專利名稱：一種雷公藤多苷及其制劑的質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雷公藤多苷及其制劑的質(zhì)量控制方法。
背景技術(shù)：
雷公藤以其獨(dú)特的功效引起國內(nèi)外醫(yī)藥界的廣泛關(guān)注。雷公藤屬在我國主要分布于長江流域以南山區(qū)和東北長白山區(qū)，民間廣泛流傳用作為治療關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、皮膚病等的草藥，也用于農(nóng)藥。明朝《滇南本草》以其異名“紫金皮”作為藥物進(jìn)行記載并用于臨床。清代《植物名實(shí)圖考》對(duì)其植物形態(tài)有較詳細(xì)的文字描述，并附有與之相符的插圖。在臨床上國內(nèi)對(duì)雷公藤的研究取得了顯著的成效和突破，從治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎已發(fā)展到治療紅斑狼瘡、銀屑病、腎炎和腫瘤研究等多種常見病和疑難雜癥，所治病種不斷增多，涉及到臨床內(nèi)、外、兒、婦、骨科、皮膚、傳染、神經(jīng)、腫瘤、風(fēng)濕、口腔等十余個(gè)學(xué)科的數(shù)十種疾病，新近又顯示出其器官移植抗排斥方面廣闊前景。由于其應(yīng)用面廣、療效顯著，且對(duì)疑難頑癥具有獨(dú)特治療作用而逐漸成為國內(nèi)外、中醫(yī)、西醫(yī)、中西醫(yī)各專家矚目和研究的熱點(diǎn)。因此為保證臨床用藥的可控性、安全性，建立一個(gè)穩(wěn)定，有效的質(zhì)量控制方法十分重要。
目前雷公藤提取物的質(zhì)量控制方法主要從單一方面來衡量，如僅依靠對(duì)其中某些成分的含量測(cè)定來控制，科學(xué)性及可靠性不夠高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提高雷公藤提取物質(zhì)量控制方法的科學(xué)性，而提供一種從多方面考察產(chǎn)品質(zhì)量的雷公藤多苷及其制劑的質(zhì)量控制方法。
本發(fā)明中，所數(shù)的雷公藤多苷為衛(wèi)矛科植物雷公藤(Tripterygium wilfordiiHook F.)的根部經(jīng)去皮，粉碎，提取，層析精制得到，其制劑指所有以雷公藤多苷為原料的各種劑型。本發(fā)明的方法適用于雷公藤多苷及其制劑的質(zhì)量控制，及含雷公藤多苷的藥物及制劑的質(zhì)量控制。本發(fā)明中，制劑的質(zhì)量控制以雷公藤多苷為基礎(chǔ)物質(zhì)進(jìn)行換算。
本發(fā)明的方法包括三個(gè)方面的質(zhì)量控制(1)以標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，采用薄層色譜進(jìn)行分離檢測(cè)。
其中，所述的薄層色譜中，溶解樣品的溶劑較佳的為環(huán)己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇或乙腈；薄層板較佳的為硅膠；展開劑較佳的為環(huán)己烷/丙酮或氯仿/甲醇。
具體實(shí)驗(yàn)步驟可如下取相當(dāng)于雷公藤多苷0.3～1g的固體，加入有機(jī)溶劑(可以是環(huán)己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、乙腈等)50mL，超聲提取30分鐘，搖勻。取上述溶液25mL，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)佑袡C(jī)溶劑(可以是環(huán)己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、乙腈等)2mL溶解，作為供試品溶液。另取雷公藤甲素對(duì)照品，加氯仿制成每毫升含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液(1)。取雷公藤酯甲對(duì)照品加氯仿制成每毫升含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液(2)。照薄層色譜法(藥典2005版附錄)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液(1)、(2)各5uL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以展開劑展開[展開劑可以是氯仿∶甲醇(90～70∶1～3)；也可以是環(huán)己烷∶丙酮(3-10∶1-7)]，展開，取出，涼干，噴以5％磷鉬酸乙醇溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在于對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。
(2)干燥失重、熾灼殘?jiān)椭亟饘俸繖z測(cè)。
其中，干燥失重的方法依照中國藥典2005年一部附錄，具體為標(biāo)準(zhǔn)為60℃減壓干燥4小時(shí)后，減失重量不得超過質(zhì)量百分比5.0％。
其中，熾灼殘?jiān)臋z測(cè)方法依照中國藥典2005年一部附錄，標(biāo)準(zhǔn)為重量不超過質(zhì)量百分比1.0％。
其中，重金屬含量的檢測(cè)方法依照中國藥典2005年一部，標(biāo)準(zhǔn)為不得超過百萬分之二十的重量。
本發(fā)明中，制劑的質(zhì)量控制檢測(cè)依照藥典制劑項(xiàng)下規(guī)定進(jìn)行。
(3)高效液相色譜測(cè)定雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯甲含量，以及毒力試驗(yàn)。
