專利名稱：用于制備液體中的細胞和/或顆粒的單元和裝置以及用于顯微鏡分析的方法
用于制備液體中的細胞和/或顆粒的單元和裝置以及用于
顯微鏡分析的方法本發(fā)明涉及在液體中含有的貼壁細胞或非貼壁細胞和/或顆粒的制備。對于觀察在液體中含有的生物細胞，制備單元在藥物工業(yè)中是熟知的。例如，此類 制備單兀在來自公司 Thermo Fisher Scientific Inc. , 81 Wyman Street, Waltham,美國以 名稱“Shandon EZ Single Cytofunnel”是可得到的。該單元包括忙藏室、過濾卡(filter card)和光學載玻片。對應的過濾卡由高吸收性材料制備，并在中心具有孔。通常，過濾卡與載玻片鄰近 排列，以使過濾卡的孔限定載玻片上的沉積區(qū)域。因此，該沉積區(qū)域被過濾卡的高吸收性材 料圍繞。最初，將含細胞的液體保持在與載玻片分離的貯藏室中。在將制備單元放置在例 如,“Shandon Cytospin 4 Cytocentrifuge”中的專用離心機后，并以一定的速度旋轉(zhuǎn)制備 單元時，旋轉(zhuǎn)作用斜置制備單元，從而通過過濾卡中的孔，將含細胞的液體從貯藏室釋放到 載玻片上的沉積區(qū)域。一旦含細胞的液體達到沉積區(qū)域，該液體將通過過濾卡的高吸收性 材料除去，將細胞留在載玻片的沉積區(qū)域。然后可以將玻璃板與制備單元分離并進一步用 于細胞的顯微鏡觀察。盡管上述離心機可以同時處理12個制備單元，但期望的是更有效且高效的制備 單元和/或制備裝置。因此，本發(fā)明的目的是提供用于高效地、可靠地且高質(zhì)量地制備液體中含有的細 胞和/或顆粒的制備單元、制備裝置和方法。根據(jù)本發(fā)明，該任務通過根據(jù)各個獨立權(quán)利要求的制備單元、制備裝置和方法解 決。在從屬權(quán)利要求中描述了根據(jù)本發(fā)明的制備單元和制備裝置的其他實施方案。具體而言，本發(fā)明涉及用于制備在液體中含有的細胞和/或顆粒的單元，其包括 經(jīng)配置用于儲存含細胞和/或顆粒的液體，并在應用預定的外力，特別是離心力時，通過出 口釋放儲存的含細胞和/或顆粒的液體的貯藏室。通道與貯藏室的出口鄰近排列，貯藏室 的出口通向通道。通道具有比出口的橫截面更大的橫截面。從出口過渡到通道處的壁形成 了邊緣。該單元還包括用于接收釋放的含細胞和/或顆粒的液體的觀察構(gòu)件，以及在通道 和觀察構(gòu)件之間與觀察構(gòu)件鄰近排列的吸收裝置(absorbing means)。該吸收裝置具有孔， 其允許含細胞和/或顆粒的液體通過孔流到觀察構(gòu)件上。該吸收裝置還從觀察構(gòu)件上的含 細胞和/或顆粒的液體中除去液體，以使細胞和/或顆粒留在觀察構(gòu)件上用于觀察。根據(jù) 本發(fā)明的制備單元是用于劃算地、可靠地且高質(zhì)量地制備細胞，特別是非貼壁細胞或者液 體中原本含有的其他顆粒的小型且簡單的單元。在不需要應用任何額外的外力的情況下，抵抗作用于液體的重力，將液體以懸掛 狀態(tài)儲存于貯藏室中。這通過粘附力和/或表面張力實現(xiàn)，所述粘附力和/或表面張力可 以通過貯藏室或者其出口的合適形狀有利地影響。因此，該液體可以可靠地維持在貯藏室 中，從而防止在從貯藏室中釋放液體前，該液體與吸收裝置不受控制地接觸。此外，確保細胞和/或顆粒的小心處理。降低或者完全避免制備期間的損傷，導致了細胞死亡率和/或顆粒變形的減少。此外，避免了細胞的堵塞，從而對于多種制備物，提 供了高度可重復的結(jié)果。在平行進行含細胞或者顆粒的多種液體的處理的情況下，如果通 過多孔板提供多個制備單元，那么這是特別有利的。此外，使用根據(jù)本發(fā)明的制備單元，可以在均一條件下，在貯藏室中維持的液體中 沉淀細胞和顆粒。在釋放具有細胞和顆粒的液體期間，該沉淀基本上保持不變。因此，分布 在沉積區(qū)域上的所得細胞是非常均勻的。均勻分布是有利的，因為它們提供了好的觀察條 件，特別是對于自動圖像分析。作為實例，根據(jù)本發(fā)明的單元可以在藥物工業(yè)中用于制備細胞和/或顆粒。通過在貯藏室的出口處排列的邊緣，借助于粘附力和/或表面張力，增強了貯藏 室中液體的保留。因此，在沒有應用額外的外力的情況下，液體可以以貯藏室的任一方向可 罪地維持在It減室中。對于非貼壁細胞與觀察室的附著，離心處理是特別有利的，因為可以避免使用粘 著性化學物。粘著性化學物具有風險，它們可能改變細胞的誘導狀態(tài)，例如，通過與胞外基 質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用。在根據(jù)本發(fā)明的單元的第一個實施方案中，出口和通道之間過渡處邊緣的壁包括 90度的角度。此種過渡是容易生產(chǎn)的。然而，其他形狀的過渡也是可能的，例如交錯形或者 包括除90度以外的角度的邊緣。