專利名稱：：一種雷公藤減毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物解毒
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種對(duì)天然有毒植物藥雷公藤進(jìn)行整體生物轉(zhuǎn)化，以獲得減毒、增效的雷公藤的方法。
背景技術(shù)：
：藥用植物雷公藤(7W^er義^"邁^7/br&7Hook,f)系衛(wèi)矛科的藤本灌木，藥用部位為其根及根莖。在我國(guó)主要分布于長(zhǎng)江流域以南山區(qū)、東北長(zhǎng)白山區(qū)，云南和貴州也有分布。雷公藤作為草藥治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、趺打損傷、皮膚病等已有悠久的歷史。1972年Kupchan首次報(bào)導(dǎo)了雷公藤甲素(二萜內(nèi)酯化合物)具有明顯的抗白血病及抗腫瘤活性，且用量很小，從而引起了'學(xué)者廣泛的注意。隨著研究的不斷深入，雷公藤在免疫抑制、器官移植，男性節(jié)育，抗菌，抗炎，活血化瘀及降低血液粘度，抗癌防癌及治療疑難雜癥與自身免疫性疾病方面越來(lái)越顯示出巨大的應(yīng)用前景。但由于雷公藤的毒性較大，特別是對(duì)肝臟、心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)的毒副作用，一直制約了雷公藤在臨床上的深度應(yīng)用。面對(duì)如此現(xiàn)狀，如何對(duì)雷公藤及其所含有的活性成分進(jìn)行減毒研究，成為了眾多專家、學(xué)者爭(zhēng)相研究的重要靶點(diǎn)。已經(jīng)報(bào)道的各種解毒方法，包括利用中藥配方解毒、活性成分的結(jié)構(gòu)修飾或者利用分離純化的單體成分來(lái)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化解毒等雖然都取得了一些進(jìn)展，但所獲成果離實(shí)際的臨床應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)化還有一定的距離。天然藥物的生理活性物質(zhì)往往是由一系列化合物所組成的，這一系列化合物可能是同系物或者結(jié)構(gòu)類型不一樣的化合物，在生理活性方面具有相互協(xié)同、互補(bǔ)增效的作用，在作用范西上往往具有多靶點(diǎn)的特征。雷公藤的主要活性成分二瞎內(nèi)酯類化合物在藥材中含量低，結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜，具有多個(gè)不對(duì)稱中心，化學(xué)合成難度較大，利用純化合物來(lái)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化缺乏實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。新近出現(xiàn)的整體生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，是利用微生物在藥材活性成分不被分離狀態(tài)下進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的類型和比例會(huì)出現(xiàn)較大的變化，從而導(dǎo)致原藥材毒性與功效亦出現(xiàn)較大的改變。這種不分離狀態(tài)下的生物轉(zhuǎn)化具有反應(yīng)條件溫和、成本低、副產(chǎn)物少、后處理簡(jiǎn)單、污染小等優(yōu)點(diǎn)，能夠完成傳統(tǒng)有機(jī)合成難以進(jìn)行的反應(yīng)，成為了創(chuàng)新藥物研究和開(kāi)發(fā)的重要途徑之一。但將該方法應(yīng)用于雷公藤解毒，現(xiàn)有技術(shù)中尚未見(jiàn)有成功的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種雷公藤減毒的方法，利用微生物對(duì)雷公藤原藥材進(jìn)行整體生物轉(zhuǎn)化，以達(dá)到增強(qiáng)療效和降低毒性的效果。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。除非另有說(shuō)明，否則本發(fā)明所采用的百分?jǐn)?shù)均為重量百分?jǐn)?shù)。