本發(fā)明涉及環(huán)境工程及生物能源
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種微藻的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著能源消耗的日益增長，石油、煤炭等不可再生資源的耗竭，以及全球環(huán)境氣候惡化的加劇，能源、資源與環(huán)境問題已成為影響人類社會(huì)可持續(xù)健康發(fā)展的首要因素，開發(fā)利用“綠色”可再生資源作為燃料變得極為迫切與重要。理想的化石能源替代品需要具備高能量密度、低吸濕性、低揮發(fā)性、可再生性及與現(xiàn)存發(fā)動(dòng)機(jī)設(shè)備和運(yùn)輸設(shè)施相兼容等特性。從生物能源替代化石能源的角度，烴類燃料比脂肪酸甲酯更接近于傳統(tǒng)化石燃料，而且烴類燃燒后產(chǎn)熱值高，對大氣CO2含量無凈增加，是一種非常有潛力的可再生能源。微藻因其光合效率高、相對含油量高、固碳效率高及綜合利用價(jià)值高等優(yōu)勢，被認(rèn)為是最具發(fā)展?jié)摿Φ纳镔|(zhì)資源之一。除了傳統(tǒng)能源面臨枯竭，水體污染也嚴(yán)重威脅著社會(huì)的發(fā)展與人類的健康，金屬污染因其危害大、治理難等特點(diǎn)成為工業(yè)廢水治理過程中的一大難題。2015年新實(shí)施的環(huán)保法明確指出在進(jìn)行農(nóng)業(yè)生產(chǎn)用水灌溉時(shí)，應(yīng)當(dāng)采取措施，防止重金屬和其他有毒有害物質(zhì)污染環(huán)境，因此治理工業(yè)廢水中的金屬污染問題成為凈化廢水的關(guān)鍵。鈷(Co2+)是我國比較稀缺的礦產(chǎn)資源之一，然而隨著科技的進(jìn)步和人類生活環(huán)境的惡化，以及核技術(shù)的開發(fā)利用，鈷污染也隨之而來。當(dāng)鈷離子濃度較高時(shí)會(huì)對植物產(chǎn)生毒害作用，危害人類健康。目前對于廢水中Co2+的去除比較常見的方法是物理-化學(xué)技術(shù)，如化學(xué)沉淀、溶劑萃取、離子交換及膜分離等去除廢水中的金屬，這些技術(shù)由于金屬去除不完全、昂貴的設(shè)備及大量的試劑和能量需求等原因而難以應(yīng)用。專家提倡通過微藻培養(yǎng)，不僅可以凈化環(huán)境污水，還能產(chǎn)生生物燃料，解決傳統(tǒng)能源枯竭引發(fā)的危機(jī)。以藻類凈化為首的生物學(xué)方法，可克服傳統(tǒng)的物理-化學(xué)方法缺陷成為金屬廢水污染凈化或恢復(fù)的研究熱點(diǎn)。然而，前人研究表明通過傳統(tǒng)的液體懸浮培養(yǎng)藻類凈化金屬廢水，藻細(xì)胞的生長受到抑制，生物產(chǎn)率較低。如公開號為CN103305425A的中國發(fā)明專利申請公開了一種通過光照調(diào)節(jié)提高布朗葡萄藻烴產(chǎn)量的方法，該方法是通過在布朗葡萄藻生長過程中，根據(jù)布朗葡萄藻的濃度逐步增加光強(qiáng)，避免在布朗葡萄藻濃度較低時(shí)過高光強(qiáng)對細(xì)胞造成損傷，維持光照在適宜布朗葡萄藻細(xì)胞生長的條件，使得生物量迅速積累，至細(xì)胞生長到對數(shù)期后期時(shí)，調(diào)整光照至較高的水平，在適宜烴合成的條件下繼續(xù)培養(yǎng)，使得細(xì)胞在此階段大量積累烴類物質(zhì)以及其他脂質(zhì)。但該方法只能提高布朗葡萄藻的烴產(chǎn)量，不能解決水體污染問題。微藻在培養(yǎng)過程中需要消耗培養(yǎng)液、營養(yǎng)鹽及CO2等，因此導(dǎo)致微藻生物能源的成本居高不下。另外一方面，也有研究人員通過傳統(tǒng)的液體懸浮培養(yǎng)方式用經(jīng)過二次處理的生活污水培養(yǎng)微藻，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生活污水中的氮和磷含量減小，同時(shí)有毒重金屬元素砷、鉻、鎘等的濃度有所降低，但遺憾的是微藻生物產(chǎn)率很低，經(jīng)濟(jì)效益不佳，很難產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用。因此，亟需尋找一種微藻培養(yǎng)方法，通過該方法不僅能夠解決傳統(tǒng)能源危機(jī)對人類帶來的不便，還能解決水體污染對人類帶來的健康影響。