專利名稱：多肽的逆流提純的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用逆流色譜法提純蛋白質(zhì)或肽的方法。本發(fā)明特別涉及逆流色譜法用于提純蛋白質(zhì)或肽(包括合成、半重組體或重組體多肽，比如重組體GLP-1)的用途。
背景技術(shù)：
逆流提純系統(tǒng)是固相或者物理地和流體流的流動反向移動，或者通過改變該系統(tǒng)的不同分離床的定位而進(jìn)行模擬以使該移動相對于流體流逆流的提純系統(tǒng)。逆流提純系統(tǒng)包括例如模擬移動床色譜(SMB)和多柱逆流溶劑梯度提純(MCSGP)。模擬移動床色譜(SMB)首次描述于US 2，985，589。該說明書公開了分成許多單獨(dú)的互連分離床的分離塔，所述分離床含有固相色譜吸附劑。塔底部的管道泵連接從底部到頂部的流，從而提供連續(xù)環(huán)路。進(jìn)料(F)和解吸劑(D)的入口及提余液(R)和提取物(E) 的出口位于分離床串列的特定點(diǎn)。按限定的間隔，床的位置在流的相反方向上切換，產(chǎn)生固相床相對于流體流的逆流移動。引入第一床的進(jìn)料(F)開始分離成其中所含的各種組分， 保留較少的物種沿著流體流的方向遷移并在提余液口得到收集。保留較多的物種保持優(yōu)先和固相關(guān)聯(lián)并在提取物口得到收集。通過調(diào)節(jié)切換次數(shù)和F、D、R及E的流率，建立循環(huán)穩(wěn)定狀態(tài)，可從所述系統(tǒng)得到連續(xù)的提純產(chǎn)品流。近來，SMB已被用于分離糖異構(gòu)體、碳?xì)浠衔?、溶劑和其它工業(yè)應(yīng)用。這些工業(yè)裝置中的許多(像原來的'589裝置)采用機(jī)械旋轉(zhuǎn)閥的變化進(jìn)行柱切換。所述閥組件排列成在任何給定的閥位，將多個入口和出口流導(dǎo)向預(yù)定的柱子，并通過各個旋轉(zhuǎn)步驟相應(yīng)地推進(jìn)一個位置。這樣的旋轉(zhuǎn)閥公開于US 6，719，001、4，574，840和4，614，205。為了強(qiáng)調(diào)這些裝置中的一些的預(yù)期規(guī)模，參見US 3，040, 777，它描述了占64平方英尺面積和重10 噸的閥。其它SMB 系統(tǒng)公開于 US 4，434，051 和 US 5，635，072。另一個專利 US 6，544，413 公開了多重閥裝置，它具有四個閥的成簇閥總成，所述閥用于近似于對各個色譜床控制輸入/輸出。它對于小規(guī)模SMB系統(tǒng)具有減少液體體積的優(yōu)勢。US6，979，402公開了一裝置， 其中跨接(cross-over)導(dǎo)管完全被連接通道代替，所述連接通道用機(jī)器制成旋轉(zhuǎn)閥體的頂板和底板并和柱口對準(zhǔn)以制造SMB流體環(huán)路，從而減小空隙體積。將SMB用于提純藥物活性非對映體和對映體的若干新近應(yīng)用已公開于US 6，462，221,6, 461，858,6, 458，995和6，455，736。在用于這樣的分子的二元分離的SMB中使用新的手性樹脂正在變得常見。SMB也被考慮用于從復(fù)雜混合物提純生物分子。例如，使用SMB提純單克隆抗體已被Gottschlich等人報(bào)道(J. Chromatogr. A, 765 (1997) 201)并公開于WO 2004/024284o SMB提純之前已被公開用于胰島素提純，如WO 2001/0879 所公開的。WO 2008/048395公開了小規(guī)模模擬移動床色譜法。胰高血糖素樣肽_1 (GLP-I)是在血糖水平低時釋放的激素。GLP-I增大胰島素生產(chǎn)從而降低血糖水平。GLP-I和GLP-I 類似物用于治療II型糖尿病。對用于提純流體混合物的提純系統(tǒng)仍然存在需求，所述流體混合物包括一種或多種雜質(zhì)和關(guān)注的蛋白質(zhì)或肽(比如GLP-I肽)，其中雜質(zhì)的濃度比關(guān)注的蛋白質(zhì)或肽的濃度
