專利名稱：β－二氫沉香呋喃倍半萜多醇酯類化合物合成新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)合成β-二氫沉香呋喃倍半萜多醇酯類化合物的方法。
農(nóng)桿菌是一種植物病原菌，主要有根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌，能浸染植物受傷部位，導(dǎo)致受傷部位長瘤或長根。C58農(nóng)桿菌是一種含有Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細胞是通過將體內(nèi)質(zhì)粒的一段DNA(T-DNA)轉(zhuǎn)移到被浸染的植物細胞而實現(xiàn)的。參與該過程的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)主要有三個方面(1)被轉(zhuǎn)移的T-DNA，該DNA片段位于農(nóng)桿菌內(nèi)一個大質(zhì)粒上(Ti或Ri)；(2)位于同一質(zhì)粒上，用于編碼FDNA加工、轉(zhuǎn)移及整合等功能蛋白的致毒區(qū)(Vir區(qū))，該致毒區(qū)至少包括6個位點，分別為VirA、VirB、VirC、VirD、VirE和VirG，每位點包括1-11個開放閱讀框。有些菌種還有VirF和VirH位點；(3)位于細菌染色體上的與農(nóng)桿菌吸附植物細胞壁有關(guān)的基因(Chv)。已有研究表明，農(nóng)桿菌浸染植物細胞時，首先是吸附到植物細胞壁(與Chv)有關(guān)，隨后VirA的蛋白感受植物受傷細胞產(chǎn)生的信號(酚類化合物、糖類等)，自身發(fā)生磷酸化。磷酸化的VirA蛋白進而將其磷酸基轉(zhuǎn)移到VirG蛋白保守的天冬氨酸殘基上，使VirG蛋白活化，活化的VirG蛋白以二體或多體的形式結(jié)合到其它Vir基因啟動的特定區(qū)域，從而激活其它Vir基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生T-DNA。T-DNA具有編碼生長素合成酶基因iaaM(tmsll)、iaaH(tms2)及編碼細胞分裂素合成酶基因ipt(tmr)，當(dāng)農(nóng)桿菌浸染植物時可以將T-DNA整合到植物細胞的基因組，在植物細胞內(nèi)iaaM和iaaH基因分別表達編碼色氨酸單加氧酶及吲哚乙酸酰胺水解酶，這兩個酶共同作用合成吲哚乙酸(1AA)，而ipt基因表達編碼異戊烯基轉(zhuǎn)移酶，該酶催化合成細胞分裂素一異戊烯腺嘌呤(ipA)。T-DNA指導(dǎo)的生長素及細胞分裂素的合成導(dǎo)致了轉(zhuǎn)化植物組織出現(xiàn)冠癭組織的形態(tài)。
為達上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案β-二氫沉香呋喃倍半萜多醇酯類化合物合成新方法，包括苦皮藤接種C58農(nóng)桿菌、組織培養(yǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物萃取步驟；在接種步驟，用經(jīng)活化的C58農(nóng)桿菌對苦皮藤根、莖、葉進行接種；在組織培養(yǎng)步驟，取接種后形成的冠癭組織接種于固體培養(yǎng)基A上，于16-32℃培養(yǎng)2-4周；在目標(biāo)產(chǎn)物萃取步驟，在提取器中用有機溶劑回流萃取愈傷組織4-6小時，蒸去有機溶劑得目標(biāo)產(chǎn)物β-二氫沉香呋喃倍半萜多醇酯類化合物。
在組織培養(yǎng)步驟，把固體培養(yǎng)基A培養(yǎng)后的冠癭組織移入液體培養(yǎng)基B于16-32℃培養(yǎng)2-4周。
