本發(fā)明涉及保健品制備技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種用于骨關(guān)節(jié)修復(fù)的帶魚(yú)活性提取物的制備方法。

背景技術(shù)：

多肽從二十世紀(jì)初才開(kāi)始受到關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)它區(qū)別于蛋白質(zhì)區(qū)別于氨基酸，具有藥物的作用。到了上個(gè)世紀(jì)九十年代才有了長(zhǎng)足發(fā)展，在不斷更新的技術(shù)指導(dǎo)下，多肽的應(yīng)用范圍越來(lái)越廣，作用也越來(lái)越大，這才邁進(jìn)了我們的生活，在我們生活中占據(jù)的份額越來(lái)越大，多肽類(lèi)藥物高效低毒特異性強(qiáng)具有區(qū)別于其他藥物的特有優(yōu)勢(shì)，正不斷影響著我們的生活。而且多肽潛力巨大，是生物科學(xué)發(fā)展的又一大突破和發(fā)展方向。

天然存在的海洋活性多肽由于在生物體中含量低，而且提取困難，難以實(shí)現(xiàn)大量生產(chǎn)供給所需，化學(xué)人工合成多肽成本昂貴。所以，人們更多地把目光投向開(kāi)發(fā)蛋白酶解產(chǎn)物獲得活性多肽這條途徑上來(lái)。由于海洋生物生存的環(huán)境與陸地生物完全不同，如高壓、低溫、高溫和高鹽等極端環(huán)境，為了適應(yīng)這些極端的海洋生物環(huán)境，海洋生物蛋白質(zhì)無(wú)論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，同時(shí)，海洋生物蛋白資源無(wú)論在種類(lèi)和數(shù)量上都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于陸地蛋白資源，并且未得到很好的開(kāi)發(fā)。種類(lèi)繁多的海洋蛋白氨基酸序列中，潛在著許多具有生物活性的氨基酸序列，用特異的蛋白酶水解，就釋放出有活性的肽段。海洋生物蛋白資源是21世紀(jì)人類(lèi)重要的蛋白類(lèi)食物及生物活性物質(zhì)的重要來(lái)源。我國(guó)目前的海洋生物蛋白資源總量在世界各國(guó)名列前茅，但我國(guó)目前的蛋白類(lèi)水產(chǎn)品中，除一部分直接食用外，大部分通過(guò)簡(jiǎn)單的加工技術(shù)制成食品進(jìn)入市場(chǎng)，加工技術(shù)落后，產(chǎn)品結(jié)構(gòu)單一，產(chǎn)品的附加值低，使得產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力較差。因此，我國(guó)急需對(duì)海洋生物蛋白資源進(jìn)行優(yōu)化利用和高值化加工。

現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號(hào)為cn103333940b的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利，公開(kāi)了一種利用帶魚(yú)制備二肽基肽酶iv抑制肽的方法，步驟包括：將帶魚(yú)加水絞碎成均勻的魚(yú)肉漿；魚(yú)肉漿放入酶解罐中，添加內(nèi)切蛋白酶，攪拌水解4～12h，得水解液；升溫至95～100℃，保持10～15分鐘滅酶；將水解液冷至40～60℃，添加外切蛋白酶，攪拌水解2～8h；升溫至95～100℃，保持10～15分鐘滅酶；內(nèi)切蛋白酶為木瓜蛋白酶、neutrase中性蛋白酶、alcalase堿性蛋白酶中的一種。外切蛋白酶為flavourzyme風(fēng)味蛋白酶。將上述所得滅酶后的水解液離心取上清液；將上清液加入到超濾膜分離器中，調(diào)節(jié)超濾膜的壓力為0.05～0.1mpa，超濾膜的截留分子量為3000da，收集超濾膜透過(guò)液；采用親和層析方法分離純化dpp-iv抑制肽。海洋生物蛋白質(zhì)無(wú)論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，上述方法采用陸地上提取的蛋白酶對(duì)海洋生物進(jìn)行酶解，酶解效率低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種使用從海洋生物中提取的蛋白酶酶解的用于骨關(guān)節(jié)修復(fù)的帶魚(yú)活性提取物的制備方法，制備得到的帶魚(yú)活性提取物能有效消除關(guān)節(jié)腫痛，促進(jìn)關(guān)節(jié)滑液的生成，加速軟組織的重建和恢復(fù)。

