本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中與不同惡性程度肝癌相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前原發(fā)性肝癌診斷存在如下問(wèn)題：

(1)臨床早期診斷率低

85％患者診斷時(shí)已到晚期：目前主要的臨床診斷手段包括影像檢查、血清甲胎蛋白(afp)檢測(cè)、血液酶學(xué)檢查和腫瘤組織活檢。影像檢查技術(shù)和手段中，超聲檢查可顯示直徑為2cm以上的腫瘤，但需重復(fù)、動(dòng)態(tài)檢查并結(jié)合其他指標(biāo)進(jìn)行診斷。計(jì)算機(jī)斷層掃描(ct)在原發(fā)性肝癌的診斷中最為普遍，可顯示2cm的腫瘤，陽(yáng)性率在90％以上。但是對(duì)占位性病變性質(zhì)難以確定，對(duì)于直徑小于1厘米的腫瘤難以發(fā)現(xiàn)，正電子發(fā)射體層顯像(pet)可顯示肝癌組織的代謝情況，但是診斷的敏感性僅有50％左右。磁共振成像(mri)具有很高的組織分辨率和多參數(shù)、多方位成像等特點(diǎn)，而且無(wú)輻射影響，但是其空間分辨率不及ct，且費(fèi)用昂貴，不能普遍應(yīng)用于普查。由此可見(jiàn)，影像學(xué)方法只能檢測(cè)前臨床診斷期和臨床癥狀期的癌腫，即當(dāng)癌腫小于0.5cm時(shí)因癌腫相關(guān)血管尚未形成無(wú)法在影像學(xué)上發(fā)現(xiàn)。血液酶學(xué)方面，afp是目前臨床上診斷hcc最常用的血清腫瘤標(biāo)記物，其診斷hcc的敏感性和特異性分別為41％～65％和80％～94％。但在部分良性肝病、生殖系統(tǒng)和胃腸道的一些惡性腫瘤中afp也有升高，且在一部分hcc中afp水平長(zhǎng)期保持低水平(<20ng/ml)，其較高的假陽(yáng)性及假陰性嚴(yán)重影響了afp診斷hcc的準(zhǔn)確性。因此，血清afp檢測(cè)因自身的局限性無(wú)法在原發(fā)性肝癌早期做出正確的診斷，仍需在影像學(xué)的配合下，在前臨床診斷期和臨床癥狀期協(xié)助診斷。綜上所述，目前臨床上原發(fā)性肝癌的主要診斷手段均為針對(duì)臨床癥狀期，尚無(wú)真正意義的早期診斷方法。

(2)慢性乙型肝炎患者在疾病進(jìn)展中,缺乏肝癌早期預(yù)警指標(biāo)

由于肝癌早期診斷率較低，臨床尚無(wú)針對(duì)腫瘤早期的診斷方法。在兒童時(shí)期感染乙型肝炎病毒的成人中，約25％會(huì)因慢性感染死于肝硬化或肝癌，因此在慢性乙型肝炎治療和隨訪中，引入肝癌預(yù)警體系對(duì)高危人群進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)測(cè)，擬補(bǔ)影像學(xué)和酶學(xué)診斷指標(biāo)不靈敏的不足，對(duì)于肝癌早期診斷非常的必要。

(3)肝癌治療后復(fù)發(fā)的預(yù)警

目前肝癌的治療方法包括手術(shù)和非手術(shù)治療。早期肝癌多采用手術(shù)切除，肝移植，無(wú)水酒精消融(percutaneousethanolinjection，pei)和射頻消融(radiofrequencyablation,rfa)等治療方法；中期肝癌多采用經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈內(nèi)化療栓塞術(shù)(transarterialchemoembolization，tace)，tace+fra，經(jīng)導(dǎo)管放射性栓塞(transarterialradioembolization，tare)；晚期肝癌采用常規(guī)全身系統(tǒng)性化療或分子靶向治療藥物索拉非尼治療。大量臨床資料顯示，直徑≤5cm的小hcc治療效果明顯優(yōu)于直徑>5cm的大hcc，而直徑≤2cm的微小hcc療效更佳。但是，因?yàn)橥ǔＧ闆r下，70％～80％的原發(fā)性肝癌病人發(fā)現(xiàn)時(shí)已到晚期，失去了根治性手術(shù)機(jī)會(huì)，而且即使手術(shù)切除肝癌，5年后腫瘤復(fù)發(fā)率仍超過(guò)70％。可見(jiàn)，肝癌治療后易于復(fù)發(fā)，因此，原發(fā)性肝癌需要早期診斷，但也需要針對(duì)治療后復(fù)發(fā)的預(yù)警指標(biāo)。

