專利名稱：一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯不定芽轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯不定芽轉(zhuǎn)化方法，屬于植物基因工程領(lǐng)域。
技術(shù)背景甘薯是旋花科甘薯屬的蔓生性草本植物，產(chǎn)量高，其塊根營養(yǎng)豐富，淀粉含量高達(dá) 12%-20%，是重要的糧食作物及工業(yè)原料。但甘薯種間、種內(nèi)雜交存在不親和性，限制 了親本的組配，而誘變育種往往效率不高且嵌合現(xiàn)象較為嚴(yán)重，因此通過遺傳工程技術(shù) 改良甘薯種質(zhì)具有重大意義。農(nóng)桿菌是一類革蘭氏陰性菌，包括根癌農(nóng)桿菌(含有致瘤Ti質(zhì)粒)和發(fā)根農(nóng)桿菌 (含致根Ri質(zhì)粒)，甘薯的遺傳轉(zhuǎn)化主要使用根癌農(nóng)桿菌。根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒含有 T-DNA區(qū)，T-DNA可將攜帶的任何基因整合到植物基因組中，實(shí)現(xiàn)外源基因的導(dǎo)入。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的過程包括細(xì)菌在敏感細(xì)胞上吸附，植物傷口處產(chǎn)生酚類物 質(zhì)或外源添加酚類物質(zhì)激活vir基因表達(dá)，vir基因表達(dá)產(chǎn)物作用于T-DNA使其產(chǎn)生 T-DNA鏈，進(jìn)一步形成T-DNA復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞，此復(fù)合體在胞內(nèi)蛋白與細(xì)菌蛋白的共同 作用下進(jìn)入細(xì)胞核，而后整合入植物基因組。自1993年0tani等人首次獲得用毛狀根再生的轉(zhuǎn)基因甘薯植株，至今已有一些以 各種甘薯外植體為受體的轉(zhuǎn)基因報(bào)道，如Newell等以甘薯塊根為受體獲得轉(zhuǎn)基因植株， Gama等以愈傷組織為受體獲得轉(zhuǎn)基因植株，Cipriani等以甘薯葉片為受體獲得轉(zhuǎn)基因 植株。但與其他作物相比，甘薯的基因轉(zhuǎn)化進(jìn)展還比較慢，缺乏高效的遺傳轉(zhuǎn)化及再生 體系，獲得的轉(zhuǎn)基因植株比較少(基本只局限在幾個(gè)品種)。因此，甘薯的轉(zhuǎn)基因體系 有待改進(jìn)。 ' 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯不定芽轉(zhuǎn)化方法，建立了一個(gè)適合多個(gè) 甘薯品種的不定芽發(fā)生體系，從而有效地克服了基因型對甘薯遺傳轉(zhuǎn)化的限制，使絕大 多數(shù)基因型的甘薯都能夠發(fā)生不定芽。此法取材不受季節(jié)限制，轉(zhuǎn)化頻率較高，且再生 植株無性系變異較小。本發(fā)明所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯不定芽轉(zhuǎn)化方法包括無菌苗快繁，以甘薯莖段為受體 的遺傳轉(zhuǎn)化，不定芽再生及小苗生根，抗生素篩選和小苗移栽等步驟，具體是(1) 無菌苗的獲得及培養(yǎng) 將甘薯植株距地面10厘米以上部分剪下，用自來水沖洗30分鐘，剪去葉片將莖切成2cm左右小段，用70%乙醇消毒1分鐘，去凈乙醇后用O. l柳gCl2消毒10分鐘，無菌 水沖洗4遍，無菌濾紙吸去水分后將莖段放入固體培養(yǎng)基上，在22"C-25t下光照培養(yǎng)。 其中所述固體培養(yǎng)基配方為MS+0. Omg/L NAA (萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂， pH5. 8。(2) 甘薯莖段的預(yù)培養(yǎng)將培養(yǎng)20-30天的甘薯無菌小苗剪去葉片及根，將莖切成0. 5-1厘米的小段(每段 含1-2個(gè)節(jié))，將莖段沿側(cè)芽所在的軸線縱向切成兩半，并切去可見的側(cè)芽。經(jīng)過上述 處理的甘薯莖段切面向下置于固體培養(yǎng)基上，22t-25"C下暗培養(yǎng)3天。其中所述固體培養(yǎng)基配方為MS+0. 1-1.0mg/L歸(萘乙酸)+20§/1^蔗糖+7§/1瓊脂，PH5.8。(3) 菌株的活化及菌液的制備將4 °C保存的帶有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌在添加了 50mg/L利福平的YEP固體培養(yǎng) 基上劃線，28。