其中，雷公藤甲素含量的測(cè)定的實(shí)驗(yàn)條件及具體操作如下1.色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以有機(jī)溶劑(可以是環(huán)己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、乙腈等)0.01mol/L磷酸二氫鹽(可以是鉀鹽、鈉鹽等)溶液(PH2-6)(20-60∶80-40)為流動(dòng)相，柱溫25～50℃，以1mL/min流速進(jìn)行洗脫，檢測(cè)波長為218nm、225nm。理論板數(shù)按雷公藤甲素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。
2.對(duì)照品溶液的制備取雷公藤甲素對(duì)照品適量，精密稱定，加(可以是甲醇或流動(dòng)相)溶解并制成每毫升約含50ug的溶液。
3.供試品溶液的制備取相當(dāng)于雷公藤多苷約0.3g的固體，精密稱定，加入有機(jī)溶劑(可以是環(huán)己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、乙腈、流動(dòng)相等)10mL溶解，稱重，超聲提取，再稱重加相同的有機(jī)溶劑補(bǔ)足損失量，搖勻，離心(3000r/min)。精密吸取上清液5mL，加至用相同的有機(jī)溶劑濕法裝好的中性氧化鋁(3g，內(nèi)徑1cm，70-350目，20-40度)柱上，用相同的有機(jī)溶劑洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸除有機(jī)溶劑，殘?jiān)杂袡C(jī)溶劑(可以是環(huán)己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、乙腈、流動(dòng)相等)轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加相同的有機(jī)溶劑定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。
4.測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。雷公藤多苷中含雷公藤甲素為質(zhì)量百分比0.10～0.20％。
其中，雷公藤內(nèi)酯甲含量的測(cè)定的實(shí)驗(yàn)條件及具體操作如下1.色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-乙腈-水(75～50∶10～30∶5～20)為流動(dòng)相，柱溫25～50℃，以1mL/min流速進(jìn)行洗脫，檢測(cè)波長為210nm。理論板數(shù)按雷公藤內(nèi)酯甲峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。
2.對(duì)照品溶液的制備取雷公藤內(nèi)酯甲對(duì)照品適量，精密稱定，加(可以是甲醇或流動(dòng)相)溶解并制成每毫升中約含0.1mg的溶液。
3.供試品溶液的制備取相當(dāng)于雷公藤多苷約0.3g的固體，精密稱定，加入有機(jī)溶劑(可以是環(huán)己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、乙腈、流動(dòng)相等)10mL溶解，稱重，超聲提取，稱重并加入相同的有機(jī)溶劑補(bǔ)足損失量，離心(3000r/min)。精密吸取上清液5mL至已用相同的有機(jī)溶劑濕法裝好的中性氧化鋁(3g，內(nèi)徑1cm，70-350目，20-40度)柱上，用相同的有機(jī)溶劑洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，殘?jiān)杂袡C(jī)溶劑(可以是環(huán)己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、乙腈、流動(dòng)相等)轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加相同的有機(jī)溶劑定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。
4.測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。雷公藤多苷中含雷公藤內(nèi)酯甲0.25～0.40％。
其中，毒力試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)條件及操作如下對(duì)照品溶液的制備，精密稱取對(duì)照品適量，每20mg加吐溫-80，0.1ml，攪勻，加熱使溶解，逐滴加水稀釋至所需體積。
供試品溶的制備精密稱取本品適量，按對(duì)照品溶液的制備方法配制。
測(cè)定法取同一來源，體重18-22g的健康小白鼠，灌胃給藥，分別測(cè)定對(duì)照品和供試品的半數(shù)至死量，供試品與對(duì)照品兩者LD50的比值應(yīng)為0.90～1.10，即LD50的平均可信限率不得超過15％，P＝0.95。
本發(fā)明所用試劑及原料均市售可得。
本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于本發(fā)明打破了只從某個(gè)方面因素決定雷公藤多苷質(zhì)量的局面，從多個(gè)因素入手，協(xié)同控制雷公藤多苷的質(zhì)量，結(jié)果更科學(xué)有效，更加可靠。本專利方法經(jīng)科學(xué)統(tǒng)計(jì)方法驗(yàn)證，精密度高、重現(xiàn)性強(qiáng)、方法穩(wěn)定，回收率、線性都很好。


