水不溶性高分子化合物的分解物的連續(xù)制造方法
【專利摘要】本發(fā)明的課題在于，通過容易的操作且高效地使水不溶性蛋白質(zhì)、水不溶性多糖類等水不溶性高分子化合物進行可溶化和低分子化，從而制造新型的功能性材料。根據(jù)本發(fā)明來提供水不溶性高分子化合物的分解物的制造方法，其包括如下的各工序：使固體酸催化劑接觸水不溶性高分子化合物并進行加熱處理后，回收上清液的工序；向回收上清液后的固體酸催化劑中添加水性介質(zhì)并攪拌，進行加熱處理后，進一步回收上清液的工序；用水性介質(zhì)清洗該固體酸催化劑，回收清洗液的工序；將回收的上清液與清洗液合并，得到非吸附于固體酸催化劑的級分的工序；以及，使吸附的成分從該固體酸催化劑中溶出，回收溶出液，得到吸附于固體酸催化劑的級分的工序。
【專利說明】
水不溶性高分子化合物的分解物的連續(xù)制造方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及對水不溶性高分子化合物(蛋白質(zhì)或多糖類)進行可溶化和低分子化， 從而連續(xù)地制造水不溶性高分子化合物(蛋白質(zhì)或多糖類)的分解物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，作為藥品、飲料食品、化妝品的材料而著眼于功能性蛋白質(zhì)、功能性膚。其 中，作為其代表例，可列舉出具備與骨?關(guān)節(jié)疾病相伴的癥狀的緩和作用、美膚作用、骨形 成作用等的膠原及其分解物、即膠原膚。膠原或膠原膚的原料主要是魚、牛、豬、雞皮、骨、腫 等，水母類也被用作原料之一，提出了經(jīng)由對水母類進行凍結(jié)?解凍?低溫膽藏?攬拌等 處理工序而從水母類中有效回收未改性膠原的方法(專利文獻1、2等）。
[0003] 近年來，在日本沿岸各地大量出現(xiàn)水母類成為嚴重的社會問題，其對漁業(yè)造成重 大的損害，并且，水母類會聚集在工廠、發(fā)電廠等的取水口，為了將其去除、對其進行廢棄處 理會耗費成本，因此，如上所述，作為膠原的原料期望實現(xiàn)水母的有效利用。截止至今的現(xiàn) 狀是:被用作膠原原料的水母類主要是小型且容易液化的海月水母，可食用水母(esculent jellyfish)等大型且水不溶性蛋白質(zhì)多的水母類尚未有效利用。
[0004] -般來說，水不溶性蛋白質(zhì)的可溶化和低分子化通過加熱處理、酸或堿處理、蛋白 分解酶（蛋白酶)處理等來進行。然而，加熱處理存在因蛋白質(zhì)種類的不同而發(fā)生熱改性的 問題。酸或堿處理中有可能破壞氨基酸，處理后的廢液處理耗時耗力。另外，蛋白分解酶處 理中，為了配合所用酶的最佳條件，需要設(shè)定?控制溫度、pH，處理物中殘留有酶時，還需要 失活、去除酶的操作。
[0005] 另外，使用固體酸催化劑使蛋白質(zhì)水解的方法(專利文獻3)是已知的，其還用于制 造水母膠原膚(專利文獻4)。然而，運些例子均W可溶性蛋白質(zhì)作為對象，未進行水不溶性 蛋白質(zhì)的可溶化和低分子化。
[0006] 另一方面，作為木質(zhì)系生物質(zhì)資源的有效活用，研究了由纖維素、半纖維素、木素 構(gòu)成的木質(zhì)纖維素的分解技術(shù)，但其與上述水不溶性蛋白質(zhì)存在相同的問題。例如，作為木 質(zhì)纖維素的分解技術(shù)，有酸糖化法、酶糖化法，使用了硫酸的酸糖化法雖然存在快速反應(yīng)的 優(yōu)點，但存在產(chǎn)物(單糖)過度分解的問題，酸的廢液處理存在污染環(huán)境的問題。另外，使用 了纖維素酶的酶糖化法存在環(huán)境污染小的優(yōu)點，但是，纖維素具有e-葡萄糖分子介由1，4糖 巧鍵聚合而成的高分子彼此進行氨鍵合、不溶于水的穩(wěn)固的晶體結(jié)構(gòu)，因此，存在與纖維素 酶接觸的面積少、反應(yīng)慢的問題。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)文獻 專利文獻 專利文獻1:日本特開2007-051191號 專利文獻2:日本特開2008-031106號 專利文獻3:日本特開2009-120511號 專利文獻4:日本特開2013-95708號。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 發(fā)明要解決的問題 因此，本發(fā)明的課題在于，通過容易的操作且高效地使水不溶性蛋白質(zhì)、水不溶性多糖 類等水不溶性高分子化合物進行可溶化和低分子化，從而制造新型的功能性材料。
[0009] 用于解決問題的手段 本發(fā)明人等為了解決上述課題而重復(fù)進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn):利用固體酸催化劑 對水不溶性蛋白質(zhì)進行處理時，水不溶性蛋白質(zhì)分解物令人驚訝地主要得到非吸附于固體 酸催化劑的級分。并且，通過在重復(fù)進行非吸附級分的回收操作后，進一步合并從固體酸催 化劑中溶出的吸附級分，從而成功地W高收率連續(xù)地制造水不溶性蛋白質(zhì)分解物，由此完 成了本發(fā)明。
[0010] 旨P，本發(fā)明包括W下的發(fā)明。
