專利名稱：一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生雷公藤毛狀根的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生雷公藤(Tripterygium wilfordii Hok . Π)毛狀根的方法，并初步建立了雷公藤毛狀根離體培養(yǎng)體系。
背景技術(shù)：
發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobaeterium rhizogenes)是根瘤菌科(Rhi—zobiaceae)農(nóng)桿菌屬(Agrobactefium) —類革蘭氏陰性土壤農(nóng)桿菌，可以侵染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物，通過發(fā)根農(nóng)桿菌感染植物，將其所含的Ri質(zhì)粒上的一段DNA (T-DNA)轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中，誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根。雷公藤是一種雙子葉木質(zhì)藤本植物，分布于南方福建、江西、浙江、廣東、湖南、湖北、臺(tái)灣等省份。是珍貴的藥用植物。雷公藤提取物中含有70種以上的有效成分，主要有； 生物堿類、二萜類、三萜類、倍半萜類等次生代謝物。這些成分具有解毒散結(jié)、活血化瘀、消炎、抗腫瘤、免疫調(diào)整、抗生育等多種藥理作用。廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺病、腎病、 皮膚病、白血病等疾病。由于植物次生代謝物質(zhì)具有極其復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，至今仍沒有找到有效的或經(jīng)濟(jì)可行合成方法。雖然近幾十年來利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究獲得了迅速發(fā)展，但是由于植物細(xì)胞培養(yǎng)是采用未分化的細(xì)胞，其生長與代謝通路常常不相容的，因而次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力低且不穩(wěn)定，從而限制了其產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。而經(jīng)過發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物所形成的毛狀根(hair root)由于其生長迅速且遺傳性狀穩(wěn)定，成為藥用植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的重要原料。毛狀根本質(zhì)是一種惡性增殖的器官、相對(duì)于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，其具有激素自養(yǎng)、生長迅速、周期短等特點(diǎn)，因而可進(jìn)行大量培養(yǎng)。同時(shí)它起源于單細(xì)胞，遺傳性狀穩(wěn)定，擁有親本植株的特征次生代謝途徑。利用藥用植物毛狀根培養(yǎng)體系生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究已有幾十年的歷史。如 Mano等(1986)建立了 29個(gè)日本莨菪japinlica)毛狀根無性系，研究表明均能產(chǎn)生阿托品烷生物堿，從中選育出的克隆，其重量的增加比正常植株高出102倍，莨菪堿含量高達(dá)1. 3%，為原植株根中的3倍；Yshikawa和Furuya (1987)通過人參的愈傷組織成功誘導(dǎo)出了毛狀根，這種毛狀根在無外源激素的條件下生長迅速，是用激素誘導(dǎo)人參根快速增長的2倍，毛狀根中有效成分人參皂甙的含量最高可達(dá)干重的0. 95%，高于在生根和天然栽培根的含量，Parr等(1988)通過誘導(dǎo)長春花形成的毛狀根，并從中檢測到了具有抗癌作用的長春堿，但通過長春花的細(xì)胞培養(yǎng)卻無法得到這種生物堿，說明毛狀根能夠合成某些懸浮細(xì)胞不能合成的次生代謝物質(zhì)。
目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)利用雷公藤毛狀根對(duì)其活性物質(zhì)進(jìn)行生產(chǎn)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生雷公藤毛狀根的方法，利用毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)雷公藤甲素，可用以填補(bǔ)中藥缺口。
