專利名稱：一種新型β-葡聚糖酶GLU、新型耐高溫β-葡聚糖酶VGLU及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明 涉及一種新型β -葡聚糖酶GLU、新型耐高溫β -葡聚糖酶VGLU及其基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
β-葡聚糖是植物細(xì)胞壁的主要組成成分，屬結(jié)構(gòu)性非淀粉多糖(Non-starch polysaccharides, NSP)，廣泛存在于禾谷類(大麥、燕麥、黑麥和小麥等)的糊粉層和胚乳細(xì)胞壁中。β-葡聚糖通常是飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子及在啤酒釀造過程中會(huì)降低啤酒的品質(zhì)及產(chǎn)率。β -葡聚糖酶(β -Glucanase,E. C 3. 2. 1. 73)可水解β -糖苷鍵而形成葡萄糖聚合物等小分子物質(zhì)，屬于半纖維素水解酶。由于葡聚糖酶的作用特點(diǎn)，該酶可廣泛應(yīng)用于啤酒釀造、飼料等行業(yè)，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。改革開放以來，我國的飼料工業(yè)得到迅速發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2010年，中國飼料總產(chǎn)量達(dá)到1. 57億噸，比上年提高5. 9%。在飼料產(chǎn)量快速增長的同時(shí)，飼料原料的短缺問題日益嚴(yán)重，預(yù)計(jì)2010年到2020年我國飼料用糧將缺乏2. 4 8. 3X IO7噸能量飼料，因此，非常規(guī)飼料原料如大麥、小麥、棕櫚粕等的應(yīng)用成為解決短缺問題的有效途徑，但由于這些原料中葡聚糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量較高，單胃動(dòng)物不能分泌內(nèi)源性葡聚糖酶，無法消化利用葡聚糖，再加上葡聚糖的存在會(huì)造成較高的黏稠性，影響其它營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，因此葡聚糖成為飼料中一種主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，嚴(yán)重影響了這些原料的使用。β-葡聚糖是由β _1，3和β _1，4混合的糖苷鍵連接形成的葡聚糖聚合物，分為水溶性和水不溶性兩種，其中與蛋白質(zhì)結(jié)合的β-葡聚糖大都不溶于水。水溶性的β-葡聚糖所占的比例較大，可與水形成粘稠狀物質(zhì)，而且β-葡聚糖濃度愈高，粘度越大。高濃度β-葡聚糖會(huì)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，吸收其周圍的水分子，從而降低了周圍環(huán)境的物理特性。β _葡聚糖是表層帶負(fù)電荷的表面活性物質(zhì)，在溶液中極易與帶相反電荷的養(yǎng)分物質(zhì)結(jié)合，從而影響?zhàn)B分的吸收。此外，葡聚糖還能吸附Ca2+、Zn2+、Na+等金屬離子以及有機(jī)質(zhì)，造成這些物質(zhì)的代謝受阻。研究表明β -葡聚糖，尤其是水溶性β -葡聚糖具有很強(qiáng)的抗?fàn)I養(yǎng)作用，即使飼料中含有少量的葡聚糖，也能對(duì)畜禽(主要是單胃動(dòng)物)的營養(yǎng)吸收具有很強(qiáng)的阻礙作用，其結(jié)果可造成畜禽營養(yǎng)性下痢，動(dòng)物生長和飼料利用率降低，蛋雞采食量、蛋重和產(chǎn)蛋率下降。由于畜禽均不能分泌葡聚糖酶，因此對(duì)這類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化需要添加外源酶制劑。β -葡聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面(1)增大動(dòng)物胃腸道食糜粘性麥類飼料中含有的葡聚糖類物質(zhì)能結(jié)合大量水分，增加了消化道內(nèi)容物的粘稠度。高粘度的腸道食糜對(duì)畜禽動(dòng)物的料重比和增重有十分明顯的負(fù)面影響。因?yàn)槠暇厶穷愇镔|(zhì)可使腸內(nèi)容物呈濃稠的膠凍樣，因此減緩了腸內(nèi)食糜通過消化道的速度，從而降低了畜禽的采食量。另外，高粘度會(huì)使畜禽的飲水量增加，糞便水分含量隨之提高，從而養(yǎng)分排出量也增加，這就意味著養(yǎng)分消耗增加。β -葡聚糖導(dǎo)致消化道內(nèi)容物粘度增加，降低了葡萄糖、脂肪、水和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)在腸道中的吸收，引起腹瀉，生產(chǎn)性能明顯降低。