苦皮藤接種C58農(nóng)桿菌可在無菌條件下采用葉盤法或直接穿刺法進行或在自然生長條件下用直接穿刺法進行；組織培養(yǎng)過程避光進行，培養(yǎng)基采用無激素培養(yǎng)基。
C58農(nóng)桿菌活化過程為先將凍干保存的C58農(nóng)桿菌接種于PH7.0-7.5的無菌斜面固體培養(yǎng)基A’上進行培養(yǎng)，每100ml固體培養(yǎng)基A’含蛋白胨0.2-1.0g、牛肉浸膏0.3-1.5g、蔗糖0.5-3g、硫酸鎂20-30mg、瓊脂1-5g，培養(yǎng)條件為20-28℃、約2天轉(zhuǎn)接一次、轉(zhuǎn)接2-4次；再接種于PH7.0-7.5的無菌液體培養(yǎng)基B’上進行培養(yǎng)，每100ml液體培養(yǎng)基B’含蛋白胨0.5-1.5g、酵母膏0.2-0.8g、蔗糖0.5-1.5g，培養(yǎng)條件20-28℃、120-160rpm搖床培養(yǎng)1-2天，對照無菌液體培養(yǎng)液OD56nm＝1.58時，按菌液無菌液體培養(yǎng)液體積比1∶200把菌液加入培養(yǎng)液于120-160rpm搖床繼續(xù)培養(yǎng)至OD560nm＝1.5-1.6時止，該培養(yǎng)液稀釋5倍至OD560nm＝0.7-0.8。
固體培養(yǎng)基A含有硫酸鎂185-740mg/l、磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉或二者之和75-340mg/l、硝酸鉀950-3800mg/l、硝酸銨825-3300mg/l、氯化鈣220-880mg/l、蔗糖1 5000-60000mg/l、瓊脂6000-24000mg/l；硫胺0.25-1.0mg/l、吡多醇0.25-1.0mg/l、煙酸0.025-0.10mg/l、肌醇50-200mg/l；硼酸3.2-12.4mg/l、硫酸錳7.8-31.2mg/l、硫酸鋅4.3-17.2mg/l、鉬酸鈉0.125-0.50mg/l、硫酸銅0.0125-0.050mg/l、氯化鈷0.0125-0.050mg/l、碘化鉀0.415-1.66mg/l、硫酸亞鐵13.9-55.6mg/l、EDTA鈉鹽18.6-74.6mg/l或EDTA鐵鹽21.5-86mg/l，逐一稱取除蔗糖、瓊脂外培養(yǎng)基成分，水溶、混合并加水稀釋至所需濃度，再加入配方量蔗糖和瓊脂使溶化，調(diào)PH＝5.5-6.5滅菌。
液體培養(yǎng)基B中含有硫酸鎂185-740mg/l、磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉或二者之和75-340mg/l、硝酸鉀950-3800mg/l、硝酸銨825-3300mg/l、氯化鈣220-880mg/l、蔗糖15000-60000mg/l；硫胺0.25-1.0mg/l、吡多醇0.25-1.0mg/l、煙酸0.025-0.10mg/l、肌醇50-200mg/l；硼酸3.2-12.4mg/l、硫酸錳7.8-31.2mg/l；硫酸鋅4.3-17.2mg/l、鉬酸鈉0.125-0.50mg/l、硫酸銅0.0.125-0.050mg/l、EDTA鈉鹽18.6-74.6mg/l或EDTA鐵鹽21.5-86mg/l，逐一稱取除蔗糖外培養(yǎng)基成分，水溶、混合并加水稀釋至所需濃度，再加入蔗糖溶解，調(diào)PH＝5.5-6.5滅菌得液體培養(yǎng)基B。