小得多。發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供改進(jìn)的多肽提純方法，所述多肽包括合成式、半重組體式或重組體式生產(chǎn)的多肽，比如重組體GLP-1。本發(fā)明的發(fā)明人顯示了逆流提純系統(tǒng)(比如 SMB)特別適合于提純重組體蛋白質(zhì)，特別是GLP-1。
發(fā)明概要發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，逆流色譜法特別適合于提純蛋白質(zhì)或肽，包括合成式、半重組體式或重組體式生產(chǎn)的蛋白質(zhì)或肽，比如GLP-I肽。公眾和藥物批準(zhǔn)機(jī)關(guān)對更純和更同質(zhì)的治療蛋白質(zhì)制品存在越來越大的需求。成本也得低。因此，為了滿足這些期望，生產(chǎn)成本是在工業(yè)過程中必須最佳化的問題。因此，在第一寬泛方面，本發(fā)明涉及通過逆流色譜法提純肽、多肽或蛋白質(zhì)的方法。在另一方面，本發(fā)明涉及將流體混合物中的關(guān)注的多肽和至少一種其它組分色譜分離的方法，所述方法包括a)提供逆流提純系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括流體連接的多個部分，所述部分包括至少一個固相和第一解吸劑流；b)將所述流體混合物作為進(jìn)料流引入所述逆流提純系統(tǒng)，其中所述流體混合物以逆流方式和所述固相接觸；c)通過調(diào)節(jié)進(jìn)料流中的至少一種調(diào)節(jié)劑的濃度而控制等溫線，使得把mm和A作為(/或α的函數(shù)繪圖時，等溫線的初始斜率A和操作線的斜率大約平行；d)進(jìn)行關(guān)注的多肽和至少一種其它組分的分離；和e)收集所述關(guān)注的多肽以提供它的提純組合物。


圖1 產(chǎn)品(-—)和雜質(zhì)(-·-·)的色譜圖。從圖中看到，兩個峰之間存在大的重疊。 必須采取折中。從2CV收集的產(chǎn)品將得到大的產(chǎn)率，但純度低；而從2. 5CV收集的產(chǎn)品將得到高純度，但產(chǎn)率低。圖2 純?nèi)踅Y(jié)合組分·(-·--)、純強(qiáng)結(jié)合組分(一)的等溫線和這兩個等溫線的初始斜率。如果流(stream)含有8g/L強(qiáng)組分(產(chǎn)品)且弱結(jié)合的雜質(zhì)是它的5%，它相當(dāng)于 0. 4g/L。該圖顯示在低濃度，初始斜率是雜質(zhì)等溫線的合理近似，而對于較強(qiáng)結(jié)合的組分， 情況則不同。圖3 帶再循環(huán)的SMB設(shè)備。SMB由I-IV四個部分組成，每個部分帶有兩個柱。解吸劑泵之后的部分稱為部分I。來自部分IV的排出物(outlet)再循環(huán)至部分I。液體流向右而柱移動向左。圖4 一個真實(shí)移動床(TMB)中的穩(wěn)定狀態(tài)濃度分布。較強(qiáng)結(jié)合組分沿著樹脂方向移動到提取物口，而較弱結(jié)合組分隨著洗脫劑移動到提余液口。所有流如圖3所示進(jìn)入和離開TMB。
圖5 帶有八個柱子、再生及平衡的開放環(huán)路SMB設(shè)備的布局。柱子可以在SMB設(shè)備(Abel 2004)中再生和平衡。由于提余液流僅含有弱結(jié)合組分，部分III的出口可以作為代替用作平衡柱的入口。圖6 離子交換色譜法(IEX)中的線性等溫線的鹽依賴性。理論保留將是
為In(Cs)的函數(shù)的雙對數(shù)圖中的直線。較弱結(jié)合組分的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(+)顯示而較強(qiáng)結(jié)合組分通過(ο)顯示。對于較弱結(jié)合組分，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合線為(-…_)，而對較強(qiáng)結(jié)合組分為(一)。圖7 反相色譜法(RP)中的線性等溫線的乙醇依賴性。理論保留將是Vk-Vnk作為有機(jī)相濃度Cm的函數(shù)的半對數(shù)圖中的直線。較弱結(jié)合組分為(-·-·-)而較強(qiáng)結(jié)合組分為(一)。圖8 等度溶液。