該角度可以是這樣的尺寸，以提供液體的特性與形成邊緣的壁的材料的特性之間 的良好匹配。例如，對于具有高螺動能力(creeping capability)的液體，邊緣可以具有峰 的形狀(the shape of a peak),即其可以包括小于90度的角度。在根據(jù)本發(fā)明的制備單元的其他實施方案中，貯藏室包括圓頂形或者漏斗形部分 以及鄰接圓頂形或者漏斗形部分的圓柱形部分。在根據(jù)本發(fā)明的制備單元的其他實施方 案中，貯藏室經(jīng)構(gòu)造以含有預定體積的含細胞和/或顆粒的液體，其中預定體積為1 Ul至 1000 u 1之間，特別地10 ill至100 ill之間，和特別地50 ill。其是在藥物工業(yè)中通常使用 的量，其中將處理少量的液體制備物。在根據(jù)本發(fā)明的制備單元的其他實施方案中，貯藏室包括在貯藏室的出口對面末 端處排列的通風口。這允許在離心期間從貯藏室中小心且均一地釋放所儲存的液體。通過 通風口，將釋放的液體所留下的空間用氣體，例如空氣填充。因此，可以防止由于液體的非 均一或者不小心釋放造成的對在液體中含有的細胞或者顆粒的任何不利影響。此外，對于裝填貯藏室，可以通過該通風口將含細胞和/或顆粒的液體有利地分 配到貯藏室中。具體而言，其可以這樣實現(xiàn)，將含具有細胞和/或顆粒的液體的移液器的開 口端放置在通風口周圍的壁上，并然后將壓力應用于移液器中含有的液體，以使液體經(jīng)通 風口流向貯藏室。隨著貯藏室的壁被液體浸濕，含細胞和/或顆粒的液體被吸入到貯藏室 中。制備單元可以是預裝配的，即通過將貯藏室與吸收裝置和/或觀察室組合，并然后借助 于移液機器人用液體裝填貯藏室。然而，應當提及，盡管優(yōu)選的是通過通風口裝填貯藏室， 但還可以從相反端裝填貯藏室。在根據(jù)本發(fā)明的制備單元的其他實施方案中，觀察室是用于光學觀察的載片。具 體而言，用于光學觀察的載片是透明的載片，例如，載玻片如顯微鏡載片，并且可以是包被 的或者未包被的。
在根據(jù)本發(fā)明的制備單元的其他實施方案中，吸收裝置包括濾紙。濾紙?zhí)峁┝烁?的吸收能力并且相對便宜。當然，也可以使用除濾紙外的吸收裝置。在根據(jù)本發(fā)明的制備單元的其他實施方案中，圍繞在孔周圍的吸收裝置部分具有 預定的厚度，以實現(xiàn)對液體的預定吸收速度。吸收速度是可以控制的參數(shù)，以允許細胞和/ 或顆粒停留在觀察構(gòu)件上，而不是隨移向并進入吸收裝置的液體一起移走。吸收裝置可以具有臺階形狀(st印-shape)，以使其包括直接與孔鄰近的內(nèi)區(qū)域， 在內(nèi)區(qū)域吸收裝置是壓縮的，以控制吸收速度，還包括內(nèi)區(qū)域周圍的外區(qū)域，在外區(qū)域吸收 裝置是未壓縮的，并具有高的吸收能力。這使得能夠控制吸收速度以及除去大量的液體，并 且還能在鄰近排列單元的情況下防止交叉污染。優(yōu)選地，與孔鄰近的吸收裝置的表面是平坦的、水平的、平滑的或者光滑的，并且 沒有任何纖維泄露到孔中或者觀察構(gòu)件上的區(qū)域中，其中細胞沉積在所述孔或區(qū)域。這提 供了制備方法的高度可再現(xiàn)性。可以塑造貯藏室的出口通往的通道，以形成另外的邊緣，其在單元的組裝時使吸 收裝置施壓于觀察構(gòu)件，以防止吸收裝置與觀察構(gòu)件之間的間隙。這防止了細胞和/或顆 粒從觀察構(gòu)件上的沉積區(qū)域中逸出，并且還防止了鄰近排列的單元之間的交叉污染。在根據(jù)本發(fā)明的制備單元的其他實施方案中，孔周圍的吸收裝置的壁部分是向觀 察構(gòu)件預彎曲的，以致在單元的組裝時，該部分可以與觀察構(gòu)件緊密連接。在這種構(gòu)造的情 況下，避免了觀察構(gòu)件與吸收裝置之間的間隙。本發(fā)明還涉及包括如上所述的多個獨立制備單元的制備裝置，其中獨立單元對于 交叉污染是互相分離的。用這種裝置，可以平行進行多個制備，從而能夠進行細胞和/或顆 粒的自動化高通量制備、觀察和/或分析。根據(jù)本發(fā)明的制備裝置的一個實施方案包括96孔板或者384孔板，其中多個獨立 單元的貯藏室分別由96孔板或者384孔板的孔形成。其具有這樣的優(yōu)點，獨立單元的貯藏 室組合在緊湊的標準孔板中，所述緊湊的標準孔板具有孔間的標準化距離，并具有標準化 的足跡(foot-print)，使得可以通過此類多孔板的標準裝置非常有效地處理它們。例如，可 以同時裝填該平板的各個孔的全部貯藏室。在其他實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的制備裝置包括形成獨立單元的觀察構(gòu)件的觀察 板。因此，可以共同地處理獨立單元的觀察構(gòu)件，以通過自動化圖像分析提供有效的觀察。在其他實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的制備裝置包括形成獨立單元的吸收裝置的第一 和第二吸收層，其中第一吸收層與觀察板直接鄰近地排列并與觀察板接觸，并且其中第二 吸收層在遠離觀察板的側(cè)面上與第一吸收層鄰近排列并與第一吸收層接觸。