本發(fā)明方法中，C58農(nóng)桿菌接種后1-15分鐘即可形成冠癭組織或冠癭瘤。本發(fā)明利用生物學(xué)的轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)方法合成β-二氫沉香呋喃倍半萜多醇酯類化合物，不受自然資源限制；方法中組織培養(yǎng)用培養(yǎng)基為組織培養(yǎng)中廣泛應(yīng)用的培養(yǎng)基，成份易得；培養(yǎng)基中含有氮、磷、鉀等大量元素，硼、鋅、錳、鉬、鈷、碘、鐵、鈉等微量元素，硫胺、吡多醇、煙酸、肌醇等維生素。能夠提供組織培養(yǎng)所需各種營養(yǎng)成份。組織培養(yǎng)條件溫和，萃取方法簡便易行，整個方法易于工業(yè)化應(yīng)用。除具有上述優(yōu)點外，與常規(guī)組織培養(yǎng)方法相比較，本發(fā)明采用轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)法，不需要添加外源植物激素，成本大幅度降低；組織生長迅速，一般2-4周即可完成，而常規(guī)組織培養(yǎng)法則需近3個月；無需照明，常規(guī)組織培養(yǎng)一般在光照下效果好，而本發(fā)明采用轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)法則無需光照，培養(yǎng)過程避光進行，既減少了生產(chǎn)設(shè)備，又降低了投資額及生產(chǎn)成本，維護費用也得以降低。
組織培養(yǎng)及目標(biāo)產(chǎn)物萃取把接種后形成的冠癭組織轉(zhuǎn)接于固體培養(yǎng)基A上，在25℃無光條件下培養(yǎng)2周，把愈傷組織置于索氏提取器中加石油醚萃取4小時，再蒸除石油醚，即得目標(biāo)產(chǎn)物β-二氫沉香呋喃倍半萜多醇酯類化合物，其代表物為苦皮素A。
本實施例中，固體培養(yǎng)基A制法為硫酸鎂370mg、磷酸二氫鉀170mg、硝酸鉀1900mg、硝酸銨1650mg、氯化鈣440mg、硼酸6.2mg、硫酸錳15.6mg；硫酸鋅8.6mg、鉬酸鈉0.25mg、硫酸銅0.025mg、氯化鈷0.025mg、碘化鉀0.83mg、硫酸亞鐵27.8mg、EDTA鈉鹽37.3mg、硫胺0.5mgl、吡多醇0.5mg、煙酸0.05mg、肌醇120mg，用水溶解、混合，加水稀釋至1000ml，再稱取蔗糖36000mg、瓊脂14000mg加入上述溶液中加熱使溶化，用0.1mol/1NaoH調(diào)PH＝5.8，121℃滅菌20分鐘，冷卻得固體培養(yǎng)基1。
實施例2，本實施例中，固體培養(yǎng)基A配方為硫酸鎂444mg/l、磷酸二氫鉀204mg/l、硝酸鉀2800mg/l、硝酸銨1980mg/l、氯化鈣528mg/l、硼酸7.4mg/l、硫酸錳18.8mg/l；硫酸鋅10.3mg/l、鉬酸鈉0.30mg/l、硫酸銅0.03mg/1、氯化鈷0.03mgl、碘化鉀0.99mg/l、硫酸亞鐵33.2mg/l、EDTA鈉鹽44.5mg/l、硫胺0.6mgl/l、吡多醇0.6mg/l、煙酸0.06mg/l、肌醇120mg/l。蔗糖30000mg/l、瓊脂12000mg/l。其它同實施例1。
實施例3，本實施例中，C58農(nóng)桿菌活化及苦皮藤葉片消毒處理同實施例1。固體培養(yǎng)基A配方及制法同實施例1。液體培養(yǎng)基B配方為硫酸鎂296mg/l、磷酸二氫鉀136mg/l、硝酸鉀1520mg/l、硝酸銨1320mg/l、氯化鈣328mg/l、硼酸5.0mg/l、硫酸錳12.4mg/l；硫酸鋅6.9mg/l、鉬酸鈉0.20mg/l、硫酸銅0.02mg/l、氯化鈷0.02mg/l、碘化鉀0.66mg/l、硫酸亞鐵22.3mg/l、EDTA鈉鹽29.4mg/l、硫胺0.4mgl/l、吡多醇0.4mg/l、煙酸0.04mg/l、肌醇80mg/l。蔗糖30000mg/l。制法為取上述除蔗糖外成份水溶、混合并加水稀釋至所需濃度，加入蔗糖溶解，調(diào)PH＝6.0，121℃滅菌30min得液體培養(yǎng)基A。