(2)營養(yǎng)屏障作用粘稠的膠狀β -葡聚糖類物質(zhì)可將腸道中的食糜如網(wǎng)狀包裹起來，阻礙了內(nèi)源消化酶與營養(yǎng)物質(zhì)的接觸，起營養(yǎng)屏障作用。另外，β -葡聚糖的存在還會(huì)抑制膽酸的分泌，影響了脂肪代謝的順利進(jìn)行。通過添加外源性β _葡聚糖酶，可將膠質(zhì)狀的β _葡聚糖水解為小分子物質(zhì)，食糜的粘性則大大降低，內(nèi)源性消化酶可充分與食糜混合，提高了淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)有吸收。(3)促進(jìn)腸道內(nèi)有害菌的增殖，損害腸道粘膜正常形態(tài)養(yǎng)分的消化吸收不良可導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)在腸道內(nèi)蓄積，富含養(yǎng)分的食糜是細(xì)菌，特別是致病菌的良好培養(yǎng)基，并且食糜通過消化道的速率降低，會(huì)大大減少了菌群的移動(dòng)，使細(xì)菌尤其是厭氧微生物得以在腸道上大量定居下來，從而改變了腸道內(nèi)的微生物區(qū)系。并且大量有害細(xì)菌的增殖會(huì)消耗許多營養(yǎng)物質(zhì)，從而降低營養(yǎng)物質(zhì)的利用率。此外，腸內(nèi)細(xì)菌數(shù)量增多會(huì)刺激腸壁，并使之增厚，同時(shí)損傷腸壁，進(jìn)一步降低腸道對(duì)養(yǎng)分的吸收。某些細(xì)菌還可能產(chǎn)生毒素，影響宿主健康。通過外源添加β-葡聚糖酶是一種有效途徑，但由于飼料制粒需要經(jīng)受高溫，要求所使用的β “葡聚糖酶不僅作用效果顯著，還需具有耐高溫的特點(diǎn)。β -葡聚糖酶作為一種飼料用酶，其作用機(jī)理主要包括如下幾個(gè)方面(1) β-葡聚糖酶可以降解飼料原料中的β-葡聚糖，消除β-葡聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高飼料的消化利用率。(2) β -葡聚糖酶可改善動(dòng)物消化道的生態(tài)環(huán)境和功能。β -葡聚糖酶水解β _葡聚糖后，粘性大大降低，食糜的排空速度提高，減少了腸道內(nèi)發(fā)酵，尤其是厭氧微生物發(fā)酵的可能性，從而降低了動(dòng)物腸道疾病的發(fā)生。有研究表明，在大麥日糧中添加以葡聚糖酶可顯著降低斷奶仔豬的腹瀉率。另外，消外道黏度的降低也有利于水、蛋白質(zhì)、脂類、電解質(zhì)的內(nèi)源分泌，使消化道的功能得到改善。(3)提高動(dòng)物內(nèi)源酶的分泌及活性。研究表明，添加β _葡聚糖酶可顯著提高畜禽腸道內(nèi)容物中的胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等內(nèi)源酶的分泌及活性。β -葡聚糖酶可使飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化轉(zhuǎn)移至腸道進(jìn)行，從而提高內(nèi)源酶的活性，降低膽汁鹽的早期分離，可更好地促進(jìn)動(dòng)物對(duì)養(yǎng)分的消化吸收，顯著提高大麥等農(nóng)副產(chǎn)品的消化利用率。在葡聚糖酶對(duì)仔豬消化機(jī)能的影響實(shí)驗(yàn)中，仔豬十二指腸內(nèi)溶物總蛋白水解酶和淀粉酶的活性分別提高了 20. 96% (P < 0. 01)和 5. 66% (P < 0. 05)。(4)促進(jìn)動(dòng)物生長，提高機(jī)體免疫功能。添加β _葡聚糖酶于大麥、小麥等日糧中， 可明顯改善動(dòng)物神經(jīng)內(nèi)分泌狀況。研究表明，麥類等高水平SNSP基礎(chǔ)日糧中添加以β-葡聚糖酶為主的NSP酶制后，除了加強(qiáng)營養(yǎng)成分的消化吸收外，還能影響神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，從而影響代謝，促進(jìn)生長。啤酒作為一種大眾化的酒精飲料，素有“液體面包”之稱，其消費(fèi)量呈逐年上升趨勢(shì)。在啤酒生產(chǎn)時(shí)需要用到大麥，通常大麥中葡聚糖含量高達(dá)4%-8%，由于大麥 β -葡聚糖鏈分子發(fā)生扭結(jié)，分子間結(jié)合不緊密，且溶解后黏度高，糖化時(shí)使麥汁黏度增高， β -葡聚糖易被高分子蛋白質(zhì)吸附，造成麥糟“板結(jié)”，從而導(dǎo)致麥汁和啤酒過濾困難，降低麥汁得率；另外，大麥葡聚糖不能被酵母利用或分解，易引起啤酒混濁和凝膠沉淀，影響啤酒的穩(wěn)定性，降低啤酒的品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益。據(jù)統(tǒng)計(jì) ，2010年中國啤酒產(chǎn)量達(dá)到4300萬噸，連續(xù)9年位居世界第一。但由于大麥中β -葡聚糖的影響，每年對(duì)啤酒行業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失估計(jì)在20億元左右，解決大麥中的葡聚糖問題一直是該行業(yè)的一個(gè)重大課題。最近的研究及應(yīng)用情況表明，采用β-葡聚糖酶可有效地去除啤酒糖化過程大麥中的β-葡聚糖。β-葡聚糖酶屬于水解酶類，對(duì)水解谷物中的β-葡聚糖具有重要作用。其應(yīng)用于啤酒生產(chǎn)中，可以分解大麥及麥芽中的β "葡聚糖凝膠，降低膠狀深沉物，發(fā)送啤酒的混濁度，提高產(chǎn)品質(zhì)量。近年來，利用葡聚糖酶分解葡聚糖提高發(fā)酵菌種的糖化力，減少麥芽汁中β "葡聚糖的殘留量，改善啤酒質(zhì)量，取得了良好效果。目前，β-葡聚糖酶廣泛應(yīng)用于啤酒發(fā)酵工業(yè)，美國、日本、丹麥、德國、澳大利亞、 加拿大等國均已采用β-葡聚糖酶作為啤酒工業(yè)的主要酶制劑。我國每年啤酒產(chǎn)量達(dá)4300 多萬噸，且仍量上升趨勢(shì)，但在啤酒釀造過程中，大麥胚乳細(xì)胞中的β -葡聚糖不能充分降解，β -葡聚糖的殘留是造成啤酒酒體混濁、泡沫持久力減少和掛杯力不強(qiáng)的主要原因之
