用于治療慢性疼痛的多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于治療慢性疼痛的多肽，多肽的基序?yàn)锳SADPGH，基序通過可選的連接基團(tuán)偶聯(lián)有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)段。本發(fā)明的多肽，既可以抑制神經(jīng)元內(nèi)Fyn調(diào)節(jié)的NR2磷酸化，又不影響Fyn活性，可以很好地治療慢性疼痛。
【專利說明】用于治療慢性疼痛的多肽
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多肽，特別涉及一種用于治療慢性疼痛的多肽。
【背景技術(shù)】[0002]慢性疼痛(主要分為炎性痛、神經(jīng)病理性疼痛)的特征是痛覺過敏(hyperalgesia)、異常性疼痛(allodynia)、自發(fā)性疼痛(spontaneous pain)等,其發(fā)生都涉及到神經(jīng)突觸可塑性變化導(dǎo)致的中樞致敏(central sensitization),對(duì)于疼痛的發(fā)生而言，脊髓背角(spinal cord dorsal horn, S⑶H)被譽(yù)為疼痛之旅的起點(diǎn)，S⑶H的突觸信號(hào)傳遞能夠接受復(fù)雜的、兩相的、且是活性依賴的神經(jīng)調(diào)節(jié)，在這種調(diào)節(jié)之下，從周圍神經(jīng)系統(tǒng)的感覺傳入被精確地編碼并被傳入大腦。當(dāng)外周傷害性刺激通過初級(jí)傳入神經(jīng)元的整合調(diào)節(jié)(包括免疫細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等與神經(jīng)元的對(duì)話等)激活了脊髓背角(spinal corddorsal horn, S⑶H)的感覺神經(jīng)元后，將引起突觸后神經(jīng)元末梢的去極化，激活末梢上NR。研究表明，NR的過度激活是慢性疼痛中樞致敏發(fā)生的不可或缺的重要環(huán)節(jié)。
[0003]NR是谷氨酸受體的離子型受體，由功能亞基(NMDA rec印torl，NRl)和調(diào)節(jié)亞基(NMDA receptor2, NR2)組成，NR2 又分 NR2A、NR2B、NR2C 及 NR2D。NRl 和一種 NR2 可能還有NR3組成完整的NR離子通道。生理情況下，配體與NR結(jié)合后，NR通道(存在于功能亞基)開放，陽離子內(nèi)流，尤其是Ca2+的內(nèi)流，這種基本的電活動(dòng)(基礎(chǔ)活性)是NR相關(guān)的生理功能賴以存在的基礎(chǔ)。如前所述，NR的過度活化在慢性疼痛中樞致敏的產(chǎn)生和維持方面起關(guān)鍵作用。
[0004]目前，不同類型的新的鎮(zhèn)痛藥正在開發(fā)之中，以NR為靶點(diǎn)，設(shè)法抑制NR的過度激活一直以來是慢性疼痛等神經(jīng)病變的研究熱點(diǎn)。抑制NR的激活通?？梢允褂肗R拮抗劑，然而，這些拮抗劑都具有神經(jīng)毒作用，拮抗劑阻斷NR基礎(chǔ)電活動(dòng)時(shí)會(huì)破壞NR依賴的生理功能?？傊?，以NR為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)治療疾病的策略首先應(yīng)該不影響NR的基礎(chǔ)電活動(dòng)，減少對(duì)NR依賴的生理功能的干擾。對(duì)于NR通道而言，陽離子內(nèi)流的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)存在于NR的功能亞基，而陽離子內(nèi)流的強(qiáng)度等(NR的活性)受調(diào)節(jié)亞基NR2調(diào)節(jié)，因此，通過調(diào)控NR2來調(diào)節(jié)NR活性是治療慢性疼痛的新策略。發(fā)明人在之前的研究中利用SiRNA沉默NR2B減輕了病理神經(jīng)痛大鼠的痛覺過敏，這印證了以NR2為靶點(diǎn)治療慢性疼痛的可行性。NR2的酪氨酸磷酸化變化是NR2調(diào)節(jié)NR活性的最基本方式，NR2酪氨酸磷酸化，則NR活性增強(qiáng)，反之，去磷酸化則使NR活性降低，因此，干預(yù)NR2的酪氨酸磷酸化治療NR過度活化導(dǎo)致的病理生理改變可能是避免阻斷NR，減少對(duì)NR依賴的生理功能干擾的有效途徑。
[0005]NR2酪氨酸磷酸化由神經(jīng)元非受體依賴的蛋白激酶家族(Src family proteinkinases, SFKs)調(diào)節(jié)。Fyn是脊髓神經(jīng)元中富含的SFKs成員，F(xiàn)yn催化NR2酪氨酸磷酸化，是許多信號(hào)通路調(diào)節(jié)NR2磷酸化的信號(hào)交匯點(diǎn)。盡管NR2A或NR2B的C-末端的多個(gè)酪氨酸殘基可以被SFKs家族磷酸化，但NR2B Tyrl472位點(diǎn)的磷酸化主要由Fyn調(diào)節(jié)，一些學(xué)者認(rèn)為NR2B就是NR參與疼痛的調(diào)節(jié)亞基，因此，S⑶H中突觸后Fyn調(diào)節(jié)NR2特別是NR2B酪氨酸磷酸化在慢性疼痛中的作用備受關(guān)注。