專利名稱：一種促進微藻快速增殖的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種促進微藻快速增殖的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。
背景技術：
微藻是一類在水中生長的，種類繁多且分布極其廣泛的低等植物，具有高效的光合作用反應系統。微藻通過(X)2的固定，可以將光能轉化為化學能，并以油脂或淀粉等有機物的形式儲存在體細胞內。隨著資源短缺的壓力和環(huán)境問題日益嚴峻，利用微藻進行生物柴油及其部分化石能源替代產品的開發(fā)，已成為目前研究的熱點。相對于一般的自養(yǎng)生物來說，微藻增殖較快，并且需要的養(yǎng)料不多——主要是陽光、水和二氧化碳，不會引起與農業(yè)用地、牧業(yè)用地競爭的矛盾。總之，微藻的應用前景廣闊，它的開發(fā)將為我國提供一種新的可再生資源。通過微藻進行生物柴油生產是一個復雜的系統工程，涵蓋多個技術環(huán)節(jié)，包括微藻藻種的篩選和培育、微藻的規(guī)模培養(yǎng)和誘導產油脂、油脂的收集和加工等幾個方面。微藻作為生物柴油原料的研究始于20世紀60年代，近年來，隨著生物技術的發(fā)展，通過對藻種的生物改造，已獲得豐富的具有高產油能力的微藻資源，因此這種新型的生物柴油生產模式非常具有應用前景。然而，由于微藻是一種處于進化最末端的光能自養(yǎng)型生物，其代謝通路上的限制性因素很多，培養(yǎng)液中(X)2的濃度、溶氧、光強等條件均對微藻的生長構成影響。另外，微藻的產能效率低下，藻類繁殖一代的時間較長，是很多工業(yè)微生物幾十倍甚至幾百倍，因此， 在工業(yè)應用中，如何促進微藻快速增殖，進而實現微藻的高密度培養(yǎng)，是發(fā)展微藻生物質能源的基礎性課題。目前，在微藻培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的選擇及培養(yǎng)條件的優(yōu)化方面，已取得了一些工作進展。CN01134147. 5描述了一種將大型藻類細胞浸提液作為培養(yǎng)基，用于進行微藻培養(yǎng)的方法。該方法制備工藝簡單，同時營養(yǎng)組分豐富，等同于一種純天然的培養(yǎng)基，但是，由于這種培養(yǎng)基成分的不確定性，一些代謝機理不明晰，因此很難進行大規(guī)模的工業(yè)應用。由于微藻是一種光能自養(yǎng)微生物，產能水平及CO2固定效率很低，因此，其生物量增長速率明顯低于一般的化能微生物。在微藻培養(yǎng)條件的優(yōu)化方面，主要的研究熱點在于CO2的供給形式的改進，其目的是通過提高(X)2固定效率，以加速生物量的增長。CN2009102(^971. 3公開了一種在微藻培養(yǎng)過程中的供氣方式，其主要手段是將(X)2氣體以微米級氣泡形式注入微藻光合反應器中，以解決(X)2利用率低的問題。CN1109936. 4公開了一種微藻細胞溶劑化補碳與氣浮法采收相耦合的培養(yǎng)方法，其主要手段是從耦合池底部通入富含(X)2溶氣水，對藻液進行補碳，在溶氣水氣化過程中完成細胞溶劑化補碳與氣浮法采收。這兩種方法均從不同角度增加了 CO2氣體與培養(yǎng)液的接觸時間，避免了 CO2氣體來不及被藻體細胞吸收即被溢出的問題。但是，水生的微藻在進行(X)2固定的過程中一般利用CO:或HC03_，微藻對(X)2的耐受一般在一個較窄的范圍，過多的CO2氣體通入，不利于微藻生物量的積累。由此看見， 僅僅通過改變(X)2的供給，對提高微藻生物量累計的促進作用有限。

發(fā)明內容
針對現有技術的不足，本發(fā)明提供一種促進微藻快速增殖的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。 該培養(yǎng)基配制方法簡單、成本低，適于工業(yè)應用；采用該培養(yǎng)基進行微藻培養(yǎng)在無需復雜的 CO2供應設備及光照條件下，就可以快速提高微藻自養(yǎng)代謝效率及CO2的固定效率，從而解決微藻生物量積累緩慢的問題?！N促進微藻快速增殖的培養(yǎng)基，在常規(guī)培養(yǎng)基中加入含羥基的三碳有機物，含羥基的三碳有機物在培養(yǎng)基中濃度不大于lg/L，優(yōu)選0. 05g/L 0. 8g/L。本發(fā)明中，所述的含羥基的三碳有機物包括甘油、1，3-丙二醇、1、2-丙二醇、丙醇、異丙醇、甘油酸、甘油醛，優(yōu)選甘油。本發(fā)明中，所述的常規(guī)培養(yǎng)基的組成為0. 05g/L 0. lg/L K2HPO4 ·3Η20、0. lg/L 0. 