一種微藻的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微藻的培養(yǎng)方法。該方法包括：（1）將原始微藻種子液在自養(yǎng)生長的條件下，采用逐級提高pH值的方式進(jìn)行馴化培養(yǎng)，初始pH為8.0～9.0，提高2～8次，每次pH提高0.5～2.0，每提高一次在相同條件下培養(yǎng)24～96h，馴化培養(yǎng)至pH為11.0～12.0，獲得耐受高pH的藻液；（2）將馴化后的藻液接入pH為11.0～12.0的異養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～24h，然后將培養(yǎng)液的pH調(diào)為7.0～8.0進(jìn)一步培養(yǎng)；（3）微藻生長處于穩(wěn)定期后，結(jié)束培養(yǎng)，收獲微藻細(xì)胞。該方法可以有效抑制微藻培養(yǎng)時(shí)的雜菌生長，不需添加抗生素，對微藻的品質(zhì)沒有不良的影響，安全可靠，價(jià)格低廉。
【專利說明】一種微藻的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微藻生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種抑制雜菌的微藻培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微藻指微型藻類，是一種廣泛分布于陸地、海洋、河流的微生物，細(xì)胞代謝產(chǎn)生的多糖、蛋白質(zhì)、色素等，使其在食品、醫(yī)藥、基因工程、液體燃料等領(lǐng)域都有很好的開發(fā)前景。很多微藻不但可進(jìn)行光能自養(yǎng)生長，同時(shí)在無光照條件下，它們也能像細(xì)菌、酵母一樣利用有機(jī)物進(jìn)行異養(yǎng)生長。
[0003]微藻能夠利用自然界中的光能和無機(jī)碳源進(jìn)行自養(yǎng)生長，自養(yǎng)生長存在著生長速率低、最終生物量低、生長周期長的缺點(diǎn)。同時(shí)微藻在不需要光照的條件下能夠利用有機(jī)物作為碳源和氮源的營養(yǎng)方式進(jìn)行異養(yǎng)生長，異養(yǎng)生長能夠克服微藻自養(yǎng)生長存在的生長速率低、生物量低和生長周期長的缺點(diǎn)，具有生長速率快、最終生物量高的優(yōu)點(diǎn)，能夠縮短周期，但是由于微藻異養(yǎng)生長是利用有機(jī)物作為營養(yǎng)方式，營養(yǎng)比較豐富，所以在生長過程中不像自養(yǎng)生長那樣能夠抑制細(xì)菌、真菌等污染物的生長，因此微藻異養(yǎng)培養(yǎng)方式容易造成原有雜菌的生長，引起微藻品質(zhì)的下降，嚴(yán)重時(shí)會導(dǎo)致培養(yǎng)的失敗。因此，如何防止微藻異養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)雜菌污染的問題一直是微藻異養(yǎng)生長的一個(gè)瓶頸問題，近年來已經(jīng)有了關(guān)于這方面的一些報(bào)道。
[0004]CN200810112998.9公開了一種從自養(yǎng)到異養(yǎng)兩步培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)生物柴油的方法，該法在異養(yǎng)發(fā)酵階段為了防止雜 菌的生長，在培養(yǎng)液中添加氯霉素或單氟乙酸鈉抑菌劑，這種方法雖然能夠抑制異養(yǎng)培養(yǎng)中雜菌的生長，但抑菌劑的加入在一定程度上影響微藻生長速度和微藻的品質(zhì)，同時(shí)也增加了成本。
[0005]高大文等在《pH值對白腐真菌液體培養(yǎng)基抑制雜菌效果的影響研究》(高大文，文湘華，周曉燕等.PH值對白腐真菌液體培養(yǎng)基抑制雜菌效果的影響研究[J].環(huán)境科學(xué)，2005, 26(6))一文中表明低pH值對細(xì)菌和酵母菌的具有明顯的抑制作用，但是低pH值下微藻會死亡。
[0006]CN200910089608.5公開了一種在微藻大規(guī)模培養(yǎng)中有效治理敵害生物的方法，該法首先確定正在培養(yǎng)的微藻污染的敵害生物種類，以及所述敵害生物種類的耐受酸堿程度，然后根據(jù)所述敵害生物的不同耐受酸堿程度對微藻培養(yǎng)體系的PH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，當(dāng)確定有效殺死或抑制敵害生物后，再將PH值調(diào)回適合所述藻類正常生長的pH值。該法根據(jù)敵害生物的不同耐受酸堿程度對微藻培養(yǎng)體系的PH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)pH值的目的是殺死敵害生物，并不是為了獲得耐受性的微藻；并且有些藻類的耐受性并不如敵害生物強(qiáng)，在殺死敵害生物的同時(shí)，微藻的生長也受到了很大的影響，對于一些耐受力不強(qiáng)的藻種，調(diào)節(jié)到適宜的PH值后可能生長很難恢復(fù)，影響了微藻的產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種微藻的培養(yǎng)方法。該方法可以有效抑制微藻培養(yǎng)時(shí)的雜菌生長，不需添加抗生素，對微藻的品質(zhì)沒有不良的影響，安全可靠，價(jià)格低廉