[0011] (1)水不溶性高分子化合物的分解物的制造方法，其包括W下的工序： (A) 使固體酸催化劑接觸水不溶性高分子化合物后，進行加熱處理，并回收上清液的工 序； (B) 在工序(A)之后，向該固體酸催化劑中添加水性介質(zhì)并攬拌，進行加熱處理后，回收 上清液的工序； (C) 在工序(B)之后，用水性介質(zhì)清洗該固體酸催化劑，并回收清洗液的工序； (D) 將工序(A)中回收的上清液、工序(B)中回收的上清液和工序(C)的清洗液合并，得 到非吸附于固體酸催化劑的級分的工序； (E) 在工序(D)之后，使吸附的成分從該固體酸催化劑中溶出，回收溶出液，得到吸附于 固體酸催化劑的級分的工序。
[0012] (2)根據(jù)（1)所述的方法，其中，水不溶性高分子化合物為水不溶性蛋白質(zhì)或水不 溶性多糖類。
[0013] (3)根據(jù)（1)或(2)所述的方法，其還包括在使水不溶性高分子化合物接觸固體酸 催化劑之前浸潤至水性介質(zhì)的工序。
[0014] (4)根據(jù)（1)~(3)中任一項所述的方法，其中，水不溶性高分子化合物的量相對于 固體酸催化劑W質(zhì)量比計為0.01~0.5倍。
[0015] (5)根據(jù)（1)~(4)中任一項所述的方法，其中，在前述工序(A)中，調(diào)整水不溶性高 分子化合物與固體酸催化劑接觸時的水性介質(zhì)的量，W使其相對于固體酸催化劑W質(zhì)量比 計達到^50倍。
[0016] (6)根據(jù)（1)~巧）中任一項所述的方法，其中，前述工序(A)和(B)的加熱處理在40~ 160°C下進行0.^168小時。
[0017] (7)根據(jù)（1)~(6)中任一項所述的方法，其中，分別重復(fù)多次前述工序(A)和(B)的 操作，直至非吸附級分中的水不溶性高分子化合物的分解物的收率達到50%W上為止。
[0018] (8)根據(jù)（1)~(7)中任一項所述的方法，其中，固體酸催化劑為選自陽離子交換體、 沸石和娃藻±中的至少1種。
[0019] 發(fā)明的效果 根據(jù)本發(fā)明，可提供水不溶性高分子化合物的分解物的制造方法。通過使用本發(fā)明的 方法，能夠高效且低成本地由截止至今未被有效利用的材料連續(xù)地制造水不溶性高分子化 合物的分解物。另外，本發(fā)明的方法與W往的加熱處理、酸或堿處理、蛋白分解或糖分解酶 處理不同，不存在高分子化合物的無用的改性，可進行確實的水解處理，在制造工序中不需 要復(fù)雜的操作、特殊的控制。
[0020] 本申請基于2013年12月25日申請的日本專利申請2013-267662號而要求優(yōu)先權(quán)， 包括該專利申請的說明書中記載的內(nèi)容。
【附圖說明】
[0021] 圖1示出作為本發(fā)明的一個實施方式的水不溶性蛋白質(zhì)分解物的連續(xù)制造方法的 工序圖。
[0022] 圖2示出作為本發(fā)明的一個實施方式的水不溶性蛋白質(zhì)分解物的連續(xù)制造方法中 的非吸附于固體酸催化劑的級分(上清液)的回收方法的一個實施方式。
[0023] 圖3示出非吸附于固體酸催化劑的級分中的水不溶性蛋白質(zhì)分解物(可食用水母 傘部的膠原膚）的回收量變遷（圖3a:反應(yīng)時間24小時、圖3b:反應(yīng)時間48小時）W及基于反 應(yīng)時間的吸附量對比（圖3c)。
[0024] 圖4中，圖4a示出非吸附于固體酸催化劑的級分中的水不溶性蛋白質(zhì)分解物(可食 用水母傘部的膠原膚）的分子量分布(反應(yīng)時間24小時、上圖：回收液第^6次、下圖：回收液 第7~12次、支鏈淀粉標準品分子量Ml:112kDa、M2:47.3kDa、M3:22.8kDa、M4:11.8kDa、 M5:5.化化）。圖4b示出非吸附于固體酸催化劑的級分中的水不溶性蛋白質(zhì)分解物(可食用 水母傘部的膠原膚）的分子量分布(反應(yīng)時間48小時、支鏈淀粉標準品分子量Ml: 112kDa、 M2:47.3kDa、M3:22.8kDa、M4:11.8kDa、M5:5.9kDa)。
[0025] 圖5示出吸附于固體酸催化劑的級分中的水不溶性蛋白質(zhì)分解物(可食用水母傘 部的膠原膚）的分子量分布(上圖：反應(yīng)時間24小時、下圖：反應(yīng)時間48小時、支鏈淀粉標準 品分子量Ml: 112kDa、M2:47.3kDa、M3:22.8kDa、M4:11.8kDa、M5:5.9kDa)。
[0026] 圖6示出非吸附于固體酸催化劑的級分中的水不溶性蛋白質(zhì)分解物(絲膠膚)的回 收量的變遷。
[0027] 圖7示出非吸附于固體酸催化劑的級分中的水不溶性蛋白質(zhì)分解物(絲膠膚)的分 子量分布（上圖：回收液第1~6次、下圖：回收液第7~12次、支鏈淀粉標準品分子量Ml: 112kDa、M2:47.3kDa、M3:22.8kDa、M4:11.8kDa、M5:5.9kDa)。
[0028] 圖8示出吸附于固體酸催化劑的級分中的水不溶性蛋白質(zhì)分解物(絲膠膚）的分子 量分布（支鏈淀粉標準品分子量]?1:11化1)曰、12:47.31^)曰、13:22.81^)曰、]\14:11.81^)曰、15: S.l^Da)。
[0029] 圖9示出非吸附于固體酸催化劑的級分中的水不溶性蛋白質(zhì)分解物(角蛋白膚）的 分子量分布（上圖：回收液第1~5次、下圖：回收液第6~8次、支鏈淀粉標準品分子量Ml : 112kDa、 M2:47.3kDa、 M3:22.8kDa、 M4:11.8kDa、 M5:5.9kDa)。
