本發(fā)明涉及生物
技術領域：
，尤其涉及一種用于檢測人類brca1基因突變的lsp引物及試劑盒。
背景技術：
：乳腺癌易感基因1(breastcancersusceptibllitygene1，brca1)是一種腫瘤抑癌基因，該基因位于17q12-21區(qū)，基因組長約80kb，編碼區(qū)5711bp，共24個外顯子，編碼一個具有1863個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。brca1蛋白具有n-端鋅指結(jié)構(gòu)域、brca1c末端基序(brct)、rad51結(jié)合區(qū)、核定位區(qū)和轉(zhuǎn)錄活性區(qū)等5個特征性結(jié)構(gòu)域。brca1蛋白參與dna損傷修復、轉(zhuǎn)錄活化與抑制、細胞周期的調(diào)節(jié)、中心體復制的負性調(diào)節(jié)、對腫瘤生長起負性調(diào)節(jié)作用、在維持基因組穩(wěn)定性中起重要作用。若brca1基因發(fā)生突變，導致?lián)p傷的雙鏈dna不能得到修復，引起p53水平升高，繼而p21升高，導致細胞凋亡和細胞周期停滯。如果是p53的基因修復失敗，細胞過度增殖，從而導致腫瘤的發(fā)生。brca1基因可發(fā)生多形式、多位點基因突變，主要有移碼突變、錯義突變、無義突變。研究表明，brca1基因突變會導致家族遺傳性乳腺癌及卵巢癌，帶有brca1基因突變的患者一生中罹患乳腺癌的幾率為40％-87％，卵巢癌的幾率為16％-60％，除此之外也容易患其他癌癥。通過檢測brca1基因突變，能夠憑借乳腺癌患病風險及采取預防措施，降低乳腺癌或卵巢癌的發(fā)病率。目前用于brca1突變檢測方法的金標準為測序法技術。測序法是基因突變檢測的可靠方法，也是應用最多的方法。其需要對樣品進行擴增、純化、序列分析，所需的時間長，成本高，對取材和技術的要求都比較高，最重要的是限制靈敏度不高，只能對含量大于30％的突變基因進行檢測，對環(huán)境和操作者有危害，因此在臨床應用上具有一定的限制。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測人類brca1基因突變的lsp引物及試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于檢測人類brca1基因突變的lsp引物，所述lsp引物的5’端為一段帶有不同雙熒光標記的線型探針，3’端為一段與模板互補的序列，兩段序列之間用spacer18進行連接；當模板存在時，所述lsp引物便能與模板退火延伸，合成模板互補鏈；當模板互補鏈合成完后，所述lsp引物的5’端探針部分就會與之結(jié)合，形成一個類似蝎子的形狀；下游引物則沿著模板互補鏈的3’端進行延伸，在聚合酶的作用下剪切探針部分，從而發(fā)光。進一步的，所述brca1基因的引物序列如seqidno:1-42所示，其中一對上游引物序列為熒光基團-seqidno:1-淬滅基團-spacer18-seqidno:2，相應下游引物為seqidno:3，上游引物序列為熒光基團-seqidno:4-淬滅基團-spacer18-seqidno:5，相應下游引物為seqidno:6，以此類推至上游引物序列為熒光基團-seqidno:40-淬滅基團-spacer18-seqidno:41，相應下游引物為seqidno:42。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種含有上述的lsp引物，用于檢測人類brca1基因突變的試劑盒。進一步的，所述用于檢測人類brca1基因突變的試劑盒，還含有brca1基因反應緩沖液1，brca1基因反應緩沖液2，brca1基因反應緩沖液3，brca1基因反應緩沖液4，brca1基因外控反應緩沖液，brca1基因陰性對照，brca1基因陽性對照。本發(fā)明的技術為線型蝎子引物(linearscorpionprimer，lsp)，該方法具有特異性強、靈敏度高的特點，同時擁有同一個反應管中通過不同熒光通道進行區(qū)分不同突變型的特點。該lsp引物的5’端為一段帶有不同雙熒光標記的線型探針，3’端為一段與模板互補序列，兩段序列之間用spacer18進行連接。當模板存在時，lsp引物便能與模板退火延伸，合成模板互補鏈；當模板互補鏈合成完后，lsp引物的5’端探針部分就會與之結(jié)合，形成一個類似蝎子的形狀；接下來下游引物則沿著模板互補鏈的3’端進行延伸，在聚合酶的作用下，剪切探針部分，從而發(fā)光。本發(fā)明的試劑盒包含：上述lsp引物，brca1基因反應緩沖液1，brca1基因反應緩沖液2，brca1基因反應緩沖液3，brca1基因反應緩沖液4，brca1基因外控反應緩沖液，brca1基因陰性對照，brca1基因陽性對照。