專利名稱：一種發(fā)根農(nóng)桿菌k599介導的菊花轉(zhuǎn)基因方法
一種發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導的菊花轉(zhuǎn)基因方法
(-)技術(shù)領域 本發(fā)明涉及一種發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導的菊花轉(zhuǎn)基因方法。 背景技術(shù)：
菊花(Dendranthema morifolium)屬于菊科菊屬的植物，原產(chǎn)我國，是我國十 大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，也是集文化意義和經(jīng)濟價值于一體的名品花卉，并 有食用和藥用價值(戴思蘭等，菊屬系統(tǒng)學及菊花起源的研究進展，北京林業(yè)大學學 報，2002，24(5/6) 230-234)。株形、花型和花色是影響菊花等花卉品質(zhì)的重要的 因素，而植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在改良花卉品質(zhì)中起著重要作用，邵寒霜等、Petty等、Zheng 等先后報道利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將lef、phyA、Phy B_1等基因轉(zhuǎn)入菊花，使菊花的形態(tài) 和花期等發(fā)生了改變(邵寒霜等，擬南芥LFY cDNA的克隆及轉(zhuǎn)化菊花的研究，植物 學 艮，1999， 41(3) 268-271 ； Pettyetal, Modifying chrysanthemum (Dendranthema grandifloram)growth habit genetic manipulation, Acta Hort, 2000, 508 319—321; Zheng et al，Modification of plant architecture inchrysanthemum by ecotopic expression of the tabacco phytochrome Bl gene, J Amer Soc Hort Sci，2001，126(1) 19-26)。對于株型，用 于盆栽或地被用途的菊花，往往需要植株矮化、分枝性強、著花數(shù)目多等特征。目 前，改變觀賞植物的株形，常用的基因是來自發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的rol基因(Zukeret al, rolC-transgenic carnation with improved horticultural traits quantitative and qualitative analysis of greenhouse-grown plants，J Am SocHort Sci, 2001, 126 13-18)。 Kiyokawa 等將發(fā)根農(nóng)桿菌rolA、B、C基因轉(zhuǎn)入了球根秋海棠中，結(jié)果觀察到植株矮化、延遲開 花，葉禾口花辧均變自皮(Kiyokawa et al, Genetic transformation of Begonia tuberhybrida by Ri rolgenes, Plant Cell Reports, 1996，15 (8) : 606-609)。Handa 等將 rol 基因?qū)臊埬憣?植物草龍膽(prairie gentian)中，除了觀察到轉(zhuǎn)基因植株矮化、葉變皺之外，還觀察到花 冠呈杯狀變化(Handa et al, Genetic transformationof Eustoma grandifiorum with rol gene, Acta Hort, 1995，392 209-218)。Zuker等用基因槍和根癌農(nóng)桿菌相結(jié)合的方法，將 rol基因?qū)胂闶裰校瑀ol基因減少了香石竹腋芽的產(chǎn)生，增強發(fā)根的能力。