第二吸收層具 有的吸收能力增加了第一吸收層的吸收能力(例如，第二吸收層的吸收能力可以高于第一 吸收層的吸收能力)。其具有這樣的優(yōu)點，可以增加吸收的液體的總量，并改進了各個制備 細胞的相互分離，從而降低了交叉污染的風險。在其他實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的制備裝置包括用將各個壓縮力施加于獨立單元 的彈簧板，以實現(xiàn)各個吸收裝置與各個觀察構(gòu)件的緊密連接。該壓縮力將吸收裝置牢牢地 壓在觀察構(gòu)件上，以防止間隙(參見上文)。此外，壓縮還補償了第一吸收層的厚度的個體變化。在根據(jù)本發(fā)明的制備裝置的其他實施方案中，彈簧板包括對應于獨立單元的數(shù)目的多個螺旋形彈簧。每一螺旋形彈簧作用于一個獨立單元。這導致將各個壓力應用于每一 獨立制備單元，觀察板的各個部分擠壓向各個貯藏室，各個吸收裝置排列其間。螺旋形彈簧 例如，可以是圓錐形的。本發(fā)明還涉及用于制備在液體中含有的細胞(特別是但并非僅僅是非貼壁細胞) 的方法，包括步驟將含細胞的液體分配到貯藏室中；僅通過粘附力和/或表面張力，抵抗 其重力，將含細胞的液體維持在貯藏室中；將額外的預定外力，特別地離心力應用于含細胞 的液體以將液體從貯藏室中釋放到觀察構(gòu)件上；從觀察構(gòu)件中除去液體，將細胞留在觀察 構(gòu)件上用于觀察。通過應用額外的預定外力，特別地離心力，將細胞與觀察構(gòu)件的表面連接。此外， 通過應用所述力，使細胞展平，以使細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)更多相互側(cè)面相鄰地伸展而是重疊。這改進 了細胞結(jié)構(gòu)的顯微分析，因為顯微圖像基本上是三維細胞結(jié)構(gòu)的兩維投影。這可能與暴露 于細胞的物質(zhì)對細胞的結(jié)構(gòu)或者組分，例如對內(nèi)體、線粒體、細胞核或者微核的基因毒性作 用的測定特別相關(guān)。當細胞沉積在觀察構(gòu)件上后，可以干燥細胞并然后進行顯微鏡分析，根據(jù)本發(fā)明 的制備方法的一個實施方案還包括將包含水凝膠的涂層應用在其上具有沉積的細胞的觀 察構(gòu)件上的步驟。水凝膠含有至少一種染料，其能與細胞的專門組分結(jié)合。與細胞的專門組 分結(jié)合的染料當用預定波長的光激發(fā)時是發(fā)熒光的，而只要其不與該專門細胞組分結(jié)合， 其是不發(fā)熒光的。作為實例，水凝膠可以是瓊脂糖水凝膠，其使在觀察構(gòu)件上沉積的細胞保持在濕 潤狀態(tài)。對于維持沉積在觀察構(gòu)件(例如顯微鏡載片)上或者前述觀察板上的細胞的形態(tài) 學，水凝膠是有利的。在室溫，水凝膠如前述瓊脂糖水凝膠以類似于明膠的狀態(tài)存在，即其 基本上為固體。其使細胞免于干枯并免于受到污染。然而，小分子如染料的分子基本上可 以在水凝膠中自由移動，并通過水凝膠擴散到細胞中，在那里它們與專門的細胞組分，例如 細胞核、微核、細胞的其他專門組分，或者與細胞邊界結(jié)合。該實施方案是有利的，因為與將染料應用于沉積在觀察構(gòu)件上的細胞、從觀察構(gòu) 件中洗去任何過量的未擴散到細胞中的染料、然后將具有染色細胞的觀察構(gòu)件放置在顯微 鏡下用于顯微鏡分析相反，洗滌步驟可以完全省去，因為染料已經(jīng)包含于水凝膠中并擴散 到細胞中，不需洗去任何過量的染料。因此，本發(fā)明的另一方面涉及用于細胞的顯微鏡分析的方法，包括步驟-使用根據(jù)本發(fā)明的前述制備方法制備細胞，-用預定波長的光照明細胞-將制備的細胞放置在顯微鏡下和-分析顯微鏡圖像。在用預定波長的光照明后，只有已經(jīng)擴散到細胞中并與細胞的專門組分結(jié)合的染 料才顯示出熒光。例如，染料可適合于與細胞的胞核和潛在的微核結(jié)合。因此，可以測定微 核的形成，所述微核的形成可以作為在顯微鏡分析之前細胞所暴露的特定的物質(zhì)可以是基 因毒性的指示。如果提供了其他染料并其擴散到細胞中且與細胞邊界結(jié)合，并且在用其他預定波 長的光照明細胞后，其他染料也顯示出熒光，以至于細胞的邊界以及細胞內(nèi)的任一專門結(jié)構(gòu)都清楚可見，因而進一步增強了顯微鏡圖像的反差。通過示例性實施方案和參考附圖的方式，在下文中更詳細地描述了本發(fā)明。其顯 示于

圖1根據(jù)本發(fā)明的獨立制備單元的實施方案的橫截面圖；圖2根據(jù)本發(fā)明的制備裝置的實施方案的立體透視圖；圖3圖2的制備裝置的側(cè)視圖；圖4沿圖3的線IV-IV的橫截面圖；圖5圖4的細節(jié)V的放大圖；圖6圖4的細節(jié)VI的放大圖；圖7圖2的細節(jié)VII的放大圖；圖8在組裝狀態(tài)中圖2的制備裝置的側(cè)視圖；圖9沿圖8的線IX-IX的橫截面圖；圖10圖9的細節(jié)X的放大圖；圖11在組裝狀態(tài)中圖2的制備裝置的透視圖，圖12圖2的裝置的觀察板的細節(jié)，其中其上沉積了細胞，并用含染料的水凝膠覆