其中，brca1反應緩沖液1—brca1反應緩沖液4都包含200nmol/l突變型引物，200nmol/l人基因組內(nèi)標(dna)引物(即為表1中的brca1內(nèi)參對應的上下游引物)，3.2mmol/lhcl、16.8mmol/lbase、60mmol/lkcl、2.5mmol/lmgcl2、0.1mmol/ledta·2na、200μmmol/ldatp、200μmmol/ldgtp、200μmmol/ldctp、200μmmol/ldutp、100μmmol/ldttp。brca1反應緩沖液1的突變引物是s4p、a7c、g10l突變類型的引物(表1中對應的序列)；brca1反應緩沖液2的突變引物是m18t、c24a、h1732del突變類型的引物(表1中對應的序列)；brca1反應緩沖液3的突變引物是g1731dup、g1735l、g1738g突變類型的引物(表1中對應的序列)；brca1反應緩沖液4的突變引物是a1739g、h1746a、l1750a突變類型的引物(表1中對應的序列)。brca1外控反應緩沖液包含200nmol/lbrca1外控引物(即表1中brca1外控的上下游引物)，3.2mmol/lhcl、16.8mmol/lbase、60mmol/lkcl、2.5mmol/lmgcl2、0.1mmol/ledta·2na、200μmmol/ldatp、200μmmol/ldgtp、200μmmol/ldctp、200μmmol/ldutp、100μmmol/ldttp。brca1陰性對照為生理鹽水。brca1陽性對照由s4p、a7c、g10l、m18t、c24a、h1732del、g1731dup、g1735l、g1738g、a1739g、h1746a、l1750a的12種突變型質(zhì)粒與人基因組dna按1:1體積比混合而來。dna酶混合液：2.0u/0.5μl的taq聚合酶，0.002u/0.5μl的ung酶，酶儲存緩沖液補足至0.5ul。酶儲存緩沖液配置方法：加入0.5mol/ledta·2na20μl，25體積％的tritonx-1004ml，5mol/lnacl2ml，0.5mol/lhcl5.6ml，0.5mol/lbase4.4ml，加入30ml雙重蒸餾水，50ml甘油，充分混合均勻后，補加雙重蒸餾水定容至100ml。brca1反應緩沖液1能夠檢測s4p、a7c、g10l突變類型；brca1反應緩沖液2能夠檢測m18t、c24a、h1732del突變類型；brca1反應緩沖液3能夠檢測g1731dup、g1735l、g1738g突變類型；brca1反應緩沖液4能夠檢測a1739g、h1746a、l1750a突變類型；brca1外控反應緩沖液作為判斷結(jié)果用。在8聯(lián)pcr反應條的每個反應管中加入25μl石蠟油，備用。取48μl反應緩沖液加入相應的8聯(lián)pcr管中，再將制備的基因組dna各取2μl依次加入8聯(lián)pcr管中，振搖混勻，稍微離心，置入熒光pcr擴增儀內(nèi)。擴增曲線通過連接于pcr擴增儀的終端電腦獲取，用于分析為brca1哪種突變類型。對照品用于檢測核酸提取過程和pcr擴增過程是否正常進行。線型蝎子引物(lsp)作為一種組分加入到反應緩沖液。線型蝎子引物(lsp)：(1)線型蝎子引物(lsp)技術的應用在于brca1突變型檢測引物結(jié)構(gòu)的改造，該引物包括：5’端為一段帶有不同雙熒光標記的線性探針，3’端為一段與模板互補序列，兩段序列之間用spacer18進行連接。當模板存在時，lsp引物便能與模板退火延伸，合成模板互補鏈；當模板互補鏈合成完后，lsp引物的5’端線性探針部分就會與之結(jié)合，形成一個類似蝎子的形狀；接下來下游引物則沿著模板互補鏈的3’端進行延伸，在聚合酶的作用下，剪切線性探針部分，從而發(fā)光。原理見圖1。其中為淬滅基團，為發(fā)光基團，……為間臂，為剪切后發(fā)光基團發(fā)光。(2)本發(fā)明是應用線型蝎子引物(lsp)技術設計的人類brca1基因突變檢測試劑盒(熒光pcr法)，靶基因為包含各種突變的基因序列，根據(jù)人類基因組的特點，選擇了管家基因作為外控的目的基因和內(nèi)參基因。設計的引物探針如表1所示：表1各突變類型的上下游引物序列表本發(fā)明的試劑盒設計線型蝎子引物(lsp)的引物部分退火溫度為56℃-60℃，同時探針部分tm值為55℃-60℃。1.和普通引物探針組合相比，線型蝎子引物(lsp)具有引物的延伸功能和探針的發(fā)光檢測功能，有效減少反應體系引物量，減少引物二聚體，增加反應特異性。2.和普通引物相比，線型蝎子引物(lsp)的引物部分3’端引入特異突變，增加反應特異性。3.線型蝎子引物(lsp)的結(jié)構(gòu)使反應體系檢測具有相近堿基突變互不干擾的功能，可以達到同管分型的效果。4.線型蝎子引物(lsp)具有單一穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，具有高靈敏度檢測效果，可以檢測低至0.1％的突變。5.線型蝎子引物(lsp)的5’端探針部分和靶基因序列的互補鏈完全匹配，為鏈內(nèi)互補，具有更好的結(jié)合穩(wěn)定度，檢測結(jié)果具有更高的熒光信噪比。