οβ -葡聚糖酶作為啤酒用酶，其主要作用機(jī)理如下(1)降解大麥胚乳細(xì)胞中的β-葡聚糖，增加可發(fā)酵產(chǎn)物，提高糖化生產(chǎn)效率。 β"葡聚糖酶可專一性地分解粘度很高的各種大麥β "葡聚糖，能夠疏松大麥胚乳細(xì)胞壁， 促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)容物的外溢，從而提高了原料的利用率。(2)降低麥汁粘度，改善過濾性能，提高過濾速度，改善麥汁清亮度。(3)提高啤酒的膠體穩(wěn)定性，清除因β -葡聚糖引起的冷混濁。另外，β-葡聚糖酶還可用于制糖工業(yè)、環(huán)保及資源處理等方面，具有良好的應(yīng)用前景。β _葡聚糖酶主要來源于微生物，產(chǎn)生β -葡聚糖酶的微生物主要包括細(xì)菌(芽孢桿菌)、真菌(曲霉、毛霉、木霉等)和瘤胃微生物等。由于飼料制粒、啤酒釀造過程中通常均需高溫處理，而普通β-葡聚糖酶耐熱性能較差，因此開發(fā)出的β "葡聚糖酶應(yīng)具有耐高溫性能，才能廣泛地作為飼料用酶、啤酒釀造用酶等使用。本發(fā)明提供了一種新型耐高溫β -葡聚糖酶，其耐熱性能良好，并在畢赤酵母這一真核系統(tǒng)中高效表達(dá)，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型β -葡聚糖酶GLU。本發(fā)明的另一目的是提供編碼上述新型葡聚糖酶的基因。本發(fā)明的另一目的是提供一種新型耐高溫β -葡聚糖酶VGLU。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼上述新型耐高溫葡聚糖酶的基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述新型葡聚糖酶或上述新型耐高溫葡聚糖酶的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述新型葡聚糖酶基因GLU或上述新型耐高溫 β -葡聚糖酶基因VGLU的的重組菌株。本發(fā)明的另一目的是提供制備上述新型耐高溫β -葡聚糖酶VGLU的方法。本發(fā)明的另一目的是提供上述新型β-葡聚糖酶GLU或新型耐高溫β-葡聚糖酶 VGLU的應(yīng)用。本發(fā)明的一種生產(chǎn)上述新型β-葡聚糖酶GLU的黑曲霉AN070902(ASpergilluS niger)，于2010年10月20日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號(hào)為CGMCC No. 4235，其相關(guān)信息記載于申請(qǐng)?zhí)枮镃N201010566249. 0的專利申請(qǐng)中，已于2011年4月 6日公開。本發(fā)明提供了一種新型β -葡聚糖酶GLU，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示MSRPFIFPAV FTLAASALAA PVNTTTEDET AQIPAEAVIG YSDLE⑶FDVAVLPFSNSTNLNGLFINTTI ASIAAKEEGV SLEKREAEAY VEFVSAKDFS AEffLYTLEEVQYGKFEARMKSAAAMGTVSS MFLYQNGSEI ADGRPffVEVD IEVLGKNPGS YQSNFIIGKAGAQKTSEKHHAVSPDRLAAF HTYGLEffTPN YffSRTVDVRE VRKTEGGQVSRFTGTQGLNL NLffSSESAAffVGQFDESKLP LFQFINWVKV GEYTPGQKYG GSDFTLDffTD NFDTFDGSRffGKGDffTFDGNRVDLTDKNIY SRDGMLILAL VKSPSSKPER EMTSLLAFNG QSST該酶蛋白由344個(gè)氨基酸組成，其理論pI/Mw 4. 70/38025. 29。本發(fā)明還提供了編碼上述β-葡聚糖酶的基因GLU，該基因的序列如SEQ ID NO. 2 所示atgtctagaccattcatttttcccgctgtttttaccttggctgcctctgctttggccgct60
ccagtcaacactactaccgaggacgagactgctcaaattcctgctgaggctgtcatcggt120
tactctgacctggaaggagatttcgacgttgctgtcttgcctttctccaactccaccaac180
ttgaatggtttgttcatcaacactactatcgcttctattgctgccaaggaagagggtgtt240
tctcttgagaagagagaggctgaagcctacgttgaattcgtttctgctaaggacttttct300
gccgagtggttgtacactttagaggaagtccaatacggtaagttcgaggctcgtatgaag360
tctgctgccgctatgggaacagtcagttccatgttcttgtaccagaacggttccgaaatc420
gccgatggaagaccatgggtagaggtggatatcgaagttctcggtaagaacccaggatcc480