圖1為雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
圖2雷公藤內(nèi)酯甲標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。
實(shí)施例(1)以標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，采用薄層色譜進(jìn)行分離檢測(cè)。
取相當(dāng)于雷公藤多苷約0.3g的固體，加入氯仿50mL，超聲提取，搖勻。取上述溶液25mL，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)勇确?mL溶解，作為供試品溶液。另取雷公藤甲素對(duì)照品，加氯仿制成每毫升含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液(1)。取雷公藤內(nèi)酯甲對(duì)照品加氯仿制成每毫升含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液(2)。照薄層色譜法(附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液(1)、(2)各5uL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇(80∶1)為展開劑，展開，取出，涼干，噴以5％磷鉬酸乙醇溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在于對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。
(2)干燥失重、熾灼殘?jiān)椭亟饘俸繖z測(cè)。
干燥失重的方法依照中國藥典2005年一部附錄，具體為標(biāo)準(zhǔn)為60℃減壓干燥4小時(shí)后，減失重量不得超過質(zhì)量百分比5.0％。
熾灼殘?jiān)臋z測(cè)方法依照中國藥典2005年一部附錄，標(biāo)準(zhǔn)為重量不超過質(zhì)量百分比1.0％。
重金屬含量的檢測(cè)方法依照中國藥典2005年一部，標(biāo)準(zhǔn)為不得超過百萬分之二十的重量。
(3)高效液相色譜測(cè)定雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯甲含量，以及毒力試驗(yàn)。
儀器Agilent.1100 Series高效液相色譜儀。
(一)雷公藤甲素測(cè)定1、對(duì)照品溶液的制備取雷公藤甲素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并制成每毫升約含50ug的溶液。
2、供試品溶液的制備取相當(dāng)于雷公藤多苷約0.3g的固體，精密稱定，加入乙酸乙酯10mL溶解，稱重，超聲提取，再稱重加乙酸乙酯補(bǔ)足損失量，搖勻，離心(3000r/min)。精密吸取上清液5mL，加至用乙酸乙酯濕法裝好的中性氧化鋁(3g內(nèi)徑1cm，70-350目)柱上(室溫條件下)，用乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸除乙酸乙酯，殘?jiān)约状嫁D(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。
3、測(cè)定精密吸取供試品溶液10μL，照HPLC法(中國藥典2005年版一部)操作。色譜條件柱溫30℃，流動(dòng)相甲醇-0.01mol/L磷酸二氫鉀(35∶65)，流速1.00mL/min。在225nm波長處測(cè)定供試品和對(duì)照品的峰面積，計(jì)算即得。
(二)雷公藤內(nèi)酯甲測(cè)定1、對(duì)照品溶液的制備取雷公藤內(nèi)酯甲對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并制成每毫升中約含0.1mg的溶液。
2、試品溶液的制備取相當(dāng)于雷公藤多苷約0.3g的固體，精密稱定，加入乙酸乙酯10mL溶解，稱重，超聲提取，稱重并加入乙酸乙酯補(bǔ)足損失量，離心(3000r/min)。精密吸取上清液5mL至已用乙酸乙酯濕法裝好的中性氧化鋁(3g，內(nèi)徑1cm，70-350目)柱上(室溫條件下)，用乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，殘?jiān)约状嫁D(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。
3、測(cè)定精密吸取供試品溶液20μL，照HPLC法(中國藥典2005年版一部附錄)操作。色譜條件柱溫30℃，流動(dòng)相甲醇-乙晴-水(60∶25∶15)，流速1.0mL/min。在210nm波長處測(cè)定供試品和對(duì)照品的峰面積，計(jì)算即得。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密稱取雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯甲對(duì)照品8.15mg、6.04mg，用甲醇溶解并定容至25mL作為儲(chǔ)備液。分別精密吸取儲(chǔ)備液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL和0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0置5mL量瓶中，按色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。分別繪制曲線，并計(jì)算得回歸方程Y1＝1714.2X+0.7818，Y2＝507.02X-0.0258；R1＝1.0000，R2＝0.9998。表明在0.163～1.630μg、0.484～4.840μg之間兩者有較好的線性關(guān)系(見圖1)。
表1雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