附圖說明圖1是線型蝎子引物(lsp)反應原理圖；圖2是實施例樣品熒光值分析圖；圖3是陽性對照品熒光值分析圖；圖4是陰性參考品實驗結(jié)果圖；圖5是陽性參考品實驗結(jié)果圖；圖6是最低檢測限參考品實驗結(jié)果圖；圖7是重復性參考品實驗結(jié)果圖。具體實施方式下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內(nèi)的文獻所描述的技術或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1：(一)樣本質(zhì)粒制備：由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司分別合成以下基因片段(分別見表2所示序列)，ta克隆進pgem-t-easy載體獲得重組菌。表2質(zhì)粒及其對應的基因片段序列表將重組菌擴大培養(yǎng)，用takaraminibestplasmidpurificationkit提取獲得帶有目的基因片段的質(zhì)粒：s4p質(zhì)粒、a7c質(zhì)粒、g10l質(zhì)粒、m18t質(zhì)粒、c24a質(zhì)粒、h1732del質(zhì)粒、g1731dup質(zhì)粒、g1735l質(zhì)粒、g1738g質(zhì)粒、a1739g質(zhì)粒、h1746a質(zhì)粒、l1750a質(zhì)粒。1.陰性參考品(為不同正常人的基因組dna)提取不同正常亞洲人的血液dna即可。2.陽性參考品(為突變含量為0.1％的樣本)分別將s4p、a7c、g10l、m18t、c24a、h1732del、g1731dup、g1735l、g1738g、a1739g、h1746a、l1750a的質(zhì)粒和正常人基因組dna的濃度均調(diào)節(jié)到1.0×107copies/μl，然后按照上述質(zhì)粒和正常人基因組dna體積比1:1000分別進行混合，得到突變含量為0.1％的樣本，即為陽性參考品。3.最低檢測限參考品(核酸濃度為50ng/μl，突變含量為0.1％)分別將s4p、a7c、g10l、m18t、c24a、h1732del、g1731dup、g1735l、g1738g、a1739g、h1746a、l1750a的質(zhì)粒和正常人基因組dna的濃度均調(diào)節(jié)到1.0×106copies/μl，然后按照突變質(zhì)粒和正常人基因組dna體積比1:1000分別進行混合，得到突變含量為0.1％的樣本，即為最低檢測限參考品4.重復性參考品用突變含量為1％的重復性參考品進行重復測定10次，變異系數(shù)(cv)應不高于5.0％(n＝10)。分別將s4p、a7c、g10l、m18t、c24a、h1732del、g1731dup、g1735l、g1738g、a1739g、h1746a、l1750a的質(zhì)粒和正常人基因組dna的濃度均調(diào)節(jié)到1.0×107copies/μl，然后按照突變質(zhì)粒和正常人基因組dna體積比1:100將所有突變質(zhì)粒與正常人基因組dna進行混合，得到突變含量為1％的樣本，即為重復性參考品。5.陽性對照品將s4p、a7c、g10l、m18t、c24a、h1732del、g1731dup、g1735l、g1738g、a1739g、h1746a、l1750a的質(zhì)粒和正常人基因組dna的濃度均調(diào)節(jié)到1.0×106copies/μl，然后按照上述質(zhì)粒和正常人基因組dna體積比1:1分別進行混合，得到的樣本，即為陽性參考品。(二)實驗過程1.試劑準備(試劑準備區(qū))(1)取出brca1各基因突變的反應緩沖液(即反應緩沖液1-反應緩沖液4以及外控反應緩沖液)、dna酶混合液、石蠟油等室溫放置，使其充分溶解，備用。(2)若一支反應緩沖液能一次性用完，則直接分別取13μldna酶混合液加入各反應緩沖液中，充分混合均勻，3000-5000g離心5秒，移至標本處理區(qū)。(3)不滿24人份，則取干凈離心管，配制反應體系(每人份配置體系：50μl反應緩沖液+0.5μldna酶混合液)，按照需要計算好試劑用量，充分混合均勻后，3000-5000g離心5秒，移至標本處理區(qū)。2.加樣(標本處理區(qū))在8聯(lián)pcr反應條的每個反應管中加入25μl石蠟油，備用。取48μl反應緩沖液加入相應的8聯(lián)pcr管中，每個pcr管添加48μl反應緩沖液，再將對照品(brca1陰性對照和brca1陽性對照)和參考品各取2μl依次加入8聯(lián)pcr管中，振搖混勻，稍微離心，置入熒光pcr擴增儀內(nèi)。反應布局如表3所示。表38聯(lián)pcr反應條反應布局表序號名稱1…1011121brca1反應緩沖液1樣本1…樣本10brca1陰性對照brca1陽性對照2brca1反應緩沖液2樣本1…樣本10brca1陰性對照brca1陽性對照3brca1反應緩沖液3樣本1…樣本10brca1陰性對照brca1陽性對照4brca1反應緩沖液4樣本1…樣本10brca1陰性對照brca1陽性對照5brca1外控反應緩沖液樣本1…樣本10brca1陰性對照brca1陽性對照3.