諸多的研究表明，慢性疼痛大鼠痛覺過敏的維持依賴于Fyn調(diào)節(jié)的NR2B Tyrl472位點(diǎn)的酪氨酸磷酸化，多種信號(hào)分子可通過Fyn催化NR2尤其是NR2B的磷酸化進(jìn)而引起炎性疼痛或神經(jīng)病理痛的發(fā)生。這些結(jié)果提示，干預(yù)神經(jīng)元內(nèi)Fyn調(diào)節(jié)的NR2尤其是NR2B的酪氨酸磷酸化可以治療慢性疼痛如炎性疼痛。干預(yù)神經(jīng)元內(nèi)Fyn對(duì)NR2的酪氨酸磷酸化可以使用Fyn抑制劑，然而，這種方法特異性差，由于同源家族的酶的催化區(qū)域具有保守性，而Fyn是廣泛存在于體內(nèi)多種組織的酪氨酸蛋白激酶，使用激酶抑制劑抑制Fyn的活性會(huì)影響神經(jīng)系統(tǒng)以外組織Fyn的生理作用。從遺傳性干預(yù)的角度，我們也可以通過基因療法抑制Fyn的表達(dá)，目前還沒有可應(yīng)用于臨床的具有高轉(zhuǎn)染效率、合適的半衰期、特異性和靶向性高的siRNA分子體內(nèi)給藥系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種既可以抑制神經(jīng)元內(nèi)Fyn調(diào)節(jié)的NR2磷酸化，又不影響Fyn活性的多肽。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種治療慢性疼痛的制劑。
[0008]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種用于治療慢性疼痛的多肽，其基序?yàn)锳SADPGH (SEQ ID NO:1)，基序通過可選的連接基團(tuán)偶聯(lián)有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)段。
[0009]優(yōu)選的，上述治療慢性疼痛的多肽中偶聯(lián)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)段為跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
[0010]優(yōu)選的，上述跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)肽為Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域中的片段短肽?？缒まD(zhuǎn)運(yùn)肽的序列為YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:2)。
[0011]特別的，用于治療慢性`疼痛的多肽的序列為ASADPGH-YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:3)。
[0012]一種治療慢性疼痛的制劑，含有上述的多肽。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明的多肽，既可以抑制神經(jīng)元內(nèi)Fyn調(diào)節(jié)的NR2磷酸化，又不影響Fyn活性，可以很好地治療慢性疼痛。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是NR磷酸化活化和炎性疼痛的治療機(jī)理圖；
圖2是Tat-FynP對(duì)培養(yǎng)脊髓神經(jīng)細(xì)胞NR2B酪氨酸磷酸化蛋白水平的影響圖；
圖3是不同肽對(duì)Fyn活性的影響圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]一種用于治療慢性疼痛的多肽，其基序?yàn)锳SADPGH，基序通過可選的連接基團(tuán)偶聯(lián)有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)段。
[0016]跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)段的作用在于提供細(xì)胞轉(zhuǎn)動(dòng)信號(hào)，將使細(xì)胞將目的肽轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)起效。優(yōu)選的，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)段為跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)肽。優(yōu)選的，上述跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)肽為Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域中的片段短肽。跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列為YGRKKRRQRRR。當(dāng)然，也可以使用其他的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)段，以促進(jìn)多肽進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。
[0017]特別的，用于治療慢性疼痛的多肽的序列為ASADPGH-YGRKKRRQRRR。[0018]一種治療慢性疼痛的制劑，含有上述的多肽。