3g/L ΚΗ2Ρ04、0· 05g/L 0. lg/L MgSO4 · 7Η20、0· 01g/L 0. lg/LCaCl2 · 2Η20、0· 01g/L 0. 05g/L NaCl、0· 00lg/L 0. 01g/L FeCl3 · 6Η20、0· lg/L 0. 5g/L NaNO3 或 KNO30一種促進微藻快速增殖的培養(yǎng)方法，微藻液體積和含羥基化合物的培養(yǎng)基體積按 1 15 1 30比例在生物反應器內混合，生物反應器內初始微藻生物量為40mg/L 80mg/L，培養(yǎng)溫度為20°C 37°C，攪拌速度為IOOrpm 500rpm，光照強度為lOOOlux 50001ux。本發(fā)明在進行微藻低生物量培養(yǎng)初期無需氣體輸送設備，通過開放式的培養(yǎng)方式進行微藻培養(yǎng)。本發(fā)明中，微藻可以來自于任何具有完整光能磷酸化體系及C3循環(huán)的藻類，如藍藻、綠藻等，優(yōu)選綠藻中的球藻。與現有技術相比本發(fā)明促進微藻快速增殖的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法具有如下優(yōu)點1、本發(fā)明促進微藻快速增殖的培養(yǎng)基是在常規(guī)的培養(yǎng)基中加入少量的含羥基三碳有機物，具有配制方法簡單、成本低，適于工業(yè)應用等優(yōu)點。2、從現有技術可知，在微藻的培養(yǎng)過程中，葡萄糖是一種優(yōu)良的碳源，相同條件下使用葡萄糖作為碳源微藻的生長速度最快，但從本發(fā)明的實施例和比較例中可以看出，隨著培養(yǎng)時間的增加，含有葡萄糖的培養(yǎng)基中的小球藻的生長速度隨著葡萄糖的消耗明顯放緩，小球藻生長曲線呈S型，而使用含羥基三碳有機物的培養(yǎng)基中小球藻的快速生長具有持續(xù)性，在達到穩(wěn)定期前，生長曲線幾乎成線性，因此甘油、丙醇、丙二醇、甘油醛等這些含羥基的三碳有機物并不是作為傳統意義上碳源，含羥基的三碳有機物在二氧化碳的代謝途徑中的作用和葡萄糖有明顯區(qū)別。3、采用本發(fā)明的培養(yǎng)基進行微藻培養(yǎng)能夠快速提高微藻自養(yǎng)代謝效率及(X)2的固定效率，高于含有相同濃度的葡萄糖的培養(yǎng)基，從而解決微藻生物量積累緩慢的問題。由于光能自養(yǎng)微藻是以C3循環(huán)的形式進行(X)2固定的，即(X)2在核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶/加氧BS (ribulose-l, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, Rubisco)白勺作用下，核Sll 糖-1，5- 二磷酸羧化為2-羧-3-酮-核糖醇-1，5- 二磷酸，然后2-羧-3-酮-核糖醇-1， 5-二磷酸被裂解為兩個3-磷酸甘油酸，從此進入細胞內代謝途徑。在常規(guī)培養(yǎng)基中加入了含羥基三碳有機物，如甘油、丙醇、丙二醇、甘油醛等，作為一種誘導物，即在微藻的培養(yǎng)初期作為C3循環(huán)代謝過程中底物類似物，它的加入可以誘導代謝過程中一些相關酶類(如磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油醛脫氫酶等)的過分表達，由于生物代謝過程是一個鏈式反應體系，限速反應影響著整個代謝鏈的效率，因此直接引入了三碳有機物進入微藻的生長循環(huán)， 提升了 C3循環(huán)代謝效率，即提高了(X)2的固定效率。4、本發(fā)明中，主要根據光能自養(yǎng)微生物氧化磷酸化過程及(X)2固定的代謝途徑研究，發(fā)現了含羥基三碳有機物銜接著整個(X)2羧化和五碳化合物再生過程，因此在培養(yǎng)基配制過程中有針對的添加了含羥基的三碳有機物及其底物類似物，通過底物誘導作用，促進微藻細胞光合反應，從而提高了 (X)2的轉化率，提升了整個(X)2固定效率，能夠促進微藻在前期培養(yǎng)過程中得以快速生長。與傳統的通過各種形式，單純依靠增加(X)2的通氣量，以提高 CO2轉化率，實現微藻快速增殖的方法相比，本方法不但針對性更強、效果更明顯，而且對培養(yǎng)條件要求更低，設備簡單，能耗需求更少，在大規(guī)模生產中更容易實現。


圖1是實施例中不同甘油濃度下小球藻生物量積累隨時間變化曲線圖。圖2是比較例中不同葡萄糖濃度下小球藻生物量積累隨時間變化曲線圖。