干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白3(ifitm3，也被稱(chēng)為1-8u)的基因最初確定于1984年，系從inf治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤篩選cdna過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，其克隆來(lái)源于人淋巴細(xì)胞的cdna文庫(kù)。ifitm3可在大多數(shù)組織中翻譯表達(dá)，并高度誘導(dǎo)干擾素表達(dá)。以往的研究表明ifitm3屬于鼠基因家族，其較短，含有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白(5-18kda)，具有較高的核心序列相似性，但n和c-末端存在進(jìn)化差異。人類(lèi)的同源基因(ifitm1，ifitm2，和ifitm3)均聚集在11號(hào)染色體上一個(gè)18-kb的基因組序列內(nèi)，并介導(dǎo)細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程，包括細(xì)胞粘附，免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)，生殖細(xì)胞歸巢和成熟。

干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3(ifitm3)是一種具有廣譜抗囊膜病毒活性的蛋白，ifitm3是由i型或ii型干擾素(ifn)誘導(dǎo)產(chǎn)生的，它可以通過(guò)抑制流感病毒和其他包膜病毒進(jìn)入細(xì)胞而限制病毒復(fù)制，缺失ifitm3基因后，ifn的抗病毒作用會(huì)明顯變?nèi)?。rs12252位于干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3基因中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何篩查不同惡性程度肝癌患者。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了下述1-6中任一用途：

1、檢測(cè)人基因組中rs12252的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備篩查或輔助篩查不同惡性程度肝癌患者產(chǎn)品中的應(yīng)用；

2、檢測(cè)人基因組中rs12252的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)不同惡性程度肝癌易感性產(chǎn)品中的應(yīng)用；

3、檢測(cè)人基因組中rs12252的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)與不同惡性程度肝癌相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

4、檢測(cè)人基因組中rs12252的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備鑒定或輔助鑒定與不同惡性程度肝癌相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

5、人基因組中rs12252的多態(tài)性或基因型在制備篩查或輔助篩查不同惡性程度肝癌患者產(chǎn)品中的應(yīng)用；

6、人基因組中rs12252的多態(tài)性或基因型在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)不同惡性程度肝癌易感性產(chǎn)品中的應(yīng)用。

rs12252是人染色體11p5.5上的一個(gè)二等位多態(tài)性的snp位點(diǎn)，該變異是轉(zhuǎn)換(t/c，在其互補(bǔ)鏈上則為a/g)。rs12252基因型是cc、ct或tt。其中，cc是rs12252位點(diǎn)為c的純合型，tt是rs12252位點(diǎn)為t的純合型，ct是rs12252位點(diǎn)為t和c的雜合型。所述檢測(cè)人基因組中rs12252的多態(tài)性或基因型具體可通過(guò)檢測(cè)rs12252的核苷酸種類(lèi)確定。

上述用途中，所述不同惡性程度肝癌具體可體現(xiàn)在肝癌細(xì)胞的分化程度(高分化、中分化和低分化)上，肝癌細(xì)胞的分化程度越高，肝癌惡性程度越小。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述不同惡性程度肝癌為高分化肝細(xì)胞性肝癌、中分化肝細(xì)胞性肝癌和低分化肝細(xì)胞性肝癌，其中不同惡性程度肝癌按照惡性程度從高到低依次為高分化肝細(xì)胞性肝癌、中分化肝細(xì)胞性肝癌和低分化肝細(xì)胞性肝癌。

上述用途中，所述人可為肝癌患者。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了含有檢測(cè)或輔助檢測(cè)人基因組中rs12252的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)的產(chǎn)品。