[0030] 圖10示出吸附于固體酸催化劑的級分中的水不溶性蛋白質(zhì)分解物（角蛋白膚）的 分子量分布(支鏈淀粉標準品分子量Ml:112kDa、M2:47.3kDa、M3:22.8kDa、M4:11.8kDa、 M5:5.9kDa)。
[0031] 圖11示出非吸附于固體酸催化劑的級分中的水不溶性多糖類分解物(瓊脂寡糖） 的回收量的變遷。
[0032] 圖12示出非吸附于固體酸催化劑的級分中的水不溶性多糖類分解物(瓊脂寡糖） 的分子量分布(對照物質(zhì)Ml:5.9kDa(昭和電工株式會社制Shodex STANDARD P-82、M2:3糖 (蜜S糖）、M3:2糖(薦糖）、M4:1糖(葡萄糖））。
【具體實施方式】
[0033] W下針對本發(fā)明進行詳細說明。
[0034] 本發(fā)明是水不溶性高分子化合物的分解物的制造方法，其包括W下的工序。圖1示 出其制造工序的概要。
[0035] (A)使固體酸催化劑接觸水不溶性高分子化合物后，進行加熱處理，并回收上清液 的工序； (B) 在工序(A)之后，向該固體酸催化劑中添加水性介質(zhì)并攬拌，進行加熱處理后，回收 上清液的工序； (C) 在工序(B)之后，用水性介質(zhì)清洗該固體酸催化劑，并回收清洗液的工序； (D) 將工序(A)中回收的上清液、工序(B)中回收的上清液和工序(C)的清洗液合并，得 到非吸附于固體酸催化劑的級分的工序； (E) 在工序(D)之后，使吸附的成分從該固體酸催化劑中溶出，回收溶出液，得到吸附于 固體酸催化劑的級分的工序。
[0036] 作為本發(fā)明方法中使用的"水不溶性高分子化合物"，優(yōu)選為水不溶性蛋白質(zhì)或水 不溶性多糖類。另外，本發(fā)明中，"水不溶性高分子化合物的分解物"只要是水不溶性高分子 化合物經(jīng)可溶化?分解而得到的物質(zhì)即可，則平均分子量、分子量分布不限。
[0037] 工序(A): 工序(A)中，使固體酸催化劑接觸水不溶性高分子化合物后，進行加熱處理，回收上清 液。本發(fā)明中，"水不溶性"是指無法溶于水的狀態(tài)。
[0038] 水不溶性高分子化合物中包括水不溶性蛋白質(zhì)或水不溶性多糖類，可W是動物 性，也可W是植物性，另外，種類也沒有特別限定。作為水不溶性蛋白質(zhì)，可列舉出例如膠 原、絲膠、絲蛋白、角蛋白、酪蛋白、白蛋白、球蛋白、彈性蛋白、肌凝蛋白、肌動蛋白、乳清蛋 白、大豆蛋白、小麥蛋白、胡麻蛋白、卵蛋白等。其中，優(yōu)選為水母類的膠原，水母類沒有限 定，可列舉出隸屬于鉢水母綱（S巧地ozoa)、根口目（化izostomeae)的可食用水母、越前水 母、硝水母、Thysanostoma thysanura、蝶形棱口水母、Cephea cephea(斗樂夕弓欠）、海蜜 (Rhopilema asamushi)、Cassiopea ornate(哥力哥夕弓欠）等。另外，作為水不溶性多糖 類，可列舉出纖維素、半纖維素、木質(zhì)纖維素、菊糖、果膠、葡聚糖、角叉菜多糖、瓊脂糖、幾下 質(zhì)、幾下糖等。對于水不溶性高分子化合物原料，為了通過與固定酸催化劑接觸來促進可溶 化?低分子化，優(yōu)選的是，使用裁切機、切肉機、切割器等作為前處理來進行粗粉碎，進而進 行粉末化。粉末化例如可利用鍵磨機、珠磨機、漉磨機、銷磨機、共混器等本領(lǐng)域技術(shù)人員通 常使用的機械來進行。
[0039] 進行了上述前處理的水不溶性高分子化合物可W在與固體酸催化劑接觸之前，浸 潤于水性介質(zhì)。浸潤因水不溶性高分子化合物的種類而異，優(yōu)選進行^36小時左右。
[0040] 本發(fā)明中使用的固體酸催化劑優(yōu)選為選自陽離子交換體、沸石和娃藻±中的至少 一種，更優(yōu)選為陽離子交換體。運些固體酸催化劑可w僅使用1種，也可w組合使用巧中w 上。
[0041] 陽離子交換體優(yōu)選為具有橫基、簇基中的至少1種的樹脂，橫基、簇基可W分別是 橫基丙基、簇甲基。在陽離子交換體的抗衡離子為質(zhì)子W外的情況下，優(yōu)選置換成質(zhì)子型后 進行使用。橫酸型陽離子交換體是指包含橫酸基(-S0抽)的具有陽離子交換能力的離子交 換體，作為優(yōu)選形態(tài)，可列舉出包含橫酸基的陽離子交換樹脂和包含橫酸基的陽離子交換 膜。作為優(yōu)選的陽離子交換樹脂，可列舉出東曹株式會社制造的T0Y0PEARL SP-650C、SP- 550C等那樣地包含親水性乙締基聚合物作為基材的樹脂;Nafion(注冊商標)等那樣地包含 全氣橫酸的聚四氣乙締共聚物。
[0042] 沸石只要是通常被用作沸石催化劑的沸石即可使用，沒有特別限定，可列舉出例 如東曹株式會社制造的節(jié)才弓厶（注冊商標)等。
[0043] 娃藻±只要能夠作為酸催化劑而發(fā)揮功能即可使用，沒有特別限定，可列舉出例 如和光純藥工業(yè)株式會社制造的娃藻±(顆粒狀)等。
[0044] 本發(fā)明中使用的固體酸催化劑的形狀可W是粒狀、粉末狀中的任一者。另外，可適 合地使用平均粒徑為化m~2mm左右、離子交換容量為0.01~leq/L左右的催化劑。