至 rm. o圖13用根據(jù)本發(fā)明的裝置和方法制備的非貼壁細胞的示例性圖像，和圖14使用根據(jù)本發(fā)明的裝置和方法進行的微核測試的分析結(jié)果的實例。圖1顯示用于制備根據(jù)本發(fā)明的在液體中含有的細胞和/或顆粒的制備物的獨立 制備單元10的實施方案的橫截面圖。制備單元10包括用于儲存細胞懸浮液的儲藏室20。儲藏室20包括圓頂形或漏斗 形部分25，以及與圓頂形部分25鄰接的圓柱形部分26。貯藏室20可設定用于含有預定體 積的細胞懸浮液，其通常為lu 1至1000 ii 1之間,特別地10ii 1至lOOii 1之間，和特別地 50 ill。在圓頂形部分25的遠端處，貯藏室20包括出口 22。貯藏室20還包括通往圓頂形 部分25的通風口 24。圓柱形通道30與貯藏室20的出口 22鄰近排列。通道30具有比出口 22的橫截 面更大的橫截面。具體而言，通道30與貯藏室20的出口 22同軸排列。在出口 22至通道 30的過渡處，壁形成了邊緣32。在該實施方案中，邊緣32包括90度的角度a。在遠離貯藏室20的出口 22的側(cè)面，具體為濾紙40的吸收裝置40與通道30鄰近 排列。濾紙40可以是坐標紙或者層析紙，特別地獲自公司W(wǎng)hatman Ltd,Brentford,倫敦， 英國的Grade 17Chr紙。濾紙40具有孔42。孔42與圓柱形通道30同軸排列。具體為載玻片50的觀察構(gòu)件與濾紙40鄰近排列，使得濾紙40在通道30與載玻 片50之間排列。此外，塑造制備單元10的通道以形成另外的邊緣34，其與濾紙40鄰近排 列。邊緣34將濾紙40擠壓向載玻片50，以防止濾紙40與載玻片50之間的間隙。部分25和26形成了貯藏室20的內(nèi)部空腔，用于儲存包括液體和在液體中包含的 細胞的細胞懸浮液，只要除重力外沒有應用其他外力。在這方面，邊緣32連同粘附力和/ 或表面張力幫助將細胞懸浮液抵抗重力保留在貯藏室20中。然而，當應用預定離心力時， 細胞懸浮液從貯藏室經(jīng)出口 22釋放。然后，空氣可以流經(jīng)通風口 24進入貯藏室20，從而填 充由于釋放的細胞懸浮液留下的空白空間。還可以通過將移液器的末端放于通風口 24周圍的壁、對移液器中細胞懸浮液應用預定的壓力(例如通過擠壓移液器)，從而細胞懸浮液 通過通風口 24被吸入貯藏室20的加寬的圓頂形部分，并然后進入圓柱形部分26。通道30和孔42允許細胞懸浮液(其已經(jīng)從貯藏室20中釋放)從貯藏室20移動 到載玻片50。載玻片50用于接收經(jīng)孔42釋放的細胞懸浮液。濾紙40的孔42設定用于 接觸接收的細胞懸浮液，以便除去來自細胞懸浮液的液體，并留下沉積在載玻片50上的細 胞。可以通過孔42周圍的濾紙40部分的高度控制液體的吸收速度。一旦吸收了液體并且 細胞沉積在了載玻片50上，就可以將載玻片50轉(zhuǎn)移至成像裝置，例如顯微鏡或者平板讀數(shù) 器。圖2顯示根據(jù)本發(fā)明的制備裝置的實施方案的立體透視圖。該制備裝置包括一套 不同的平板和薄層，即從底部到頂部以以下順序基板700、彈簧板600、中間板602、觀察板 500 (例如玻璃板)、第一吸收層400 (例如第一濾層)、第二吸收層402 (例如第二濾層)、孔 板200 (例如漏斗板)和蓋板702。制備裝置包括96個單獨的單元10 (參見圖I)。孔板200包括貯藏室20和通道 30，第一吸收層400包括吸收裝置40，并且觀察板500包括觀察構(gòu)件50。中間板602用于補償由獨立制備單元10上彈簧板600的各個彈簧施加的不同壓 力。此外，中間板602防止觀察板500受到彈簧板600的彈簧604的刮劃(還參見圖7中 的細節(jié)VII)?；?00包括多個釘706，其在組裝期間幫助平板組套正確地排列。這些釘706與 彈簧板600和孔板200中的對應孔嚙合。此外，顯示了夾子704，其適合于將裝配的且壓縮 的組套維持在一起作為緊湊的制備裝置。為此，夾子704是U形的，其中配置的兩個彎曲邊 緣嚙合到在基板700和蓋板702的側(cè)壁中存在的槽中。圖3顯示了圖2的制備裝置的側(cè)視圖，并且圖4顯示了沿圖3的線IV-IV的橫截 面圖，參考相同的參考編號。在圖5中放大顯示了顯示孔板200的一部分的細節(jié)V，并且在 圖6中放大顯示了顯示第一吸收層400的一部分的細節(jié)VI。這些部分在下文進行了更詳細 的描述。圖5顯示了圖3的孔板200的細節(jié)V的放大圖。細節(jié)V顯示了孔板200的96個 獨立制備單元中的兩個的部分。各個單元的每一部分都包括用于獨立地儲存和釋放各個細 胞懸浮液的貯藏室20和通道30。