上機檢測(擴增檢測區(qū))(1)循環(huán)條件設置38℃5分鐘，95℃10分鐘；進入以下循環(huán)：95℃15秒，60℃50秒，5循環(huán)；95℃15秒，58℃50秒(30秒后讀熒光)，35循環(huán)；38℃30秒。(2)儀器檢測通道選擇熒光素設定為fam、rox、hex和cy5，熒光信號收集設在58℃30秒，具體設置方法請參考儀器(全自動醫(yī)用pcr分析系統(tǒng)genelight9800)使用說明書。4.結(jié)果分析條件設定使用全自動醫(yī)用pcr分析系統(tǒng)(genelight9800)進行分析時，基線取3～12個循環(huán)的熒光信號，閾值可以根據(jù)儀器噪音情況調(diào)整，設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線(無規(guī)則的噪音線)的最高點，且ct值＝0.0為準。閾值循環(huán)數(shù)則為熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。(三)檢驗結(jié)果的解釋其中突變反應孔代表的是brca1反應緩沖液1-brca1反應緩沖液4的pcr管對應的孔位，代表檢測突變型；外控反應孔代表的是brca1外控反應緩沖液的pcr管對應的孔位，檢測的是外控，用于最終判斷標準。1.陰性對照的突變反應孔的fam通道、rox通道、hex通道和cy5通道應均無擴增曲線，brca1外控反應孔的fam通道和cy5通道應無擴增曲線，否則該次實驗視為無效。陽性對照brca1突變反應孔的fam通道、rox通道、hex通道和cy5通道應均有擴增曲線，brca1外控反應孔的fam通道和cy5通道應有擴增曲線，否則該次實驗視為無效。所有待測反應孔的cy5通道應有擴增曲線，否則該次實驗視為無效。2.待測樣本brca1外控反應孔的fam通道應有擴增曲線，且ct值應控制在15-25之間。若ct值大于25則說明存在pcr抑制或者加入的dna量過少，需重新提取dna或者加大加入的dna量；若ct值小于15，則說明加入的dna過量，需減少dna量。3.突變結(jié)果的判斷：確定待測樣本brca1突變檢測反應孔的fam通道、rox通道、hex通道三個通道各自ct值和brca1外控反應孔的fam通道ct值，計算δct(δct＝突變孔ct值－brca1外控ct值)，通過比較|δct|與cut-offδct之間的關系來判讀結(jié)果，如表所示進行判斷。若突變反應孔的fam通道ct值＝0，則判斷為陰性；若15<突變反應孔的fam通道ct值<35，則判斷|δct|值：|δct|大于或等于cut-offδct時，則判斷為陰性；|δct|小于cut-offδct時，則判斷為突變陽性。如下表4所示。表4實驗結(jié)果判斷表(四)檢測結(jié)果分析1.熒光值分析(1)本底熒光值在300-700之間，具有較低的熒光本底。結(jié)果見圖2。圖2主要是對所有的樣品(包括陰性參考品、陽性參考品、最低檢測限參考品、重復性參考品)的熒光本底截圖，是對熒光本底進行分析，熒光本底較低，說明熒光淬滅效果佳。(2)能夠達到3-4.5倍的擴增效率，具有較高的信噪比，見圖3。圖3主要是對陽性對照品擴增效率進行分析，由圖可知擴增的倍率有達到3-4.5倍，說明該方法擴增效率高，信噪比高。(3)擴增陰性參考品時，無擴增曲線，具有良好的特異性。2.實驗數(shù)據(jù)分析(1)檢測陰性參考品，結(jié)果均為陰性。結(jié)果見圖4。只有brca1外控反應管有擴增曲線，突變反應孔均無擴增曲線。(2)檢測陽性參考品，結(jié)果均為陽性，結(jié)果見圖5。每個反應孔的每個通道均有擴增曲線。(3)檢測最低檢測參考品，結(jié)果全為陽性，無假陰性。結(jié)果見圖6。(4)重復檢測重復性參考品10次，結(jié)果全為陽性且變異系數(shù)(cv)均小于5％，滿足實驗設計要求。結(jié)果見圖7和表5。從表5可以看出，檢測重復性參考品10次，結(jié)果全為陽性且變異系數(shù)(cv)均小于5％。表5試驗結(jié)果表綜上說明，本發(fā)明的線型蝎子引物(lsp)檢測的特異性好，靈敏度高，相近基因型間互不干擾，檢測結(jié)果具有更高的熒光信噪比。盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領域的普通技術人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。