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明第一方面提供了一種微藻的培養(yǎng)方法，該方法是在貼壁培養(yǎng)裝置中接種微藻，通入CO2氣體、光照以及含有培養(yǎng)液的廢水，所述的培養(yǎng)液的配方為：KNO30.1～0.6g/LMgSO4.7H2O0.1～0.5g/LCaCl2.2H2O0.02～0.08g/LNa2EDTA0.01～0.03g/LK2HPO40.04～0.07g/LH3BO32.1～2.9mg/LMnSO4.H2O1.1～1.8mg/LZnSO4.7H2O0.1～0.4mg/LNa2MoO4.2H2O0.03～0.08mg/LCuSO4.5H2O0.5～1.0mg/LCo(NO3)2.6H2O0.09mg/L優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液的配方為：KNO30.3～0.5g/LMgSO4.7H2O0.2～0.4g/LCaCl2.2H2O0.03～0.06g/LNa2EDTA0.01～0.02g/LK2HPO40.04～0.06g/LH3BO32.3～2.7mg/LMnSO4.H2O1.3～1.6mg/LZnSO4.7H2O0.1～0.3mg/LNa2MoO4.2H2O0.04～0.06mg/LCuSO4.5H2O0.6～0.8mg/LCo(NO3)2.6H2O0.09mg/L其中，所述的廢水來自工業(yè)廢水。其中，所述的廢水中含有大量的金屬離子鈷以及氮和磷。其中，所述的廢水中，鈷的濃度為0.1～50mg/L，氮的濃度為50～400mg/L，磷的濃度為20～100mg/L。優(yōu)選地，鈷的濃度為0.5～10mg/L，氮的濃度為100～300mg/L，磷的濃度為40～80mg/L。進(jìn)一步優(yōu)選地，鈷的濃度為1mg/L，2mg/L，3mg/L，4mg/L，5mg/L，6mg/L，7mg/L，8mg/L，9mg/L；氮的濃度為120mg/L，150mg/L，180mg/L，200mg/L，250mg/L，280mg/L；磷的濃度為50mg/L，55mg/L，60mg/L，65mg/L，70mg/L，75mg/L。其中，所述的微藻選自布朗葡萄藻、海綠球藻、纖細(xì)角毛藻、間囊藻和菱形藻中的一種或任意幾種的組合。其中，所述微藻的培養(yǎng)條件為：CO2的濃度為0.5％～3％；光照時(shí)間為12～24h；光照強(qiáng)度為80-120μmolm-2s-1；培養(yǎng)的溫度為18～28℃；培養(yǎng)的時(shí)間為6～12d。優(yōu)選地，所述微藻的培養(yǎng)條件為：CO2的濃度為1％～2％；光照時(shí)間為20～24h；光照強(qiáng)度為95-110μmolm-2s-1；培養(yǎng)的溫度為20～28℃；培養(yǎng)的時(shí)間為6～8d。本發(fā)明第二方面提供了一種利用微藻處理廢水的方法，該方法通過在上述微藻的培養(yǎng)過程中可去除廢水中的金屬鈷離子、氮和磷。本發(fā)明第三方面提供了一種從上述微藻培養(yǎng)方法中培養(yǎng)得到的微藻的用途，可作為汽油、柴油和航空燃料的原料。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的微藻生物膜貼壁培養(yǎng)是根據(jù)光稀釋與固定化的原理，將藻細(xì)胞與培養(yǎng)基相分離，并固定在一定的生物膜材料上，極少量的培養(yǎng)基液體通過附著多孔材料的背面或內(nèi)部滴入以使藻細(xì)胞處于半干濕潤狀態(tài)，并在一定光照強(qiáng)度與CO2濃度下進(jìn)行生長的培養(yǎng)方式，其在培養(yǎng)過程中的取樣和培養(yǎng)后的采收均比傳統(tǒng)液體懸浮培養(yǎng)更為經(jīng)濟(jì)、簡便。本發(fā)明提供的微藻培養(yǎng)方法能夠有效去除廢水中的鈷離子以及氮和磷，尤其是在一定范圍內(nèi)隨著鈷離子濃度的增加，微藻的油脂產(chǎn)量也隨之增加，尤其是布朗葡萄藻中長鏈烴的比例有所提高，為汽油、柴油以及航空燃料提供了更優(yōu)的生物原料。附圖說明圖1A為本發(fā)明實(shí)施例1提供的葡萄藻在不同鈷濃度的培養(yǎng)液中生物量積累效果示意圖；圖1B為本發(fā)明實(shí)施例1提供的葡萄藻在不同鈷濃度的培養(yǎng)液中生物產(chǎn)率變化效果示意圖；圖2A為本發(fā)明實(shí)施例1提供的葡萄藻在正常鈷濃度(0.09mg/L)與鈷富余(4.50mg/L)的培養(yǎng)液中粗烴含量積累效果示意圖；圖2B為本發(fā)明實(shí)施例1提供的葡萄藻在正常鈷濃度(0.09mg/L)與鈷富余(4.50mg/L)的培養(yǎng)液中粗烴產(chǎn)率變化效果示意圖；圖3A為本發(fā)明實(shí)施例1提供的葡萄藻在正常鈷濃度(0.09mg/L)與鈷富余(4.50mg/L)的培養(yǎng)液中Co2+濃度變化效果示意圖；圖3B為本發(fā)明實(shí)施例1提供的葡萄藻在正常鈷濃度(0.09mg/L)與鈷富余(4.50mg/L)的培養(yǎng)液中N濃度變化效果示意圖；圖4為本發(fā)明實(shí)施例1提供的葡萄藻在正常鈷濃度(0.09mg/L)與鈷富余(4.50mg/L)的培養(yǎng)液中烴構(gòu)架分布效果示意圖。