圖6顯示了圖3的第一吸收層400的細節(jié)VI的放大圖。該細節(jié)顯示吸收層400 的96個獨立單元的一個完整單元，所述吸收層400包括被吸收層400圍繞的孔42。吸收層 400在圍繞孔42的區(qū)域中具有臺階形橫截面，所述孔具有圍繞孔42且具有更小厚度的內(nèi) 部區(qū)域44，并且具有圍繞內(nèi)部區(qū)域44且具有比內(nèi)部區(qū)域44的厚度更大的厚度的外部區(qū)域 45。通過壓縮吸收層400可以獲得內(nèi)部區(qū)域44的更小厚度。通過該壓縮，可以將液體的吸 收速度調(diào)整到期望的速度。外部區(qū)域45保持未壓縮，以對待除去的液體顯示出高的吸收能 力。圖7顯示了具有兩個螺旋形彈簧604的圖2的彈簧板600的細節(jié)的放大圖。螺旋 形彈簧604排列在彈簧板600和中間板602之間。每一螺旋形彈簧604作用于一個獨立單 元10 (參見圖I)。因此，每一彈簧604的力將各個壓力應用于中間板602的對應區(qū)域，所述 中間板602的對應區(qū)域反過來將壓力應用于觀察板500的對應區(qū)域，所述觀察板500的對應區(qū)域擠壓向包含各個貯藏室20的孔板200。螺旋形彈簧604可以是圓錐狀，其中與彈簧板600鄰近排列的彈簧繞線具有大的 直徑，并且繞線的直徑朝中間板602的方向減少。圖8顯示了在組裝狀態(tài)中圖2的制備裝置的側(cè)視圖，并且圖9顯示了沿圖8的線 IX-IX的橫截面圖。兩個夾子704 (僅顯示了一個)將組裝的且壓縮的平板和薄層組套維持 在一起作為緊湊的制備裝置。這借助于每一夾子704的兩個彎曲邊緣實現(xiàn)，所述兩個彎曲 邊緣嚙合到在基板700和蓋板702的側(cè)壁中存在的槽中。制備裝置的細節(jié)X顯示于圖10 中，并在下文進行了更詳細的進一步描述。圖10顯示了圖9的制備裝置的細節(jié)X的放大圖，并且特別地該細節(jié)顯示了兩個完 全組裝的制備單元10。在遠離觀察板500的側(cè)面，第二吸收層402與第一吸收層400鄰近 排列并與第一吸收層400接觸。第二吸收層402具有比第一吸收層400的吸收能力更高的 吸收能力。這增加了可以由吸收層吸收的液體的總量，并幫助改進了獨立制備單元的相互 分離，從而降低了交叉污染的風險。圖11顯示了在組裝狀態(tài)中根據(jù)圖2的制備裝置的透視圖，用兩個夾子704(僅顯 示了一個夾子)將包括基板700和蓋板702的組套夾在一起。在組裝狀態(tài)中，制備裝置是 非常緊湊且牢固的，并且可以容易地放置到離心機中。在該實施方案中，制備裝置具有標 準的足跡(footprint)。因此，可以在沒有任何修飾的情況下將其放置在常規(guī)離心機，例如 “Shandon Cytospin 4 細胞離心機”中。根據(jù)圖2至11的制備裝置包括多個獨立的單元10，其是相互分離的，避免了交叉 污染，并因此適合于平行進行的多個制備。孔板200提供了緊湊的方式的獨立單元10的 貯藏室20和通道30，具有孔間標準化距離且具有標準化足跡。觀察板500提供了獨立單 元10的觀察構(gòu)件50，使得可以共同處理觀察構(gòu)件50，以提供通過自動化圖像分析的高效觀 察。第一吸收層400用作為從觀察板500中除去液體的主要工具，然而，其具有可控制的吸 收速度以防止在吸收期間細胞與液體一起被吸走。第二吸收層402用于在除去液體中輔助 吸收層400，并用于改進獨立制備單元的相互分離。中間板602用于均勻分布通過彈簧板600的彈簧604施加的各個壓縮力，并防止 觀察板500受到彈簧604的刮劃。彈簧板600用于將壓縮力施加給平板和薄層的組套，所 述平板和薄層的組套借助于基板700、蓋板702和夾子704以緊湊且牢固方式維持在一起。 釘706用于在組裝期間正確地排列平板組套。如果期望增加壓縮力，可以在剩余的組套保 持不變的情況下插入額外的間隔板(從而增加彈簧板600的彈簧的壓縮)。可以將完整組 裝的制備裝置放置到標準離心機中，以使可以同時進行多個細胞制備。如上所述，有利的是將含一種或多種染料的水凝膠分別應用于觀察構(gòu)件上或者觀 察板上沉積的細胞。水凝膠可以含有至少一種染料，所述至少一種染料能與細胞的專門組 分結(jié)合。例如，水凝膠是瓊脂糖水凝膠并含有兩種染料，一種染料適合于與細胞的專門組分 或者結(jié)構(gòu)，例如與細胞核或者微核結(jié)合，并且其他染料適合于與細胞邊界結(jié)合。當分別與專 門的組分或者結(jié)構(gòu)，或者與細胞邊界結(jié)合時，當用各個預定波長的光激發(fā)，各個染料是發(fā)熒 光的，而只要其沒有與該專門的細胞組分、結(jié)構(gòu)或者邊界結(jié)合，其是不發(fā)熒光的。瓊脂糖水凝膠使沉積在觀察構(gòu)件上的細胞保持在濕潤狀態(tài)，其對于維持沉積在觀 察構(gòu)件上或者觀察板上的細胞的形態(tài)學是有利的。在室溫，水凝膠如前述瓊脂糖水凝膠以類似于明膠的狀態(tài)存在，即其基本上為固體。其使細胞免于干透以及免于受到污染。然而， 小分子如染料的分子基本上可以在水凝膠中自由移動，并擴散通過水凝膠進入到細胞中， 在那里它們與專門的細胞組分，例如如細胞核、微核、細胞的其他專門組分，或者與細胞界