MTv ο
[0008]本發(fā)明微藻培養(yǎng)方法包括如下內(nèi)容:(1)將原始微藻種子液在自養(yǎng)生長的條件下，采用逐級提高PH值的方式進(jìn)行馴化培養(yǎng)，初始pH為8.0~9.0，提高次數(shù)為2~8次，每次PH提高0.5~2.0，每提高一次在相同條件下培養(yǎng)24~96h，馴化培養(yǎng)至pH為11.0~12.0，獲得耐受高pH的藻液；(2)將馴化后的藻液接入pH為11.0~12.0的異養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)10~24h，然后將培養(yǎng)液的pH調(diào)為7.0~8.0進(jìn)一步培養(yǎng)；(3)微藻生長處于穩(wěn)定期后,結(jié)束培養(yǎng),收獲微藻細(xì)胞。
[0009]本發(fā)明方法中，逐級提高pH的次數(shù)越多，微藻的適應(yīng)性就更強(qiáng)，馴化培養(yǎng)獲得的微藻細(xì)胞的耐受高PH的能力就越強(qiáng)，但是提高的次數(shù)越密集，培養(yǎng)周期就越長，因此，pH提高次數(shù)優(yōu)選為2~5次。
[0010]本發(fā)明方法中，所述的微藻為小球藻、葡萄藻、小環(huán)藻或雨生紅球藻等淡水藻。自養(yǎng)培養(yǎng)基采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的SE培養(yǎng)基或者BG-1l培養(yǎng)基。采用的異養(yǎng)培養(yǎng)基配方如下:葡萄糖 30g/L, KNO3 9.28g/L，KH2PO4 1.4g/L，MgSO4.7H20 0.7g/L，CaCl2 儲液 17mL/L，F(xiàn)eSO4儲液8mL/L，微量元素lmL/L，其中CaCl2儲液為將6.35g CaCl2.2H20溶于IL蒸餾水中，F(xiàn)eSO4儲液為將2.49g FeSO4.7H20和25g EDTA溶于IL蒸餾水中，微量元素為將H3BO3 11.42g、ZnSO4.7H20 8.82g、MnCl2.H2O 1.42g、(NH4)6Mo7O24.4H20 0.87g、CuSO4.5H201.57g、Co(NO3)2.6H20 0.49g 溶于 IL 蒸餾水中。
[0011]本發(fā)明方法中，步驟(1)所述的馴化培養(yǎng)是將微藻種子液按1:5~1:10的體積比接入裝有新鮮自養(yǎng)培養(yǎng)基的 搖瓶中培養(yǎng)，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH，培養(yǎng)在光照振蕩恒溫?fù)u床中進(jìn)行，培養(yǎng)溫度為20~35°C，光照強(qiáng)度為1000~lOOOOlux，搖床轉(zhuǎn)速為100~200rpm。
[0012]本發(fā)明方法中，步驟(2)所述的異養(yǎng)培養(yǎng)是將獲得的耐受高pH的藻液按1:5~1:10的體積比接入發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液pH為11.0~12.0，通氣量為I~5L/(L.π?η)，在此pH值下微藻能夠正常生長，酵母菌、細(xì)菌和真菌等雜菌的生長受到了抑制，培養(yǎng)10~24h后，微藻生長處于足夠的優(yōu)勢。
[0013]本發(fā)明方法中，步驟(2)采用流加稀酸或者通入二氧化碳?xì)怏w的方式來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值為7.0~8.0，培養(yǎng)48~120h。培養(yǎng)過程中，通過血球計(jì)數(shù)法獲得微藻生物量的值。
[0014]本發(fā)明方法中，微藻的生長到達(dá)了穩(wěn)定期，結(jié)束培養(yǎng)?？梢圆捎秒x心、絮凝或氣浮等方法收集微藻細(xì)胞。
[0015]本發(fā)明的微藻培養(yǎng)方法，具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)對原始微藻種子液采用逐級提高pH的方式來馴化獲得耐受高PH的藻液，避免了培養(yǎng)初期的高pH對藻液本身生長的抑制作用；
(2)經(jīng)過了耐受高pH的自養(yǎng)培養(yǎng)，可以有效的去除雜菌，達(dá)到純化原始種子液的目的，再通過異養(yǎng)培養(yǎng)進(jìn)行增殖，省略了原始藻液的分離純化步驟，能夠有效地避免和殺死雜菌；(3)本方法不需要添加抗生素，對微藻的品質(zhì)沒有不良影響，安全可靠，簡單快捷，成本低廉。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1