具體實施例方式下面結合實施例進一步說明本發(fā)明的效果，但不構成對本發(fā)明的限制。本發(fā)明中，以689nm為掃描波長，建立了 OD值與生物量之間的標準曲線，通過對菌液OD值測量，從而確定計算反應體系內的生物量的濃度，同時，在實際培養(yǎng)過程中可以利用分光光度計，定時測量反應體系的OD值，以確定微藻生物量的積累情況。實施例1(1)常規(guī)培養(yǎng)基中加入甘油，使培養(yǎng)基中的甘油濃度為0. lg/L，常規(guī)培養(yǎng)基的具體組成為 0. 075g/L K2HPO4 · 3Η20、0· 175g/L ΚΗ2Ρ04、0· 075g/LMgS04 · 7Η20、0· 025g/L CaCl2 · 2Η20、0· 025g/L NaCl、0· 005g/L FeCl3 · 6Η20、0· 25g/LNaN03。(2)取液體保藏的一種球藻(chlorella vulgaris) IOmL,濃度為 800mg/L，按 1 19體積比，加入190mL新配制的含有甘油的培養(yǎng)基，培養(yǎng)液中微藻菌體濃度為40mg/L 水平。用透氣濾菌膜對三角瓶口進行封口處理，以利于培養(yǎng)環(huán)境的空氣流通。(3)選擇振蕩搖床進行培養(yǎng)，振蕩轉速設置為140rpm。利用搖床的照明系統為培養(yǎng)體系提供一個持續(xù)的光照條件，光照強度為30001UX水平。整個培養(yǎng)系統的溫度設置為 25°C。定時取樣以分光光度儀分析搖瓶中OD值，從而計算出藻體濃度。實施例2(1)常規(guī)培養(yǎng)基中加入甘油，使培養(yǎng)基中的甘油濃度為0. 25g/L，常規(guī)培養(yǎng)基的具體組成為 0. 075g/L K2HPO4 · 3Η20、0· 175g/L ΚΗ2Ρ04、0· 075g/LMgS04 · 7Η20、0· 025g/L CaCl2 · 2Η20、0· 025g/L NaCl、0· 005g/L FeCl3 · 6Η20、0· 25g/LNaN03。(2)取液體保藏的一種球藻(chlorella vulgaris) 10mL，濃度約為 1200mg/L，按 1 19體積比，加入190mL新配制的含有甘油的培養(yǎng)基，培養(yǎng)液中微藻菌體濃度約為60mg/ L水平。用透氣濾菌膜對三角瓶口進行封口處理，以利于培養(yǎng)環(huán)境的空氣流通。(3)選擇振蕩搖床進行培養(yǎng)，振蕩轉速設置為120rpm。利用搖床的照明系統為培養(yǎng)體系提供一個持續(xù)的光照條件，光照強度為30001UX水平。整個培養(yǎng)系統的溫度設置為27°C。定時取樣以分光光度儀分析搖瓶中OD值，從而計算出藻體濃度。實施例3(1)常規(guī)培養(yǎng)基中加入甘油，使培養(yǎng)基中的甘油濃度為0.5g/L，常規(guī)培養(yǎng)基的具體組成為 0. 075g/L K2HPO4 · 3Η20、0· 175g/L ΚΗ2Ρ04、0· 075g/LMgS04 · 7Η20、0· 025g/L CaCl2 · 2Η20、0· 025g/L NaCl、0· 005g/L FeCl3 · 6Η20、0· 25g/LNaN03。(2)取液體保藏的一種球藻(chlorella vulgaris) 10mL，濃度約為 1600mg/L，按 1 19體積比，加入190mL新配制的含有甘油的培養(yǎng)基，培養(yǎng)液中微藻菌體濃度約為SOmg/ L水平。用透氣濾菌膜對三角瓶口進行封口處理，以利于培養(yǎng)環(huán)境的空氣流通。(3)選擇振蕩搖床進行培養(yǎng)，振蕩轉速設置為160rpm。利用搖床的照明系統為培養(yǎng)體系提供一個持續(xù)的光照條件，光照強度為40001UX水平。整個培養(yǎng)系統的溫度設置為 25°C。定時取樣以分光光度儀分析搖瓶中OD值，從而計算出藻體濃度。比較例常規(guī)培養(yǎng)基中加入葡萄糖，配制培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度分別為0. Ig/L,0. 25/ L、0. 5g/L的三種含葡萄糖的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)基的具體組成為0. 075g/LK2HP04 · 3H20、 0. 175g/L KH2P04、0. 075g/L MgSO4 · 7Η20、0· 025g/L CaCl2 · 2Η20、0· 025g/L NaCl、0· 005g/L FeCl3 ·6Η20、0. 25g/L NaNO30其余條件同實施例1至3，定時取樣以分光光度儀分析搖瓶中 OD值，從而計算出藻體濃度。按照實施例1 3的培養(yǎng)方式，通過幾天的培養(yǎng)，微藻生物量的積累情況見圖1，可以看出在培養(yǎng)基中添加適量濃度的甘油，在培養(yǎng)的初期，由于甘油的加入，使得微藻藻種很快度過延滯期，更有利于微藻生物量的積累。