Dolgov 等將rolC基因?qū)刖栈ㄆ贩N‘White Snowdon’中，獲得兩個轉(zhuǎn)化系，其中有一個系與 對照相比，表現(xiàn)為叢生、矮化，并且葉多分裂(Dolgov et al，Agrobacterialtransformation of chrysanthemum, Acta Hort，1997，447 329-334)。此外，有研究報道利用農(nóng)桿菌 轉(zhuǎn)基因法將不同功能的目的基因轉(zhuǎn)入菊花(傅榮昭和劉敏，通過根癌農(nóng)桿菌介導法獲得 菊花轉(zhuǎn)基因植株，植物生理學報，1998，24(1) 72-76 ；王關(guān)林等，雪花蓮凝集素基 因轉(zhuǎn)化菊花及轉(zhuǎn)基因植株的抗蚜性研究，遺傳學報，2004，31(12) 1434-1438 ；洪波 等，AtDREBlA基因在菊花中的異源表達提高了植株對干旱和鹽漬脅迫的耐性，中國科 學(C輯)，2006，36(3) 223-231 ；洪波等，地被菊花Fall Color體細胞胚途徑再生， 遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性檢測，中國農(nóng)業(yè)科學，2006，39(7) 1443-1450 ；孫 磊等，利用雙T-DNA載體系統(tǒng)獲得無選擇標記轉(zhuǎn)基因菊花，園藝學報，2008，35(5)727-734，姜丹等，擬南芥花期基因FT轉(zhuǎn)化切花菊‘神馬，，園藝學報，2010，37(3) 423-430)，但上述報道中菊花的再生效率偏低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種菊花再生效率高的發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導的菊花轉(zhuǎn)基因方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導的菊花轉(zhuǎn)基因方法，所述方法包括(1)將發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌液侵染菊花無菌苗葉片或葉腋，誘導形成轉(zhuǎn)基因不定 根；侵染形成轉(zhuǎn)基因不定根可按照常規(guī)方法進行，具體方法可如下將高5 8cm菊花 組織培養(yǎng)無菌苗植株，中部以上的葉片用解剖刀劃出或者用解剖剪剪出長0.5 Icm傷口，用微量進樣器吸取15 20 μ L農(nóng)桿菌菌液滴加于葉片傷口處或者葉腋處，或者用 5mL容量的無菌注射器吸取5 10 μ L農(nóng)桿菌菌液，將針頭插入葉片或葉腋處，再將菌液 注入。(2)當轉(zhuǎn)基因不定根生長到2cm以上后，從頂端剪取0.4 0.8cm長度的轉(zhuǎn)基因 不定根，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基進行繁殖，每隔15 20天剪取長度0.4 0.8cm的轉(zhuǎn)基因不定 根頂端轉(zhuǎn)入新的繼代培養(yǎng)基，按此方法進行繼代培養(yǎng)2 3代后再轉(zhuǎn)入誘導培養(yǎng)基進行誘 導培養(yǎng)，將誘導出的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進行分化培養(yǎng)，將分化出的苗轉(zhuǎn)入生根培 養(yǎng)基形成帶根的完整植株；所述繼代培養(yǎng)基為添加500mg/L頭孢霉素的MS培養(yǎng)基；所述誘導培養(yǎng)基為添加0.5mg/L 6_芐氨基嘌呤+lmg/L萘乙酸的MS培養(yǎng)基；所述分化培養(yǎng)基為添加2mg/L 6-芐氨基嘌呤的MS培養(yǎng)基；所述生根培養(yǎng)基為添加0.5mg/L生長素的MS培養(yǎng)基；上述培養(yǎng)均在帶蓋培養(yǎng)瓶中進行；(3)分化出的完整植株長至5 6cm時，打開培養(yǎng)瓶蓋練苗3d后，再移栽到泥炭礱糠灰珍珠巖體積比3 1 1的土壤中，在自然條件下生 長，獲得轉(zhuǎn)基因菊花。所述步驟(1)中發(fā)根農(nóng)桿菌K599可為野生型發(fā)根農(nóng)桿菌K599，也可以為帶有目 的基因的發(fā)根農(nóng)桿菌K599，所述帶有目的基因的發(fā)根農(nóng)桿菌K599由含有目的基因的質(zhì) 粒導入野生型發(fā)根農(nóng)桿菌K599獲得。