一種雷公藤減毒的方法，包括以下步驟1、將干燥雷公藤根莖粉碎過(guò)60目篩后，加入雷公藤重量30~60%的麥麩和10~30%豆粉，混合均勻；2、將占混合物料總重1~10%的普通渥堆發(fā)酵普洱茶第4~10天中的發(fā)酵物，或者是占混合物料總重0.01~0.05%的煙曲霉，或者是占混合物料總重0.01~0.05%的毛霉與煙曲霉的混合菌種，作為接種物；3、在混合物料中加入占物料總重60%~90%的開(kāi)水，并充分混合均句，然后在105。C條件下蒸汽滅菌40-120min，冷卻到35。C后，接種步驟2所述的菌種或發(fā)酵物，再添加占混合物料總重30%~60%的純凈水，混合均勻；4、接種后的混合物料再在溫度為25'C40'C,相對(duì)濕度為50~80%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)4~10天，經(jīng)過(guò)乙醇提取，回收乙醇，濃縮干燥后得到雷公藤減毒提取物。進(jìn)一步的，將步驟(2)所述的接種物置于25-40'C,相對(duì)濕度為50~80%的條件下培養(yǎng)4~10天。所述的毛霉與煙曲霉混合比重為l:1~1:5。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)通過(guò)深入的研究，發(fā)現(xiàn)了對(duì)雷公藤具有獨(dú)特轉(zhuǎn)化效果的單一微生物或混合微生物，并利用這些微生物的轉(zhuǎn)化作用，對(duì)雷公藤中復(fù)雜的有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行分解和轉(zhuǎn)化，通過(guò)生物化學(xué)作用使原有成分發(fā)生了變化，不同成分之間的比例出現(xiàn)增減以及產(chǎn)生了新的活性物質(zhì)，從而使雷公藤的功效發(fā)生了較大變化。藥理研究表明，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與原藥材相比，不僅實(shí)現(xiàn)了降低毒性的目標(biāo)，更出現(xiàn)了藥理活性有所增強(qiáng)的效果。同時(shí)由于直接運(yùn)用了未經(jīng)提取分離的原料藥材，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可以直接制成適當(dāng)劑型為臨床所用，避免了轉(zhuǎn)化單一活性物質(zhì)造成的資源浪費(fèi)。該方法操作簡(jiǎn)便，成本低廉，其應(yīng)用對(duì)雷公藤的臨床推廣和產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)具有重要的意義，并且有利于雷公藤生物資源的充分利用和可持續(xù)發(fā)展。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但它們不是對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例1稱取雷公藤20kg，粉碎，過(guò)60目篩，置于容器中，加入麥麩6kg、豆粉6kg，混合，加入20L的開(kāi)水，使物料充分混合均勻；將混合物料釆用蒸汽進(jìn)行滅菌，在105"條件下滅菌40min,冷卻到35°C時(shí)接種占混合物料總重0.01%的毛霉與煙曲霉按1:l混合的菌種，并添加20L純凈水，混合均勻；接菌種后的物料在溫度為35'C，相對(duì)濕度為70%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)7天；結(jié)東后的混合物料經(jīng)過(guò)乙醇提取，回收乙醇，干燥得到2.8kg的雷公藤減毒提取物。實(shí)施例2稱取雷公藤20kg，粉碎，過(guò)60目篩，置于容器中，加入麥麩12kg、豆粉2kg,混合，加入30L的開(kāi)水，使物料充分混合均句；將混合物料釆用蒸汽進(jìn)行滅菌，在105'C條件下滅菌120min，冷卻到35"C時(shí)接種占混合物料總重0.05%的毛霉與煙曲霉按1:5混合的菌種，并添加10L純凈水，混合均勻；接菌種后的物料在溫度為40'C，相對(duì)濕度為80%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)4天；結(jié)東后的混合物料經(jīng)過(guò)乙醇提取，回收乙醇，干燥得到2.6kg的雷公藤減毒提取物。實(shí)施例3稱取雷公藤20kg，粉碎，過(guò)60目篩，置于容器中，加入麥麩8kg、豆粉4kg,混合，加入25L的開(kāi)水，使物料充分混合均勻；將混合物料釆用蒸汽進(jìn)行滅菌，在105'C條件下滅菌40min,冷卻到35°C時(shí)接種占混合物料總重0.03%的毛霉與煙曲霉按1:3混合的菌種，并添加15L純凈水，混合均勻；接菌種后的物料在溫度為25°C,相對(duì)濕度為50%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)10天；結(jié)東后的混合物料經(jīng)過(guò)乙醇提取，回收乙醇，干燥得到2.8kg雷公藤減毒提取物。