[0045] 前述固體酸催化劑優(yōu)選為多孔質(zhì)體。例如，前述東曹株式會社制造的T0Y0PEARL SP-650C、SP-550C是向凝膠過濾色譜用填充劑中導(dǎo)入橫酸基作為離子交換基團的多孔質(zhì) 體。關(guān)于多孔質(zhì)體的細孔尺寸，適當(dāng)?shù)募毧壮叽缫蛩蝗苄愿叻肿踊衔锏哪繕朔肿恿慷?異，例如為0. (H~0.75皿、優(yōu)選為0.05~0.6皿。
[0046] 水不溶性高分子化合物與固體酸催化劑接觸時的水性介質(zhì)的量還配合著用于濕 潤水不溶性高分子化合物的水性介質(zhì)，相對于固體酸催化劑W質(zhì)量比計為^50倍、優(yōu)選為5 ~15倍。本發(fā)明的方法中，為了 W水不溶性高分子化合物的分解物為主而回收至固體酸催化 劑的非吸附級分(上清液），水性介質(zhì)的量低于上述范圍時，需要進行離屯、分離操作，故不優(yōu) 選。另外，水性介質(zhì)的量超過上述范圍時，作業(yè)效率變差，故不優(yōu)選。本發(fā)明中，水不溶性高 分子化合物的浸潤W及水不溶性高分子化合物與固體酸催化劑的接觸中使用的水性介質(zhì) 只要不妨礙水不溶性高分子化合物與固體酸催化劑的反應(yīng)就沒有特別限定，可列舉出例如 水(離子交換水、純化水、R0水、自來水、井水等）、憐酸鹽、碳酸鹽、乙酸鹽、棚酸鹽、巧樣酸 鹽、TRIS等緩沖液、氯化鋼、氯化鐘、氯化巧等無機鹽水溶液等。另外，鹽濃度優(yōu)選為ImM~ 0.1M左右的低濃度。
[0047] 水不溶性高分子化合物的量可根據(jù)固體酸催化劑的催化劑能力來適當(dāng)確定，例 如，相對于固體酸催化劑，W質(zhì)量比計為0.01~0.5倍、優(yōu)選為0.05~0.2倍。
[0048] 固體酸催化劑與水不溶性高分子化合物接觸后的加熱處理對于良好地推進水不 溶性高分子化合物的可溶化和低分子化反應(yīng)而言是必須的。加熱溫度為40~160°C、優(yōu)選為 60~120°C、更優(yōu)選為80~100°C，加熱時間取決于加熱溫度，為0.1~168小時、優(yōu)選為10~72小 時、更優(yōu)選為24~48小時。例如，水不溶性高分子化合物為水不溶性蛋白質(zhì)時，重要的是，其 低分子化停留在分解至膚為止，在高溫下長時間處理時，水不溶性蛋白質(zhì)有可能被水解為 氨基酸，因此優(yōu)選的是，處理溫度越為高溫，則越減少處理時間。
[0049] 本發(fā)明中，水不溶性高分子化合物與固體酸催化劑的接觸優(yōu)選用間歇法進行。用 間歇法進行時，將容器內(nèi)的固體酸催化劑與水不溶性高分子化合物充分混合后，進行加熱。 加熱優(yōu)選在密封容器后進行。加熱條件如上所示。間歇法中使用的容器可w是1個，也可w 是多個。
[0050] 進行上述加熱處理后，回收上清液。上清液的回收可通過沉降分離、上浮分離、過 濾、膜分離、離屯、分離等方法來進行，沉降分離是簡便的，故而優(yōu)選。將上清液的回收方法的 例子示于圖2。固體酸催化劑比水性介質(zhì)更重，因此，若靜置則通常在15分鐘左右發(fā)生沉淀， 在實際操作中，可W在罐底的略上方（固體酸催化劑的沉淀位置的略上方)設(shè)置排液閥，由 此進行排液來回收上清液?；蛘?，也可W在罐底設(shè)置具有如下孔徑的過濾器，由此進行排液 來回收上清液，所述孔徑會使包含水不溶性高分子化合物的分解物的上清液穿過，但固體 酸催化劑無法穿過。
[0051] 該工序中的上述一系列操作（水不溶性高分子化合物與固體酸催化劑的接觸、加 熱處理、上清液的回收)要進行多次。針對次數(shù)，可根據(jù)水不溶性高分子化合物的種類、該工 序的目標收率來適當(dāng)變更，可例示出4~5次左右。關(guān)于重復(fù)次數(shù)，W將該工序的上清液、下一 工序(B)的上清液和下一工序(C)的清洗液合并的非吸附級分中的水不溶性高分子化合物 的分解物的收率達到50% W上、優(yōu)選達到65% W上、更優(yōu)選達到70% W上、最優(yōu)選達到80% W上 的方式進行確定。關(guān)于水不溶性高分子化合物與固體酸催化劑的各次接觸，從基于固體酸 催化劑的水不溶性高分子化合物的可溶化?低分子化效率的觀點出發(fā)，優(yōu)選的是，將要處 理的水不溶性高分子化合物的總量分成等量來進行。
[0化。工序(B): 工序(B)中，在工序(A)之后，向該固體酸催化劑中添加水性介質(zhì)并攬拌，進行加熱處理 后，回收上清液。通過該工序，在工序(A)中未被可溶化而附著于固體酸催化劑表面的水不 溶性高分子化合物發(fā)生可溶化和低分子化，從而能夠回收。該工序的加熱處理按照前述固 體酸催化劑與水不溶性高分子化合物接觸時的加熱處理條件(溫度和時間）進行即可。另 夕h該工序的回收操作還優(yōu)選進行多次。針對次數(shù)，可根據(jù)水不溶性高分子化合物的種類、 工序(A)中的水不溶性高分子化合物的分解物的收率和最終目標收率來適當(dāng)變更，可例示 出3~6次左右。重復(fù)次數(shù)W將工序(A)的上清液、工序(B)的上清液和下一工序(C)的清洗液 合并的非吸附級分中的水不溶性高分子化合物的分解物的收率達到50%W上、優(yōu)選達到65% W上、更優(yōu)選達到70%W上、最優(yōu)選達到80%W上的方式確定即可。上清液的回收可W與工序 (A)同樣地進行。