序列表<110>廈門安普利生物工程有限公司<120>用于檢測人類brca1基因突變的lsp引物及試劑盒<130>apls17001i<160>54<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>dna<213>人工合成<400>1ctcttcgcgttgaagaagt19<210>2<211>24<212>dna<213>人工合成<400>2ggaacagaaagaaatggatttctt24<210>3<211>21<212>dna<213>人工合成<400>3gctgacttaccagatgggaca21<210>4<211>23<212>dna<213>人工合成<400>4cgttgaagaagtacaaaatgtca23<210>5<211>24<212>dna<213>人工合成<400>5aagaaatggatttatctgctcgtt24<210>6<211>21<212>dna<213>人工合成<400>6ccaaattaaccagatgggaca21<210>7<211>23<212>dna<213>人工合成<400>7caaaatgtcattaatgctatgca23<210>8<211>20<212>dna<213>人工合成<400>8atctgctcttcgcgttgtaa20<210>9<211>21<212>dna<213>人工合成<400>9gctgacttaccagatgggaca21<210>10<211>20<212>dna<213>人工合成<400>10tcccatctggtaagtcagca20<210>11<211>23<212>dna<213>人工合成<400>11gtacaaaatgtcattaatgcgac23<210>12<211>22<212>dna<213>人工合成<400>12ggtcaattctgttcatttgctc22<210>13<211>20<212>dna<213>人工合成<400>13tcccatctggtaagtcagca20<210>14<211>24<212>dna<213>人工合成<400>14agtacaaaatgtcattaatgcgac24<210>15<211>22<212>dna<213>人工合成<400>15ggtcaattctgttcatttgcat22<210>16<211>19<212>dna<213>人工合成<400>16aatctcaccccaccactct19<210>17<211>23<212>dna<213>人工合成<400>17gtttggtttctttcaggtaaagc23<210>18<211>19<212>dna<213>人工合成<400>18ctgcaaaggggagtggaat19<210>19<211>20<212>dna<213>人工合成<400>19tggtcaatggaagaaaccac20<210>20<211>20<212>dna<213>人工合成<400>20ccaggacagaaagcatgatt20<210>21<211>20<212>dna<213>人工合成<400>21gattctcttgctcgctttgg20<210>22<211>20<212>dna<213>人工合成<400>22tggtcaatggaagaaaccac20<210>23<211>24<212>dna<213>人工合成<400>23ttggtttctttcagcatgattgta24<210>24<211>20<212>dna<213>人工合成<400>24gattctcttgctcgctttgg20<210>25<211>20<212>dna<213>人工合成<400>25tggtcaatggaagaaaccac20<210>26<211>21<212>dna<213>人工合成<400>26gcatgattttgaagtcagcga21<210>27<211>20<212>dna<213>人工合成<400>27gattctcttgctcgctttgg20<210>28<211>20<212>dna<213>人工合成<400>28tggtcaatggaagaaaccac20<210>29<211>20<212>dna<213>人工合成<400>29gattttgaagtcagaggcgg20<210>30<211>20<212>dna<213>人工合成<400>30gattctcttgctcgctttgg20<210>31<211>19<212>dna<213>人工合成<400>31caaagcgagcaagagaatc19<210>32<211>20<212>dna<213>人工合成<400>32tgtggtcaatggaagaacca20<210>33<211>20<212>dna<213>人工合成<400>33cagagtggtggggtgagatt20<210>34<211>19<212>dna<213>人工合成<400>34aatcccaggacagaaaggt19<210>35<211>19<212>dna<213>人工合成<400>35aaccaccaaggtccaaacg19<210>36<211>20<212>dna<213>人工合成<400>36cagagtggtggggtgagatt20<210>37<211>18<212>dna<213>人工合成<400>37ctggcatcgtgatggact18<210>38<211>20<212>dna<213>人工合成<400>38gctatccctgtacgcctctg20<210>39<211>20<212>dna<213>人工合成<400>39agggcatacccctcgtagat20<210>40<211>18<212>dna<213>人工合成<400>40ctggcatcgtgatggact18<210>41<211>20<212>dna<213>人工合成<400>41gctatccctgtacgcctctg20<210>42<211>20<212>dna<213>人工合成<400>42agggcatacccctcgtagat20<210>43<211>300<212>dna<213>人工合成<400>43gtattattctaaaaccttccaaatcttaaatttactttattttaaaatgataaaatgaag60ttgtcattttataaaccttttaaaaagatatatatatatgtttttctaatgtgttaaagt120tcattggaacagaaagaaatggatttatttgctcttcgcgttgaagaagtacaaaatgtc180attaatgctatgcagaaaatcttagagtgtcccatctggtaagtcagcacaagagtgtat240taatttgggattcctatgattatctcctatgcaaatgaacagaattgaccttacatacta300<210>44<211>300<212>dna<213>人工合成<400>44gtattattctaaaaccttccaaatcttaaatttactttattttaaaatgataaaatgaag60ttgtcattttataaaccttttaaaaagatatatatatatgtttttctaatgtgttaaagt120tcattggaacagaaagaaatggatttatctgctctttgcgttgaagaagtacaaaatgtc180attaatgctatgcagaaaatcttagagtgtcccatctggtaagtcagcacaagagtgtat240taatttgggattcctatgattatctcctatgcaaatgaacagaattgaccttacatacta300<210>45<211>300<212>dna<213>人工合成<400>45gtattattctaaaaccttccaaatcttaaatttactttattttaaaatgataaaatgaag60ttgtcattttataaaccttttaaaaagatatatatatatgtttttctaatgtgttaaagt120tcattggaacagaaagaaatggatttatctgctcttcgcgttgaaaaagtacaaaatgtc180attaatgctatgcagaaaatcttagagtgtcccatctggtaagtcagcacaagagtgtat240taatttgggattcctatgattatctcctatgcaaatgaacagaattgaccttacatacta300<210>46<211>300<212>dna<213>人工合成<400>46gtattattctaaaaccttccaaatcttaaatttactttattttaaaatgataaaatgaag60ttgtcattttataaaccttttaaaaagatatatatatatgtttttctaatgtgttaaagt120tcattggaacagaaagaaatggatttatctgctcttcgcgttgaagaagtacaaaatgtc180attaatgctacgcagaaaatcttagagtgtcccatctggtaagtcagcacaagagtgtat240taatttgggattcctatgattatctcctatgcaaatgaacagaattgaccttacatacta300<210>47<211>360<212>dna<213>人工合成<400>47gtattattctaaaaccttccaaatcttaaatttactttattttaaaatgataaaatgaag60ttgtcattttataaaccttttaaaaagatatatatatatgtttttctaatgtgttaaagt120tcattggaacagaaagaaatggatttatctgctcttcgcgttgaagaagtacaaaatgtc180attaatgctatgcagaaaatcttagagcgtcccatctggtaagtcagcacaagagtgtat240taatttgggattcctatgattatctcctatgcaaatgaacagaattgaccttacatacta300gggaagaaaagacatgtctagtaagattaggctattgtaattgctgatttccttaactga360<210>48<211>276<212>dna<213>人工合成<400>48ctcccaaagtgctaggattacaggggtgagccactgcgcctggcctgaatgccttaaata60tgacgtgtctgctccacttccattgaaggaagcttctctttctcttatcctgatgggttg120tgtttggtttctttcaggtaaagctccctccctcaagttgacaaaaatctcaccccacca180ctctgtattccactcccctttgcagagatgggccgcttcattttgtaagacttattacat240acatacacagtgctagatactttcacacaggttctt276<210>49<211>444<212>dna<213>人工合成<400>49ctcccaaagtgctaggattacaggggtgagccactgcgcctggcctgaatgccttaaata60tgacgtgtctgctccacttccattgaaggaagcttctctttctcttatcctgatgggttg120tgtttggtttctttcagcatgattttgaagtcagaggagatgtggtcaatggaagaaacc180accaaggtccaaagcgagcaagagaatcccaggacagaaagcatgattttgaagtcagag240gagatgtggtcaatggaagaaaccaccaaggtccaaagcgagcaagagaatcccaggaca300gaaaggtaaagctccctccctcaagttgacaaaaatctcaccccaccactctgtattcca360ctcccctttgcagagatgggccgcttcattttgtaagacttattacatacatacacagtg420ctagatactttcacacaggttctt444<210>50<211>300<212>dna<213>人工合成<400>50ctcccaaagtgctaggattacaggggtgagccactgcgcctggcctgaatgccttaaata60tgacgtgtctgctccacttccattgaaggaagcttctctttctcttatcctgatgggttg120tgtttggtttctttcagcatgattttaaagtcagaggagatgtggtcaatggaagaaacc180accaaggtccaaagcgagcaagagaatcccaggacagaaaggtaaagctccctccctcaa240gttgacaaaaatctcaccccaccactctgtattccactcccctttgcagagatgggccgc300<210>51<211>299<212>dna<213>人工合成<400>51ctcccaaagtgctaggattacaggggtgagccactgcgcctggcctgaatgccttaaata60tgacgtgtctgctccacttccattgaaggaagcttctctttctcttatcctgatgggttg120tgtttggtttctttcagcatgattttgaagtcagagaagatgtggtcaatggaagaaacc180accaaggtccaaagcgagcaagagaatcccggacagaaaggtaaagctccctccctcaag240ttgacaaaaatctcaccccaccactctgtattccactcccctttgcagagatgggccgc299<210>52<211>300<212>dna<213>人工合成<400>52ctcccaaagtgctaggattacaggggtgagccactgcgcctggcctgaatgccttaaata60tgacgtgtctgctccacttccattgaaggaagcttctctttctcttatcctgatgggttg120tgtttggtttctttcagcatgattttgaagtcagaggaggtgtggtcaatggaagaaacc180accaaggtccaaagcgagcaagagaatcccaggacagaaaggtaaagctccctccctcaa240gttgacaaaaatctcaccccaccactctgtattccactcccctttgcagagatgggccgc300<210>53<211>300<212>dna<213>人工合成<400>53ctcccaaagtgctaggattacaggggtgagccactgcgcctggcctgaatgccttaaata60tgacgtgtctgctccacttccattgaaggaagcttctctttctcttatcctgatgggttg120tgtttggtttctttcagcatgattttgaagtcagaggagatgtggtcaatggaaga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