taccaatccaacttcatcatcggtaaagctggtgctcaaaagacttccgagaagcaccac540
gctgtttctcctgacaggctcgccgctttccacacctacggtttggaatggactcctaac600
tactggtcaaggactgttgacgtcagagaggtcagaaagactgaaggtggacaagtttcc660
agattcaccggtactcaaggattgaacttgaatctttggtcctctgagtctgcagcttgg720
gttggtcaattcgacgaatctaagctgccactgttccagttcattaactgggtcaaagtt780
ggtgaatacacgccaggtcaaaagtatggcggttctgacttcactttggactggaccgac840
aactttgacaccttcgatggttctagatggggtaagggtgactggactttcgacggtaac900
cgtgtcgacttgaccgacaagaacatctactccagagacggtatgttgattcttgccttg960
gtcaagagtccaagttccaaaccagaaagggagatgacgagcctgctagccttcaacggt1020
caatcttccacctaa1035經(jīng)檢測(cè)，該酶在pH 2. 0 6. 5的條件下酶活穩(wěn)定，屬于酸性葡聚糖酶，動(dòng)物消化道全程的各種PH環(huán)境均不會(huì)顯著降低酶活，同時(shí)蛋白酶體外水解實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明獲得的 β-葡聚糖酶具有良好的耐胃蛋白酶及胰蛋白酶消化能力。另外，在模擬啤酒釀造條件下， 該酶也對(duì)麥芽中的葡聚糖具有良好的水解效果。但該酶具有一個(gè)缺點(diǎn)，即其耐高溫性能稍差，75°C水浴中保存IOmin后，其酶活力損失達(dá)70 %左右，因此，需對(duì)該酶進(jìn)行相應(yīng)的改造，以篩選獲得耐高溫性能的β-葡聚糖酶。本發(fā)明優(yōu)選采用定點(diǎn)突變法和易錯(cuò)PCR對(duì)SEQ ID NO. 1所示的黑曲霉 (Aspergillus niger)來源的β -葡聚糖酶GLU進(jìn)行改造，并經(jīng)過高通量篩選的方法篩選得到新型耐高溫β-葡聚糖酶VGLU。本發(fā)明的新型耐高溫β-葡聚糖酶VGLU和原有黑曲霉生產(chǎn)的β -葡聚糖酶GLU相比，有4個(gè)氨基酸的差異，突變位點(diǎn)由+46G，+62N，+288T，+313D 突變成+46C，+62C，+288C，+313C，整個(gè)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中增加了兩個(gè)二硫鍵，突變后的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示MSRPFIFPAVFTLAASALAAPVNTTTEDET AQIPAEAVIG YSDLECDFDV
AVLPFSNSTN60
LCGLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAY VEFVSAKDFS AEffLYTLEEV
QYGKFEARMK120
SAAAMGTVSSMFLYQNGSEIADGRPffVEVD IEVLGKNPGS YQSNFIIGKA
GAQKTSEKHH180
AVSPDRLAAFHTYGLEffTPNYffSRTVDVRE VRKTEGGQVS
RFTGTQGLNLNLffSSESAAff240
VGQFDESKLPLFQFINWVKVGEYTPGQKYG GSDFTLDffTD
NFDCFDGSRffGKGDWTFDGN300
RVDLTDKNIYSRCGMLILALVKSPSSKPER EMTSLLAFNG QSST 344
編碼該氨基I酸序列的基因如SEQ ID NO. 4所示，命名為VGLU
atgtctagaccattcatttttcccgctgtttttaccttggctgcctctgc tttggccgct60
ccagtcaacactactaccgaggacgagactgctcaaattcctgctgaggc tgtcatcggt120
tactctgacctggaatgcgatttcgacgttgctgtcttgcctttctccaa ctccaccaac180
ttgtgcggtttgttcatcaacactactatcgcttctattgctgccaagga agagggtgtt240
tctcttgagaagagagaggctgaagcctacgttgaattcgtttctgctaa ggacttttct300
gccgagtggttgtacactttagaggaagtccaatacggtaagttcgaggc tcgtatgaag360
tctgctgccgctatgggaacagtcagttccatgttcttgtaccagaacgg ttccgaaatc420
gccgatggaagaccatgggtagaggtggatatcgaagttctcggtaagaa cccaggatcc480
taccaatccaacttcatcatcggtaaagctggtgctcaaaagacttccgagaagcaccac540
