本發(fā)明屬于環(huán)境生態(tài)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種實驗生態(tài)條件下定量研究海洋微藻種間相互作用的共培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
海洋微藻是海洋初級生產(chǎn)力的基礎(chǔ)，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)與能量流動中起到重要作用。海洋微藻種群與群落的動態(tài)變化對于維持海洋生態(tài)系統(tǒng)平衡與穩(wěn)定意義重大。定量研究微藻間相互作用對于闡釋或預(yù)測環(huán)境變化的潛在生態(tài)學(xué)效應(yīng)提供最基礎(chǔ)的理論依據(jù)。
研究微藻間相互作用的主要方法是建立微藻的共培養(yǎng)體系。目前國內(nèi)外對于微藻共培養(yǎng)體系的構(gòu)建并沒有確定的方法或依據(jù)，只是根據(jù)各自的實驗?zāi)繕?biāo)構(gòu)建體系，隨意性較大，且相互之間缺乏可比性。根據(jù)上述現(xiàn)狀，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化的、簡單宜行的、能夠在實驗生態(tài)條件下定量研究微藻種群與群落動態(tài)變化或種間競爭的研究體系具有重要意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本方法的目的是提供一種用于定量研究微藻種間相互作用的共培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法，從微藻的選擇、起始生物量控制、營養(yǎng)鹽的添加方式等方面入手，將共培養(yǎng)體系的各項初始條件規(guī)范化，解決了現(xiàn)有研究體系的隨意性與研究結(jié)果的不可比性。
一種用于定量研究微藻種間相互作用的共培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法，其特征在于，具體步驟如下：
1)海洋微藻的選擇：目標(biāo)微藻需形態(tài)差異顯著，能在顯微鏡下通過大小、形狀的差異輕松加以區(qū)分；
2)首先將目標(biāo)微藻培養(yǎng)至指數(shù)生長期，然后接種于共培養(yǎng)體系中；共培養(yǎng)體系實驗周期設(shè)定在10-12天，實驗體積應(yīng)不低于200ml；
3)取樣及計數(shù)：共培養(yǎng)體系中的微藻需取樣后分別計數(shù)，每種微藻每次取樣量為0.5ml,細(xì)胞密度為三次取樣計數(shù)的平均值；
4)起始生物量的設(shè)定：起始生物量＝起始細(xì)胞密度(個/ml)×每細(xì)胞質(zhì)量≈起始細(xì)胞密度(個/ml)×(微藻平均細(xì)胞長度×平均寬度)；將微藻的起始生物量比設(shè)定為1:1，對于a，b兩種微藻，
a與b的起始密度比＝b細(xì)胞的(平均長度×平均寬度)/a細(xì)胞的(平均長度×平均寬度)。
5)共培養(yǎng)體系的構(gòu)建：根據(jù)研究目的的不同，微藻共培養(yǎng)體系的構(gòu)建方式有兩種：
①需要確定細(xì)胞的直接接觸(directcellcontact)是否會對競爭產(chǎn)生影響
建立特別的共培養(yǎng)體系，共培養(yǎng)體系為：在箱體的中間用篩絹隔開，形成兩個空間，所述篩絹與箱體連接處密封；所述篩絹孔徑大小800-1000目；
②不需要確定細(xì)胞直接接觸對競爭結(jié)果的影響
按照起始生物量比一次性接入微藻后即可進(jìn)行；
6)共培養(yǎng)體系中營養(yǎng)鹽的添加
營養(yǎng)鹽的添加采用一次性添加方法，添加的營養(yǎng)鹽為海洋微藻所需的廣譜性營養(yǎng)鹽f/2配方(guillard,1975)；