本發(fā)明針對(duì)背景技術(shù)中提到的問(wèn)題，采取的技術(shù)方案為：用于骨關(guān)節(jié)修復(fù)的帶魚(yú)活性提取物的制備方法，包括復(fù)合酶酶解、多級(jí)膜過(guò)濾、納濾、hplc洗脫和冷凍干燥，上述復(fù)合酶酶解步驟為采用海洋芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶酶解帶魚(yú)魚(yú)肉勻漿液，并采用超聲波輔助酶解。海洋生物蛋白質(zhì)無(wú)論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，海洋芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶同時(shí)對(duì)帶魚(yú)蛋白進(jìn)行酶解，可得到大量有活性的肽段。

作為優(yōu)選，冷凍干燥步驟為：預(yù)凍：-35~-45℃預(yù)凍3~5h；冷凍干燥：-45~-35℃，3~5pa冷凍干燥5~7h，-10~-5℃，10~20pa冷凍干燥2~3h；升華干燥：10~15℃，50~60pa升華干燥3~4h；解析干燥:7~14℃，3~5pa解析干燥2~4h，得到用于骨關(guān)節(jié)修復(fù)的帶魚(yú)活性提取物。凍干整個(gè)過(guò)程都在程序的控制下，操作簡(jiǎn)單，工序簡(jiǎn)潔，自動(dòng)化程度高，減少了人力、物力。低溫下干燥能更好地保留活性肽的活性；低壓下干燥，活性肽不易氧化，療效更好；凍結(jié)時(shí)活性肽形成“骨架”，干燥后保存原形，為多孔疏松結(jié)構(gòu)且顏色基本不變，產(chǎn)品外觀更加優(yōu)良；復(fù)水性好，凍干活性肽能迅速吸水還原成凍干前狀態(tài)，使用方便；脫水徹底，活性肽中含水量低，一般在1%-3%，且有利于長(zhǎng)途運(yùn)輸和長(zhǎng)期保存。

作為優(yōu)選，冷凍干燥前加入30~40wt%輔料，輔料的成分及其重量份為：80~90份右旋糖酐-40和2~5份活性肽。上述輔料利于產(chǎn)品成型，即防止在抽真空時(shí)藥物與水蒸氣一起飛散或成形時(shí)收縮，并且可保護(hù)活性肽。

作為優(yōu)選，活性肽的氨基酸序列為hshacasyycskhshacktacakfcgtascthylsylcrvlhpgklcacvncsr。上述活性肽通過(guò)氫鍵與具有骨關(guān)節(jié)修復(fù)的活性肽連接，能以極少量的量就能很好的保護(hù)功能性肽，使其免于儲(chǔ)藏過(guò)程中氧氣及其他因素對(duì)其結(jié)構(gòu)的破壞。

作為優(yōu)選，復(fù)合酶酶解步驟中海洋芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶的加入量為1~2wt%，酶解溫度為25~35℃，ph為7.0~9.0，酶解時(shí)間為40~60min。上述條件下，蛋白酶的加入量少且酶解效率高。

作為優(yōu)選，多級(jí)膜過(guò)濾步驟為先將濾液用0.2~0.4μm微濾膜過(guò)濾，濾液再分別通過(guò)截留分子量14-18kda、6-8kda的超濾膜，濃縮濾液。通過(guò)物理方式對(duì)濾液進(jìn)行純化處理，操作簡(jiǎn)單，不會(huì)破壞功能肽的活性，得到的超濾液中對(duì)骨關(guān)節(jié)有修復(fù)作用的功能肽的含量高。

作為優(yōu)選，hplc洗脫步驟中洗脫步驟為0~5min，用1~3%三氟乙酸和98~99%乙腈洗脫，流速為0.8~1.5ml/min；5~15min，用5~7%三氟乙酸和93~95%乙腈洗脫，流速為0.8~1.5ml/min；15~30min，用8~12%三氟乙酸和88~92%乙腈洗脫，流速為0.8~1.5ml/min。根據(jù)功能肽的極性設(shè)計(jì)洗脫液組分及洗脫操作，將對(duì)骨關(guān)節(jié)有修復(fù)作用的功能肽與其他物質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行進(jìn)一步純化。