gctgtttctcctgacaggctcgccgctttccacacctacggtttggaatggactcctaac600
tactggtcaaggactgttgacgtcagagaggtcagaaagactgaaggtggacaagtttcc660
agattcaccggtactcaaggattgaacttgaatctttggtcctctgagtctgcagcttgg720
gttggtcaattcgacgaatctaagctgccactgttccagttcattaactgggtcaaagtt780
ggtgaatacacgccaggtcaaaagtatggcggttctgacttcactttggactggaccgac840
aactttgacaccttcgatggttgcagatggggtaagggtgactggactttcgacggtaac900
cgtgtcgacttgaccgacaagaacatctactccagatgcggtatgttgattcttgccttg960
gtcaagagtccaagttccaaaccagaaagggagatgacgagcctgctagccttcaacggt1020
caatcttccacctaa1035
經(jīng)檢測(cè)，該I■組酶的熱穩(wěn)定性良好，在75°C水浴中放置Ih酶活力仍能保持85%
左右，在很大程度上能減少高溫操作時(shí)引起的酶活喪失，并且該酶的其他性能及穩(wěn)定性能也非常優(yōu)良，因此該酶可廣泛作為飼料用酶及啤酒釀造用酶使用，該酶的理論P(yáng)I/Mw 4.74/38050. 50。本發(fā)明還提供了包含上述新型β-葡聚糖酶基因GLU的重組載體，優(yōu)選為 PPICz α A-GLU ；以及包含上述新型耐高溫β -葡聚糖酶基因VGLU的重組載體，優(yōu)選為 pPICzaA-VGLU。將本發(fā)明的新型β _葡聚糖酶基因與新型耐高溫β _葡聚糖酶基因分別插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將本發(fā)明的新型葡聚糖酶基因與新型耐高溫β “葡聚糖酶基因分別插入到質(zhì)粒PPICz α A上的EcoR I和NotI限制性酶切位點(diǎn)之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動(dòng)子的下游并受其調(diào)控，分別得到重組酵母表達(dá)質(zhì)粒 pPICz α A-GLU 與 pPICz α A-VGLU0本發(fā)明還提供了包含上述新型β-葡聚糖酶基因GLU或新型耐高溫β-葡聚糖酶基因VGLU的重組菌株的重組菌株，優(yōu)選為畢赤酵母重組菌株Χ33。本發(fā)明還提供了一種制備新型耐高溫葡聚糖酶VGLU的方法，其特征在于，包括以下步驟1)用上述重組載體pPICz α A-VGLU轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)新型耐高溫β-葡聚糖酶VGLU的表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的新型耐高溫β -葡聚糖酶VGLU。本發(fā)明還提供了上述新型β-葡聚糖酶GLU或新型耐高溫β-葡聚糖酶VGLU的應(yīng)用，優(yōu)選其在飼料、啤酒釀造工業(yè)中的應(yīng)用。本發(fā)明的新型耐高溫β-葡聚糖酶的耐熱性能良好，是一種優(yōu)良的酸性葡聚糖酶，并且具有非常好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解能力，完全可達(dá)到飼料及啤酒釀造用酶的要求。本發(fā)明的新型耐高溫β-葡聚糖酶通過高效表達(dá)后能夠達(dá)到較高的發(fā)酵水平，在工業(yè)生產(chǎn)中可大大降低生產(chǎn)成本，使其在飼料、啤酒釀造等工業(yè)中顯示出更大的應(yīng)用潛力。
圖1重組耐高溫β-葡聚糖酶在50L罐中的發(fā)酵過程曲線。圖2重組耐高溫β -葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度。
圖3重組耐高溫β -葡聚糖酶的最適反應(yīng)ρΗ值。圖4重組耐高溫β -葡聚糖酶的溫度耐受性能(不同處理溫度)。圖5重組耐高溫β -葡聚糖酶的溫度耐受性能(不同處理時(shí)間)。圖6重組耐高溫β -葡聚糖酶的ρΗ耐受性能。圖7重組耐高溫β-葡聚糖酶在胃蛋白酶，胰蛋白酶處理后剩余酶活。本發(fā)明的一種生產(chǎn)上述新型β-葡聚糖酶GLU的黑曲霉AN070902(ASpergilluS niger)，于2010年10月20日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號(hào)為CGMCC No. 4235，其相關(guān)信息記載于申請(qǐng)?zhí)枮镃N201010566249. 0的專利中，該專利已公開于2011 年4月6日。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》 (第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行； 所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實(shí)驗(yàn)材料和試劑1、菌株與載體大腸桿菌菌株ToplO、畢赤酵母X33、載體pPICzalphaA購自Invitrogen公司。