互補的核酸探針在 適合于所述核酸探針與所述稀有細(xì)胞特異性核酸序列雜交的條件下溫育，以形成雙鏈復(fù)合 體；以及 (vi) 檢測所述雙鏈復(fù)合體，從而檢測所述體液樣品中所述稀有細(xì)胞的存在。
17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述生物液體是人的體液。
18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述生物液體是血液、血漿、羊水、尿液或來自絨 毛膜絨毛取樣（CVS)活組織檢查的細(xì)胞懸浮液。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述稀有細(xì)胞是胎兒細(xì)胞。
20. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中通過熒光原位雜交（FISH)來檢測所述雙鏈復(fù)合 體。
21. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述稀有細(xì)胞特異性核酸序列是染色體異常的表 征。
22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述染色體異常是單基因異常。
23. 如如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述稀有細(xì)胞特異性核酸序列是患癌傾向的表 征。
24. 用于從生物液體中捕獲、檢測和分離稀有細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包括： (i) 固定在基質(zhì)上的第一抗體，其中所述抗體對于所述稀有細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原是特 異性的；以及 (ii) 以及適合于抗原抗體結(jié)合的緩沖溶液。
25. 估算每單位來自哺乳動物的生物液體中的稀有細(xì)胞數(shù)量的方法，其中所述方法包 括： (i) 提供固定在基質(zhì)上的抗體，其中所述抗體結(jié)合所述稀有細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原相； (ii) 使固定化的抗體與已知單位的生物液體樣品接觸，其中體液包含多種稀有細(xì)胞和 多種其他細(xì)胞； (iii) 將所述固定化的抗體與所述單位的體液樣品在適合于所述抗體與所述稀有細(xì)胞 的細(xì)胞表面抗原結(jié)合的條件下溫育，以形成抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體； (iv)洗滌所述抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體，以除去未結(jié)合的細(xì)胞，并提供固定化的抗體-稀 有細(xì)胞復(fù)合體；以及 (V)檢測所述樣品中固定化的抗體-稀有細(xì)胞復(fù)合體的數(shù)量，從而估算每單位所述生 物液體樣品中稀有細(xì)胞的數(shù)量。
【文檔編號】G01N33/68GK104364389SQ201280056066
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月14日
【發(fā)明者】J·科霍斯羅維, L·H·凱爾納, H·班娜妮 申請人:科勒本斯公司