[005；3]工序(C): 工序(C)中，在工序(B)之后，用水性介質(zhì)清洗固體酸催化劑，回收清洗液。該工序中，不 進行加熱處理，用水性介質(zhì)對固體酸催化劑進行1次清洗即可。
[0054]工序(D): 工序(D)中，將工序(A)中回收的上清液、工序(B)中回收的上清液和工序(C)中回收的 清洗液合并，得到非吸附于固體酸催化劑的級分。通過該工序，能夠通過與固體酸催化劑的 反應(yīng)來進行可溶化?低分子化，并且，W高收率得到非吸附于固體酸催化劑的水不溶性高 分子化合物。
[00巧]工序化）: 工序(E)中，在工序(D)之后，使吸附的成分從固體酸催化劑中溶出，回收溶出液，得到 吸附于固體酸催化劑的級分。溶出可使用W高濃度(0.1MW上)包含氯化鋼等鹽的水溶液或 鹽酸、=氣乙酸等酸、=乙胺等堿等。根據(jù)本發(fā)明的方法，利用上述工序(AMD)能夠W高收 率得到水不溶性高分子化合物的分解物，進而，根據(jù)該工序，在通過與固體酸催化劑的反應(yīng) 而進行了可溶化?低分子化的水不溶性高分子化合物的分解物之中，還能夠得到吸附于固 體酸催化劑的水不溶性高分子化合物的分解物，能夠進一步提高收率。
[0056] 工序(D)中得到的非吸附級分和工序(E)中得到的吸附級分可W分別干燥而制成 最終制品，另外，也可W在混合后進行干燥而制成最終制品。作為干燥方法，沒有特別限定， 可列舉出自然干燥、凍結(jié)干燥、送風(fēng)干燥、溫風(fēng)干燥、真空干燥、基于微波照射的干燥等方 法。 實施例
[0057] W下，通過實施例來更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限定于運些實施例。
[0058] (實施例1)可食用水母傘部的不溶性膠原的可溶化.低分子化 (1)可食用水母傘部的不溶性膠原的制備 將日本福岡縣柳川市的有明海中采取的可食用水母分離成傘部和口腕部。將處于傘部 內(nèi)側(cè)的褐色皮剝掉后，用自來水進行清洗，進一步用微酸性電解水、臭氧水進行清洗殺菌。 切取1kg個體，破碎成1mm~1cm的方形斷片。用紗布過濾，得到包含不溶性膠原的固體。將所 得固體用9倍量的R0水進行懸濁，通過過濾來回收固體。將該操作進一步重復(fù)2次，進行清 洗?脫鹽。對回收的固體進行凍結(jié)干燥，干燥后利用共混器進行粉末化，從而得到不溶性膠 原粉末。
[0059] (2)基于固體酸催化劑的可食用水母傘部的不溶性膠原的可溶化?低分子化 (2-1)反應(yīng)時間為24小時 用90ml的R0水使（1)中制備的不溶性膠原粉末Ig濕潤1晚后，與陽離子交換樹脂 (T0Y0PEA化SP-550C)lOmr混合，充分攬拌。使其W80°C反應(yīng)24小時而進行可溶化后，進行 冷卻，回收包含膠原膚的上清液。接著，與上述同樣操作，使（1)中制備的可食用水母傘部的 不溶性膠原粉末濕潤1晚后，添加至前述上清液回收后的陽離子交換樹脂，用R0水定容至 100ml后，充分攬拌。使其W80°C反應(yīng)24小時，再次回收上清液。將該操作進一步重復(fù)3次（回 收^5次結(jié)束）?？墒秤盟競悴康牟蝗苄阅z原粉末各次使用等量，共計使用5g。
[0060] 向殘留的陽離子交換樹脂中添加 R0水，定容至100ml，充分攬拌。使其W80°C反應(yīng) 24小時后，回收上清液。將該操作進一步重復(fù)6次（回收6~11次結(jié)束）。將殘留的陽離子交換 樹脂用30ml的R0水進行清洗。將回收的上清液與清洗液混合，得到未吸附至陽離子交換樹 脂的分子量(Mp)12kDaW下的膠原膚液。
[0061] 圖3a示出回收的上清液中的膠原膚(非吸附膚)的量的變遷(反應(yīng)時間為24小時）。
[0062] 接著，向清洗后的陽離子交換樹脂中添加 0.5M化C1 30ml，從樹脂中溶出包含膠 原膚的分解物。將其進一步重復(fù)3次，將所有溶出液混合，得到吸附于陽離子交換樹脂的分 子量(Mp)12kDaW下的膠原膚液。
[0063] (2-2)反應(yīng)時間為48小時 用90ml的R0水使（1)中制備的不溶性膠原粉末Ig濕潤1晚后，與陽離子交換樹脂 (T0Y0PEA化SP-550C)lOmr混合，充分攬拌。使其W80°C反應(yīng)48小時而進行可溶化后，進行 冷卻，回收包含膠原膚的上清液。接著，與上述同樣操作，使（1)中制備的可食用水母傘部的 不溶性膠原粉末濕潤1晚后，添加至前述上清液回收后的陽離子交換樹脂，用RO水定容至 100ml后，充分攬拌。使其W80°C反應(yīng)48小時，再次回收上清液。將該操作進一步重復(fù)3次（回 收^5次結(jié)束）?？墒秤盟競悴康牟蝗苄阅z原粉末各次使用等量，共計使用5g。
[0064] 向殘留的陽離子交換樹脂中添加 R0水，定容至100ml，充分攬拌。使其W80°C反應(yīng) 48小時后，回收上清液。將該操作進一步重復(fù)2次（回收6~8次結(jié)束）。將殘留的陽離子交換樹 脂用80ml的R0水進行清洗。將回收的上清液與清洗液混合，得到未吸附于陽離子交換樹脂 的分子量(Mp)12kDaW下的膠原膚液。
[0065] 圖3b示出回收的上清液中的膠原膚(非吸附膚)的量的變遷(反應(yīng)時間為48小時）。
[0066] 接著，向清洗后的陽離子交換樹脂中添加0.5M化C1 50ml，從樹脂中溶出包含膠 原膚的分解物。將該操作進一步重復(fù)2次，將所有的溶出液混合，得到吸附于陽離子交換樹 脂的分子量(Mp)12kDaW下的膠原膚液。