所述目的基因可為本領域常規(guī)用于改善菊花形態(tài)、 花期或株形的基因。有不少報道指出，在含有植物激素的培養(yǎng)基上，離體的葉片和莖在培養(yǎng)過程中 自身會產(chǎn)生非轉(zhuǎn)基因的不定根(林規(guī)等，影響月季愈傷組織誘導和分化的因素，分子植 物育種，2006，4(2) 223-227 ； Nolanetal, Auxinup-ulates MtSERKl expression in both Medicago trancatula root-forming andembryogenic cultures, Plant Physiol, 2003, 133(1) 218-230)，發(fā)明人在進行菊花葉片和莖的離體培養(yǎng)實驗中也觀察到這種情況；而利用活 體生長狀態(tài)下的菊花葉片和葉腋作為農(nóng)桿菌侵染的對象，經(jīng)過PCR檢測獲得的不定根均 為轉(zhuǎn)基因不定根，因此，利用活體材料直接作為農(nóng)桿菌誘導不定根的受體，可以有效克 服假陽性轉(zhuǎn)基因不定根的出現(xiàn)。此外，在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因過程中，外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后必須使用抗生素抑制直至殺滅農(nóng)桿菌，通常使用的抗生素是濃度為250 IOOOmg/ L的頭孢霉素。Yepes等觀察到頭孢霉素對菊花的外植體再生有毒害作用，會抑制植 株的分化(Yepes etal， Agrobacterium tumefaciens versus biolistic-mediated transformation of thechrysanthemum cvs.Polaris and Golden Polaris with nucleocapsid proteingenes of three Tospoviras species, International Symposium on Cut Flowers inthe Tropics species, Acta Hort, 1999，482 209-218)。本發(fā)明中利用不定根繁殖過程中頂端生長點區(qū)域無菌的特 點，通過截取不定根頂端靠近生長點區(qū)域進行繼代培養(yǎng)2 3次，結(jié)合使用頭孢霉素殺 菌，能很好地抑制和殺滅發(fā)根農(nóng)桿菌，因此，在隨后的不定根誘導愈傷及分化過程中無 須再使用抗生素(頭孢霉素)殺菌，從而有效提高了轉(zhuǎn)基因再生效率。
雖然目前已經(jīng)有報道利用農(nóng)桿菌介導法以及基因槍法獲得了轉(zhuǎn)基因菊花，但其 轉(zhuǎn)化效率仍然不高。本發(fā)明利用發(fā)根農(nóng)桿菌K599對菊花切割的葉片和未切割的葉腋進 行活體感染生根，其生根頻率分別達88%和60%，不定根的愈傷組織誘導率和愈傷組織 再生率分別達75%和63.3%。并且，獲得的轉(zhuǎn)基因植株實現(xiàn)了來源于K599Ri質(zhì)粒的外 源rolC的高效表達，這為進一步進行菊花矮化育種和目標基因的轉(zhuǎn)移提供了一個良好的 實驗體系。本發(fā)明利用活體植物材料直接作為發(fā)根農(nóng)桿菌K599侵染的受體誘導不定根，其 有益效果主要體現(xiàn)在能克服假陽性不定根的出現(xiàn)；同時，利用不定根繁殖過程中頂端 生長點區(qū)域無菌的特點，通過截取不定根頂端靠近生長點區(qū)域進行繼代培養(yǎng)，結(jié)合使用 頭孢霉素殺菌，能達到有效抑制和殺滅農(nóng)桿菌的目的，在隨后的不定根誘導愈傷及分化 過程中無須再使用抗生素殺菌，提高了轉(zhuǎn)基因再生效率。本發(fā)明利用發(fā)根農(nóng)桿菌K599對 菊花活體進行不定根的誘導和實現(xiàn)不定根的再生，為菊花的矮化育種和目標基因的轉(zhuǎn)移 提供了良好的實驗方法。