C黑暗培養(yǎng)3天后挑取單菌落，接入含有50mg/L利福平的YEP液體培養(yǎng) 基，黑暗下28 °C、 200r/rain振蕩培養(yǎng)24小時(shí)后再次轉(zhuǎn)接，相同條件下培養(yǎng)16小時(shí)。 將菌液置于滅菌的離心管中，8000rpm離心5分鐘收集菌體，用5%蔗糖溶液重懸菌體， 調(diào)整至0D600值為0.6-1.0，備用。(4) 農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)將預(yù)培養(yǎng)過的甘薯莖段浸入步驟(3)的農(nóng)桿菌菌液中，侵染10-15分鐘。將莖段 取出，用無菌濾紙吸去多余菌液，切面朝下置于繼代培養(yǎng)基上，23t-25。C下暗培養(yǎng)5 天。其中所述繼代培養(yǎng)基配方為MS+0. l-1.0mg/LNAA+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。(5) 農(nóng)桿菌脫菌及不定芽再生 將共培養(yǎng)后的組織塊用無菌水清洗3-4次，再用無菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)接至不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在23。C-25°C、且每日光照14小時(shí)條件下，連續(xù)培養(yǎng)20士2天，分化出不 定芽。其中所述不定芽誘導(dǎo)譜養(yǎng)基配方為MS+0. 1-1. Omg/LKT (激動(dòng)素)+0. 01-0. lmg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5. 8，并添加200mg/L頭孢噻肟鈉抑制農(nóng)桿菌生長。(6) 甘薯小芽的分割及生根當(dāng)甘薯莖段上的不定芽長至1厘米左右時(shí)，將小芽單獨(dú)剪下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上， 在23t -25"C、且每日光照14±1小時(shí)條件下，連續(xù)培養(yǎng)14天。其中所述生根培養(yǎng)基 配方為MS+0. 1-1. Omg/L醒+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5. 8，添加200mg/L頭孢噻月虧 鈉。(7) 轉(zhuǎn)基因植株的篩選將已生根的甘薯小苗不傷及根部取出，轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基上，在23t-25t、且每 曰光照14小時(shí)條件下，連續(xù)培養(yǎng)14天。其中所述篩選培養(yǎng)基配方為MS+0. 1-1.0mg/L NAA+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5. 8，添加200mg/L頭孢噻肟鈉和25 mg/L卡那霉素。(8) 檢測及移栽當(dāng)小苗經(jīng)篩選存活、且根系生長良好后，將其不傷及根部取出，除去殘存培養(yǎng)基移 入土壤，用薄膜覆蓋花盆以提高濕度(移栽成活率大于90%)。當(dāng)小苗在土壤中長出4-7片新葉，剪取2-3片新葉用CTAB法提取DNA檢測。甘薯葉片經(jīng)液氮研磨后迅速轉(zhuǎn)移至1. 5ml離心管中，加入600ii 165QC預(yù)熱的2xCTAB 提取緩沖液，顛倒離心管混勻，65。C水浴30分鐘?；旌衔锢鋮s至室溫后加入等體積的 酚:氯仿異戊醇(體積比25:24:1),混勻后12000rpm離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至新管， 加入等體積氯仿異戊醇(體積比24: 1)，混勻后12000rpm離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移 至新管，加入三分之二體積預(yù)冷的異丙醇，混勻，12000rpm離心IO分鐘，棄去上清液。 70%乙醇不打散沉淀洗滌3次，棄去乙醇將沉淀晾干。用30iil雙蒸水溶解后PCR檢測。本發(fā)明所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯不定芽轉(zhuǎn)化方法的特點(diǎn)和有益效果是(1)不定芽再 生速度快，轉(zhuǎn)化周期短，從莖段預(yù)處理開始60-80天即可獲得轉(zhuǎn)基因植株；(2)以莖段 為外植體誘導(dǎo)不定芽可以避免愈傷組織培養(yǎng)中引起的不良變異；(3)本發(fā)明的莖段不定 芽再生體系再生率高且適用于多種甘薯品種(例如濟(jì)薯21，濟(jì)薯22，美國紅心，徐 薯18等)，適用性廣，克服了基因型對甘薯遺傳轉(zhuǎn)化的限制；(4)操作比較簡單，易于掌握，重復(fù)性好。本發(fā)明提出了一個(gè)甘薯遺傳轉(zhuǎn)化的新方法，以甘薯莖段為外植體，通過對其侵染及 誘導(dǎo)不定芽獲得轉(zhuǎn)基因植株，適用于多種基因型，且再生速度快，是一個(gè)能夠用于甘薯 轉(zhuǎn)基因育種的可靠體系。