較強(qiáng)結(jié)合組分的吸附Aa，及較弱結(jié)合組分的吸附Ab，連同部分III 中的無因次(dimensionless)流率m111。在等度溶液中，進(jìn)料流中的調(diào)節(jié)劑的濃度將會等于部分II中的濃度。因此部分III中的濃度將會和這些相同且不會取決于進(jìn)料流(水平線)。因此，較弱和較強(qiáng)結(jié)合組分的等溫線的初始斜率將會恒定。因此僅5和7.5之間的進(jìn)料流量會滿足保留較強(qiáng)結(jié)合組分并洗提較弱結(jié)合組分的要求。圖9 梯度溶液。在SMB設(shè)備中使用梯度將導(dǎo)致等溫線初始斜率的變化，這取決于調(diào)節(jié)劑的濃度(不再是水平線，參見圖8)。然而使用梯度并不總會保證調(diào)節(jié)劑的無因次流率mm會位于較弱和較強(qiáng)結(jié)合組分的初始斜率之間。圖10 進(jìn)料和洗脫劑中的調(diào)節(jié)劑濃度的吸引人的組合?？梢钥吹綄τ谒羞M(jìn)料流量，操作線HIm位于較弱和較強(qiáng)結(jié)合組分的初始斜率之間。圖11 脈沖實(shí)驗(yàn)的范·德姆特(van Deemter)圖。范·德姆特圖顯示減小的塔板高度作為流率的函數(shù)。圖12 線性等溫線的完全分離區(qū)域。最佳操作點(diǎn)在m11的最小值和mm的最大值， 相當(dāng)于W點(diǎn)。圖13 等度條件下非線性等溫線的完全分離區(qū)域。W點(diǎn)下移且設(shè)備中生產(chǎn)率減小。圖14:具有鹽/有機(jī)溶劑和pH梯度的完全分離區(qū)域。可以看到最佳操作點(diǎn)W由于梯度而上移。這允許較高的進(jìn)料流，因此得到較高的生產(chǎn)率。圖15 用于SMB實(shí)驗(yàn)II的解吸劑I和解吸劑II (也參見圖18)的試驗(yàn)。保留體積可由擬合EMG函數(shù)而計(jì)算。指數(shù)修正高斯(EMG)函數(shù)的描述可見于Jeansorme (1991)。圖16 等溫線的計(jì)算的初始斜率A，和部分III中的無因次流量m，以及進(jìn)料流中的最佳鹽濃度。無因次流量具有和較弱結(jié)合組分的斜率Ab相同的斜率。圖17 等溫線的計(jì)算的初始斜率A，和部分III中的無因次流量m，以及進(jìn)料流中的實(shí)際鹽濃度。無因次流具有比較弱結(jié)合組分的斜率Ab小的斜率。圖18 用于II號SMB實(shí)驗(yàn)的設(shè)備的結(jié)構(gòu)。部分I和部分II之間的連接被切斷以便能在這兩個部分中使用兩種不同的鹽濃度(也參見圖5用于比較)。圖19 來自實(shí)驗(yàn)II的提取物流紫外信號。初始將進(jìn)料流設(shè)置為lAml/min直至達(dá)到循環(huán)穩(wěn)定狀態(tài)。取樣分析并將流量增大l/2ml/min并達(dá)到新的循環(huán)穩(wěn)定狀態(tài)。圖20 進(jìn)料流量為2ml/min且獲得了循環(huán)穩(wěn)定狀態(tài)后的來自實(shí)驗(yàn)II的提余液口紫外信號。經(jīng)過再生和平衡區(qū)后，將柱子移入?yún)^(qū)域II，因此紫外信號初始為零。當(dāng)組分被洗提時，紫外信號增大。在紫外信號開始再次增大之前看到曲線平穩(wěn)段。
圖21 來自實(shí)驗(yàn)III的區(qū)域III中的弱結(jié)合(-·-·-)和強(qiáng)結(jié)合(一_)組分的計(jì)算的初始斜率A，連同操作線(一)和操作點(diǎn)(黑點(diǎn))?？梢钥吹讲僮骶€具有和較弱結(jié)合組分無限稀釋時的等溫線的初始斜率大約相同的斜率。圖22 進(jìn)料流為2ml/min且獲得了循環(huán)穩(wěn)定狀態(tài)后的來自實(shí)驗(yàn)III的提余液口紫外信號。經(jīng)過再生和平衡區(qū)后，將柱子移入?yún)^(qū)域II，因此紫外信號初始為零。當(dāng)組分被洗提時，紫外信號增大?？吹胶蛨D20相比非常不同的峰。圖23 對于較弱結(jié)合組分⑴和較強(qiáng)結(jié)合組分(ο)，在反相色譜法(RP)中的線性等溫線的測量的乙醇依賴性，連同對實(shí)驗(yàn)的擬合。