作為優(yōu)選，hplc洗脫步驟中洗脫結(jié)束后收集在250nm有吸收的洗脫物，合并并濃縮。對(duì)骨關(guān)節(jié)修復(fù)作用優(yōu)異的功能肽在250nm處有較強(qiáng)吸收。上述操作得到的帶魚(yú)活性提取物能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生成，能大量催生和補(bǔ)充關(guān)節(jié)滑液，潤(rùn)滑關(guān)節(jié)軟骨面，減少磨損，增加關(guān)節(jié)部位的靈活度；能有效促進(jìn)膠原基質(zhì)的生成，刺激結(jié)締組織細(xì)胞再生，進(jìn)而加速軟組織的重建和恢復(fù)；具有抑制微血管衍生的因子，還可增加抗體的產(chǎn)生，提高免疫能力，具有消炎和止痛的功效，可以減輕疼痛，改善運(yùn)動(dòng)能力；可以抑制軟骨降解酶的活性，從而起到預(yù)防和治療關(guān)節(jié)退行性變的作用；分子量小，人體對(duì)帶魚(yú)活性提取物的吸收利用率高，可有效增加骨密度，延緩骨質(zhì)疏松。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1）海洋生物蛋白質(zhì)無(wú)論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，海洋芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶同時(shí)對(duì)帶魚(yú)蛋白進(jìn)行酶解，可得到大量有活性的肽段；2）冷凍干燥前在產(chǎn)品中加入輔料，輔料中有氨基酸序列為hshacasyycskhshacktacakfcgtascthylsylcrvlhpgklcacvncsr的活性肽。上述活性肽通過(guò)氫鍵與具有骨關(guān)節(jié)修復(fù)的活性肽連接，能以極少量的量就能很好的保護(hù)功能性肽，使其免于儲(chǔ)藏過(guò)程中氧氣及其他因素對(duì)其結(jié)構(gòu)的破壞；3）得到的帶魚(yú)活性提取物能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生成，能大量催生和補(bǔ)充關(guān)節(jié)滑液，潤(rùn)滑關(guān)節(jié)軟骨面，減少磨損，增加關(guān)節(jié)部位的靈活度；能有效促進(jìn)膠原基質(zhì)的生成，刺激結(jié)締組織細(xì)胞再生，進(jìn)而加速軟組織的重建和恢復(fù)；具有抑制微血管衍生的因子，還可增加抗體的產(chǎn)生，提高免疫能力，具有消炎和止痛的功效，可以減輕疼痛，改善運(yùn)動(dòng)能力；可以抑制軟骨降解酶的活性，從而起到預(yù)防和治療關(guān)節(jié)退行性變的作用；分子量小，人體對(duì)帶魚(yú)活性提取物的吸收利用率高，可有效增加骨密度，延緩骨質(zhì)疏松。

具體實(shí)施例

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方案作進(jìn)一步說(shuō)明：

實(shí)施例1：

用于骨關(guān)節(jié)修復(fù)的帶魚(yú)活性提取物的制備方法，包括復(fù)合酶酶解、多級(jí)膜過(guò)濾、納濾、hplc洗脫和冷凍干燥，上述復(fù)合酶酶解步驟為采用海洋芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶酶解帶魚(yú)魚(yú)肉勻漿液，并采用超聲波輔助酶解。海洋生物蛋白質(zhì)無(wú)論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，海洋芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶同時(shí)對(duì)帶魚(yú)蛋白進(jìn)行酶解，可得到大量有活性的肽段。

冷凍干燥步驟為：預(yù)凍：-40℃預(yù)凍5h；冷凍干燥：-40℃，4pa冷凍干燥6h，-7℃，16pa冷凍干燥2.6h；升華干燥：13℃，57pa升華干燥3h；解析干燥:10℃，4pa解析干燥3h，得到用于骨關(guān)節(jié)修復(fù)的帶魚(yú)活性提取物。凍干整個(gè)過(guò)程都在程序的控制下，操作簡(jiǎn)單，工序簡(jiǎn)潔，自動(dòng)化程度高，減少了人力、物力。低溫下干燥能更好地保留活性肽的活性；低壓下干燥，活性肽不易氧化，療效更好；凍結(jié)時(shí)活性肽形成“骨架”，干燥后保存原形，為多孔疏松結(jié)構(gòu)且顏色基本不變，產(chǎn)品外觀更加優(yōu)良；復(fù)水性好，凍干活性肽能迅速吸水還原成凍干前狀態(tài)，使用方便；脫水徹底，活性肽中含水量低，且有利于長(zhǎng)途運(yùn)輸和長(zhǎng)期保存。

冷凍干燥前加入36wt%輔料，輔料的成分及其重量份為：87份右旋糖酐-40和3份活性肽。上述輔料利于產(chǎn)品成型，即防止在抽真空時(shí)藥物與水蒸氣一起飛散或成形時(shí)收縮，并且可保護(hù)活性肽。