圖1為發(fā)根農(nóng)桿菌K599對菊花活體侵染形成轉(zhuǎn)基因不定根及轉(zhuǎn)基因不定根的 再生植株A:無菌苗葉片被K599活體侵染生根；B:無菌苗葉腋被K599活體侵染生 根；C:轉(zhuǎn)基因不定根組織培養(yǎng)形成愈傷組織；D:轉(zhuǎn)基因不定根組織培養(yǎng)再生完整植 株；E移栽成活的轉(zhuǎn)基因植株。圖2為轉(zhuǎn)基因毛狀根和再生的植株進行PCR擴增結(jié)果；M 1 Kb IadderDNA分
子量標記；1 3 轉(zhuǎn)基因毛狀不定根；4 非轉(zhuǎn)基因根；5 7 轉(zhuǎn)基因再生植株；8 非轉(zhuǎn)基因植株；9:發(fā)根農(nóng)桿菌K599Ri質(zhì)粒。圖3為rolC基因在菊花野生型和轉(zhuǎn)基因植株中的表達分析；WT 非轉(zhuǎn)基因菊 花；T01，T02和T03:轉(zhuǎn)基因菊花。圖4為利用發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導獲得的菊花轉(zhuǎn)gi^D基因的不定根。圖5為利用發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導獲得的菊花轉(zhuǎn)gi^D基因的再生植株。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限 于此
實施例1 材料與方法1農(nóng)桿菌菌株及其培養(yǎng)實驗用菌種為野生型發(fā)根農(nóng)桿菌K599 (購自the National Collection ofPlant Pathogenic Bacteria in U.K.)。將-80 °C保存的菌種在LB+Str (鏈霉素)50mg/L的固體培養(yǎng) 基上劃線、28°C過夜培養(yǎng)，挑取單菌落在LB+Str (鏈霉素)50mg/L的液體培養(yǎng)中、230 250r/min、28°C過夜培養(yǎng)，生長旺盛的菌液用作進一步實驗。2菊花材料 以菊花(小紫菊，購自杭州花卉市場)組織培養(yǎng)無菌苗作為發(fā)根農(nóng)桿菌K599感 染誘導毛狀不定根的受體材料。3毛狀不定根的誘導將過夜培養(yǎng)生長旺盛的發(fā)根農(nóng)桿菌K599用LB培養(yǎng)基離心清洗兩次后重懸于LB 培養(yǎng)基中，調(diào)光密度(OD6tltl)到0.5左右。將高5 8cm菊花組織培養(yǎng)無菌苗植株，中部 以上的葉片用解剖刀劃出或者用解剖剪剪出長0.5 Icm傷口，用微量進樣器吸取15 20 μ L農(nóng)桿菌菌液滴加于葉片傷口處或者葉腋處，或者用5mL容量的無菌注射器吸取5 10 μ L農(nóng)桿菌菌液，將針頭插入葉片或葉腋處，再將菌液注人。隨后菊花植株繼續(xù)培養(yǎng)。4毛狀不定根的培養(yǎng)和再生當不定根生長到2cm以上后，從頂端剪取不定根約0.5cm，轉(zhuǎn)入MS (0)+500mg/ L Cef (頭孢霉素)(即MS培養(yǎng)基添加500mg/L Cef)上繁殖，每隔15 20天剪取不定根 0.5cm左右的頂端轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2 3代后再轉(zhuǎn)入不含頭孢霉素的MS+6-BA 0.5mg/L+NAA lmg/L誘導培養(yǎng)基上誘導愈傷組織，30d后將誘導出的愈傷組織轉(zhuǎn)入 MS+6-BA 2mg/L上進行分化，最后將分化出的苗轉(zhuǎn)入MS+IAA 0.5mg/L培養(yǎng)基上形成帶 根的完整植株。分化出的完整植株長至5cm左右，打開培養(yǎng)瓶蓋練苗3d，再移栽到含泥 炭礱糠灰珍珠巖(體積比3 1 1)的盆缽中，在自然條件下生長。5農(nóng)桿菌K599質(zhì)粒、毛狀不定根和再生植株DNA的提取農(nóng)桿菌K599質(zhì)粒DNA的提取同向太和等的方法(向太和等，野生型發(fā)根農(nóng)桿 菌K599的解毒，遺傳，2001，23(4) 336-340)。提取毛狀不定根和再生植株DNA的 方法是剪取少量毛狀根或葉片放入2mL Eppendorf離心管中，加液氮速凍后用玻璃棒搗 碎，力口 750 μ L DNA抽提液(100mmol/L Tris-HCl, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS)，60°C水浴Ih后加等體積的氯仿乙醇異戊醇(體積比為80 16 4)混 合液，室溫靜置30min，期間來回顛倒數(shù)次，4°C、11000r/min下離心lOmin，取上層液 相用等體積的異丙醇沉淀，再用70%乙醇在4°C、6000r/min下離心5min清洗2次，室溫 干燥后溶于20 μ L無菌ddH20貯于_20°C備用。