限結(jié)合。具有其上沉積了細胞501并用含染料的水凝膠502覆蓋的觀察板500的細節(jié)圖解 顯示于圖12中?？梢詫⑷绱酥苽涞挠^察板500儲存預定的時間，以允許染料擴散進入細胞 501并分別與細胞核和可能的微核以及與細胞邊界結(jié)合。隨后，將細胞進行顯微鏡分析，產(chǎn) 生了細胞和細胞結(jié)構(gòu)的高反差顯微鏡圖像。本方法的更詳細實例描述于下文中細胞培養(yǎng)在T-175燒瓶中，在含10%馬滅活血清、2mM L_谷氨酰胺和1 %青霉素/鏈霉素抗 生素的RPMI 1640中，將“L5178Ytk+/_”型的小鼠淋巴瘤細胞懸浮培養(yǎng)至75%匯合以及95% 存活(全部培養(yǎng)基都可從 Life Technologies Corporation, Carlsbad, California,美國 得到)?；衔餃赜?7 °C，5 % C02，用60 ill生長培養(yǎng)基中的8000個細胞在獲自Beckton Dickinson, New Jersey,美國的型號為“Falcon 353077”的96孔板中進行化合物溫育24 小時。將化合物以1%的最終DMS0濃度溶解于二甲亞砜DMS0中(偶爾也溶解于水中)。對 于陽性對照，使用15iig/ml的甲磺酸甲酯(methylmethanesulfonate) (MMS)。細胞離心&固定在用250 u 1移液器頭混合5次后，使用獲自公司CyBio AG, Jena,德國的型號為 “CyBi-well”的96頭自動化移液器，將50 yl細胞懸浮液從溫育板中轉(zhuǎn)移到倒置的漏斗板 中(參見圖4和圖5顯示的孔板200的小室20)?；旧先鐖D2中所示來組裝細胞制備裝置。將包含等強度的96個螺旋彈簧的彈 簧板600放置在框架(frame)的基板700的上部并用薄的柔性的金屬中間板602覆蓋用于 保護。其次，在堆積式組裝中，將專門的玻璃板500用作為觀察板以接受細胞。這種平板可 以是獲自 Schott Technical Glass Solutions GmbH, Jena,德國的 “Nexterion” 玻璃板。 使用兩個有孔的濾紙板400和402，每一濾紙板都在SBS-標準間隔處具有96個孔(SBS=生 物分子科學協(xié)會(Society for Biomolecular Science))。與玻璃板500接觸的第一濾層 400將形成每一個96樣品點的邊界，并除去離心期間來自懸浮液的培養(yǎng)基(3. 5mm直徑的 孔)。為了以限定的速度實現(xiàn)均勻的且各向同性的液體去除，將過濾材料按圍繞每一孔的環(huán) 的形狀壓成0. 5mm的厚度。以疏松接觸位于第一濾板400的上部的第二濾板402將增加第一濾板400的保留 能力，并包括更大孔(7. 0mm直徑)用于更好地安裝在倒置漏斗板200的邊緣32。將裝滿了細胞懸浮液的漏斗板200小心放置在第一濾板400的上部，并裝入第二 濾板402的孔中。通過制備裝置的蓋板完成組裝。通過人工杠桿式壓力機預壓縮，使用兩 個金屬托架704從基本上不占空間的側(cè)面固定制備裝置，使得將整個裝置安裝入，例如獲 自公司Heraeus,德國的型號為“Multifuge IS”的市售離心機的微量滴定板桶中。這種特 定的離心機可以立即加速到1000RPM的設定離心速度，維持5分鐘。拆卸制備裝置后，在環(huán)境空氣中干燥平板1分鐘，然后浸沒在70%乙醇/水中固定過夜，并且保存長達一周。染色和封片固定后，在甩掉過量液體的情況下干燥玻璃板1分鐘，并浸沒在磷酸緩沖鹽水 (PBS)中5分鐘作為預處理。用雙蒸水(ddH20)快速漂洗與平板的沉積了細胞的表面相反 的底面，并然后將平板準備用于封片。為了使細胞保持濕潤狀態(tài)，并且為了防止細胞形態(tài)的不期望改變和染色假象， 證明用瓊脂糖水凝膠覆蓋細胞是有利的。為此，將獲自Sigma-Aldrich Corporation, Missouri，美國的“低熔點低凝膠化溫度瓊脂糖型VII”在850W在微波爐中在PBS中溶解成 最終2%重量/體積溶液。在粉末完全溶解前，其需要幾分鐘以及幾次煮沸和混合循環(huán)。可以在瓊脂糖凝膠中進行用獲自Sigma Aldrich Corporation (Missouri,美國) 的型號為“Hoechst” (1uM(H20))的染料染色細胞的細胞核，和用獲自Life Technologies Corporation (Carlsbad, California,美國)的型號為 “cell mask red”(1 u g/ml (PBS)) 的染料染色細胞的細胞核，不需要任意額外的洗滌步驟。