將實(shí)驗(yàn)室保藏的小球藻液以1:9的體積比接入裝有200mL SE培養(yǎng)基的500mL搖瓶中進(jìn)行自養(yǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)在光照振蕩恒溫?fù)u床中進(jìn)行，培養(yǎng)基的初始PH用氫氧化鈉調(diào)節(jié)到8.0,搖床轉(zhuǎn)速為120rpm，培養(yǎng)溫度為25°C，光照強(qiáng)度為30001ux ;逐級提高pH值5次，每次pH提高0.6，每提高一次在相同條件下培養(yǎng)36h，馴化培養(yǎng)至pH為11.0，獲得耐受高pH的藻液。經(jīng)過逐級馴化培養(yǎng)后，一部分不耐受高PH的微藻已經(jīng)死亡，繼續(xù)生長的微藻為可耐受高pH的微藻，將其作為種子液，接入裝有異養(yǎng)培養(yǎng)基的15L發(fā)酵罐中進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)，接種比例為體積比1: 9，發(fā)酵體積為10L,培養(yǎng)初期pH為11.0，通氣量為2L/ (L.min)，培養(yǎng)16h后，小球藻生長得到了足夠的優(yōu)勢，鏡檢幾乎無雜菌。此時(shí)，采用流加鹽酸的方式將培養(yǎng)液的PH值調(diào)為大約7.5，在此pH下維持小球藻繼續(xù)生長，其余條件不變，培養(yǎng)84h后，小球藻生長達(dá)到穩(wěn)定期，結(jié)束培養(yǎng)。表1為異養(yǎng)培養(yǎng)的不同階段所測得的雜菌數(shù)目和小球藻生物量。
[0017]表1不同階段的雜菌數(shù)目和小球藻生物量
【權(quán)利要求】
1.一種微藻的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:(1)將原始微藻種子液在自養(yǎng)生長的條件下，采用逐級提高PH值的方式進(jìn)行馴化培養(yǎng)，初始pH為8.0~9.0，提高次數(shù)為2~8次，每次PH提高0.5~2.0，每提高一次在相同條件下培養(yǎng)24~96h，馴化培養(yǎng)至pH為11.0~12.0，獲得耐受高pH的藻液；(2)將馴化后的藻液接入pH為11.0~12.0的異養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)10~24h，然后將培養(yǎng)液的pH調(diào)為7.0~8.0進(jìn)一步培養(yǎng)；(3)微藻生長處于穩(wěn)定期后,結(jié)束培養(yǎng),收獲微藻細(xì)胞。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:pH提高次數(shù)為2~5次。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的微藻為小球藻、葡萄藻、小環(huán)藻或雨生紅球藻。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:自養(yǎng)培養(yǎng)基采用SE培養(yǎng)基或者BGlI培養(yǎng)基。
5.按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:采用的異養(yǎng)培養(yǎng)基配方如下:葡萄糖 30g/L, KNO3 9.28g/L, KH2PO4 1.4g/L, MgSO4.7H20 0.7g/L, CaCl2 儲液 17mL/L, FeSO4 儲液8mL/L，微量元素lmL/L，其中CaCl2儲液為將6.35g CaCl2.2Η20溶于IL蒸餾水中，F(xiàn)eSO4儲液為將2.49g FeSO4.7H20和25g EDTA溶于IL蒸餾水中，微量元素為將H3BO3 11.42g、ZnSO4.7H20 8.82g、MnCl2.H2O 1.42g、(NH4)6Mo7O24.4H20 0.87g、CuSO4.5H20 1.57g、Co (NO3) 2.6H20 0.49g 溶于 IL 蒸餾水中。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)所述的馴化培養(yǎng)是將微藻種子液按1:5~1:10的體積比接入裝有新鮮自養(yǎng)培養(yǎng)基的搖瓶中培養(yǎng)，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH，培養(yǎng)在光照振蕩恒溫?fù)u床中進(jìn)行，培養(yǎng)溫度為20~35°C，光照強(qiáng)度為1000~lOOOOlux，搖床轉(zhuǎn)速為100~200rpm。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)所述的異養(yǎng)培養(yǎng)是將獲得的耐受高PH的藻液按1:5~1:10的體積比接入發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液pH為11.0~12.0，通氣量為I~5L/(L.min)。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)采用流加稀酸的方式或者通入二氧化碳?xì)怏w的方式來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH為7.0~8.0，培養(yǎng)48~120h。
9.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:采用離心、絮凝或氣浮方法收集微藻細(xì) 胞。
【文檔編號】C12R1/89GK103773687SQ201210404113
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月23日
【發(fā)明者】師文靜, 廖莎, 王領(lǐng)民, 張霖, 李曉姝 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院