具體實(shí)施方式以下是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1本實(shí)施例采用的微藻為布朗葡萄藻(BotryococcusbrauniiSAG807-1)，購買于德國哥廷根大學(xué)，采用的培養(yǎng)液為Chu13培養(yǎng)基。Chu13培養(yǎng)基培養(yǎng)液的組成和配制參見表1，在配制培養(yǎng)液時(shí)，將以下成分以固體形式加入蒸餾水中配成100～1000倍的母液，使用時(shí)再按需稀釋配制成培養(yǎng)液，然后將Chu13培養(yǎng)基分裝封口，滅菌處理，最后取出滅菌處理后的培養(yǎng)基，冷卻至室溫后，待用。表1Chu13培養(yǎng)基的組成及其含量成分儲(chǔ)液濃度使用時(shí)終濃度KNO3150g/L0.2g/LMgSO4.7H2O75.0g/L0.1g/LCaCl2.2H2O36.0g/L0.04g/LNa2EDTA1.0g/L0.01g/LK2HPO440.0g/L0.052g/LH3BO32.86g/L0.00286g/LMnSO4.H2O1.54g/L0.00154g/LZnSO4.7H2O0.22g/L0.00022g/LNa2MoO4.2H2O0.06g/L0.00006g/LCuSO4.5H2O0.08g/L0.0008g/LCo(NO3)2.6H2O0.09g/L0.0009g/L1、葡萄藻在不同Co2+濃度中的生長情況取在正常Chu13培養(yǎng)基液體培養(yǎng)至對數(shù)期的葡萄藻為藻種，將葡萄藻細(xì)胞與培養(yǎng)基相分離，并固定在0.45μm的醋酸纖維膜材料上，極少量的培養(yǎng)基液體通過附著在濾紙的背面或內(nèi)部滴入以使藻細(xì)胞處于半干濕潤狀態(tài)。采用Chu13作為培養(yǎng)基液，分別配制6組Co2+濃度不同的培養(yǎng)液，Co2+的濃度分別為0.09mg/L，0.18mg/L，0.45mg/L，0.90mg/L，4.50mg/L，45.00mg/L，在溫度為25℃、光照強(qiáng)度為100μmolm-2s-1、CO2濃度為1％的條件下分別進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)第0d，2d，4d，6d，8d分別對葡萄藻的生物產(chǎn)量及生物產(chǎn)率進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Co2+濃度在0.09mg/L～4.50mg/L之間，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，葡萄藻的生物量呈現(xiàn)了線性增長，生物產(chǎn)率稍微有所升高，但增幅不是很明顯；當(dāng)Co2+濃度為45.00mg/L時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，葡萄藻的生物量沒有明顯變化，生物產(chǎn)率有所下降，具體見圖1A和圖1B。通過該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以說明，當(dāng)Co2+濃度小于4.50mg/L時(shí)，本發(fā)明提供的葡萄藻培養(yǎng)方法能夠有效去除水體中的Co2+。2、葡萄藻在正常培養(yǎng)液(Co2+濃度為0.09mg/L)與鈷富余的培養(yǎng)液(Co2+濃度為4.50mg/L)中的粗烴產(chǎn)量情況采用正常Chu13培養(yǎng)液(Co2+濃度為0.09mg/L)與Co2+濃度為4.50mg/L的Chu13培養(yǎng)液進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)，在溫度為25℃、光照強(qiáng)度為100μmolm-2s-1、CO2濃度為1％的條件下分別進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)第0d，2d，4d，6d，8d分別對葡萄藻的粗烴含量及粗烴產(chǎn)率進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長，Chu13正常培養(yǎng)液(Co2+濃度為0.09mg/L)與鈷富余(Co2+濃度為4.50mg/L)的Chu13培養(yǎng)液中培養(yǎng)得到的葡萄藻粗烴含量及粗烴產(chǎn)率均隨時(shí)間的延長而增長，在鈷富余的培養(yǎng)液中，粗烴含量高于正常培養(yǎng)液中的粗烴含量，粗烴產(chǎn)率變化相差不大，具體見圖2A和圖2B。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以說明，本發(fā)明提供的葡萄藻的培養(yǎng)方法能夠有效去除水體中高濃度的Co2+，對粗烴含量不僅沒有影響，還有明顯的提高。