2、酶與試劑盒逆轉(zhuǎn)錄酶superscript III、RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司。質(zhì)粒DNA提取試劑盒，膠回收試劑盒，PCR純化試劑盒購自上海生工公司。限制性內(nèi)切酶購自Fermentas 公司。3、培養(yǎng)基基本鹽培養(yǎng)基磷酸氫二銨5%、磷酸二氫鉀0. 5 %、七水硫酸鎂1. 5%、硫酸鉀 1.95%、硫酸鈣0. 1%、氫氧化鉀0. 1%、消泡劑0.03%。高壓后每升加4. 35毫升PTMlPTMl (微量鹽溶液)硫酸銅0. 6%、碘化鉀0. 018%、一水硫酸錳0. 3%、二水鉬酸鈉0. 02 %、硼酸0. 002 %、六水氯化鈷0. 05 %、氯化鋅2 %、七水硫酸鐵6. 5 %、濃硫酸 0.5%、生物素 0. 02%實(shí)施例1、黑曲霉(Aspergillus niger) β -葡聚糖酶GLU基因的克隆運(yùn)用RNA提取試劑盒，提取黑曲霉(Aspergillus niger)總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄酶 superscript III Reverse Transcriptase 操作說明合成第一鏈 cDNA。以 cDNA 為模板， 設(shè)計(jì)β-葡聚糖酶引物(GLU5EcoRI，GLU3NotI)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物由EcoRI和NotI 進(jìn)行雙酶切，然后與經(jīng)過同樣酶切的畢赤酵母表達(dá)載體PPICzalphaA相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)抗生素Zeocin篩選后，獲得陽性克隆。提取陽性克隆的質(zhì)粒。送樣到上海英駿生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，所獲得克隆DNA插入片段含有β-葡聚糖酶基因完整的開放閱讀框。該β-葡聚糖酶基因GLU，全長1035bp，編碼344個(gè)氨基酸。擴(kuò)增所用引物如下GLU 5EcoRI 5’ CTGAGAATTCATGTCTAGACCATTCATTTTTCCCG3’
GLU 3NotI 5’ AGAGCGGCCGCTTAGGTGGAAGATTGACCGTTGAAG3’實(shí)施例2、GLU的基因定點(diǎn)突變將克隆出的GLU基因，采用EcoRI和NotI進(jìn)行雙酶切，連接到經(jīng)相同雙酶切的載體pPICz α A上，獲得重組表達(dá)載體pPICz α A-GLU,然后轉(zhuǎn)化到BL21中，選擇陽性克隆子采用IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶。然后采用該酶在不同溫度下(60-100°C )處理IOmin后檢測(cè)剩余酶活， 發(fā)現(xiàn)該酶在85°C下酶活損失達(dá)80%以上，這說明直接由GLU編碼的β-葡聚糖酶耐高溫性能較差。因此需對(duì)該基因進(jìn)行優(yōu)化改良。通過對(duì)葡聚糖酶進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)自動(dòng)建模分析 (swissmodel)，分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。在不破壞其二級(jí)結(jié)構(gòu)與活性中心的前提下，對(duì)活性中心附近以及二級(jí)結(jié)構(gòu)連接處進(jìn)行氨基酸定點(diǎn)突變，增加二硫鍵，以增強(qiáng)葡聚糖酶蛋白的穩(wěn)定性能及耐高溫性能。共預(yù)測(cè)了 4個(gè)待突變位點(diǎn)，分別為+46G，+62N, +288T， +313D，然后針對(duì)性的設(shè)計(jì)了 4對(duì)突變引物，目的基因突變位點(diǎn)統(tǒng)一為TGC，TGC左右各取15 個(gè)堿基構(gòu)成正向引物；反向引物與正向引物完全互補(bǔ)。PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI酶切處理后轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，在LB-Amp平板篩選陽性突變重組克隆，并對(duì)篩選的陽性克隆子進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，采用IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)對(duì)比測(cè)試，優(yōu)化后的基因所編碼的葡聚糖酶耐高溫性能大大提高。經(jīng)四次定點(diǎn)突變，獲得了優(yōu)化后的葡聚糖酶基因，命名為VGLU。實(shí)施例3、包含耐高溫β -葡聚糖酶基因VGLU的畢赤酵母工程菌的構(gòu)建優(yōu)化后的耐高溫β -葡聚糖酶基因VGLU，采用EcoRI和NotI進(jìn)行雙酶切，重新連接到經(jīng)相同雙酶切的載體PPICz α A上，獲得重組表達(dá)載體pPICz α A-VGLU。然后采用SacI 進(jìn)行線性化，線性化后的重組載體電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33，電轉(zhuǎn)化后涂布于YPD (Zeo+)平板上進(jìn)行篩選，得到畢赤酵母重組菌株。實(shí)施例4、耐高溫β -葡聚糖酶重組菌株的高效表達(dá)將篩選獲得的耐高溫β -葡聚糖酶重組菌株pPICZaA-VGLU-X33-9進(jìn)行高密度發(fā)