取消毒處理后葉片用備用打孔器打成小圓片，放入滅菌培養(yǎng)箱中，滅菌后加入活化后的C58農(nóng)桿菌液接種，浸泡5分鐘，用無菌濾紙吸干多余菌液。轉(zhuǎn)接于固體培養(yǎng)基A上，在25℃無光條件下培養(yǎng)2周，再取出愈傷組織移入液體培養(yǎng)基B中于振蕩培養(yǎng)箱中25℃120rpm(轉(zhuǎn)/分)條件下避光培養(yǎng)2周，過濾分開培養(yǎng)物和培養(yǎng)液，分別于索氏提取器中用甲醇提取4小時，蒸去甲醇得目標(biāo)產(chǎn)物β-二氫沉香呋喃倍半萜多醇酯類化合物，其代表物為苦皮素A。
實施例1、2、3中目標(biāo)產(chǎn)物代表物苦皮素A1H和13CNMR普數(shù)據(jù)見表，結(jié)構(gòu)式見

圖1。用RP-HPLC法(反相高壓液相色譜，流動相甲醇∶水＝9∶1，流速1ml/min，C-18柱)測定目標(biāo)產(chǎn)物代表苦皮素A含量，實施例1、2、3所得目標(biāo)產(chǎn)物中苦皮素A含量分別為0.26％、0.26％、0.22％。
表1 苦皮素A1H和13C NMR譜圖數(shù)據(jù)CδC H δH175.01 5.49d267.32 5.39dd341.13 2.02dd 2.12d472.14591.55676.86 5.22s753.57 2.58d873.88 5.62dd975.39 6.06d10 50.51011 84.51112 61.712 4.87d 4.65d13 24.213 1.78s14 26.314 1.61s15 30.015 1.72s乙?；鵤169.5 169.6b20.521.11.55s 2.11s異丁?；鵤175.8 176.7b34.134.32.38sept 2.85septc18.418.6 19.0 19.1 0.92d 0.95d 1.353d 1.348d苯甲酰基a165.7b129.4c129.2 7.85md128.6 7.42me133.4 7.55m
權(quán)利要求
1.β-二氫沉香呋喃倍半萜多醇酯類化合物合成新方法，本發(fā)明特征在于，包括苦皮藤接種C58農(nóng)桿菌、組織培養(yǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物萃取步驟；在接種步驟，用經(jīng)活化的C58農(nóng)桿菌對苦皮藤根、莖、葉進行接種；在組織培養(yǎng)步驟，取接種后形成的冠癭組織接種于固體培養(yǎng)基A上，于16--32℃培養(yǎng)2-4周；在目標(biāo)產(chǎn)物萃取步驟，在提取器中用有機溶劑回流萃取愈傷組織4-6小時，蒸去有機溶劑得目標(biāo)產(chǎn)物β-二氫沉香呋喃倍半萜多醇酯類化合物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在組織培養(yǎng)步驟，把固體培養(yǎng)基A培養(yǎng)后的冠癭組織移入液體培養(yǎng)基B于16-32℃培養(yǎng)2-4周。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，苦皮藤接種C58農(nóng)桿菌可在無菌條件下采用葉盤法或直接穿刺法進行或在自然生長條件下用直接穿刺法進行；組織培養(yǎng)過程避光進行，培養(yǎng)基采用無激素培養(yǎng)基。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，C58農(nóng)桿菌活化過程為先將凍干保存的C58農(nóng)桿菌接種于PH7.0-7.5的無菌斜面固體培養(yǎng)基A’上進行培養(yǎng)，每100ml固體培養(yǎng)基A’含蛋白胨0.2-1.0g、牛肉浸膏0.3-1.5g、蔗糖0.5-3g、硫酸鎂20-30mg、瓊脂1-5g，培養(yǎng)條件為20-28℃、約2天轉(zhuǎn)接一次、轉(zhuǎn)接2-4次；再接種于PH7.0-7.5的無菌液體培養(yǎng)基B’上進行培養(yǎng)，每100ml液體培養(yǎng)基B’含蛋白胨0.5-1.5g、酵母膏0.2-0.8g、蔗糖0.5-1.5g，培養(yǎng)條件20-28℃、120-160rpm搖床培養(yǎng)1-2天，對照無菌液體培養(yǎng)液OD56nm＝1.58時，按菌液無菌液體培養(yǎng)液體積比1∶200把菌液加入培養(yǎng)液于120-160rpm搖床繼續(xù)培養(yǎng)至OD560nm＝1.5-1.6時止，該培養(yǎng)液稀釋5倍至OD560nm＝0.7-0.8。