[0067] (3)膚混合物的定量 (3-1)膠原膚標準樣品的制備 用100ml的R0水使可食用水母傘部的不溶性膠原粉末Ig濕潤1晚后，與陽離子交換樹脂 (T0Y0PEA化SP-550C)lOOg混合，充分攬拌。使其W80°C反應(yīng)24小時而進行可溶化后，進行 冷卻，用R0水500ml進行清洗。將清洗后的樹脂用5%S乙胺/10%乙臘100ml提取3次。與所得 提取液混合后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮干固。用R0水溶解已干固的提取物，進行凍結(jié)干燥。 將所得干燥物調(diào)整至3.00、1.50、0.75、0.375、0.188mg/ml，用于膠原膚定量用的標準曲線。 [006引（3-2)膚量的測定 (2)中使用的膠原膚量的測定使用了PIERCE公司制造的BCA protein assay kit。將 BCA protein assay reagent A與BCA protein assay reagent BW50:1 進行混合，將其制 成BCA reagent。將樣品10化1與BCA reagent 2ml混合，W37°C培養(yǎng)15分鐘后，用562 nm測 定吸光度。吸光度測定使用了S紳公司制造的數(shù)碼比色計mini photo 10。由利用（3-1)制 作的膠原膚標準曲線計算膚量。
[0069] 將反應(yīng)24小時的測定結(jié)果示于表1和表2?；厥盏纳锨逡褐械哪z原膚(非吸附膚)量 為3.65g、收率為73%。另外，回收的溶出液中的膠原膚(吸附膚)量為0.86 g、收率為17%。
[0070] [表1]
[0071] [表 2]
[0072] 將反應(yīng)48小時的測定結(jié)果示于表3和表4?；厥盏纳锨逡褐械哪z原膚(非吸附膚)量 為3.58g、收率為72%。另外，回收的溶出液中的膠原膚(吸附膚)量為0.77g、收率為15%。
[0073] [表 3]
[00；
[0075] 如上所示，反應(yīng)時間為24小時和48小時時，收率沒有顯著差異，反應(yīng)時間為48小時 時，回收次數(shù)少即可，可W說是有效的。
[0076] (4)膚混合物的分子量分布的分析 使用凝膠滲透色譜測定(2)中得到的膠原膚的分子量分布。W下示出測定條件。 a) HPLC裝置:使用了累化Sciences公司制化-7410、自動取樣器化Sciences公司制 化-7420、柱恒溫槽化Sciences公司制C0631C、UV檢測器島津制作所制SPD-10AV和日立 公司制k4200、RI檢測器化Sciences公司制化-7454、真空Degasser Gastorr公司制AG- 14。 b) 柱：東曹株式會社制TSKgel G3000SWXL(7.8X300mm，5皿） c) 流動相:50mM憐酸鋼緩沖液/50mM氯化鋼(pH 7.0) d) 流速:0.5ml/min e) 溫度:20 C f) 測定波長:215nm、280nm g) 分子量測定用標準品昭和電工公司制造的化odex STANDA畑P-82達到0.1%的 方式進行制備，作為分子量測定用標準液。
[0077] 圖4示出上清液中的膠原膚（非吸附膚）的分子量分布（支鏈淀粉標準品分子量 Ml: 112kDa、M2:47.3kDa、M3:22.8kDa、M4:11.8kDa、M5:5.9kDa)。反應(yīng)時間為24小時時，回收 第1次、第2次能夠得到支鏈淀粉分子量換算為5.化化W下的尖銳的峰，其后在高分子側(cè)得 到寬闊的峰(圖4曰）。反應(yīng)時間為48小時時，峰從高分子側(cè)略微向低分子側(cè)位移(圖4b)。
[0078] 圖5示出溶出液中的膠原膚（吸附膚）的分子量分布(支鏈淀粉標準品分子量Ml: 112kDa、M2:47.3kDa、M3:22.8kDa、M4:11.8kDa、M5:5.化 Da)。吸附膚的分子量低于非吸附 膚，峰值為5.9kDaW下。另外，不受反應(yīng)時間的影響，反應(yīng)24小時和反應(yīng)48小時時，分子量分 布大致相同。
[00巧](實施例2)絲膠的可溶化?低分子化 (1)基于固體酸催化劑的絲膠的可溶化.低分子化 用90ml的R0水使絲膠粉末(高原公司制）1 g濕潤1晚后，與陽離子交換樹脂(T0Y0PEA化 SP-550C)10ml混合，充分攬拌。使其W80°C反應(yīng)24小時而進行可溶化后，進行冷卻，回收包 含絲膠膚的上清液。接著，與上述同樣操作，使絲膠粉末濕潤1晚后，將上述上清液添加至回 收后的陽離子交換樹脂，用R0水定容至100ml后，充分攬拌。使其W80°C反應(yīng)24小時，再次回 收上清液。將該操作進一步重復(fù)3次（回收1~5次結(jié)束）。絲膠粉末各次使用等量，共計使用 5邑。向殘留的陽離子交換樹脂中添加 R0水，定容至100ml，充分攬拌。使其W80°C反應(yīng)24小時 后，回收上清液。將該操作進一步重復(fù)6次（回收6~11次結(jié)束）。將殘留的陽離子交換樹脂用 60ml的R0水進行清洗。將回收的上清液與清洗液混合，得到未吸附于陽離子交換樹脂的分 子量(Mp巧.9kDa W下的絲膠膚液。
[0080] 圖6示出回收的上清液中的絲膠膚(非吸附膚)的量的變遷。
