本發(fā)明涉及一種在堿性磷酸酶催化下形成的多肽水凝膠及其在提高抗腫瘤藥物活性方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由自組裝多肽形成的水凝膠具有生物相容性好、生物活性高等特點和優(yōu)點，相關(guān)領(lǐng)域的研究是近20年的熱點。它已經(jīng)在再生醫(yī)學(xué)、藥物控釋、分析檢測、組織工程等方面展現(xiàn)了很高的應(yīng)用前景。多肽折疊對于蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的三級結(jié)構(gòu)、獲得生物學(xué)功能、組裝成蛋白復(fù)合體來說是至關(guān)重要的。多肽錯誤折疊和蛋白的錯誤組裝將會導(dǎo)致蛋白功能缺失，并與疾病有關(guān)。受自發(fā)自組裝系統(tǒng)的啟發(fā)，自組裝多肽已經(jīng)廣泛用于生物材料的構(gòu)建。在氫鍵、π-π堆積、疏水相互作用和靜電相互作用等非共價相互作用的幫助下，多肽能自組裝形成多種納米材料和水凝膠。近期的研究結(jié)果表明：自組裝的動力學(xué)和形成水凝膠的途徑對于由此產(chǎn)生的材料的性能有著深遠(yuǎn)的影響，如機械性能、外觀、功能等。然而，他們對于多肽折疊、自組裝和功能的影響卻很少有人研究。本發(fā)明的意義在于提供了一種酶催化苯丁酸氮芥-多肽水凝膠的制備及抗癌應(yīng)用，通過調(diào)控多肽折疊和組裝提高抗腫瘤藥物的活性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的

本發(fā)明的目的是提供了一種酶催化苯丁酸氮芥-多肽水凝膠的制備及抗癌應(yīng)用，該方法所制得的水凝膠具有良好的生物相容性，通過酶促自組裝幫助多肽折疊成α-螺旋結(jié)構(gòu)來更好的發(fā)揮抗腫瘤作用。

發(fā)明概述

在本發(fā)明的第一方面，我們提供了一種由堿性磷酸酶催化形成的苯丁酸氮芥-多肽水凝膠，所述多肽結(jié)構(gòu)式如(1a)所示，

所述多肽水凝膠由結(jié)構(gòu)式如(2a)所示的磷酸化多肽水溶液在磷酸酶催化作用下于4℃過夜形成

上述結(jié)構(gòu)式如(1a)的多肽序列為crb-g^df^df^dy(d構(gòu)型)，結(jié)構(gòu)式如(2a)的磷酸化多肽序列為crb-g^df^dfp^dy(d構(gòu)型，py表示磷酸化酪氨酸)。

本發(fā)明所述磷酸化多肽均可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)自制，由fmoc-固相合成方法合成，crb-g^df^dfp^dy的合成方法及其結(jié)構(gòu)可參考文獻1(nanotechnology，2010，21(22)：225606.)。磷酸化多肽水溶液在磷酸酶催化作用下形成所述多肽水凝膠的方法也為公知技術(shù)。

在本發(fā)明的第二方面，還提供了一種以上述多肽水凝膠作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用。所述多肽水凝膠能有效提高藥物抗腫瘤活性。

本發(fā)明的有益效果是：設(shè)計了一個以抗腫瘤藥物苯丁酸氮芥作為封端的多肽序列，通過酶催化來調(diào)控多肽折疊和組裝，促使其形成α-螺旋結(jié)構(gòu)，能更好的發(fā)揮出抗腫瘤藥物的活性。本發(fā)明提供了一種新型的抗癌水凝膠，通過調(diào)控多肽折疊和組裝提高抗腫瘤藥物的活性，為開發(fā)出更多具有生物活性的多肽序列提供了新的思路。

附圖說明：

附圖1：兩種不同成膠方式形成的相同序列的電鏡圖像。左圖為加熱冷卻形成的納米顆粒的電鏡圖像，右圖為酶催化形成的納米纖維(alp、4℃過夜)的電鏡圖像。

附圖2：crb、crb-g^df^df^dy(加熱冷卻)、crb-g^df^dfp^dy(alp、4℃)處理不同類型癌細(xì)胞的ic50結(jié)果。

附圖3：crb、crb-g^df^df^dy(加熱冷卻)、crb-g^df^dfp^dy(alp、4℃)的體內(nèi)抗腫瘤效果。

具體實施方式

下面用實施例進一步描述本發(fā)明，但所述實施例僅用于本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。