活性肽的氨基酸序列為hshacasyycskhshacktacakfcgtascthylsylcrvlhpgklcacvncsr。上述活性肽通過(guò)氫鍵與具有骨關(guān)節(jié)修復(fù)的活性肽連接，能以極少量的量就能很好的保護(hù)功能性肽，使其免于儲(chǔ)藏過(guò)程中氧氣及其他因素對(duì)其結(jié)構(gòu)的破壞。

復(fù)合酶酶解步驟中海洋芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶的加入量為1.6wt%，酶解溫度為30℃，ph為8.0，酶解時(shí)間為50min。上述條件下，蛋白酶的加入量少且酶解效率高。

多級(jí)膜過(guò)濾步驟為先將濾液用0.3μm微濾膜過(guò)濾，濾液再分別通過(guò)截留分子量15kda、7kda的超濾膜，濃縮濾液。通過(guò)物理方式對(duì)濾液進(jìn)行純化處理，操作簡(jiǎn)單，不會(huì)破壞功能肽的活性，得到的超濾液中對(duì)骨關(guān)節(jié)有修復(fù)作用的功能肽的含量高。

hplc洗脫步驟中洗脫步驟為0~5min，用2%三氟乙酸和98%乙腈洗脫，流速為1ml/min；5~15min，用6%三氟乙酸和94%乙腈洗脫，流速為1ml/min；15~30min，用10%三氟乙酸和90%乙腈洗脫，流速為1ml/min。根據(jù)功能肽的極性設(shè)計(jì)洗脫液組分及洗脫操作，將對(duì)骨關(guān)節(jié)有修復(fù)作用的功能肽與其他物質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行進(jìn)一步純化。

hplc洗脫步驟中洗脫結(jié)束后收集在250nm有吸收的洗脫物，合并并濃縮。對(duì)骨關(guān)節(jié)修復(fù)作用優(yōu)異的功能肽在250nm處有較強(qiáng)吸收。

實(shí)施例2：

用于骨關(guān)節(jié)修復(fù)的帶魚(yú)活性提取物的制備方法，包括復(fù)合酶酶解、多級(jí)膜過(guò)濾、納濾、hplc洗脫和冷凍干燥，上述復(fù)合酶酶解步驟為采用海洋芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶酶解帶魚(yú)魚(yú)肉勻漿液，并采用超聲波輔助酶解。海洋生物蛋白質(zhì)無(wú)論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，海洋芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶同時(shí)對(duì)帶魚(yú)蛋白進(jìn)行酶解，可得到大量有活性的肽段。

冷凍干燥步驟為：預(yù)凍：-40℃預(yù)凍5h；冷凍干燥：-40℃，3pa冷凍干燥5h，-5℃，12pa冷凍干燥2h；升華干燥：13℃，52pa升華干燥3.4h；解析干燥:10℃，4pa解析干燥3h，得到用于骨關(guān)節(jié)修復(fù)的帶魚(yú)活性提取物。凍干整個(gè)過(guò)程都在程序的控制下，操作簡(jiǎn)單，工序簡(jiǎn)潔，自動(dòng)化程度高，減少了人力、物力。低溫下干燥能更好地保留活性肽的活性；低壓下干燥，活性肽不易氧化，療效更好；凍結(jié)時(shí)活性肽形成“骨架”，干燥后保存原形，為多孔疏松結(jié)構(gòu)且顏色基本不變，產(chǎn)品外觀更加優(yōu)良；復(fù)水性好，凍干活性肽能迅速吸水還原成凍干前狀態(tài)，使用方便；脫水徹底，活性肽中含水量低，且有利于長(zhǎng)途運(yùn)輸和長(zhǎng)期保存。

冷凍干燥前加入34wt%輔料，輔料的成分及其重量份為：85份右旋糖酐-40和3份活性肽。上述輔料利于產(chǎn)品成型，即防止在抽真空時(shí)藥物與水蒸氣一起飛散或成形時(shí)收縮，并且可保護(hù)活性肽。

活性肽的氨基酸序列為hshacasyycskhshacktacakfcgtascthylsylcrvlhpgklcacvncsr。上述活性肽通過(guò)氫鍵與具有骨關(guān)節(jié)修復(fù)的活性肽連接，能以極少量的量就能很好的保護(hù)功能性肽，使其免于儲(chǔ)藏過(guò)程中氧氣及其他因素對(duì)其結(jié)構(gòu)的破壞。