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，固體培養(yǎng)基A含有硫酸鎂185-740mg/l、磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉或二者之和75-340mg/l、硝酸鉀950-3800mg/l、硝酸銨825-3300mg/l、氯化鈣220-880mg/l、蔗糖15000-60000mg/l、瓊脂6000-24000mg/l；硫胺0.25-1.0mg/l、吡多醇0.25-1.0mg/1、煙酸0.025-0.10mg/l、肌醇50-200mg/l；硼酸3.2-12.4mg/l、硫酸錳7.8-31.2mg/l、硫酸鋅4.3-17.2mg/l、鉬酸鈉0.125-0.50mg/l、硫酸銅0.0125-0.050mg/l、氯化鈷0.0125-0.050mg/l、碘化鉀0.415-1.66mg/l、硫酸亞鐵13.9-55.6mg/l、EDTA鈉鹽18.6-74.6mg/l或EDTA鐵鹽21.5-86mg/l，逐一稱取除蔗糖、瓊脂外培養(yǎng)基成分，水溶、混合并加水稀釋至所需濃度，再加入配方量蔗糖和瓊脂使溶化，調(diào)PH＝5.5-6.5滅菌。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，液體培養(yǎng)基B中含有硫酸鎂185-740mg/l、磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉或二者之和75-340mg/l、硝酸鉀950-3800mg/l、硝酸銨825-3300mg/l、氯化鈣220-880mg/l、蔗糖15000-60000mg/l；硫胺0.25-1.0mg/l、吡多醇0.25-1.0mg/l、煙酸0.025-0.10mg/l、肌醇50-200mg/l；硼酸3.2-12.4mg/l、硫酸錳7.8-31.2mg/l；硫酸鋅4.3-17.2mg/l、鉬酸鈉0.125-0.50mg/l、硫酸銅0.0125-0.050mg/l、EDTA鈉鹽18.6-74.6mg/l或EDTA鐵鹽21.5-86mg/l，逐一稱取除蔗糖外培養(yǎng)基成分，水溶、混合并加水稀釋至所需濃度，再加入蔗糖溶解，調(diào)PH＝5.5-6.5滅菌得液體培養(yǎng)基B。
全文摘要
β－二氫沉香呋喃倍半萜多醇酯類化合物合成新方法，包括苦皮藤接種C58農(nóng)桿菌、取接種后形成的冠癭組織于培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)、目標(biāo)產(chǎn)物萃取步驟。接種步驟可采用葉盤法或直接穿刺法，組織培養(yǎng)過程避光進行，培養(yǎng)基采用無激素培養(yǎng)基。本發(fā)明不受自然資源限制，組織培養(yǎng)條件溫和，設(shè)備投資少，成本低，合成周期短，易于工業(yè)化應(yīng)用。
文檔編號C12P17/02GK1407110SQ0112838
公開日2003年4月2日 申請日期2001年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月27日
發(fā)明者趙天增, 傅經(jīng)國, 吳鳴健, 范輯玉 申請人:趙天增, 傅經(jīng)國, 河南省新鄉(xiāng)市東風(fēng)化工廠