3、葡萄藻在正常培養(yǎng)液(Co2+濃度為0.09mg/L)與鈷富余的培養(yǎng)液(Co2+濃度為4.50mg/L)中的Co2+、N含量的情況采用正常Chu13培養(yǎng)液(Co2+濃度為0.09mg/L)與Co2+濃度為4.50mg/L的Chu13培養(yǎng)液進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)，在溫度為25℃、光照強(qiáng)度為100μmolm-2s-1、CO2濃度為1％的條件下分別進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)第0d，2d，4d，6d，8d分別對葡萄藻的粗烴含量及粗烴產(chǎn)率進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長，在正常培養(yǎng)液中的Co2+濃度沒有明顯變化，在鈷富余培養(yǎng)液中，Co2+濃度有明顯的下降；N元素的濃度在正常培養(yǎng)液和鈷富余的培養(yǎng)液中隨著時(shí)間的延長都有所下降，具體見圖3A和圖3B。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以說明，本發(fā)明提供的葡萄藻的培養(yǎng)方法能夠有效的去除水體中的Co2+和N元素。4、葡萄藻在正常培養(yǎng)液(Co2+濃度為0.09mg/L)與鈷富余的培養(yǎng)液(Co2+濃度為4.50mg/L)中的烴構(gòu)架分布情況采用正常Chu13培養(yǎng)液(Co2+濃度為0.09mg/L)與Co2+濃度為4.50mg/L的Chu13培養(yǎng)液進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)，在溫度為25℃、光照強(qiáng)度為100μmolm-2s-1、CO2濃度為1％的條件下分別進(jìn)行培養(yǎng)，通過檢測發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的葡萄藻的培養(yǎng)方法，能夠產(chǎn)生的烴種類主要有C27、C29和C31，在鈷富余的培養(yǎng)液中得到的C27和C29產(chǎn)量跟正常培養(yǎng)液中沒有明顯變化，但C31有所上升。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以說明，本發(fā)明提供的葡萄藻的培養(yǎng)方法在去除水體中富余的Co2+時(shí)，烴的產(chǎn)量也沒有明顯降低，其中長鏈烴C31的產(chǎn)量還有所提高。5、烴的提取將上述培養(yǎng)得到的布朗葡萄藻溶液于8000r/min離心8min，洗滌離心3次后收集藻體，然后進(jìn)行冷凍干燥。稱取一定質(zhì)量的干燥藻粉，加入正己烷超聲15min，5000r/min離心10min后，收集正己烷提取液，提取過程重復(fù)3-4次，直到提取液無色，合并正己烷提取液，25℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉正己烷，室溫下用氮?dú)獯蹈伤堄?，稱其重量即為“粗烴”質(zhì)量，計(jì)算后得到粗烴含量。本發(fā)明涉及到的“烴”為“粗烴”。粗烴經(jīng)硅膠柱(硅膠粒度200～300目，層析柱尺寸10×100mm，正己烷為流動(dòng)相)純化，收集黃色條帶出來之前的所有樣品，25℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉正己烷，氮?dú)獯蹈伤堄啵Q重得到“純烴”質(zhì)量，計(jì)算后得到純烴含量。然后硅膠柱分別用氯仿和甲醇進(jìn)行洗脫，分別收集洗脫后的樣品，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、氮?dú)獯蹈?，稱重，即得非極性脂肪酸和極性脂肪酸含量。本實(shí)施例提供的葡萄藻在4.5mg/LCo2+濃度下貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)8d后，葡萄藻生物產(chǎn)量可達(dá)5.4gm-2d-1，而培養(yǎng)基中約85％的Co2+被去除。葡萄藻貼壁培養(yǎng)Co2+的結(jié)合能力為1473.9μmolg-1，培養(yǎng)基中N濃度也從最初的1.98mM降到約0。葡萄藻所產(chǎn)生的烴類(油脂)含量要高于正常Chu13培養(yǎng)基的量，分別是52.9％、43.2％；4.5mg/LCo2+濃度貼壁培養(yǎng)促進(jìn)了烴類的合成；通過GC-MS分析，4.5mg/LCo2+主要促進(jìn)了長鏈烴類C31的合成，相比于正常Chu13培養(yǎng)基下的C31含量提高了9.6％。以上實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的一種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都是屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3