理論保留在Vk-Vnk作為Cis函數(shù)的半對數(shù)圖中將是直線。圖M 區(qū)域III中的較弱(-·-·-)和較強(qiáng)結(jié)合(一)組分的計(jì)算的初始斜率A，連同操作線(一)和操作點(diǎn)(黑點(diǎn))?？梢钥吹讲僮骶€具有和等溫線初始斜率在無限稀釋時的變化大約相同的斜率。圖25 來自實(shí)驗(yàn)IV中的提取物流的測量的紫外信號。為每個循環(huán)(8個柱子，3min 轉(zhuǎn)換時間)將數(shù)據(jù)繪圖。起初，紫外信號因SMB設(shè)備的啟動而增大。圖沈獲得了循環(huán)穩(wěn)定狀態(tài)后的實(shí)驗(yàn)IV的提余液口紫外信號。經(jīng)過再生和平衡區(qū)后，將柱子移入?yún)^(qū)域II，因此紫外信號初始為零。當(dāng)組分被洗提時，紫外信號增大。進(jìn)料流含有許多弱結(jié)合的雜質(zhì)，且沒有看到像在圖22中那樣的清晰的峰。發(fā)明詳細(xì)內(nèi)容肽(比如GLP-I肽)可例如在發(fā)酵方法中通過重組生產(chǎn)或者在固相上通過合成生產(chǎn)。不管生產(chǎn)方式如何，除關(guān)注的多肽外還產(chǎn)生許多雜質(zhì)。例如當(dāng)通過重組生產(chǎn)時，除了生產(chǎn)關(guān)注的多肽，細(xì)胞也生產(chǎn)許多其它物質(zhì)比如高分子量蛋白質(zhì)(HMWP)和小分子(例如草酸鹽)。由于缺乏和關(guān)注的多肽的相似性，這些通常十分易于和關(guān)注的多肽分離。另外，細(xì)胞生產(chǎn)和關(guān)注的多肽非常相似的組分，例如糖基化、脫酰胺、截?cái)唷⒕奂?、二聚、氧化的雜質(zhì)等， 因此產(chǎn)生幾乎和關(guān)注的多肽相同的蛋白質(zhì)或肽。由于雜質(zhì)和關(guān)注的多肽之間的高相似度， 這些雜質(zhì)和關(guān)注的多肽分離要難得多。因此，在色譜法中，關(guān)注的多肽和這些雜質(zhì)的保留體積彼此非常接近。在等度模式中，這會對進(jìn)料流和解吸劑流的要求產(chǎn)生狹窄的約束。適合于分離對映體的提純系統(tǒng)已被描述。當(dāng)對映體通過所述提純系統(tǒng)分離時，被分離的組分通常以相等或接近相等的濃度存在。與此相反，關(guān)注的多肽在例如發(fā)酵肉湯中的濃度可能顯著高于類似雜質(zhì)的濃度，這常常使得難以將所述雜質(zhì)和關(guān)注的多肽分離同時也實(shí)現(xiàn)關(guān)注的多肽的高產(chǎn)率。圖2說明了被提純的流體混合物包括關(guān)注的多肽以及相似雜質(zhì)的情形。此處，兩個等溫線顯示于圖形中，其中被吸附的濃度按液相濃度而繪制。產(chǎn)品的濃度是8g/L，以低得多的濃度存在的雜質(zhì)的濃度是0.4g/L。從圖中看出，等溫線的初始斜率是較弱結(jié)合組分的等溫線的良好近似，而較強(qiáng)結(jié)合組分的近似不那么好。在本發(fā)明的一方面，將較弱結(jié)合組分的等溫線的初始斜率用于選擇逆流方法中的調(diào)節(jié)劑濃度。作為一個說明性實(shí)例，可以考慮如圖5所示的逆流方法具有和圖2給出的等溫線相似的等溫線的情況。這導(dǎo)致與雜質(zhì)(以低濃度存在)相比，產(chǎn)品(以高濃度存在)對樹脂的更強(qiáng)吸附。在此情況下，雜質(zhì)在例如提余液流中的洗提可因以下而發(fā)生
1.產(chǎn)品在區(qū)域III中的替換效應(yīng)2.雜質(zhì)本身的等溫線的向下彎曲，或3.等溫線的初始斜率足夠低到可以洗提。在情況1中，例如弱結(jié)合雜質(zhì)會被產(chǎn)品替換，產(chǎn)品會在提余液流中損失。雜質(zhì)正好在產(chǎn)品之前因替換效應(yīng)而洗提。在情況2中，弱結(jié)合雜質(zhì)不能在區(qū)域III的條件下以低濃度洗提。在此情況下，弱結(jié)合組分既不會在提取物流中也不會在提余液流中被洗出(wash out)，而只是在設(shè)備中積聚。