[0081] 接著，向清洗后的陽離子交換樹脂中添加0.5M化C1 60ml，從樹脂中溶出包含絲 膠膚的分解物。將其進一步重復(fù)3次，將所有溶出液混合，得到吸附于陽離子交換樹脂的分 子量(Mp巧.9kDa W下的絲膠膚液。
[0082] (2)膚混合物的定量 (2-1)絲膠膚標準樣品的制備 對（1)中得到的非吸附于陽離子交換樹脂的絲膠膚液進行凍結(jié)干燥。將所得干燥物調(diào) 整至0.75、0.375、0.188、0.094mg/ml，用于絲膠膚定量用的標準曲線。
[0083] (2-2)絲膠膚量的測定 (1)中得到的絲膠膚量的測定除了使用上述絲膠膚定量用的標準曲線之外，與實施例1 的(3-2)同樣操作來進行。
[0084] 將上述的測定結(jié)果示于表5和表6?；厥盏纳锨逡褐械慕z膠膚（非吸附膚）量為 3.36g、收率為67%。另外，回收的溶出液中的絲膠膚(吸附膚)量為0.21g、收率為4%。
[0085] [表5]
[0086
[0087] (3)膚混合物的分子量分布的解析 按照與實施例1相同的測定條件，使用凝膠滲透色譜測定（1)中得到的絲膠膚的分子量 分布。
[0088] 圖7示出上清液中的絲膠膚（非吸附膚）的分子量分布（支鏈淀粉標準品分子量 Ml: 112kDa、M2:47.3kDa、M3:22.8kDa、M4:11.8kDa、M5:5.9kDa)?；厥盏?1 次、第2次能夠得到 支鏈淀粉分子量換算為5.9kDaW下的尖銳的峰，其后在高分子側(cè)得到寬闊的峰。
[0089] 圖8示出溶出液中的絲膠膚(吸附膚）的分子量分布(支鏈淀粉標準品分子量Ml: 112kDa、M2:47.3kDa、M3:22.8kDa、M4:11.8kDa、M5:5.9kDa)。吸附膚的峰值與非吸附膚的回 收第^2次、第7~12次沒有顯著差異。
[0090] (實施例3)角蛋白的可溶化?低分子化 (1)基于固體酸催化劑的角蛋白的可溶化.低分子化 用90ml的R0水使角蛋白粉末（ナ力ク斗テス夕）Ig濕潤1晚后，與陽離子交換樹脂 (T0Y0陽ARL SP-550C)lOmr混合，充分攬拌。使其W 100°C反應(yīng)48小時而進行可溶化后，進行 冷卻，回收包含角蛋白膚的上清液。接著，與上述同樣操作，使角蛋白粉末濕潤1晚后，將上 述上清液添加至回收后的陽離子交換樹脂，用R0水定容至100ml后，充分攬拌。使其W 100°C 反應(yīng)48小時，再次回收上清液。將該操作進一步重復(fù)3次（回收1~5次結(jié)束）。角蛋白粉末各次 使用等量，共計使用5g。向殘留的陽離子交換樹脂中添加 R0水，定容至100ml，充分攬拌。使 其W100°C反應(yīng)48小時后，回收上清液。將該操作進一步重復(fù)2次（回收6~8次結(jié)束）。將殘留 的陽離子交換樹脂用80ml的R0水進行清洗。將回收的上清液與清洗液混合，得到未吸附于 陽離子交換樹脂的分子量(Mp巧.9kDaW下的角蛋白膚液。
[0091] 接著，向清洗后的陽離子交換樹脂中添加0.5M化C1 50ml，從樹脂中溶出包含角 蛋白膚的分解物。將其進一步重復(fù)2次，將所有溶出液混合，得到吸附于陽離子交換樹脂的 分子量(Mp巧.9kDaW下的角蛋白膚液。
[0092] (2)膚混合物的定量 (2-1)角蛋白膚標準樣品的制備 對（1)中得到的吸附于離子交換樹脂的角蛋白膚液(溶出液)進行凍結(jié)干燥。將所得干 燥物調(diào)整至0.75、0.375、0.188、0.094mg/ml，用于角蛋白膚定量用的標準曲線。
[0093] (2-2)角蛋白膚量的測定 利用（1)得到的角蛋白膚之中，溶出液中的角蛋白膚使用上述角蛋白膚定量用的標準 曲線，除此之外，與實施例1的（3-2)同樣操作來進行。另外，針對上清液(包含清洗液）中的 角蛋白膚，對上清液進行凍結(jié)干燥，測定干燥重量。
[0094] 回收的上清液中的角蛋白膚(非吸附膚)量為2.65g、收率為53%。另外，回收的溶出 液中的角蛋白膚(吸附膚)量為〇.20g、收率為4%。
[00M] (3)膚混合物的分子量分布的解析 按照與實施例1相同的測定條件，使用凝膠滲透色譜測定（1)中得到的角蛋白膚的分子 量分布。
[0096] 圖9示出上清液中的角蛋白膚(非吸附膚）的分子量分布(支鏈淀粉標準品分子量 Ml: 112kDa、M2:47.3kDa、M3:22.8kDa、M4:11.8kDa、M5:5.9kDa)?；厥盏?1 ~5次、第6~8次均能 夠得到支鏈淀粉分子量換算為5.9kDaW下的尖銳的峰。
[0097] 圖10示出溶出液中的角蛋白膚(吸附膚)的分子量分布。吸附膚的峰值與非吸附膚 沒有明顯差別。
[0098] (實施例4)瓊脂的可溶化?低分子化 (1)基于固體酸催化劑的瓊脂的可溶化?低分子化 用90ml的R0水來懸浮瓊脂粉末（關(guān)東化學(xué)）lg，與陽離子交換樹脂（T0Y0PEA化SP- 550C)10ml混合，充分攬拌。使其W100°C反應(yīng)24小時而進行可溶化后，進行冷卻，回收包含 瓊脂寡糖的上清液。接著，與上述同樣操作，使瓊脂粉末濕潤1晚后，將上述上清液添加至回 收后的陽離子交換樹脂，用R0水定容至100ml后，充分攬拌。使其W100°C反應(yīng)24小時，再次 回收上清液。將該操作進一步重復(fù)3次（回收^5次結(jié)束）。瓊脂粉末各次使用等量，共計使用 5邑。