6轉(zhuǎn)基因毛狀不定根和再生植株的PCR鑒定根據(jù) Furner 等發(fā)表的 rolC 基因序列(Furner etal, An Agrobacteriumtransformation in the evolution of the genus Nicotiana，Nature, 1986，319 422-427),設計并合成擴增 rolC 的 PCR 引物。rolC 引物為rolC-Pl 5 ‘ -CTCCTGACATCAAACTCGTC-3 ‘； P2 5' -TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3‘。PCR擴增參數(shù)如下起始變性 94°C 5min 后，接著進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C變性45s，56°C退火45s和72°C延伸反應90s，最后在72°C延伸lOmin。擴增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳、120V lh，EtBr(溴 化乙錠)染色，用凝膠成像系統(tǒng)(Bio/Rad公司)進行拍照記錄和分析。7再生植株qRT-PCR分析 用RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)提取轉(zhuǎn)基因植株和對照非轉(zhuǎn) 基因植株葉片 mRNA，用 SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TaKaRa 公 司)進行RT-PCR擴增。根據(jù)菊花actin基因序列(GenBank登記號 AB205087)設計弓 | 物，actin-Pl 5 ‘ -ACAACTGGCATTGTGTTGGA-3 ‘ 禾口 actin_P2 5 ‘ -CAGGACATCTGAAACGCTCA-3 ‘, 擴增結(jié)果作 為內(nèi)參。根據(jù)rolC基因序列(GenBank登記號X03432)設計引物， rolC-qPl 5 ‘ -AAGAAAGTGCGGCGAAGTAA — 3 ‘ 禾Π rolC_qP2 5' -ATCTCAGGGTCAAGGACGTG-3 ‘，進行 rolC 基因的定量分析，用 Strategene 公 司MX3000P型熒光定量PCR儀進行擴增。熒光定量PCR條件是起始95°C 2min,隨后 95°C30s、59°C30s、72°C 20s 進行 40 循環(huán)，結(jié)束后在 4°C保存。參考 Schmittgen和 Livak 的方法計算 rolC 基因相對表達量(Schmittgen and Livak, Analyzing real-time PCR data by thecomparative C (T) method, Nat Protoc, 2008，3(6) 1101-1108)。結(jié)果1毛狀不定根的誘導發(fā)根農(nóng)桿菌K599侵染菊花植株葉片的傷口以及葉腋處，在IOd左右形成肉眼可 見的毛狀根(圖1A，B)，K599侵染切割的葉片和未受傷的葉腋誘導根的頻率分別為88% (44/50)和60% (30/50)，生根頻率葉片>葉腋。而對照未滴加K599菌液的葉片的傷口 處以及腋芽處均沒有出現(xiàn)生根現(xiàn)象。2毛狀不定根的培養(yǎng)和植株再生從頂端剪取長0.5cm左右不定根，在轉(zhuǎn)入MS+500mg/L Cef(頭孢霉素)上能 快速增殖，15 20d即可生長到2cm以上，從頂端剪取快速增殖的不定根0.5cm左右轉(zhuǎn) 入新的培養(yǎng)基上，經(jīng)過2 3代培養(yǎng)后可以達到有效除菌效果，再轉(zhuǎn)入不含頭孢霉素的 MS+6-BA 0.5mg/L+NAA lmg/L誘導培養(yǎng)基上誘導愈傷組織，在誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周 后可以看到根的切口處膨大突起形成黃綠色的愈傷組織，愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，誘導率為 75% (60/70)。