本發(fā)明的方法包括(1)無菌外植體的獲得；(2)發(fā)根農(nóng)桿菌菌液的制備；(3)農(nóng)桿菌侵染誘導(dǎo)毛狀根；(4)毛狀根離體培養(yǎng)體系的建立，所述毛狀根離體培養(yǎng)體系的建立，是在27士 1°C暗培養(yǎng)條件下，將毛狀根置于含500mg/L頭孢噻肟鈉的1 / 2MS固體培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，每7d繼代一次，繼代過程中逐漸降低頭孢噻肟鈉的使用濃度，直至無菌，最后將已完全無菌的毛狀根于1 / 2MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)保存。 發(fā)根農(nóng)桿菌菌液的制備如下發(fā)根農(nóng)桿菌活化后接種于含100mg/L卡那霉素的液體YEB培養(yǎng)基中，27 士 1°C黑暗條件下120-180r/min振蕩培養(yǎng)至OD6tltl=O. 5-0. 8，收集菌液， 并將菌體在4°C條件下，SOOOr/min離心10分鐘，棄上清液，將菌體重懸于2倍體積的無菌 1 / 2MS液體培養(yǎng)基中。農(nóng)桿菌浸染誘導(dǎo)毛狀根的方法為將無菌外植體與發(fā)根農(nóng)桿菌菌液共同培養(yǎng)于 1 / 2MS液體培養(yǎng)基內(nèi)，加入識(shí)別信號(hào)因子乙酰丁香酮至150ymol/L，以促進(jìn)其轉(zhuǎn)化，在 120r/min, 27士 1°C下振蕩處理30min后，取出浸染的外植體用無菌濾紙吸干，在27士 1°C 暗培養(yǎng)條件下，置于1 / 2MS固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)毛狀根產(chǎn)生。對(duì)產(chǎn)生的無菌雷公藤毛狀根進(jìn)行檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)其含有相當(dāng)數(shù)量的雷公藤甲素 (15. 6559mg/g),明顯高于傳統(tǒng)雷公藤野生根及組培根中甲素的含量，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。


圖1為誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根。圖2為雷公藤標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜檢測圖。圖3為誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根中雷公藤甲素含量的液相色譜檢測圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生雷公藤毛狀根的方法，具體內(nèi)容與實(shí)施方式如下
1、雷公藤無菌外植體的獲取摘取野生雷公藤幼苗的葉片和嫩莖，清水沖洗后，超凈工作臺(tái)上切段，劃痕。葉片切成lcm2，嫩莖長2 4 cm。嫩莖劃痕2 3次，并保持兩端剪口平滑。將切段外植體經(jīng)70%的酒精消毒lmin，無菌水清洗3次后，再浸泡于0. 1% HgCl2 溶液中消毒IOmin后，用無菌水沖洗3次后，無菌濾紙擦干表面水分，置于1 / 2MS液體培養(yǎng)基，在20001x，16h/d日光照，25 °C條件下培養(yǎng)2 3d，以使創(chuàng)傷部位分泌更多的酚類物質(zhì)，提高轉(zhuǎn)化率。2、發(fā)根農(nóng)桿菌菌液的制備方法將實(shí)驗(yàn)室保藏的發(fā)根農(nóng)桿菌GIM1. 141 (購于廣東微生物研究所菌種保藏中心)活化后接種于含100mg/L卡那霉素的液體YEB培養(yǎng)基(牛肉浸膏，5g/L ；酵母浸膏，1 g/L ；蛋白胨，5g/L ；硫酸鎂，0. 5g/L ；pH=7. 0-7. 4)中，27士 1°C黑暗條件下振蕩培養(yǎng)(120-180r/min)至OD6tltl ^ 0. 5-0. 8收集菌液，并將菌體在4°C條件下，SOOOr/ min離心10分鐘，棄上清液，將菌體重懸于2倍體積的無菌1 / 2MS液體培養(yǎng)基中。3、農(nóng)桿菌浸染誘導(dǎo)毛狀根的方法將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的雷公藤無菌外植體，放入制備好的農(nóng)桿菌重懸菌液中，加入識(shí)別信號(hào)因子乙酰丁香酮(acetosyringone)至150μπιΟ1/1， 以促進(jìn)其轉(zhuǎn)化，在120r/min，(27士 1) °C下振蕩處理30min后，取出浸染的外植體用無菌濾紙吸干，在(27士 1)°C暗培養(yǎng)條件下，置于1 / 2MS固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)毛狀根產(chǎn)生，每7d繼代一次，約30d后在外植體的創(chuàng)傷部位可見有毛狀根長出。4 、雷公藤毛狀根離體培養(yǎng)體系建立將生成的毛狀根從雷公藤外植體上切下， 在(27士 1)°C暗培養(yǎng)條件下，置于含500mg/L頭孢噻肟鈉的1 / 2MS固體培養(yǎng)基中生長，每 7d繼代一次，繼代過程中逐漸降低頭孢噻肟鈉的使用濃度，直至無菌。最后將已完全無菌的雷公藤毛狀根于1 / 2MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)保存。為了進(jìn)一步說明本發(fā)明的效果，進(jìn)行了以下有益的試驗(yàn)