按照比較例1 3的培養(yǎng)方式，通過幾天的培養(yǎng)，生物量的積累情況見圖2，可以看出，由于葡萄糖是一種廣譜碳源，因此加入葡萄糖會引起球藻進行異養(yǎng)生長，在葡萄糖濃度較低的情況下，生物量的積累速度與培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度成正比。從實施例和比較例分析，甘油和葡萄糖都能對小球藻生物量的積累起到促進作用，但兩者的機理完全不同，尤其是在低濃度范圍內，甘油的效果更佳顯著。一方面，葡萄糖等碳源的加入，直接引起了微藻異養(yǎng)生長，其生長速度隨著碳源的消耗而逐漸降低，從而在其生長曲線上表現為S型，但甘油等三碳化合物完全是作為誘導物形式起作用，當培養(yǎng)液中存在一個最適濃度即可持久的產生作用。另一方面，在進行異養(yǎng)培養(yǎng)時，一般碳源應該持在一個較高濃度，因此通過比較可以看出，含羥基三碳有機物的誘導作用效果明顯優(yōu)于低濃度碳源的效果。
權利要求
1.一種促進微藻快速增殖的培養(yǎng)基，其特征在于所述的培養(yǎng)基是在常規(guī)培養(yǎng)基中加入含羥基的三碳有機物，含羥基的三碳有機物在培養(yǎng)基中濃度不高于lg/L。
2.按照權利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于含羥基的三碳有機物在培養(yǎng)基中濃度為 0. 05g/L 0. 8g/L。
3.按照權利要求1或2所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述的含羥基的三碳有機物包括甘油、1，3-丙二醇、1、2_丙二醇、丙醇、異丙醇、甘油酸、甘油醛。
4.按照權利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于常規(guī)培養(yǎng)基的組成為0.05g/L 0.Ig/ L K2HPO4 ·3Η20、0· lg/L 0. 3g/L ΚΗ2Ρ04、0· 05g/L 0. lg/LMgS04 ·7Η20、0· Olg/L 0. lg/L CaCl2 ·2Η20、0· Olg/L 0. 05g/L NaCl、0· OOlg/L 0. Olg/L FeCl3 · 6Η20、0· lg/L 0. 5g/ L NaNO3 或 KNO3。
5.一種促進微藻快速增殖的培養(yǎng)方法，其特征在于微藻液體積和權利要求1所述的含羥基三碳有機物的培養(yǎng)基體積按1 15 1 30比例在生物反應器內混合，生物反應器內初始微藻生物量為40mg/L 80mg/L，培養(yǎng)溫度為20°C 37°C，攪拌速度為IOOrpm 500rpm，光照強度為 IOOOIux 50001ux。
6.按照權利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于微藻為具有完整光能磷酸化體系及 C3循環(huán)的藻類。
7.按照權利要求5或6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于微藻為綠藻中的球藻。
全文摘要
本發(fā)明公開一種促進微藻快速增殖的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法，所述的促進微藻快速增殖的培養(yǎng)基是在常規(guī)培養(yǎng)基中加入含羥基的三碳有機物，含羥基的三碳有機物在培養(yǎng)基中濃度不大于1g/L，優(yōu)選0.05g/L～0.8g/L，含羥基的三碳有機物包括甘油、1，3-丙二醇、1、2-丙二醇、丙醇、異丙醇、甘油酸、甘油醛。一種促進微藻快速增殖的培養(yǎng)方法，微藻液體積和含羥基三碳有機物的培養(yǎng)基體積按1∶15～1∶30比例在生物反應器內混合，生物反應器內初始微藻生物量為40mg/L～80mg/L，培養(yǎng)溫度為20℃～37℃，攪拌速度為100rpm～500rpm，光照強度為1000lux～5000lux。本發(fā)明的培養(yǎng)基配制方法簡單、成本低，適于工業(yè)應用；采用該培養(yǎng)基進行微藻培養(yǎng)在無需復雜的CO2供應設備及光照條件下，就可以快速提高微藻自養(yǎng)代謝效率及CO2的固定效率，從而解決微藻生物量積累緩慢的問題。
文檔編號C12N1/38GK102443562SQ201010511190
公開日2012年5月9日 申請日期2010年10月12日 優(yōu)先權日2010年10月12日
發(fā)明者師文靜, 張霖, 李曉姝, 王領民 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院