實(shí)施例4稱取雷公藤20kg,粉碎，過(guò)60目篩，置于容器中，加入麥麩6kg、豆粉6kg,混合，加入20L的開(kāi)水，使物料充分混合均勾；將混合物料采用蒸汽進(jìn)行滅菌，在105X:條件下滅菌40min，冷卻到35°C時(shí)接種占混合物料總重0.01%的煙曲霉菌種，并添加20L純凈水，混合均勻；接菌種后的物料在溫度為35°C,相對(duì)濕度為70%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)7天；結(jié)東后的混合物料經(jīng)過(guò)乙醇提取，回收乙醇，干燥得到2.8kg雷公藤減毒提取物。實(shí)施例5稱取雷公藤20kg,粉碎，過(guò)60目篩，置于容器中，加入麥麩12kg、豆粉2kg，混合，加入30L的開(kāi)水，使其充分混合均勻；將混合物料采用蒸汽進(jìn)行滅菌，在105'C條件下滅菌120min，冷卻到35°C時(shí)接種占混合物料總重0.05%的煙曲霉菌種，并添加10L純凈水，混合均勻；接菌種后的物料在溫度為4(TC,相對(duì)濕度為80%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)4天；結(jié)東后的混合物料經(jīng)過(guò)乙醇提取，回收乙醇，干燥得到2.6kg雷公藤減毒提取物。實(shí)施例6稱取雷公藤20kg，粉碎，過(guò)60目篩，置于容器中，加入麥麩8kg、豆粉4kg,混合，加入25L的開(kāi)水，使其充分混合均勻；將混合物料釆用蒸汽進(jìn)行滅菌，在105'C條件下滅菌40min,冷卻到35°C時(shí)接種占混合物料總重0.03%的煙曲霉菌種，并添加15L純凈水，混合均勻；接菌種后的物料在溫度為25°C,相對(duì)濕度為50%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)10天；結(jié)束后的混合物料經(jīng)過(guò)乙醇提取，回收乙醇，干燥得到2.8kg雷公藤減毒提取物。實(shí)施例7稱取雷公藤20kg，粉碎，過(guò)60目篩，置于容器中，加入麥麩6kg、豆粉6kg，混合，加入20L的開(kāi)水，使物料充分混合均勻；將混合物料釆用蒸汽進(jìn)行滅菌，在105'C條件下滅菌40min，冷卻到35°C時(shí)接種占混合物料總重1%的普通渥堆發(fā)酵普洱茶第6天中的發(fā)酵物，并添加20L純凈水，混合均勻；接菌種后的物料在溫度為35°C，相對(duì)濕度為70%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)7天；結(jié)束后的混合物料經(jīng)過(guò)乙醇提取，回收乙醇，干燥得到2.8kg雷公藤減毒提取物。實(shí)施例8稱取雷公藤20kg,粉碎，過(guò)60目篩，置于容器中，加入麥麩12kg、豆粉2kg,混合，加入30L的開(kāi)水，使物料充分混合均勾；將混合物料釆用蒸汽進(jìn)行滅菌，在105'C條件下滅菌120min,冷卻到35'C時(shí)接種占混合物料總重100/。的普通渥堆發(fā)酵普洱茶第4天中的發(fā)酵物，并添加10L純凈水，混合均勻；接菌種后的物料在溫度為4(TC,相對(duì)濕度為80%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)10天；結(jié)東后的混合物料經(jīng)過(guò)乙醇提取，回收乙醇，干燥得到3.1kg雷公藤減毒提取物。實(shí)施例9稱取雷公藤20kg,粉碎，過(guò)60目篩，置于容器中，加入麥麩8kg、豆粉4kg,混合，加入25L的開(kāi)水，使物料充分混合均勻；將混合物料釆用蒸汽進(jìn)行滅菌，在105t:條件下滅菌40min,冷卻到35°C時(shí)接種占混合物料總重5%的普通渥堆發(fā)酵普洱茶第10天中的發(fā)酵物，并添加15L純凈水，混合均句；接菌種后的物料在溫度為25匸，相對(duì)濕度為50%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)4天；結(jié)東后的混合物料經(jīng)過(guò)乙醇提取，回收乙醇，干燥得到2.9kg雷公藤減毒提取物。為了便于理解本發(fā)明的整體生物轉(zhuǎn)化效果，下面提供3種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和雷公藤原藥材進(jìn)行的藥理、毒理研究結(jié)果。