圖1示沐GWS7載體圖(含《m基因)。圖2示pD0NR載體圖(含s朋c7基因)。圖3示p2K7GW7載體圖(含s朋c7基因)。圖4示預(yù)培養(yǎng)3天的甘薯莖段。圖5示農(nóng)桿菌侵染后共培養(yǎng)5天的甘薯莖段。圖6示再生出的不定芽。圖7示小芽再生的植株。圖8示轉(zhuǎn)《"s基因PCR檢測電泳圖，其中M為Marker (DNA/HindlII-EcoRI)，泳 道l為質(zhì)粒對照，泳道2-16為待檢測植株，泳道17為野生型對照。圖9示轉(zhuǎn)^ys基因PCR陽性植株的GUS染色結(jié)果(A圖為帶葉幼芽，B圖為根)。 圖10示轉(zhuǎn)扁c7基因PCR檢測電泳圖，其中M為Marker (DNA/HindlII-EcoRI)，泳 道l為質(zhì)粒對照，泳道2-19為待檢測植株，泳道20為野生型對照。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:以濟(jì)薯22為受體材料，轉(zhuǎn)化菌株為攜帶pKGWFS7載體的農(nóng)桿菌菌株AGL104 (載體 購買自Invitrogen公司)。(1) 無菌苗的獲得及培養(yǎng)將甘薯植株距地面10厘米以上部分剪下，用自來水沖洗30分鐘，剪去葉片將莖切 成2cm左右小段，用70%乙醇消毒1分鐘，去凈乙醇后用0. P/。HgCl2消毒10分鐘，無菌 水沖洗4遍，無菌濾紙吸去水分后將莖段放入固體培養(yǎng)基上，在25。C下光照培養(yǎng)。其 中所述固體培養(yǎng)基配方為MS+1.0mg/LNAA (萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5. 8。(2) 甘薯莖段的預(yù)培養(yǎng)將生長30天的甘薯無菌小苗剪去葉片及根，將莖切成0. 5-1厘米的小段(每段含 l-2個(gè)節(jié))，將莖段沿側(cè)芽所在的軸線縱向切成兩半，并切去可見的側(cè)芽。經(jīng)過上述處理 的甘薯莖段切面向下置于固體培養(yǎng)基上，25 t暗培養(yǎng)3天。所用固體培養(yǎng)基配方為 MS+0. 5mg/L NAA+2. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5.8。(3) 菌株的活化及菌液的制備將4 °C保存的農(nóng)桿菌在添加了 50mg/L利福平的YEP固體培養(yǎng)基上劃線，28 t黑暗 培養(yǎng)3天后挑取單菌落，接入含有50mg/L利福平的YEP液體培養(yǎng)基，黑暗下28。C、200rpm 振蕩培養(yǎng)24小時(shí)后再次轉(zhuǎn)接，相同條件下培養(yǎng)16小時(shí)。將菌液置于滅菌的離心管中， 8000rpm離心5分鐘收集菌體，用5%蔗糖溶液重懸菌體，調(diào)整至OD600值為0. 8。(4) 農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)將預(yù)培養(yǎng)過的甘薯莖段浸入農(nóng)桿菌菌液，侵染15分鐘。將莖段取出，用無菌濾紙吸去多余菌液，切面朝下置于繼代培養(yǎng)基上，25"C暗培養(yǎng)5天。所用繼代培養(yǎng)基配方為 MS+0.5mg/L NAA+2. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5. 8。(5) 農(nóng)桿菌脫菌及不定芽再生 將共培養(yǎng)后的組織塊用無菌水清洗3次，無菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)接至不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。所用培養(yǎng)基為MS+0. 5mg/L KT+0. 05mg/L NAA+3。/。蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5.8,并添加 200mg/L頭孢噻肟鈉抑制農(nóng)桿菌生長。25°C、每日14小時(shí)光照培養(yǎng)20天。不定芽再生 頻率為80%。(6) 甘薯小芽的分割及生根當(dāng)甘薯莖段上的不定芽長至1厘米左右時(shí)，將小芽單獨(dú)剪下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上。 所用培養(yǎng)基為MS+0. 5mg/L NAA+2. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5. 8，添加200mg/L頭孢噻肟鈉。 25°C、每日14小時(shí)光照培養(yǎng)14天。小芽的生根頻率為79. 1%。(7) 轉(zhuǎn)基因植株的篩選將已生根的甘薯小苗不傷及根部取出，轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基上。所用篩選培養(yǎng)基配方 為MS+0.5mg/L NAA+2. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5.8，添加200mg/L頭孢噻肟鈉和25mg/L 卡那霉素。23 nC -25°C、每日14小時(shí)光照培養(yǎng)14天，抗性小苗約占小苗總數(shù)的6. 9%。(8) 檢測及移栽當(dāng)小苗經(jīng)篩選存活、根系生長良好后，將其不傷及根部取出，除去殘存培養(yǎng)基移入 土壤，用薄膜覆蓋花盆以提高濕度。移栽成活率大于90°/。。當(dāng)小苗在土壤中長出4-7片 新葉，剪取2-3片新葉用CTAB法提取DNA檢測。甘薯葉片經(jīng)液氮研磨后迅速轉(zhuǎn)移至1. 5ml 離心管中，加入600u 165"C預(yù)熱的2乂CTAB提取緩沖液，顛倒離心管混勻，65 °C水浴 30分鐘?；旌衔锢鋮s至室溫后加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(體積比25:24:1)，混勻后 12000rpm離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至新管，加入等體積氯仿異戊醇(體積比24: 1), 混勻后12000rpra離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至新管，加入三分之二體積預(yù)冷的異丙醇， 混勻，12000rpm離心IO分鐘，棄去上清液。70%乙醇不打散沉淀洗滌3次，.棄去乙醇將 沉淀晾干。用30u 1雙蒸水溶解。PCR檢測:向20u 1體系中加入以下成分引物(10iiM) Pl、 P2各1p1， Buffer2 yl， MgCl21.4yl， dNTP(2. 5誦o1 each)0. 4y 1， DNA模板100ng， Taq酶O. lul，用水 補(bǔ)足20yl。 PCR反應(yīng)條件為:94('C變性5分鐘；94。C30秒，52°C40秒，72°C60秒，35 個(gè)循環(huán)；72('C10分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。(檢測gus基因引物Pl 5'AACCACAAACCGTTCTACTT3' P2 5'CTGATACTCTTCACTCCACA3')。結(jié)果利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯不定芽轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，對濟(jì)薯22進(jìn)行了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。三 次生物學(xué)重復(fù)(共200莖段)，通過不定芽再生獲得510棵植株，經(jīng)潮霉素篩選具有抗 性植株35株。轉(zhuǎn)基因陽性植株經(jīng)PCR檢測，證明21株為陽性植株。對轉(zhuǎn)基因陽性植株 進(jìn)行GUS染色發(fā)現(xiàn)，GUS活性出現(xiàn)在根、莖、葉中，進(jìn)一步證明了 GUS基因轉(zhuǎn)入到甘薯 基因組中，并實(shí)現(xiàn)了GUS基因的表達(dá)。實(shí)施例2:以濟(jì)薯21為受體材料，轉(zhuǎn)化菌株為攜帶有5T^c7基因(p2K7GW7載體)的農(nóng)桿菌 AGL104。 pD0NR及p2K7GW7載體購買自Invitrogen公司。 (1)無菌苗的獲得及培養(yǎng)將甘薯植株距地面10厘米以上部分剪下，用自來水沖洗30分鐘，剪去葉片將莖切 成2cm左右小段，用70%乙醇消毒1分鐘，去凈乙醇后用0. ly。HgCl2消毒10分鐘，無菌 水沖洗4遍，無菌濾紙吸去水分后將莖段放入固體培養(yǎng)基上，在25。C下光照培養(yǎng)。其 中所述固體培養(yǎng)基配方為MS+0. 5mg/L NAA (萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5. 8。(2) 甘薯莖段的預(yù)培養(yǎng)將生長30天的甘薯無菌小苗剪去葉片及根，將莖切成0. 5-1厘米的小段(每段含 1-2個(gè)節(jié))，將莖段沿側(cè)芽所在的軸線縱向切成兩半，并切去可見的側(cè)芽。