這是因為以下事實，染料Hoechst 在溶液中實際上是不發(fā)熒光的，并且只有當與DNA結(jié)合時才發(fā)熒光，以及圖像獲取是通過 共焦激發(fā)和檢測進行的，從而極大地降低了離焦背景。在50°C保持含染料的液體瓊脂糖溶 液，并使用25ml —次性移液器倒在平板上。該溶液會留在平板上，并且由于表面張力不會 溢出邊緣。20-30分鐘后凝膠變硬，并且可以將平板封固在用于玻璃"Nexterion"的專門 的有蓋框中(可以與該玻璃相同的公司獲得)。成像在獲自公司PerkinElmer Cellular Technologies (Hamburg,德國)的高通量自 動化成像系統(tǒng)“Opera QEHS”上進行攜帶了 96個部件的玻璃板的旋轉(zhuǎn)式圓盤共焦熒光顯微 術(shù)。通過固態(tài)激光，分別在405nm和635nm處激發(fā)胞核染料(Hoechst)和胞質(zhì)染料(cell mask red)。在每一實驗中調(diào)整照明源的激發(fā)強度和持續(xù)時間，以解決標記效率的差異、優(yōu)化 亮度和反差，以及最小化漂白(通常為50mW激光輸出、200-2000ms積分時間)。在每一點，通常通過2個獨立的高量子效率12位(XD照相機(130萬像素單色) 經(jīng)LCPLF 20XNA 0. 4空氣物鏡(獲自公司Olympus，日本)和優(yōu)化的濾色片套裝記錄25對 掃描圖像。通過使用來自校準樣品的獨立獲取的圖像修正任一剩余的照明不均一性、圖像 偏移或扭曲。圖像分析使用PerkinElmer的“Opera”成像系統(tǒng)的專有軟件環(huán)境“Acapella 2. 0” ( 二者都 獲自PerkinElmer Cellular Technologies,Hamburg,德國)分析共焦顯微照片。首先，通 過胞核染色圖像的分割，鑒定每一細胞的位置。一旦定位了胞核，并測量了它們的輪廓和面 積，就可以通過胞質(zhì)染色的分割測定細胞的輪廓。此外，通過可獲自公司Definiens AG (Munich,德國)的圖像分析軟件 “ eCogni t ion ”分析含微核的樣品的圖像。圖13顯示了用所述裝置和方法制備的非貼壁細胞的示例性圖像。在上排圖像中， 已經(jīng)用上述染料“Hoechst”染色了細胞，而在下排中，已經(jīng)用同樣上述的染料“cell mask red”染色了細胞。在左列中，沒有處理細胞，而在右列中，已經(jīng)用基因毒性化合物處理了細胞?？梢钥闯觯盟鲅b置和方法制備的細胞良好地粘附在未處理的玻璃表面，并且鋪展扁 平，從而胞內(nèi)結(jié)構(gòu)很好地分離。 圖14顯示了使用所述的裝置和方法進行的微核測試的分析結(jié)果的實例。如在圖 上的圖例所示，該實驗已經(jīng)在4個不同的天一式兩份進行。如在圖中所示，將含微核的細胞 占全部細胞的比例相對于物質(zhì)濃度作圖。上排含有已知沒有基因毒性的物質(zhì)，而下排含有 已知有基因毒性的物質(zhì)。從圖中可以看出，全部三種物質(zhì)都已經(jīng)正確的分類。將平板#13和 #14僅用不具有任何毒性物質(zhì)的DMS0(二甲亞砜)處理，作為陰性對照，并且其可以在下排 中顯示的圖中詳細看出。已經(jīng)將細胞稀釋成指定物質(zhì)的12個稀釋度。通過最大濃度(硝 基喹啉氧化物和絲裂霉素C為10 y M、全部其他物質(zhì)為100 y M)、稀釋因子1. 5和稀釋數(shù)目 定義濃度范圍id。使用定制的圖像處理算法計數(shù)不含微核的細胞和含一個至三個微核的細 胞。在圖中，純粹處于展示目的，將硝基喹啉氧化物和絲裂霉素C的數(shù)據(jù)向右移動了 10倍。
權(quán)利要求
1.用于制備在液體中含有的細胞和/或顆粒的單元(10)，其包括-貯藏室(20)，其配置用于儲存含細胞和/或顆粒的液體，以及當應用預定的外力，特 別是離心力時，通過出口(22)釋放所儲存的含細胞和/或顆粒的液體，-通道(30)，其與貯藏室(20)的出口(22)鄰近排列，貯藏室(20)的出口(22)通往通道，其中通道(30)具有比出口(22)的橫截面更大的橫截面，并且其中出口(22)至通道 (30)的過渡處的壁形成了邊緣(32)，-觀察構(gòu)件(50)，用于接收釋放的含細胞和/或顆粒的液體，和 -吸收裝置(40)，其與觀察構(gòu)件(50)鄰近排列，處于通道(30)和觀察構(gòu)件(50)之間， 所述吸收裝置(40)具有孔(42)，所述孔(42)允許含細胞和/或顆粒的液體經(jīng)該孔 (42)移動到觀察構(gòu)件(50)上，所述吸收裝置(40)還除去來自觀察構(gòu)件(50)上含細胞和/或顆粒的液體中的液體， 以使細胞和/或顆粒留在觀察構(gòu)件(50)上用于觀察。
2.權(quán)利要求1的單元(10)，其中所述出口(22)和通道(30)之間的過渡處的邊緣(32) 的壁包括90度的角度(a )。