7)對照組的設(shè)定
以相同條件下單獨培養(yǎng)體系中的微藻作為對照，每試驗設(shè)3個平行組；每24h取樣計數(shù)，分析微藻細(xì)胞密度的變化；如果細(xì)胞密度過大，首先要對藻液進(jìn)行稀釋，然后計數(shù)，具體方法為：取1ml藻液加入成倍的消毒海水稀釋，稀釋n倍后用血球計數(shù)板技術(shù)，所得數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)；
用血球計數(shù)板計數(shù)時以每小方格4-5個藻細(xì)胞為宜。細(xì)胞密度的按照以下公式計算：a.16格×25格的血球計數(shù)板。微藻細(xì)胞數(shù)/ml＝100小格內(nèi)微藻細(xì)胞個數(shù)/100×400×104×稀釋倍數(shù)；b.25格x16格的血球計數(shù)板：微藻細(xì)胞數(shù)/ml＝80小格內(nèi)微藻細(xì)胞個數(shù)/80×400×104×稀釋倍數(shù)。
用計數(shù)框計數(shù)時需取0.5ml藻液滴入計數(shù)框，并用槍頭小心使之平鋪于整個 計數(shù)框內(nèi)。這種做法的原因在于使微藻細(xì)胞盡量不出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，在視野下便于計數(shù)。計數(shù)時將整個視野分成不同部分，記錄全部藻細(xì)胞的數(shù)目。微藻細(xì)胞數(shù)/ml為視野下細(xì)胞總數(shù)×2×稀釋倍數(shù)。
8)定量分析
分析方法采用lotka-volterra的種間競爭模型展開，具體內(nèi)容為：
其中：n,k和r分別代表細(xì)胞密度(celldensity)，環(huán)境負(fù)載能力(thecellcarryingcapacity)和微藻在單獨培養(yǎng)體系中的最大生長速率或稱內(nèi)稟增長率(themaximumgrowthrate)，其中n1、n2分別代表物種a,b的起始細(xì)胞密度；k1、k2代表物種a,b的環(huán)境負(fù)載能力，t為時間；α和β無量綱，分別代表物物種a被b、物種b被a的抑制作用或抑制程度(thedegreeofinhibition)。
物種a與b的增長存在以下幾種可能性：
k1>k2/β，k2<k1/α：a抑制b；
k2>k1/α，k1<k2/β：b抑制a；
k1<k2/β，k2<k1/α：兩物種在共培養(yǎng)體系中可以共存并達(dá)到平衡，且這種平衡關(guān)系是穩(wěn)定的；
k1>k2/β,k2>k1/α:兩物種在共培養(yǎng)體系中可以共存并達(dá)到平衡，但這種平衡關(guān)系不穩(wěn)定。
在上述方案的基礎(chǔ)上，步驟3)中對于微藻個體大小在30μm以內(nèi)的取樣后用血球計數(shù)板計數(shù)，對于微藻個體在30μm以上的，用計數(shù)框計數(shù)；計數(shù)框計數(shù)時每次取樣量仍確定為0.5ml，藻液需盡量薄的平鋪在計數(shù)框底部以減少因為藻 細(xì)胞個體重疊而造成的計數(shù)誤差。
步驟5)中篩絹為三層，相互獨立。
本發(fā)明從微藻的選擇、起始生物量控制、營養(yǎng)鹽的添加方式等方面入手，將共培養(yǎng)體系的各項初始條件規(guī)范化，解決了現(xiàn)有研究體系的隨意性與研究結(jié)果的不可比性。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
實施例1
以東海原甲藻和塔瑪亞歷山大藻為例，使用本發(fā)明方法構(gòu)建共培養(yǎng)體系，定量研究兩種藻之間的相互作用。
實驗總體積設(shè)定為300ml，試驗周期設(shè)定為10天。
塔瑪亞歷山大藻的個體較大(個體長為20～42μm，寬18～40μm)，東海原甲藻的體長15～22μm，寬10～14μm，個體大小約為塔瑪亞歷山大藻的1/4左右(按照平均長、寬數(shù)值計算)，因此本次共培養(yǎng)選用計數(shù)框計數(shù)的方法。在共培養(yǎng)體系中采取起始生物量比為1:1的原則設(shè)定微藻的起始密度以消除起始密度差異對競爭結(jié)果的影響，此時微藻細(xì)胞的起始密度比為其體積比的倒數(shù)，即：東海原甲藻與塔瑪亞歷山大藻的起始密度比≈塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞的體積/東海原甲藻細(xì)胞體積≈塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞的(平均長度×平均寬度)/東海原甲藻細(xì)胞的(平均長度×平均寬度)。由于東海原甲藻與塔瑪亞歷山大藻的體積比為1:4，因此二者的起始密度比為4:1。本研究中將東海原甲藻的起始密度設(shè)定為為1.0×104個/ml，則亞歷山大藻的為0.25×104cells/ml。
將指數(shù)生長期的兩種微藻共同接種到f/2培養(yǎng)液中組成共培養(yǎng)體系。研究采取一次性營養(yǎng)鹽添加方法，實驗過程中不再額外添加營養(yǎng)鹽。另外，由于已知東海原甲藻與塔瑪亞歷山大藻能夠向環(huán)境中分泌胞外產(chǎn)物而對環(huán)境共存生物產(chǎn)生影響，因此本研究不需要確定細(xì)胞直接接觸的作用，體系不需要篩絹的分隔，采取二者一次性接種于共培養(yǎng)體系的研究方法。
f/2營養(yǎng)鹽根據(jù)如下配方確定：
表1f/2營養(yǎng)鹽配方(guillard,1975)
實驗以相同條件下單獨培養(yǎng)體系中的微藻作為對照，每試驗設(shè)3個平行組。每24h取樣，觀察微藻細(xì)胞密度的變化。
定量分析：根據(jù)lotka-volterra的種間競爭模型分析東海原甲藻與塔瑪亞歷 山大藻的競爭作用：
其中：n,k和r分別代表細(xì)胞密度(celldensity)，環(huán)境負(fù)載能力(thecellcarryingcapacity)和微藻的最大生長速率或稱內(nèi)稟增長率(themaximumgrowthrate)，其中n1、n2分別代表物種東海原甲藻與塔瑪亞歷山大藻的起始細(xì)胞密度；k1、k2代表物種東海原甲藻與塔瑪亞歷山大藻的環(huán)境負(fù)載能力，r1、r2分別代表東海原甲藻與塔瑪亞歷山大藻在單獨培養(yǎng)體系中的最大生長率或稱內(nèi)稟增長率，α和β東海原甲藻和塔瑪亞歷山大藻的競爭系數(shù)或稱抑制作用或抑制程度(thedegreeofinhibition)。
當(dāng)假定a＝αr1/k1,b＝βr2/k2時，方程(1)和(2)可改寫成為：
dn1/dt＝r1n1(1-n1/k1)-an1n2(3)
dn2/dt＝r2n2(1-n2/k2)-bn1n2(4)
其中：a與b分別代表塔瑪亞歷山大藻對東海原甲藻的抑制程度和東海原甲藻對塔瑪亞歷山大藻的抑制程度。通過(1)～(4)計算可以得到，東海原甲藻(k1)和塔瑪亞歷山大藻(k2)的承載能力分別為93433/cellsml和41200cells/ml；二者的生長率分別為1.85(r1,東海原甲藻)和0.22(r2，塔瑪亞歷山大藻)；由公式計算可得α(東海原甲藻)和β(塔瑪亞歷山大藻)分別為9.97和2.45。根據(jù)以上參數(shù)計算得到a和b分別為1.97×104和1.18×105(表2)，a是b的約17倍，即東海原甲藻受到塔瑪亞歷山大藻的抑制作用大約是其抑制后者作用的17倍左 右。
表2.從公式中得到的單獨培養(yǎng)體系和雙藻培養(yǎng)體系中東海原甲藻和塔瑪亞歷山大藻的一些參數(shù)
上述實施方案為本發(fā)明最佳的實施方案，但本發(fā)明的實施方案并不受上述實施方案的限制，其他的任何不違背本發(fā)明原理的條件下，可以通過改變參數(shù)的形式所產(chǎn)生的實施例，都包含于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。