弱結(jié)合雜質(zhì)的濃度會累積直至濃度對于雜質(zhì)足夠高以由于等溫線的彎曲而洗提。在此情況下的劣勢是雜質(zhì)在設(shè)備中的累積。這個增大量的雜質(zhì)會減少空閑配體的量，從而減少產(chǎn)品的結(jié)合容量，且增大量的雜質(zhì)需要在區(qū)域II中被洗提以免它最終在提余液流中。情況3是此處覆蓋的情形，其中將調(diào)節(jié)劑在進(jìn)料流和解吸劑流中的濃度選為使得弱結(jié)合雜質(zhì)總能洗提至提余液流。在此情況下，雜質(zhì)的積聚得以避免。這可通過此處建議的適當(dāng)選擇解吸劑和進(jìn)料流中的調(diào)節(jié)劑濃度而完成。發(fā)明人在本發(fā)明提供了用于將有關(guān)雜質(zhì)和關(guān)注的多肽分離的特別有效的提純方法。因此，所述提純方法中的等溫線的初始斜率對于提純關(guān)注的多肽是最佳的，其中，肽產(chǎn)品和有關(guān)雜質(zhì)存在于待被提純的流體混合物(比如從發(fā)酵過程獲得的流體混合物)中。在本發(fā)明的一方面，等溫線的最佳初始斜率通過選擇逆流提純系統(tǒng)(比如SMB設(shè)備)中的調(diào)節(jié)劑梯度而獲得，其中，以低濃度存在的較弱結(jié)合組分(即弱結(jié)合雜質(zhì))在提余液流中洗提。一方面，根據(jù)本發(fā)明方法的較弱結(jié)合的雜質(zhì)的洗提防止所述雜質(zhì)在所述設(shè)備中的積聚。 在本發(fā)明的一方面，調(diào)節(jié)劑梯度是鹽梯度。一方面，根據(jù)本發(fā)明的逆流提純系統(tǒng)用于提純發(fā)酵肉湯，其中獲得GLP-I和它的雜質(zhì)的分離。一方面，根據(jù)本發(fā)明將逆流提純系統(tǒng)用于提純包括合成式生產(chǎn)的蛋白質(zhì)或肽產(chǎn)品的流體混合物，其中獲得GLP-I肽和它的雜質(zhì)的分離。一方面，根據(jù)本發(fā)明將逆流提純系統(tǒng)用于提純包括胰島素肽(比如人胰島素、 desB30人胰島素或AspB^人胰島素)的流體混合物，其中獲得胰島素和它的雜質(zhì)的分離。一方面，根據(jù)本發(fā)明將逆流提純系統(tǒng)用于將包括蛋白質(zhì)或肽的流體混合物從它的雜質(zhì)提純，其中使用的柱子是RP HPLC柱。理解平衡對各個組分(比如關(guān)注的多肽和它的有關(guān)雜質(zhì))的保留的影響也將允許使用通常不用于逆流分離系統(tǒng)的梯度，例如IEX中的pH梯度。因此，一方面，根據(jù)本發(fā)明將逆流提純系統(tǒng)用于將包括蛋白質(zhì)或肽的流體混合物從它的雜質(zhì)提純，其中使用的調(diào)節(jié)劑是 PH且使用的柱子是IEX柱。有機(jī)組分的濃度也會影響IEX中的平衡，因此也可使用例如IEX中的有機(jī)組分。因此，一方面，根據(jù)本發(fā)明將逆流提純系統(tǒng)用于將包括蛋白質(zhì)或肽的流體混合物從它的雜質(zhì)提純，其中使用的第二調(diào)節(jié)劑是有機(jī)組分且使用的柱子是IEX柱。等溫線經(jīng)常是凸的，且被吸附組分的濃度q和液相中的濃度c之間的比率，即q/c， 在濃度增大時減小(Guiochon 2006)。這也可在圖2中看到。在本發(fā)明的一方面，等溫線接近于較弱結(jié)合組分的操作線。這樣的優(yōu)勢在于部分III中的穿透(breakthrough)得以避免。另外，在負(fù)載部分II時，可用配體的減少降低在提取物中具有較弱結(jié)合組分的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，針對上述困難的提純問題的解決方案是在SMB方法中使用梯度。之前已顯示，梯度在困難的分離問題中有效，然而沒有像本發(fā)明建議的那樣使用，在本發(fā)明中，進(jìn)料流中產(chǎn)品和雜質(zhì)之間的濃度差大。在本發(fā)明的一方面，提供了進(jìn)料流和部分II中的不同調(diào)節(jié)劑濃度，其中在設(shè)備的部分III中的平衡是進(jìn)料流量的函數(shù)。對于波動和方法變化的一定的魯棒性是需要的。圖9繪制了梯度情形下的初始斜率連同無因次流量m111。