實(shí)驗(yàn)例1二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)取18~20g小鼠70只，雌雄各半，按性別和體重隨機(jī)分為7組，見(jiàn)表1。樣品均按15g/kg的原生藥劑量折算成相應(yīng)的提取物劑量，以比較同等生藥劑量的作用差異。各組動(dòng)物分別按劑量每曰灌胃給藥一次，對(duì)照組分別給予純水和5%乙醇，連續(xù)7天，容積均為20ml/kg。末次給藥后30min,于每鼠右耳兩面均勻涂抹二甲苯50pl，左耳不涂為對(duì)照。l小時(shí)后脫臼處死動(dòng)物，用8mra打孔器將雙耳同部位等面積切下，稱重、并計(jì)算耳腫脹度。結(jié)果見(jiàn)表1。表1對(duì)二'甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>與純水對(duì)照相比P<0.01;與5%乙醇對(duì)照相比A，AAP<0.05，0.01結(jié)果3種不同轉(zhuǎn)化后的提取物的抗炎作用均比未轉(zhuǎn)化者強(qiáng)，以渥堆發(fā)酵中的普洱茶和煙曲霉、毛霉混合菌種的轉(zhuǎn)化提取物的抗炎作用最強(qiáng)，是原藥材的8倍；煙曲霉菌種的轉(zhuǎn)化總提物是原藥材的2倍。實(shí)驗(yàn)例2DNFB致小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)取20-22g小鼠96只，雌雄各半，分組及給藥方法同上，見(jiàn)表2。除空白對(duì)照外，其余動(dòng)物首次給藥后lh于腹部皮膚均勻涂抹1%DNFB混合液50ul/只致敏，并于第2天加強(qiáng)1次。末次給藥后30min,各鼠右耳兩面均勻涂抹1%DNFB混合液10ul進(jìn)行攻擊，左耳涂等量混合溶媒。激發(fā)后24h脫頸推處死動(dòng)物，取耳片稱重，以兩耳片重之差作為遲發(fā)性超敏反應(yīng)值。并剖取胸腺和脾臟稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表2。表2對(duì)小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表2可見(jiàn)，以15g/kg的相同生藥劑量連續(xù)灌胃給藥7天，對(duì)由DNFB誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)無(wú)明顯抑制作用外。實(shí)施例7對(duì)脾臟系數(shù)有明顯抑制；各組均對(duì)小鼠胸腺系數(shù)有不同程度的抑制作用，實(shí)施例1、實(shí)施例7與對(duì)照組相比均對(duì)胸腺系數(shù)有明顯抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)施例7對(duì)細(xì)胞免疫的抑制作用明顯增強(qiáng)，提示其可能為轉(zhuǎn)化后對(duì)免疫作用的物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)生了變化所致。實(shí)驗(yàn)例3小鼠免疫器官系數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)取1820g小鼠70只，雌雄各半，分組及給藥方法同上，見(jiàn)表3。末次給藥后30min,脫臼處死小鼠，剖取胸腺和脾臟稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3對(duì)小鼠免疫器官系數(shù)的影響與空白相比，P<0.05，0.01結(jié)果經(jīng)轉(zhuǎn)化后的提取物對(duì)免疫器官的抑制作用明顯強(qiáng)于未轉(zhuǎn)化者，尤其是渥堆發(fā)酵中的普洱茶，毛霉、煙曲霉混合為菌種的轉(zhuǎn)化物，提示轉(zhuǎn)化產(chǎn)物具有免疫抑制作用。實(shí)驗(yàn)例4小鼠臟器系數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)取18-20g小鼠72只，雌雄各半，分組及給藥方法同上，末次給藥后12小時(shí)，脫臼處死小鼠，解剖取肝、脾臟、腎、胸腺稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表4。