經(jīng)過上述處理 的甘薯莖段切面向下置于固體培養(yǎng)基上，22t-25uC暗培養(yǎng)3天。所用培養(yǎng)基為 MS+0. 5mg/L NAA+2. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5. 8。(3) 載體構(gòu)建利用gateway方法構(gòu)建otsc7基因的植物表達(dá)載體。以水稻的cDNA為模板，通過 一次PCR和二次PCR反應(yīng)獲得平末端二次PCR產(chǎn)物。 一次PCR體系為5xPhusion HF BufferlOul， lOmMdNTPlul'正向引物(lOuM) 2.5tU,反向引物(10uM) 2. 5 u 1，模板(水稻cDNA) 2ul， DMS0 1.5iil， Phusion 0. 3ul， H20補(bǔ)足至50yl (正向 引物N1 5' AAAAAGCAGGCTGGATGGGGATGAGGAGGGAGAG 3'，反向引物N2 5， AGAAAGCTGGG TTTCAGAACGGGACCATGCC3' )。 二次PCR體系為5xPhusion HF Buffer 10 p 1 ， 10mM dNTP lul，正向引物(IOuM) 2. 5"1，反向引物(lOuM) 2. 5ul，模板(一次PCR產(chǎn)物) 2 y 1 ， DMSO 1. 5 u 1 , Phusion 0. 3 y 1 ， H力補(bǔ)足至50 u 1 (引物attB1-F 5， GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT 3' ， attBl-R 5' GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT 3')。將二次PCR產(chǎn)物電泳檢測，切膠回收目的片段，用回收產(chǎn)物進(jìn)行BP反應(yīng)(BP反應(yīng) 體系二次PCR產(chǎn)物(40-lOOfmol) 3. 5 y ] ， i扁R' ector (150ng/yl) 0. 5yl，BP Clonase enzyme mixture 1 u 1) , 25 "C溫育連接2-3小時(shí)后取BP反應(yīng)產(chǎn)物1 u 1轉(zhuǎn)化 大腸桿菌DH5a的感受態(tài)細(xì)胞。37"C培養(yǎng)12-16小時(shí)后挑取單菌落檢驗(yàn)。取BP反應(yīng)后驗(yàn) 證為陽性且測序正確的菌擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，進(jìn)行LR反應(yīng)，反應(yīng)體系為BP產(chǎn)物 (40-100fmo1) 3. 5 y 1 ， Destination vector (] 50ng/ u 1) ， BP Clonase enzyme misture lyl,25"C溫育連接3-24小時(shí)。取LR反應(yīng)產(chǎn)物2y l轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，37°C培養(yǎng)12-16 小時(shí)后挑取單克隆驗(yàn)證。陽性菌擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌AGL104中。(4) 菌株的活化及菌液的制備將攜帶有s朋W基因的農(nóng)桿菌接入含有50mg/L利福平的YEP液體培養(yǎng)基，黑暗下 28('C、 20(kpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)后再次轉(zhuǎn)接，相同條件下培養(yǎng)16小時(shí)。將菌液置于滅菌 的離心管中，8000rpm離心5分鐘收集菌體，用5%蔗糖溶液重懸菌體，調(diào)整至0D600值 為0.8。(5) 農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)將預(yù)培養(yǎng)過的甘薯莖段浸入農(nóng)桿菌菌液，侵染15分鐘。將莖段取出，用無菌濾紙 吸去多余菌液，切面朝下置于固體培養(yǎng)基上，23 °C -25QC暗培養(yǎng)5天。所用培養(yǎng)基為 MS+0. 5mg/L NAA+2. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5. 8。(6) 農(nóng)桿菌脫菌及不定芽再生 將共培養(yǎng)后的組織塊用無菌水清洗3次，無菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)接至不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。