30d后將愈傷組織轉(zhuǎn)入MS+6-BA 2mg/L上進行分化，分化出綠色苗， 最后轉(zhuǎn)入MS+IAA0.5mg/L培養(yǎng)基上形成具有根的完整植株，愈傷組織分化頻率為63.3% (19/30)。再生植株經(jīng)過練苗后移栽成活，并能正常開花(圖1C，D，E)。再生植株形 態(tài)表現(xiàn)為矮縮、具有毛狀根等特征。3毛狀不定根以及再生植株中rolC基因的PCR擴增檢測提取誘導出的不定根和再生的植株DNA，利用根據(jù)rolC基因序列設計的PCR弓丨 物，從誘導形成的毛狀根以及再生植株DNA中均擴增到期望的770bp左右的特異性DNA 片段，該片段與從發(fā)根農(nóng)桿菌K599的Ri質(zhì)粒DNA中擴增出的特異性片段大小相同；而 非轉(zhuǎn)化根和非轉(zhuǎn)化菊花葉片DNA未擴增出任何條帶(圖2)。表明野生型發(fā)根農(nóng)桿菌K599 的Ri T-DNA已整合到誘導的毛狀根基因組中，并且由不定根再生的植株為轉(zhuǎn)基因植株。4再生植株rolC基因的qRT-PCR分析以aclin基因作為內(nèi)參對照，熒光定量PCR(qRT-PCR)分析顯示，rolC基因在轉(zhuǎn)基因植株(T01、T02、T03)中實現(xiàn)了高效表達，而在野生型的非轉(zhuǎn)基因植株(WT)中未 檢測到表達信號(圖3)。實施例2 (1)用凍融法將帶有熒光蛋白質(zhì)基因gfp的質(zhì)粒pBIN-35S-GFP(pBIN-35S_GFP 構(gòu)建方法見文獻徐紀明，向太和，含gfp植物轉(zhuǎn)基因表達載體的構(gòu)建及在矮牽牛轉(zhuǎn)基 因不定根中的高效表達，遺傳，2008，30(8) 1069-1074)導入發(fā)根農(nóng)桿菌K599，即 在50 μ L Κ599感受態(tài)細胞中加入約0.1 μ g純化質(zhì)粒pBIN_35S_GFP，混勻后在冰上放 置lOmin，置于液氮速凍5min，立即用28°C水浴熱激5min，加入500 μ L LB液體培養(yǎng) 基，在28°C緩慢振蕩培養(yǎng)2h。取ΙΟΟμ L菌液分別涂布于LB+Km(卡那霉素)50mg/ L+Str(鏈霉素)50mg/L固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)約48h篩選抗性菌落，獲得帶有質(zhì)粒 pBIN-35S-GFP的發(fā)根農(nóng)桿菌K599。
(2)以菊花組織培養(yǎng)無菌苗作為發(fā)根農(nóng)桿菌K599/pBIN-35S_GFP感染誘導毛狀 不定根的受體材料。將過夜培養(yǎng)生長旺盛的發(fā)根農(nóng)桿菌K599/pBIN-35S_GFP用LB培 養(yǎng)基離心清洗兩次后重懸于LB培養(yǎng)基中，調(diào)光密度(OD_)到0.5左右。將高5 8cm 菊花組織培養(yǎng)無菌苗植株，中部以上的葉片用解剖刀劃出或者用解剖剪剪出長0.5 Icm 傷口，用微量進樣器吸取15 20 μ L農(nóng)桿菌菌液滴加于葉片傷口處或者葉腋處，或者用 5mL容量的無菌注射器吸取5 10 μ L農(nóng)桿菌菌液，將針頭插入葉片或葉腋處，再將菌 液注人。隨后菊花植株繼續(xù)培養(yǎng)。在IOd左右形成肉眼可見的毛狀根。獲得菊花轉(zhuǎn)gfp 基因的不定根，用ZEISS顯微鏡(型號Axio imager)，在藍色激發(fā)光下(濾光片F(xiàn)ITC) 對誘導出的不定根進行熒光檢測，不定根在熒光顯微鏡下發(fā)出強烈的綠色熒光(圖4)， 表明gfp基因已得到高效表達。(3)從頂端剪取長0.5cm左右不定根，在轉(zhuǎn)入MS (0) +500mg/L Cef (頭孢霉素) 上增殖，15 20d即可生長到2cm以上，從頂端剪取快速增殖的不定根0.5cm左右轉(zhuǎn)入新 的培養(yǎng)基上，經(jīng)過2 3代培養(yǎng)后達到有效除菌效果，再轉(zhuǎn)入不含頭孢霉素的MS+6-BA 0.5mg/L+NAA lmg/L誘導培養(yǎng)基上誘導愈傷組織，在誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周后可以看到 根的切口處膨大突起形成黃綠色的愈傷組織，愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密。