[0099] 向殘留的陽離子交換樹脂中添加 R0水，定容至100ml，充分攬拌。使其W100°C反應(yīng) 24小時后，回收上清液。將該操作進一步重復(fù)2次（回收6~8次結(jié)束）。將殘留的陽離子交換樹 脂用80ml的R0水進行清洗。將回收的上清液與清洗液混合，得到未吸附于陽離子交換樹脂 的瓊脂寡糖液。
[0100] 圖11示出回收的上清液中的瓊脂寡糖(非吸附寡糖)的量的變遷。
[0101] 接著，向清洗后的離子交換樹脂中添加0.5M化C1 50ml，從樹脂中溶出包含瓊脂 寡糖的分解物。將其進一步重復(fù)2次，將所有溶出液混合，得到吸附于陽離子交換樹脂的瓊 脂寡糖液。
[0102] (2)寡糖混合物的定量 利用（1)得到的瓊脂寡糖之中，針對上清液(包含清洗液)中的瓊脂寡糖，對上清液進行 凍結(jié)干燥，測定干燥重量。另外，溶出液中的瓊脂寡糖通過下示的苯酪硫酸法來計算。首先， 向樣品1.0ml中添加5%苯酪液1.0ml并混合。接著，迅速地直接滴加濃硫酸5.0ml并混合。在 室溫下放置10分鐘，其后在水浴中冷卻10分鐘。用470nm測定吸光度。吸光度測定使用了 S 紳公司制造的數(shù)碼比色計mini photo 10。標準品使用制備成50、100、150mg/ml的葡萄糖， 用于標準曲線。
[0103] 將上述的測定結(jié)果示于表7?；厥盏纳锨逡褐械沫傊烟牵ǚ俏焦烟牵┝繛?4.15g、收率為 83%。
[0104] 「表71
[0105] 另外，回收的溶出液中未檢出瓊脂寡糖，收率為0%。
[0106] (3)寡糖混合物的分子量分布的分析 使用凝膠滲透色譜測定(1)中得到的瓊脂寡糖的分子量分布。測定中，柱使用東曹株式 會社制造的TSKgel G-0LIG0-PW(7.8 X 300mm)，除此之外，按照與實施例1相同的測定條件 進行測定。另外，作為對照物質(zhì)，使用了分子量測定用標準品（昭和電工株式會社制造的 aiodex STANDARD P-82(分子量5.9kDa))、l糖(葡萄糖）、2糖(薦糖）、3糖(蜜S糖）。
[0107] 圖12示出上清液中的瓊脂寡糖(非吸附寡糖）的分子量分布(對照物質(zhì)Ml :5.9kDa (Ml:昭和電工株式會社制Shodex STANDA畑P-82、M2:3糖（蜜S糖）、M3:2糖（薦糖）、M4:1 糖(葡萄糖)）。關(guān)于回收第次，3糖(蜜S糖）W上均能夠得到寬闊的峰。
[010引產(chǎn)業(yè)利用性 本發(fā)明能夠在成為藥品、飲料食品、化妝品等的材料的功能性膚或功能性寡糖的制造 領(lǐng)域中使用。
[0109]本說明書中援引的所有刊行物、專利和專利申請直接作為參考而引用至本說明書 中。
【主權(quán)項】
1. 水不溶性高分子化合物的分解物的制造方法，其包括以下的工序： (A) 使固體酸催化劑接觸水不溶性高分子化合物后，進行加熱處理，并回收上清液的工 序； (B) 在工序(A)之后，向該固體酸催化劑中添加水性介質(zhì)并攪拌，進行加熱處理后，回收 上清液的工序； (C) 在工序(B)之后，用水性介質(zhì)清洗該固體酸催化劑，并回收清洗液的工序； (D) 將工序(A)中回收的上清液、工序(B)中回收的上清液和工序(C)的清洗液合并，得 到非吸附于固體酸催化劑的級分的工序； (E) 在工序(D)之后，使吸附的成分從該固體酸催化劑中溶出，回收溶出液，得到吸附于 固體酸催化劑的級分的工序。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，水不溶性高分子化合物為水不溶性蛋白質(zhì)或水不 溶性多糖類。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其還包括在使水不溶性高分子化合物接觸固體酸催 化劑之前浸潤至水性介質(zhì)的工序。4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項所述的方法，其中，水不溶性高分子化合物的量相對于固 體酸催化劑以質(zhì)量比計為〇. 01~〇. 5倍。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項所述的方法，其中，在所述工序(A)中，調(diào)整水不溶性高分 子化合物與固體酸催化劑接觸時的水性介質(zhì)的量，以使其相對于固體酸催化劑以質(zhì)量比計 達到1~50倍。6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項所述的方法，其中，所述工序(A)和(B)的加熱處理在40~ 160°C下進行0.1~168小時。7. 根據(jù)權(quán)利要求1~6中任一項所述的方法，其中，分別重復(fù)多次所述工序(A)和(B)的操 作，直至非吸附級分中的水不溶性高分子化合物的分解物的收率達到50%以上為止。8. 根據(jù)權(quán)利要求1~7中任一項所述的方法，其中，固體酸催化劑為選自陽離子交換體、 沸石和硅藻土中的至少1種。
【文檔編號】C07K14/435GK106061991SQ201480071005
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2014年12月17日
【發(fā)明人】筱原聰, 馬場崇行, 木平孝治
【申請人】株式會社海月研究所, 丸和油脂株式會社