所用培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L KT十0.05mg/L NAA+3W蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5.8，并添加 200mg/L頭孢噻肟鈉抑制農(nóng)桿菌生長。23 t -25"C、每日14小時(shí)光照培養(yǎng)20天。不定芽再生頻率為75%。(7) 甘薯小芽的分割及生根當(dāng)甘薯莖段上的不定芽長至1厘米左右時(shí)，將小芽單獨(dú)剪下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上。 所用培養(yǎng)基為MS+0. 5mg/L NAA+2. 0°/。蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5. 8，添加200mg/L頭孢噻肟鈉。 23 UC -25°C、每日14小時(shí)光照培養(yǎng)14天p小芽生根頻率為80°/o。(8) 轉(zhuǎn)基因植株的篩選將已生根的甘薯小苗不傷及根部取出，轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基上。所用培養(yǎng)基為-MS+0. 5mg/L NAA+2. 0%蔗糖+0. 7%瓊脂，pH5. 8，添加200mg/L頭孢噻后鈉和25 mg/L卡 那霉素。23"C -25"C、每日14小時(shí)光照培養(yǎng)14天。轉(zhuǎn)基因抗性植株約占植株總數(shù)的6. 2%。(9) 檢測及移栽 ，當(dāng)小苗經(jīng)篩選存活、根系生長良好后，將其不傷及根部取出，除去殘存培養(yǎng)基移入 土壤，用薄膜覆蓋花盆以提高濕度。移栽成活率大于90%。當(dāng)小苗在土壤中長出4-7片 新葉，剪取2-3片新葉用CTAB法提取DNA檢測。甘薯葉片經(jīng)液氮研磨后迅速轉(zhuǎn)移至1. 5ml 離心管中，加入600u 165°C預(yù)熱的2xCTAB提取緩沖液，顛倒離心管混勻，65 t水浴 30分鐘?；旌衔锢鋮s至室溫后加入等體積的酚氯仿異戊醇(體積比25:24:1),混勻后 12000rpm離心IO分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至新管，加入等體積氯仿異戊醇(體積比24: 1)， 混勻后12000rpm離心IO分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至新管，加入三分之二體積預(yù)冷的異丙醇， 混勻，12000rpm離心IO分鐘，棄去上清液。70%乙醇不打散沉淀洗漆3次，棄去乙醇將 沉淀晾干。用30u 1雙蒸水溶解。PCR檢測:向20u 1體系中加入以下成分弓l物(10uM) Pl、 P2各lul， Buffer2 Ul， MgClal.4ul， dNTP(2. 5mmo1 each) 0. 4 w 1, DNA模板100ng， Taq酶O. lul，用水 補(bǔ)足20ul。 PCR反應(yīng)條件為:94('C變性5分鐘；94"C30秒，55°C40秒，72°C60秒，35 個(gè)循環(huán)；72"C10分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。(檢測35S引物P1 5' GAGATCAAATACCTTCCC 3' P2 5' ATTGTGCGTCATCCCTTA 3')結(jié)果利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯不定芽轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，對濟(jì)薯21進(jìn)行了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。三 次生物學(xué)重復(fù)(共190莖段)，通過不定芽再生獲得513棵植株，經(jīng)卡那霉素篩選獲得 抗性植株32株。轉(zhuǎn)基因陽性植株經(jīng)PCR檢測，證明19株為陽性植株。以100、 150 mmol/LNaCl處理轉(zhuǎn)基因植株與野生型對照，s;7sc/轉(zhuǎn)基因植株鮮重/干重均高于野生型， Na7K+比值低于野生型對照，說明耐鹽性較野生型有一定的提高。
權(quán)利要求