1、不同類型外植體對(duì)發(fā)根的影響。采用發(fā)根農(nóng)桿菌GIM1.141對(duì)雷公藤的嫩莖與葉片外植體進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)根，結(jié)果如表1所示。由表1可知，發(fā)根農(nóng)桿菌GIM1. 141菌株對(duì)雷公藤葉片外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根的效率明顯高于嫩莖外植體。表1不同外植體產(chǎn)生毛狀根的發(fā)根率
權(quán)利要求
1.一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生雷公藤毛狀根的方法，包括(1)無菌外植體的獲得； (2)發(fā)根農(nóng)桿菌菌液的制備；(3)農(nóng)桿菌侵染誘導(dǎo)毛狀根；(4)毛狀根離體培養(yǎng)體系的建立， 其特征在于所述毛狀根離體培養(yǎng)體系的建立，是在27士 1°C暗培養(yǎng)條件下，將毛狀根置于含500mg/L頭孢噻肟鈉的1 / 2MS固體培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，每7d繼代一次，繼代過程中逐漸降低頭孢噻肟鈉的使用濃度，直至無菌，最后將已完全無菌的毛狀根于1 / 2MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生雷公藤毛狀根的方法，其特征在于 發(fā)根農(nóng)桿菌菌液的制備如下發(fā)根農(nóng)桿菌活化后接種于含100mg/L卡那霉素的液體YEB培養(yǎng)基中，27 士 1°C黑暗條件下120-180r/min振蕩培養(yǎng)至OD6tltl=O. 5-0. 8，收集菌液，并將菌體在4°C條件下，8000r/min離心10分鐘，棄上清液，將菌體重懸于2倍體積的無菌1 / 2MS 液體培養(yǎng)基中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生雷公藤毛狀根的方法，其特征在于 農(nóng)桿菌浸染誘導(dǎo)毛狀根的方法為將無菌外植體與發(fā)根農(nóng)桿菌菌液共同培養(yǎng)于1 / 2MS液體培養(yǎng)基內(nèi)，加入識(shí)別信號(hào)因子乙酰丁香酮至150ymol/L，以促進(jìn)其轉(zhuǎn)化，在120r/min， 27士 1°C下振蕩處理30min后，取出浸染的外植體用無菌濾紙吸干，在27士 1°C暗培養(yǎng)條件下，置于1 / 2MS固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)毛狀根產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生雷公藤毛狀根的方法，包括(1)無菌外植體的獲得；(2)發(fā)根農(nóng)桿菌菌液的制備；(3)農(nóng)桿菌侵染誘導(dǎo)毛狀根；(4)毛狀根離體培養(yǎng)體系的建立，所述毛狀根離體培養(yǎng)體系的建立，是在27±1℃暗培養(yǎng)條件下，將毛狀根置于含500mg/L頭孢噻肟鈉的1∕2MS固體培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，每7d繼代一次，繼代過程中逐漸降低頭孢噻肟鈉的使用濃度，直至無菌，最后將已完全無菌的毛狀根于1∕2MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)保存。對(duì)產(chǎn)生的無菌雷公藤毛狀根進(jìn)行檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)其含有相當(dāng)數(shù)量的雷公藤甲素，明顯高于傳統(tǒng)雷公藤野生根及組培根中甲素的含量，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。利用毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)雷公藤甲素，可用以填補(bǔ)中藥缺口。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102321664SQ20111032091
公開日2012年1月18日 申請日期2011年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月21日
發(fā)明者吳承禎, 宋萍, 封磊, 洪偉, 陳敏捷 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)