3.權(quán)利要求1或2的單元(10)，其中所述貯藏室(20)包括圓頂形或者漏斗形部分(25) 以及與圓頂形或者漏斗形部分鄰接的圓柱形部分(26)。
4.前述權(quán)利要求中任一項的單元(10)，其中所述貯藏室(20)設定成含有預定體積 的含細胞和/或顆粒的液體，其中所述預定體積為1 U 1至1000 u 1之間，特別地10 ill至 100 u 1之間，以及特別地50 ill。
5.前述權(quán)利要求中任一項的單元(10)，其中所述貯藏室(20)包括通風口(24)，其排列 在貯藏室(20)的與出口(22)相對的末端處。
6.前述權(quán)利要求中任一項的單元(10)，其中所述觀察構(gòu)件(50)是用于光學觀察的載片。
7.前述權(quán)利要求中任一項的單元(10)，其中所述孔(42)周圍的吸收裝置(40)部分具 有預定的厚度，以實現(xiàn)對液體的預定吸收速度。
8.權(quán)利要求7的單元(10)，其中圍繞所述孔(42)的吸收裝置(40)的壁部分是朝向觀 察構(gòu)件(50)預彎曲的，以使在單元(10)的組裝時，該預彎曲部分與觀察構(gòu)件(10)緊密連接。
9.制備裝置，其包含權(quán)利要求1-8中任一項的多個獨立單元(10)，其中所述獨立單元 (10)是對于交叉污染相互隔離的。
10.權(quán)利要求9的制備裝置，其包括96孔板(200)或者384孔板，其中所述多個獨立單 元(10)的貯藏室(20)分別通過96孔板或者384孔板的孔形成。
11.權(quán)利要求9或者10的制備裝置，其進一步包括觀察板(500)，所述觀察板(500)形 成了獨立單元(10)的觀察構(gòu)件(50)。
12.權(quán)利要求11的制備裝置，其進一步包括第一(400)和第二(402)吸收層，所述第一 (400)和第二(402)吸收層形成了獨立單元(10)的吸收裝置(40)，所述第一吸收層(400) 與所述觀察板(500)直接鄰近排列并與所述觀察板(500)接觸，并且所述第二吸收層(402) 在遠離所述觀察板(500)的側(cè)面上與所述第一吸收層(400)鄰近排列并與所述第一吸收層(400)接觸，所述第二吸收層(402)具有的吸收能力増加了所述第一吸收層(400)的吸收能力。
13.權(quán)利要求9-12中任ー項的制備裝置，其進ー步包括彈簧板￠00)，用于將各個壓縮 力應用于獨立単元(10)，以實現(xiàn)所述各個吸收裝置(40)與所述各個觀察構(gòu)件(50)的緊密連接。
14.權(quán)利要求13的制備裝置，其中所述彈簧板(600)包括多個螺旋形彈簧￠04)，所述 多個螺旋形彈簧(604)與獨立単元(10)的數(shù)目對應，其中每ー螺旋形彈簧(604)作用于ー 個獨立単元(10)。
15.用于制備在液體中含有的細胞的方法，包括步驟-將含非貼壁細胞的液體分配到貯藏室(20)中；-僅通過粘附カ和/或表面張カ將含非貼壁細胞的液體抵抗其重力維持在貯藏室(20)中；-將額外的預定外力，特別是離心カ應用于含非貼壁細胞的液體，以便將液體從貯藏室 (20)中釋放到觀察構(gòu)件(50)上；-從觀察構(gòu)件(50)除去液體，將非貼壁細胞留在觀察構(gòu)件(50)上用于觀察。
16.權(quán)利要求15的方法，其進ー步包括將包含水凝膠的涂層應用在其上具有沉積的細 胞的觀察構(gòu)件(50)上的步驟，所述水凝膠含有至少ー種染料，所述染料能夠與細胞的專門 組分結(jié)合，并且當用預定波長的光激發(fā)時，所述染料是發(fā)熒光的。
17.用于細胞的顯微鏡分析的方法，其包括步驟-使用權(quán)利要求15或者權(quán)利要求16的方法制備細胞，-將制備的細胞放置在顯微鏡下和 -分析顯微圖像。
全文摘要
用于制備在液體中含有的細胞的單元(10)，其包括貯藏室(20)，該貯藏室設定成用于儲存含細胞的液體和當應用預定的外力，特別是離心力時，通過出口(22)釋放儲存的液體。與出口(22)鄰近排列的通道(30)具有比出口(22)的橫截面更大的橫截面。出口(22)至通道(30)的過渡處的壁形成了邊緣(32)。該單元還包括用于接收釋放的液體的觀察構(gòu)件(50)和在通道(30)和觀察構(gòu)件(50)之間的與觀察構(gòu)件(50)鄰近排列的吸收裝置(40)。該吸收裝置具有孔，允許釋放的液體移動到觀察構(gòu)件(50)上，并除去液體以使細胞留在觀察構(gòu)件(50)上用于觀察。
文檔編號G01N1/28GK102665917SQ201080058088
公開日2012年9月12日 申請日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月21日
發(fā)明者C·法廷格, D·沃格林, R·里特曼 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司