30d后將愈傷組織轉(zhuǎn)入 MS+6-BA 2mg/L上進行分化，分化出綠色苗，最后轉(zhuǎn)入MS+IAA 0.5mg/L培養(yǎng)基上形成 具有根的完整植株(圖5)。再生植株經(jīng)過練苗后移栽成活，并能正常開花。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導的菊花轉(zhuǎn)基因方法，所述方法包括(1)將發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌液侵染菊花無菌苗葉片或葉腋，誘導形成轉(zhuǎn)基因不定根；(2)當轉(zhuǎn)基因不定根生長到2cm以上后，從頂端剪取0.4 0.8cm長度的轉(zhuǎn)基因不定 根，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基進行繁殖，每隔15 20天剪取長度0.4 0.8cm的轉(zhuǎn)基因不定根頂 端轉(zhuǎn)入新的繼代培養(yǎng)基，按此方法進行傳代培養(yǎng)2 3代后再轉(zhuǎn)入誘導培養(yǎng)基進行誘導培 養(yǎng)，將誘導出的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進行分化培養(yǎng)，將分化出的苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基 形成帶根的完整植株；所述繼代培養(yǎng)基為添加500mg/L頭孢霉素的MS培養(yǎng)基； 所述誘導培養(yǎng)基為添加0.5mg/L 6-芐氨基嘌呤+lmg/L萘乙酸的MS培養(yǎng)基； 所述分化培養(yǎng)基為添加2mg/L 6-芐氨基嘌呤的MS培養(yǎng)基； 所述生根培養(yǎng)基添加0.5mg/L生長素的MS培養(yǎng)基； 上述培養(yǎng)均在帶蓋培養(yǎng)瓶中進行；(3)分化出的完整植株長至5 6cm時，打開培養(yǎng)瓶蓋練苗3d后，再移栽到泥炭 礱糠灰珍珠巖體積比3 1 1的土壤中，在自然條件下生長，獲得轉(zhuǎn)基因菊花。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中發(fā)根農(nóng)桿菌K599為帶 有目的基因的發(fā)根農(nóng)桿菌K599，由含有目的基因的質(zhì)粒導入野生型發(fā)根農(nóng)桿菌K599獲得。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種菊花再生效率高的發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導的菊花轉(zhuǎn)基因方法，所述方法是利用活體植物材料直接作為發(fā)根農(nóng)桿菌K599侵染的受體誘導不定根(以發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌液侵染菊花葉片傷口處或者葉腋處)，不定根再誘導愈傷組織進行分化培養(yǎng)獲得完整植株，其有益效果主要體現(xiàn)在能克服假陽性不定根的出現(xiàn)；同時，利用不定根繁殖過程中頂端生長點區(qū)域無菌的特點，通過截取不定根頂端靠近生長點區(qū)域進行繼代培養(yǎng)，結(jié)合使用頭孢霉素殺菌，能達到有效抑制和殺滅農(nóng)桿菌的目的，在隨后的不定根誘導愈傷及分化過程中無須再使用抗生素殺菌，提高了轉(zhuǎn)基因再生效率。
文檔編號C12N15/82GK102010877SQ20101051110
公開日2011年4月13日 申請日期2010年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月19日
發(fā)明者向太和, 王琳, 田璟鸞, 蔣歡 申請人:杭州師范大學