[0019]發(fā)明人所在課題組在研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)yn與NR2的結(jié)合是一種由突觸后致密物(postsynaptic density protein, PSD)蛋白 PSD-93 介導(dǎo)的非直接連接，而且，PSD-93 只介導(dǎo)SFKs家族的Fyn與NR2的結(jié)合。實(shí)質(zhì)上Fyn與PSD-95結(jié)合也以同樣的方式介導(dǎo)NR2磷酸化。PSD-93/95是胞質(zhì)內(nèi)一種特殊的銜接蛋白，其N-末端含有PDZ1，PDZ2，PDZ3三個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域(與ESD-95，Dig, and ZO-1蛋白同源)又被稱為PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白。作為PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白的主要成員，PSD-93/95通過Η)Ζ2結(jié)構(gòu)域與NR結(jié)合在一起。Fyn是一種非受體依賴的蛋白激酶，它通過酶作用區(qū)域以外的SH2結(jié)構(gòu)域與PSD-93/95的TOZ3結(jié)構(gòu)域的直接結(jié)合從而與NR形成復(fù)合體介導(dǎo)NR磷酸化，這種結(jié)合是不依賴于激酶磷酸化程度的獨(dú)特的物理結(jié)合方式，F(xiàn)yn C末端Tyr去磷酸化及激酶結(jié)構(gòu)域的Tyr磷酸化(Tyr420)都可以使Fyn激活，與通常認(rèn)為的磷酸酶下調(diào)受體的磷酸化相反，酪氨酸磷酸酶α使突觸內(nèi)Fyn去磷酸化反而促進(jìn)這種復(fù)合物的形成，進(jìn)而上調(diào)NR2酪氨酸磷酸化。慢性疼痛如炎性痛時(shí)，許多信號(hào)分子可間接或直接作用于Fyn促進(jìn)NR2磷酸化。
[0020]總之，PSD-93/95始終與NR連接在一起，當(dāng)刺激信號(hào)傳入時(shí)，PSD-93/95的TOZ3結(jié)構(gòu)域再與Fyn SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使Fyn、PSD-93/95、NR串集在一起，導(dǎo)致NR磷酸化活化(圖1A)。據(jù)此，發(fā)明人設(shè)想，可以通過抑制Fyn SH2與PSD-93/95PDZ3的相互作用，可以抑制Fyn與PSD93/95及NR的串集，從而抑制NR的磷酸化活化，防止或逆轉(zhuǎn)中樞致敏，達(dá)到對(duì)炎性疼痛的治療作用(圖1B)。該策略基于抑制Fyn SH2結(jié)構(gòu)域與TOZ3結(jié)構(gòu)域相互作用的策略，不影響NR通道的完整性，保留NR的基礎(chǔ)電活動(dòng)，因此對(duì)NR依賴的生理功能干擾小或無干擾，不影響Fyn對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)NR2以外其它蛋白的磷酸化調(diào)節(jié)及其它組織器官Fyn的作用。[0021 ] 下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)及實(shí) 驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0022]以下實(shí)驗(yàn)中的所使用的Tat-FynP的具體序列為ASADPGH-YGRKKRRQRRR。
[0023]Tat-FynP對(duì)培養(yǎng)脊髓神經(jīng)細(xì)胞NR2B酪氨酸磷酸化蛋白水平的影響 Tat-FynP,FynP.mTat-FynP分別加入預(yù)先用Fyn激動(dòng)劑孵育的培養(yǎng)細(xì)胞及未加激動(dòng)劑
的培養(yǎng)細(xì)胞，孵育后細(xì)胞裂解液按常規(guī)步驟提取蛋白分兩份(另一分備NR2B總蛋白水平檢測(cè))，利用特異性P-NR2B抗體,通過Western-blot觀察各組酪氨酸磷酸化NR2B蛋白水平的變化。
[0024]40yg總蛋白上樣，每樣上二塊平行膠，以確定蛋白分子量及上樣一致性，SDS-PAGE電泳分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，條件為150mA2小時(shí)，轉(zhuǎn)移緩沖液:25mmol/L Tris，190mmol/L甘氨酸，0.05%SDS，20%甲醇，轉(zhuǎn)移完畢后，將PVDF膜浸入封閉液，4 °C 過夜，封閉液成分:1%BSA 的 Buffer A (10mmol/T, Tris, 100mmol/L NaCl，
0.l%Tween20)。加入用封閉液稀釋的一抗(1:1000羊抗p_NR2B，均為Santa Cruz公司)，Buffer A洗膜10分鐘X 3次，加入二抗(1:300的生物素標(biāo)記的馬抗羊或羊抗兔IgG，北京中山)，37°C孵育30分鐘，洗膜3次，加入3抗(1:300辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素，北京中山)，Buffer A洗膜3次，最后將膜放入DAB溶液中顯色，一旦蛋白帶的顏色深度達(dá)到要求，即用ddH20漂洗，終止反應(yīng)，之后拍攝膜照片。將PVDF膜上的目的蛋白條帶在Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)上分析處理,磷酸化NR2B蛋白含量以O(shè)DuX面積表示。