復(fù)合酶酶解步驟中海洋芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶的加入量為1.5wt%，酶解溫度為30℃，ph為8.0，酶解時(shí)間為44min。上述條件下，蛋白酶的加入量少且酶解效率高。

多級(jí)膜過(guò)濾步驟為先將濾液用0.3μm微濾膜過(guò)濾，濾液再分別通過(guò)截留分子量16kda、7kda的超濾膜，濃縮濾液。通過(guò)物理方式對(duì)濾液進(jìn)行純化處理，操作簡(jiǎn)單，不會(huì)破壞功能肽的活性，得到的超濾液中對(duì)骨關(guān)節(jié)有修復(fù)作用的功能肽的含量高。

hplc洗脫步驟中洗脫步驟為0~5min，用2%三氟乙酸和98%乙腈洗脫，流速為1ml/min；5~15min，用6%三氟乙酸和94%乙腈洗脫，流速為1ml/min；15~30min，用10%三氟乙酸和90%乙腈洗脫，流速為1ml/min。根據(jù)功能肽的極性設(shè)計(jì)洗脫液組分及洗脫操作，將對(duì)骨關(guān)節(jié)有修復(fù)作用的功能肽與其他物質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行進(jìn)一步純化。

hplc洗脫步驟中洗脫結(jié)束后收集在250nm有吸收的洗脫物，合并并濃縮。對(duì)骨關(guān)節(jié)修復(fù)作用優(yōu)異的功能肽在250nm處有較強(qiáng)吸收。

實(shí)施例3：

1）復(fù)合酶酶解：采用海洋芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶酶解帶魚(yú)魚(yú)肉勻漿液，并采用超聲波輔助酶解。海洋芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶的加入量為1.4wt%，酶解溫度為30℃，ph為8.0，酶解時(shí)間為44min，超聲波頻率為25khz。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶3min。海洋生物蛋白質(zhì)無(wú)論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，海洋芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶同時(shí)對(duì)帶魚(yú)蛋白進(jìn)行酶解，可得到大量有活性的肽段；

2）多級(jí)膜過(guò)濾：先將濾液用0.3μm微濾膜過(guò)濾，濾液再分別通過(guò)截留分子量16kda、7kda的超濾膜，濃縮濾液至原來(lái)體積的1/20。通過(guò)物理方式對(duì)濾液進(jìn)行純化處理，操作簡(jiǎn)單，不會(huì)破壞功能肽的活性，得到的超濾液中對(duì)骨關(guān)節(jié)有修復(fù)作用的功能肽的含量高；

3）納濾：將步驟2得到的濃縮液進(jìn)行納濾操作，納濾膜的分離機(jī)理為篩分和溶解擴(kuò)散并存，同時(shí)又具有電荷排斥效應(yīng)，可以有效地去除二價(jià)和多價(jià)離子、去除分子量大于200的各類(lèi)物質(zhì)，可部分去除單價(jià)離子和分子量低于200的物質(zhì)，能很好的達(dá)到去鹽和分子量大于200的雜質(zhì)的目的；

4）hplc洗脫：hplc洗脫步驟中洗脫步驟為0~5min，用2%三氟乙酸和98%乙腈洗脫，流速為1ml/min；5~15min，用6%三氟乙酸和94%乙腈洗脫，流速為1ml/min；15~30min，用10%三氟乙酸和90%乙腈洗脫，流速為1ml/min。洗脫結(jié)束后收集在250nm有吸收的洗脫物，合并并濃縮至原來(lái)體積的1/30；

5）冷凍干燥：在步驟4得到的濃縮液中加入35wt%輔料進(jìn)行冷凍干燥。輔料的成分及其重量份：86份右旋糖酐-40和3份活性肽?；钚噪牡陌被嵝蛄袨閔shacasyycskhshacktacakfcgtascthylsylcrvlhpgklcacvncsr。預(yù)凍：-40℃預(yù)凍5h；冷凍干燥：-40℃，3pa冷凍干燥5h，-5℃，12pa冷凍干燥2h；升華干燥：13℃，52pa升華干燥3.4h；解析干燥:10℃，4pa解析干燥3h，得到用于骨關(guān)節(jié)修復(fù)的帶魚(yú)活性提取物。

本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進(jìn)行贅述。

以上所述的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類(lèi)似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>蘭溪市捷喜食品加工技術(shù)有限公司

<120>用于骨關(guān)節(jié)修復(fù)的帶魚(yú)活性提取物的制備方法

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