一方面，mm在兩個組分各自的等溫線的初始斜率A之間。這具有將所述組分分離的效果。從圖9看出，進(jìn)料流量在此情況下僅可在約3. 3和6. 6之間變化。發(fā)明人在本發(fā)明提供了通過以新的創(chuàng)造性方式結(jié)合熱力學(xué)知識和逆流提純技術(shù)知識(比如SMB)而提純關(guān)注的多肽的吸引人的方法。固定床色譜法固定床(FB)色譜法目前在藥物工業(yè)中廣泛用于提純組分。在固定床色譜法中，將與雜質(zhì)混合的所需產(chǎn)品施加于柱子，然后從柱子將它洗提。在柱出口，可從雜質(zhì)中收集產(chǎn)
P
ΡΠ O在關(guān)注的多肽和有關(guān)雜質(zhì)的這種流體混合物的FB色譜圖中，常觀察到兩個峰的重疊(圖1)。在此情況下，在柱出口，產(chǎn)品不完全和雜質(zhì)分離，且不能獲得高純度和高產(chǎn)率兩者。SMB為了克服FB色譜法的局限，可以使用逆流色譜法。廣泛使用的方法是模擬移動床(SMB)，這在之前已顯示就純度、生產(chǎn)率和溶劑消耗而言都對提純蛋白質(zhì)有效 (Schulte(2000))ο在SMB設(shè)備中，柱子以特定的轉(zhuǎn)換時間相對于流動方向逆流地移動。因此所述方法就時間和位置兩者而言都變化。SMB也被考慮用于胰島素的提純(JensenOOOO))，其中對分離由lg/Ι牛胰島素和 l/2g/l豬胰島素組成的進(jìn)料流進(jìn)行了理論研究。顯示，通過在反相色譜方法中施加乙腈梯度，消耗數(shù)值可以減小。胰島素提純已由Wang在EP1349866B1中通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在他的實(shí)驗(yàn)中，將胰島素和ZnCl2及HMWP分離。SMB方法是非連續(xù)方法，因?yàn)橹右蕴囟〞r間tsft轉(zhuǎn)換。這產(chǎn)生一組帶有時間和位置這兩者的導(dǎo)數(shù)的等式。為了簡化等式的分析，經(jīng)常代之研究真實(shí)移動床(TMB) (Guiochon, 2006，780頁)。 TMB也稱作真實(shí)逆流(TCC) (Ruthven和Ching 1989)或連續(xù)移動床(CMB) (Ma和Wang 1997)。在TMB中，認(rèn)為樹脂流沿著液體流的相反方向連續(xù)移動，在此情況下該過程變成穩(wěn)定狀態(tài)，且僅剩位置的導(dǎo)數(shù)。從這些等式獲得的濃度分布常稱為穩(wěn)態(tài)濃度分布(Ruthven和 Ching 1989)，或駐波濃度分布(Ma和Wang 1997)。之前已顯示，在理想情形下，這兩種方法相同(Guiochon 2006)。完全分離區(qū)域用于測定SMB設(shè)備中的操作點(diǎn)的廣泛應(yīng)用的方法是三角形理論(Storti 1989)。 該方法可衍生于用于TMB的理想色譜法。在理想情況下，對傳質(zhì)和軸向分散的抗性被忽略。逆流方法中的控制參數(shù)是和兩相中的濃度相比的兩相的流率之間的比率(Ruthven 1989)。在三角形理論中，流量的比率定為
權(quán)利要求
1.將流體混合物中的關(guān)注的多肽與至少一種其它組分色譜分離的方法，所述方法包括a)提供逆流提純系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括流體連接的多個部分，所述部分包括至少一個固相和第一解吸劑流；b)將所述流體混合物作為進(jìn)料流引入所述逆流提純系統(tǒng)，其中所述流體混合物以逆流方式和所述固相接觸；c)通過調(diào)節(jié)進(jìn)料流中的至少一種調(diào)節(jié)劑的濃度而控制等溫線，使得把mm和A作為Qf 或α的函數(shù)繪圖時，等溫線的初始斜率和操作線的斜率大約平行；d)進(jìn)行關(guān)注的多肽和至少一種其它組分的分離；和e)收集所述關(guān)注的多肽以提供它的提純組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將所述進(jìn)料流中的至少一種調(diào)節(jié)劑的濃度控制成不同于所述進(jìn)料流之前的所述部分，比如所述解吸劑流，中的相同調(diào)節(jié)劑的濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)的方法，其中所述關(guān)注的多肽是胰高血糖素樣肽或 