酵培養(yǎng)。配制20L基本鹽培養(yǎng)基，在50L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中滅菌后，冷卻至常溫備用。用氨水和磷酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的PH值至4. 6，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和空氣流量控制溶氧大于20 %以上，發(fā)酵溫度為30°C。整個(gè)發(fā)酵過程分3個(gè)階段第一階段為菌體培養(yǎng)階段，將重組菌 pPICZaA-VGLU-X33-9按照10%的接種量接種至發(fā)酵罐中，流加已滅菌的4L50%的葡萄糖， 培養(yǎng)24-30小時(shí)，以補(bǔ)完葡萄糖為標(biāo)志；第二階段為饑餓階段，當(dāng)葡萄糖補(bǔ)完之后，不流加任何碳源，當(dāng)溶氧上升至80%以上即表明該階段結(jié)束，為期約30-60min ；第三階段為誘導(dǎo)表達(dá)階段，流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并且保持溶氧在20%以上，培養(yǎng)時(shí)間在180-200小時(shí)之間。發(fā)酵液可通過陶瓷膜或超濾膜處理后獲得酶液。在發(fā)酵過程中的不同時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定酶活，發(fā)酵過程中耐高溫β-葡聚糖酶的表達(dá)情況如圖1所示，發(fā)酵195h的發(fā)酵液酶活為16250U/mL。實(shí)施例5、重組耐高溫β -葡聚糖酶的活性分析采用DNS法進(jìn)行檢測(cè)。1個(gè)酶活單位(U)定義為在規(guī)定條件(pH 4.8，40°C)下，每分鐘釋放出具有相當(dāng)于Ιμπιο 葡萄糖反應(yīng)力的還原性碳水化合物所需的酶量(ymol/min)
實(shí)施例6、重組耐高溫β -葡聚糖酶的性質(zhì)測(cè)定1、耐高溫β-葡聚糖酶比活測(cè)定將上述發(fā)酵液中的耐高溫β-葡聚糖酶通過離子交換柱(Q Sepharose Fast Flow Ion Exchanger)純化，采用改良型Bradford試劑盒(上海Sangon公司)測(cè)定蛋白濃度，得出該耐高溫β -葡聚糖酶比活為2031U/mg。2、耐高溫β -葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度及ρΗ測(cè)定最適反應(yīng)溫度將酶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，在不同溫度(25 80°C )下反應(yīng)，測(cè)定耐高溫β-葡聚糖酶的酶活。以最高酶活力為100%，其它溫度下測(cè)得的酶活與之相比，即得到該溫度下的相對(duì)酶活。最適反應(yīng)溫度曲線見圖2。最適反應(yīng)ρΗ 將稀釋后的酶液，與不同pH(2. 0 7. 0)檢測(cè)條件下，檢測(cè)該耐高溫 β-葡聚糖酶的酶活力，并采用最高酶活為100%，其他檢測(cè)結(jié)果與之相比，即得到不同PH 檢測(cè)條件下的相對(duì)酶活。最適反應(yīng)PH曲線見圖3。結(jié)果如圖3和圖4所示該重組耐高溫β-葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為60°C，最適反應(yīng)ρΗ為5. 0。3、耐高溫β -葡聚糖酶的耐熱性能測(cè)定(1)不同溫度耐熱性能將酶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，在不同溫度下處理IOmin后，以未處理的酶活力為對(duì)照測(cè)定耐高溫β “葡聚糖酶的相對(duì)酶活，結(jié)果見圖4。(2)不同時(shí)間耐熱性能在75°C條件下，將適當(dāng)稀釋的酶液處理不同時(shí)間 (10min-60min)，以未處理的酶活為對(duì)照測(cè)定該耐高溫β -葡聚糖酶的耐熱性能，結(jié)果見圖 5。結(jié)果顯示該耐高溫β -葡聚糖酶的耐熱性能良好，完全可達(dá)到飼料及啤酒釀造用酶的要求。4、耐高溫β -葡聚糖酶ρΗ穩(wěn)定性測(cè)定將稀釋后的酶液與不同ρΗ的緩沖液混合，室溫放置2h，以未處理的酶液為對(duì)照， 測(cè)定耐高溫β “葡聚糖酶的相對(duì)酶活，結(jié)果如圖6所示。該β-葡聚糖酶的最適ρΗ為5.0，并且在ρΗ 3 6范圍內(nèi)相對(duì)酶活均可達(dá)到80% 以上，為一種良好的酸性β-葡聚糖酶。5、耐高溫β -葡聚糖酶對(duì)胃蛋白酶、胰蛋白酶消化耐受性測(cè)定取0. ImL耐高溫β -葡聚糖酶液，分別加入0. 5mL 0. lmg/mL胃蛋白酶(ρΗ 2. 0濃度80U/mL)和0. 5mL 0. lmg/mL胰蛋白酶(ρΗ 7. 0濃度150U/mL)，于37°C處理不同時(shí)間后測(cè)酶活。