實施例1

(1)根據(jù)文獻1，用fmoc-固相合成方法合成磷酸化多肽crb-g^df^dfp^dy(alp、4℃)，它的核磁圖譜和質(zhì)譜結(jié)果如下：

¹hnmr(400mhz，dmso)δ8.32(d，j＝7.5hz，1h)，8.22(d，j＝8.1hz，1h)，7.97(d，j＝15.2hz，2h)，7.29-7.16(m，9h)，7.04(dd，j＝27.5，8.1hz，3h)，6.65(d，j＝8.3hz，2h)，4.55(d，j＝8.9hz，1h)，4.50-4.36(m，2h)，3.67(d，j＝12.4hz，5h)，3.53(dd，j＝19.7，12.5hz，2h)，3.47-3.38(m，1h)，3.03(d，j＝11.3hz，2h)，2.97-2.88(m，2h)，2.84-2.63(m，3h)，2.54(s，1h)，2.46-2.35(m，2h)，2.08(t，j＝7.3hz，2h)，1.77-1.64(m，2h).m+＝897.27，obsvd.(m+h)⁺＝898.2741，(m+na)⁺＝920.2544.

(2)取1mg磷酸化多肽crb-g^df^dfp^dy置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入990微升pbs(ph＝7.4)溶液，用碳酸鈉溶液將其ph值調(diào)節(jié)至7.4，加入1微升1u/微升的堿性磷酸酶，用pbs溶液定容于1ml，置于4℃，待反應(yīng)基本完全(約12h)即得多肽水凝膠。所述多肽結(jié)構(gòu)式如(1a)所示；

用透射電鏡觀察實施例1中多肽水凝膠的凝膠形態(tài)，如圖1所示。結(jié)果表明，對于本發(fā)明所述d構(gòu)型的多肽結(jié)構(gòu)，在1‰的濃度時能形成穩(wěn)定的納米纖維結(jié)構(gòu)，更好的發(fā)揮抗腫瘤藥物的活性。

對比例1

(1)根據(jù)文獻1，用fmoc-固相合成方法合成多肽crb-g^df^df^dy(加熱冷卻)，它的核磁圖譜和質(zhì)譜結(jié)果如下：

1hnmr(400mhz，dmso)δ8.19(dd，j＝15.0，8.0hz，2h)，8.01-7.87(m，2h)，7.23(d，j＝4.3hz，3h)，7.20-7.11(m，5h)，7.02(t，j＝7.7hz，3h)，6.65(dd，j＝8.2，5.9hz，3h)，4.58-4.42(m，2h)，4.37(dd，j＝13.5，7.7hz，1h)，3.81-3.58(m，8h)，3.52(dd，j＝16.5，5.5hz，1h)，3.38(q，j＝7.0hz，1h)，3.09-2.87(m，3h)，2.80(ddd，j＝19.3，14.0，8.9hz，2h)，2.67(dd，j＝13.7，9.6hz，1h)，2.42(t，j＝7.5hz，2h)，2.07(d，j＝7.5hz，2h)，1.77-1.63(m，2h).ms：calc.m+＝818.30，(m+h)+＝819.77.

(2)取1mg多肽crb-g^df^df^dy置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入990微升pbs(ph＝7.4)溶液，用碳酸鈉溶液將其ph值調(diào)節(jié)至7.4，用pbs溶液定容于1ml，室溫下放置，即得到納米顆粒懸濁液。所述多肽結(jié)構(gòu)式如(1a)所示；

對比例2

(1)用pbs溶解苯丁酸氮芥得到單獨的苯丁酸氮芥溶液。

mtt實驗

(1)培養(yǎng)細(xì)胞

培養(yǎng)各種實驗細(xì)胞(mcf-7、4t1、a549、hela、hepg2)至所需數(shù)量。將培養(yǎng)好的細(xì)胞鋪到96孔板中貼壁培養(yǎng)。

(2)化合物處理

分別用實施例1和對比例1、對比例2所述化合物對細(xì)胞進行處理。

(3)mtt處理

(4)dmso處理并用酶標(biāo)儀進行檢測。

從圖2中的結(jié)果看出：單獨的crb對于mcf-7、4t1、a549、hela、hepg2的ic50分別為166.5μm、179.6μm、212.6μm、224.0μm、259.4mm。而用crb-g^df^df^dy(加熱冷卻)(對比例1)處理后，ic50值均下降到了85μm以下，使用crb-g^df^dfp^dy(alp、4℃)的組(實施例1)的ic50值均下降到了50μm以下。

體內(nèi)抗腫瘤實驗

(1)實驗小鼠腫瘤模型的構(gòu)建

培養(yǎng)balb/c小鼠至6-8周，于小鼠腋下注射4t1腫瘤細(xì)胞。

(2)給藥治療

待腫瘤細(xì)胞長到一定大小，給小鼠尾靜脈注射pbs、crb、crb-g^df^df^dy(加熱冷卻)、crb-g^df^dfp^dy(alp、4℃)。

從圖3中的結(jié)果看出：在23天時，crb、crb-g^df^df^dy(加熱冷卻)、crb-g^df^dfp^dy(alp、4℃)組的腫瘤大小分別是pbs組的76.1％、60.9％、40.5％。