[0025]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。此數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的多肽Tat-FynP，可以抑制神經(jīng)元內(nèi)Fyn調(diào)節(jié)的NR2 (本實(shí)驗(yàn)中為NR2B)磷酸化。[0026]Tat-FynP對(duì)Fyn激酶活性的影響(驗(yàn)證其特異作用或祀向作用)
通過放射性免疫技術(shù)測(cè)定Fyn激酶活性。
[0027]用放射性免疫技術(shù)試劑盒分別測(cè)定Tat-FynP、FynP, mTat-FynP孵育的脊髓神經(jīng)細(xì)胞Fyn激酶活性變化。Tat-FynP的劑量分別采用可以抑制Fyn與PSD-95相互作用的量的10倍。
[0028]通過超聲破碎法提取孵育的細(xì)胞蛋白，通過lory法測(cè)定蛋白濃度。激酶活性檢測(cè):加入 20μ1 proteinA/G Plus Agarose, 4°C 水平搖床 100rpm30min, 7000rpm 離心取上清液。500 μ g蛋白中加入Fyn抗體4°C搖床,離心,buffer洗漆沉淀,上述步驟3次后bufferA重懸沉淀。構(gòu)建[Y -32p]ATP反應(yīng)體系,將10 μ I反應(yīng)體系加入混合液孵育20min,終止反應(yīng)后SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，2h，_70°C，黑暗環(huán)境中壓片48_72h，顯影、定影。圖像經(jīng)過數(shù)據(jù)系統(tǒng)分析處理。結(jié)果如圖3所示。各組Fyn活性無顯著差異，說明本發(fā)明的多肽，不影響Fyn活性。
[0029]Tat-FynP預(yù)先鞘內(nèi)注射對(duì)微量甲醛炎性痛模型大鼠痛行為的影響
動(dòng)物分為正常組、炎性疼痛組(CFA)，炎性疼痛組又分模型制作前預(yù)先鞘內(nèi)注射Tat-FynP、FynP、mTat-FynP組，分別于左后肢足底注射微量甲醛前及注射后ld、3d、4d和5d測(cè)定大鼠MWT和TWD。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tat-FynP鞘內(nèi)注射預(yù)處理對(duì)炎性疼痛大鼠具有治療作用。
[0030]造模前各組大鼠的兩種疼痛行為學(xué)指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與正常大鼠組比較，CFA組第4d (相當(dāng)于鞘內(nèi)注射治療藥物后3d)即可觀察到患足的MWT值下降非常顯著，TWD值明顯延長，與模型前基礎(chǔ)值和NS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.01)，且這種變化趨勢(shì)持續(xù)至鞘內(nèi)注射后5d。Tat-FynP組能使大鼠患足MWT值的下降幅度及TWD值的上升幅度減少，與CFA組比較有顯著差異(P〈0.01 )，而FynP組及mTat-FynP組大鼠MWT和TWD值的與CFA組比較無顯著差異(P>0.05)。(表la，表lb)。
[0031]表la、各組大鼠造模前及鞘內(nèi)注射后或相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)MWT的變化
【權(quán)利要求】
1.一種用于治療慢性疼痛的多肽，其基序?yàn)锳SADPGH，基序通過可選的連接基團(tuán)偶聯(lián)有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于:所述跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)段為跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽，其特征在于:所述跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)肽為Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域中的片段短肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多肽，其特征在于:所述跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列為YGRKKRRQRRR。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于:所述多肽的序列為ASADPGH-YGRKKRRQRRR。
6.一種治療慢性疼 痛的制劑，其特征在于:所述制劑中含有上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的多肽。
【文檔編號(hào)】A61K38/08GK103804500SQ201410030755
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月22日
【發(fā)明者】陸建華, 彭捷, 何洹, 孫梅 申請(qǐng)人:廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院