表4對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>與空白組相比，P<0.05，0.01;與溶媒組相比A,AAP<0.05,0.01結(jié)果從解剖小鼠的臟器發(fā)現(xiàn)，三種菌種的轉(zhuǎn)化提取物的肝腫大沒(méi)有原藥強(qiáng)，說(shuō)明對(duì)肝毒性有所降低；三種菌種的轉(zhuǎn)化提取物的都能抑制脾的腫大,以接種發(fā)酵普再茶的明顯；所有發(fā)酵產(chǎn)物和雷公藤都有抑制胸腺的作用，以渥堆發(fā)酵中的普洱茶為菌種的效果較強(qiáng)；不同菌種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與空白相比對(duì)腎沒(méi)有產(chǎn)生較大影響(與空白相比P>0.05)。綜合評(píng)價(jià)可得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)臟器的毒性沒(méi)有原藥強(qiáng)，并體現(xiàn)了強(qiáng)的抗炎作用于胸腺抑制有關(guān)。實(shí)驗(yàn)例5小鼠的血液生化指標(biāo)實(shí)驗(yàn)取1820g小鼠72只，雌雄各半，分組及給藥方法同上，末次給藥后12小時(shí)，釆用眼眶取血，并測(cè)量血液的生化指標(biāo)。結(jié)果見(jiàn)表5。_表5對(duì)小鼠的血液生化指標(biāo)的影響_<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結(jié)果小鼠的血液生化指標(biāo)表明，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與空白相比對(duì)白細(xì)胞、紅細(xì)胞的影響不大(與空白相比P>0.05);轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與空白相比對(duì)血小板具有升高的趨勢(shì)；煙曲霉發(fā)酵物具有降低粒細(xì)胞的作用。總體看對(duì)血液系統(tǒng)沒(méi)有較大的影響。權(quán)利要求1、一種雷公藤減毒的方法，包括以下步驟(1)將干燥雷公藤根莖粉碎過(guò)60目篩后，加入雷公藤重量30～60％的麥麩和10～30％豆粉，混合均勻；(2)將占混合物料總重1～10％的普通渥堆發(fā)酵普洱茶第4～10天中的發(fā)酵物，或者是占混合物料總重0.01～0.05％的煙曲霉，或者是占混合物料總重0.01～0.05％的毛霉與煙曲霉的混合菌種，作為接種物；(3)在混合物料中加入占物料總重60％～90％的開(kāi)水，并充分混合均勻，然后在105℃條件下蒸汽滅菌40～120min，冷卻到35℃后，接種步驟(2)所述的菌種或發(fā)酵物，再添加占混合物料總重30％～60％的純凈水，混合均勻；(4)接種后的混合物料再在溫度為25℃～40℃，相對(duì)濕度為50～80％的條件下進(jìn)行培養(yǎng)4～10天，經(jīng)過(guò)乙醇提取，回收乙醇，濃縮干燥后得到雷公藤減毒提取物。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于將步驟(2)所述的接種物置于254(TC,相對(duì)濕度為50~80°/。的條件下培養(yǎng)4~10天。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的毛霉與煙曲霉混合的比重為1:1~1:5。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種雷公藤減毒的方法，將雷公藤原藥粉末與麥麩、豆粉混合均勻，將普通渥堆發(fā)酵普洱茶第4～10天中的發(fā)酵物，或是毛霉、煙曲霉作為接種物，在混合物料中加入開(kāi)水，蒸汽滅菌40～120min，冷卻到35℃后，接種所述的菌種或發(fā)酵物，再加入純凈水，在溫度25℃～40℃，相對(duì)濕度為50～80％的條件下進(jìn)行培養(yǎng)4～10天，經(jīng)過(guò)乙醇提取，回收乙醇，濃縮干燥后得到雷公藤減毒提取物。本發(fā)明利用微生物的整體轉(zhuǎn)化作用，不僅實(shí)現(xiàn)了降低毒性的目標(biāo)，更出現(xiàn)了藥理活性有所增強(qiáng)的效果。由于直接運(yùn)用了未經(jīng)提取分離的原料藥材，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可以直接制成適當(dāng)劑型為臨床所用，避免了轉(zhuǎn)化單一活性物質(zhì)造成的資源浪費(fèi)。有利于雷公藤生物資源的充分利用和可持續(xù)發(fā)展。文檔編號(hào)A61K127/00GK101361779SQ20081005893公開(kāi)日2009年2月11日申請(qǐng)日期2008年9月19日優(yōu)先權(quán)日2008年9月19日發(fā)明者云畢,馬偉光,黃之鐠申請(qǐng)人:馬偉光