表2雷公藤酯甲標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

精密度試驗(yàn)精密吸取雷公藤甲素對(duì)照品溶液(0.0326mg/mL)10μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算平均峰面積及RSD(％)，結(jié)果見表3。
表3精密度試驗(yàn)結(jié)果(雷公藤甲素)

精密吸取雷公藤酯甲對(duì)照品溶液(0.0966mg/mL)20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算平均峰面積及RSD(％)，結(jié)果見表4。
表4精密度試驗(yàn)結(jié)果(雷公藤內(nèi)酯甲)

穩(wěn)定性試驗(yàn)取含量測(cè)定項(xiàng)下的供試品溶液分別在0、3、6、12、24小時(shí)測(cè)定含量，結(jié)果見表5。
表5穩(wěn)定性試驗(yàn)


表明雷公藤甲素和雷公藤酯甲含量在24小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定。
重現(xiàn)性試驗(yàn)取供試品每份約0.3g，共計(jì)5份，精密稱定，同前制備成供試品液，同前述方法操作測(cè)定雷公藤甲素，結(jié)果見表6。
表6重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果(雷公藤甲素)

另取供試品每份約0.3g，共計(jì)5份，精密稱定，同前制備成供試品溶液，同前述方法操作測(cè)定雷公藤內(nèi)酯甲，結(jié)果見表7。
表7重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果(雷公藤內(nèi)酯甲)


加樣回收率試驗(yàn)精密稱定已知雷公藤甲素含量的雷公藤多苷，添加一定量的雷公藤甲素對(duì)照品溶液，按照“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備加樣樣品，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明，本法具有良好的加樣回收率，平均回收率為98.6％，RSD為2.71％，結(jié)果見表8。
表8雷公藤多苷(雷公藤甲素)加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定已知雷公藤酯甲含量的雷公藤多苷(批號(hào)041126)，添加一定量的雷公藤酯甲對(duì)照品溶液，按照“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備加樣樣品，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明，本法具有良好的加樣回收率，平均回收率為98.1％，RSD為3.01％，結(jié)果見表9。
表9雷公藤多苷(雷公藤酯甲)加樣回收率試驗(yàn)

樣品測(cè)定取不同批號(hào)雷公藤多苷精密稱定，按含量測(cè)定項(xiàng)下制備并測(cè)定，用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，結(jié)果見表10、11。
表10雷公藤多苷中的雷公藤甲素含量

表11雷公藤多苷中的雷公藤內(nèi)酯甲含量

權(quán)利要求
1.一種雷公藤多苷及其制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于采用下述三個(gè)方法進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)(1)以標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，采用薄層色譜進(jìn)行分離檢測(cè)；(2)干燥失重、熾灼殘?jiān)椭亟饘俸繖z測(cè)；(3)高效液相色譜測(cè)定雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯甲含量，以及毒力試驗(yàn)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的薄層色譜中，溶解樣品的溶劑為環(huán)己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇或乙腈。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的薄層色譜中，薄層板為硅膠。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的薄層色譜中，展開劑為環(huán)己烷/丙酮或氯仿/甲醇。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的干燥失重的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為60℃減壓干燥4小時(shí)后，減失重量不得超過質(zhì)量百分比5.0％；熾灼殘?jiān)臋z測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為重量不超過質(zhì)量百分比1.0％；重金屬含量的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為不得超過百萬分之二十的重量。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的雷公藤甲素含量測(cè)定的色譜條件為，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以體積比為20～60∶80～40的有機(jī)溶劑0.01mol/L磷酸二氫鹽溶液為流動(dòng)相，柱溫25～45℃，以1mL/min流速進(jìn)行洗脫，檢測(cè)波長為218nm或225nm，理論板數(shù)按雷公藤甲素峰計(jì)算不低于2500，雷公藤甲素的含量為質(zhì)量百分比0.10～0.20％；所述的雷公藤內(nèi)酯甲的色譜條件為，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以體積比為75～50∶10～30∶5～20的甲醇-乙腈-水為流動(dòng)相，柱溫25～50℃，以1mL/min流速進(jìn)行洗脫，檢測(cè)波長為210nm，理論板數(shù)按雷公藤內(nèi)酯甲峰計(jì)算應(yīng)不低于2500，雷公藤內(nèi)酯甲的含量為質(zhì)量百分比0.25～0.40％。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑為甲醇或乙腈，所述的磷酸二氫鹽為鉀鹽或鈉鹽。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的毒力試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)為供試品與對(duì)照品兩者LD50的比值應(yīng)為0.90～1.10，LD50的平均可信限率不得超過15％，P＝0.95。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種雷公藤多苷及其制劑的質(zhì)量控制方法。本發(fā)明通過鑒別、檢查、含量測(cè)定等多個(gè)方面檢測(cè)，共同控制雷公藤多苷及其制劑的質(zhì)量，適用于雷公藤多苷及其制劑的質(zhì)量控制，及含雷公藤多苷的藥物及制劑的質(zhì)量控制。本發(fā)明打破了只從某個(gè)方面因素決定雷公藤多苷質(zhì)量的局面，從多個(gè)因素入手，協(xié)同控制雷公藤多苷的質(zhì)量，結(jié)果更科學(xué)有效，更加可靠。
文檔編號(hào)G01N35/00GK101093219SQ200710043859
公開日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2007年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月17日
發(fā)明者林健 申請(qǐng)人:上海美通生物科技有限公司, 江蘇美通制藥有限公司