GLP-I激動劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)的方法，其中所述逆流提純系統(tǒng)是離子交換色譜系統(tǒng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)的方法，其中所述等溫線通過控制所述進(jìn)料流中的鹽濃度。而控制。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)的方法，其中所述進(jìn)料流中的鹽濃度相對于所述進(jìn)料流之前的所述部分中的流中的鹽濃度在下列范圍內(nèi)
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)的方法，其中所述進(jìn)料流中的鹽濃度cf在約17.5mmol/kg到約36mmol/kg的范圍內(nèi)，且所述進(jìn)料流之前的所述部分中的流中的氯離子濃度約為 45mmol/kg0
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)的方法，其中所述解吸劑包括選自任何有機(jī)或無機(jī)鹽和它們的混合物的鹽，比如NaCl、KCl、NH4Cl、CaCl2、乙酸鈉、乙酸鉀、乙酸銨、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、檸檬酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸銨、乙酸鈣或它們的混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)的方法，其中所述逆流提純系統(tǒng)是反相色譜(RPC)系統(tǒng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)的方法，其中所述逆流提純系統(tǒng)是疏水交互作用色譜 (HIC)系統(tǒng)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述等溫線通過控制所述進(jìn)料流中的有機(jī)調(diào)節(jié)劑的濃度而控制。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-3或9-11任意一項(xiàng)的方法，其中所述進(jìn)料流和所述進(jìn)料流之前的所述部分中的流中的調(diào)節(jié)劑之間的差異在下列范圍內(nèi)
13.根據(jù)權(quán)利要求1-3或9-12任意一項(xiàng)的方法，其中所述進(jìn)料流中的調(diào)節(jié)劑以約27.3 重量％到約四.4重量％的范圍存在，且所述進(jìn)料流之前的所述部分中的流中的乙醇以約 30. 8重量％存在。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13任意一項(xiàng)的方法，其中所述逆流提純系統(tǒng)是模擬移動床(SMB) 提純系統(tǒng)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-13任意一項(xiàng)的方法，其中所述逆流提純系統(tǒng)是多柱逆流溶劑梯度提純(MCSGP)系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用逆流色譜法提純多肽的方法。本發(fā)明特別涉及逆流色譜法用于提純重組體GLP-1的用途。
文檔編號B01D15/18GK102271775SQ200980150176
公開日2011年12月7日 申請日期2009年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月8日
發(fā)明者S·S·弗雷德里克森 申請人:諾沃-諾迪斯克有限公司