結(jié)果如圖7所示。其中胃蛋白酶處理120min后，酶活性仍達(dá)92%左右，用胰蛋白酶處理120min后， 剩余83%。這說明本葡聚糖酶具有非常好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解能力。6、金屬離子和EDTA對(duì)酶活力的影響將含有ImM K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、Co2+、Cu2+ 和 EDTA 的溶液與稀釋適當(dāng)倍數(shù)的酶液混合，室溫放置30min，以未處理的酶液為對(duì)照，結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，Mg2+、Ca2+對(duì)該β _葡聚糖酶有一定的激活作用，酶活性分別促進(jìn)11%、 25% ；K+、EDTA、Zn2+對(duì)酶活性沒有影響；其余金屬離子Cr3+、Cu2+、Fe2+和Fe3+對(duì)酶活性均有不同程度的抑制作用；而SDS完全抑制了酶的活性。
表1金屬離子和EDTA對(duì)重組耐高溫β -葡聚糖酶酶活力的影響
金屬離子及化學(xué)試劑 (1 mmol/L )相對(duì)酶活(％)K+98.8Mg2+111Ca2+125Zn2+70.9Cr3+65.4Cu2+82.5Fe2+58.6Fe3+52.5EDTA98.5SDS0
權(quán)利要求
1.一種新型β-葡聚糖酶GLU，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種新型葡聚糖酶基因GLU，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的新型β-葡聚糖酶，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種新型耐高溫β -葡聚糖酶VGLU，其特征在于，由權(quán)利要求1所述新型β -葡聚糖酶改造獲得，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
4.一種新型耐高溫β-葡聚糖酶基因VGLU，其特征在于，編碼權(quán)利要求3所述的新型耐高溫β-葡聚糖酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的新型耐高溫葡聚糖酶基因VGLU，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
6.包含權(quán)利要求2所述新型β-葡聚糖酶基因GLU或權(quán)利要求4所述新型耐高溫 β -葡聚糖酶基因VGLU的重組載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為pPICzα A-GLU或 pPICz α A-VGLU0
8.包含權(quán)利要求2所述新型β-葡聚糖酶基因GLU或權(quán)利要求4所述新型耐高溫 β -葡聚糖酶基因VGLU的重組菌株。
9.一種制備新型耐高溫β-葡聚糖酶VGLU的方法，其特征在于，包括以下步驟1)用重組載體pPICzα A-VGLU轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)新型耐高溫β-葡聚糖酶VGLU的表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的新型耐高溫β-葡聚糖酶VGLU。
10.權(quán)利要求1所述新型β-葡聚糖酶GLU或權(quán)利要求3所述新型耐高溫β -葡聚糖酶VGLU的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新型β-葡聚糖酶GLU、新型耐高溫β-葡聚糖酶VGLU及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種新型β-葡聚糖酶GLU，其具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，一種新型耐高溫β-葡聚糖酶VGLU其具有如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列，且本發(fā)明還提供了編碼上述新型β-葡聚糖酶和新型耐高溫β-葡聚糖酶的基因，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4所示，本發(fā)明還提供了包含上述兩種基因的重組載體、重組菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明的新型耐高溫β-葡聚糖酶通過高效表達(dá)后能夠達(dá)到較高的發(fā)酵水平，在工業(yè)生產(chǎn)中可大大降低生產(chǎn)成本，使其在飼料、啤酒釀造等工業(yè)中顯示出更大的應(yīng)用潛力。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102363773SQ20111032005
公開日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2011年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月20日
發(fā)明者李陽源, 羅長財(cái), 鐘開新 申請(qǐng)人:廣東溢多利生物科技股份有限公司