1、一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯不定芽轉(zhuǎn)化方法，步驟包括無菌苗快繁，以甘薯莖段為受體的遺傳轉(zhuǎn)化，不定芽再生及小苗生根，抗生素篩選和小苗移栽，其特征在于所述以甘薯莖段為受體的遺傳轉(zhuǎn)化方法是將培養(yǎng)20-30天的甘薯無菌小苗剪去葉片及根，將莖切成0.5-1厘米的小段，每段含1-2個(gè)節(jié)，將莖段沿側(cè)芽所在的軸線縱向切成兩半，并切去可見的側(cè)芽；再將經(jīng)過上述處理的甘薯莖段切面向下置于固體培養(yǎng)基上，22℃-25℃下暗培養(yǎng)3天；然后將上述暗培養(yǎng)的甘薯莖段在OD600為0.6-1.0的農(nóng)桿菌懸液中侵染10-15分鐘，而后用無菌濾紙吸去菌液，切面朝下置于繼代培養(yǎng)基上，23℃-25℃下暗培養(yǎng)5天；所述不定芽再生及小苗生根的方法是將上述暗培養(yǎng)5天的甘薯莖段用無菌水清洗3-4次，再用無菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)接至不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在23℃-25℃、且每日光照14小時(shí)條件下，連續(xù)培養(yǎng)20±2天，分化出不定芽；當(dāng)甘薯莖段上的不定芽長至1厘米時(shí)，將小芽單獨(dú)剪下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，在23℃-25℃、且每日光照14小時(shí)條件下，培養(yǎng)14±1天，進(jìn)行生根；所述抗生素篩選的方法是將已生出1-2cm根的甘薯小苗不傷及根部取出，轉(zhuǎn)接到含相應(yīng)抗生素的篩選培養(yǎng)基上，在23℃-25℃、且每日光照14小時(shí)條件下，培養(yǎng)14±1天；其中所述篩選培養(yǎng)基配方為MS+0.1-1.0mg/L NAA(萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，并添加200mg/L頭孢噻肟鈉和25mg/L卡那霉素，pH5.8。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯不定芽轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述固體 培養(yǎng)基配方為MS十O. 1-1.0mg/L NAA (萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯不定芽轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述繼代 培養(yǎng)基配方為MS+O. 1-1.0mg/L NAA ('萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯不定芽轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述不 定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+0. l-1.0mg/L KT (激動(dòng)素)+0.01-0. lmg/L NAA (萘乙酸) +308幾蔗糖+7§/^瓊脂，并添加200mg/L頭孢噻肟鈉，pH5. 8。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯不定芽轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述生根 培養(yǎng)基配方為MS+0. 1-1. Omg/L NAA (萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，并添加200mg/L 頭孢噻躬鈉，pH5.8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯不定芽轉(zhuǎn)化方法。該方法包括以下步驟(1)無菌苗的獲得及培養(yǎng)，(2)甘薯莖段的預(yù)培養(yǎng)，(3)菌株的活化劑菌液的制備，(4)農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)，(5)農(nóng)桿菌脫菌及不定芽再生，(6)甘薯小芽的分割及生根，(7)轉(zhuǎn)基因植株的篩選，(8)檢測及移栽。本發(fā)明提出了一個(gè)甘薯遺傳轉(zhuǎn)化的新方法，以甘薯莖段為外植體，通過對其侵染及誘導(dǎo)不定芽獲得轉(zhuǎn)基因植株，適用于多種基因型，且再生速度快，是一個(gè)能夠用于甘薯轉(zhuǎn)基因育種的可靠體系。
文檔編號C12N15/82GK101608188SQ20091001733
公開日2009年12月23日 申請日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者向鳳寧, 鵬 王, 趙翠珠 申請人:山東大學(xué)