本發(fā)明所提供的含有檢測(cè)或輔助檢測(cè)人基因組中rs12252的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)的產(chǎn)品，為a)-d)中的任一種產(chǎn)品：

a)檢測(cè)或輔助檢測(cè)與不同惡性程度肝癌相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性或基因型的產(chǎn)品；

b)鑒定或輔助鑒定與不同惡性程度肝癌相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性或基因型的產(chǎn)品；

c)篩查或輔助篩查不同惡性程度肝癌患者產(chǎn)品；

d)檢測(cè)或輔助檢測(cè)不同惡性程度肝癌易感性產(chǎn)品。

上述產(chǎn)品中，所述不同惡性程度肝癌具體可體現(xiàn)在肝癌細(xì)胞的分化程度(高分化、低分化和低分化)上，肝癌細(xì)胞的分化程度越高，肝癌惡性程度越小。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述不同惡性程度肝癌為高分化肝細(xì)胞性肝癌、中分化肝細(xì)胞性肝癌和低分化肝細(xì)胞性肝癌，其中不同惡性程度肝癌按照惡性程度從高到低依次為高分化肝細(xì)胞性肝癌、中分化肝細(xì)胞性肝癌和低分化肝細(xì)胞性肝癌。高分化肝細(xì)胞性肝癌的表現(xiàn)為腫瘤直徑<2cm，與正常細(xì)胞相比核漿比例增大，但異型性不明顯；中分化肝細(xì)胞性肝癌表現(xiàn)為腫瘤直徑大于3cm，癌細(xì)胞胞漿豐富、嗜酸性、核圓形，核仁清楚；低分化肝細(xì)胞性肝癌表現(xiàn)為與正常肝組織相比血竇樣腔隙減少，癌細(xì)胞核漿比例明顯增大，異型性明顯。異型性是指腫瘤組織在細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)上，與其發(fā)源的正常組織的不同程度的差異。

上述產(chǎn)品中，所述人可為肝癌患者。

本發(fā)明中，所述檢測(cè)人基因組中rs12252的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)可包括擴(kuò)增包括rs12252在內(nèi)的基因組dna片段的pcr引物對(duì)/或限制性內(nèi)切酶msci。所述檢測(cè)人基因組中rs12252的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)也可僅為擴(kuò)增包括rs12252在內(nèi)的基因組dna片段的pcr引物對(duì)和/或限制性內(nèi)切酶msci。

本發(fā)明中，所述pcr引物對(duì)可為序列表中seqidno.1所示的單鏈dna和序列表中seqidno.2所示的單鏈dna。

本發(fā)明中，所述cc和所述ct基因型的個(gè)體在惡性程度高的肝癌患者群體中的比例分別高于對(duì)應(yīng)的基因型在惡性程度低的肝癌患者群體中的比例；所述tt基因型的個(gè)體在惡性程度高的肝癌患者群體中的比例低于對(duì)應(yīng)的基因型在惡性程度低的肝癌患者群體中的比例。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，cc基因型的肝癌患者具有以下規(guī)律：在中分化肝細(xì)胞性肝癌群體中的比例高于在高分化肝細(xì)胞性肝癌群體中的比例，在低分化肝細(xì)胞性肝癌群體中的比例高于在所述高分化肝細(xì)胞性肝癌群體中的比例，在所述低分化肝細(xì)胞性肝癌組中的百分比高于在所述中分化肝細(xì)胞性肝癌組中的百分比。

ct基因型的肝癌患者具有以下規(guī)律：在所述中分化肝細(xì)胞性肝癌群體中的比例低于在所述高分化肝細(xì)胞性肝癌群體中的比例，在所述低分化肝細(xì)胞性肝癌群體中的比例低于在所述高分化肝細(xì)胞性肝癌群體中的比例。

tt基因型的肝癌患者具有以下規(guī)律：在所述低分化肝細(xì)胞性肝癌群體中的比例低于在所述高分化肝細(xì)胞性肝癌群體中的比例，在所述低分化肝細(xì)胞性肝癌群體中的比例低于在所述中分化肝細(xì)胞性肝癌群體中的比例，在所述中分化肝細(xì)胞性肝癌組中的百分比低于在所述高分化肝細(xì)胞性肝癌組中的百分比。

實(shí)驗(yàn)證明，rs12252的c等位在惡性程度高的肝癌患者群體中的比例高于該等位在惡性程度低的肝癌患者群體中的比例，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明rs12252的c等位為惡性程度高的肝癌的風(fēng)險(xiǎn)等位。rs12252的三個(gè)基因型中，cc和ct基因型的個(gè)體在惡性程度高的肝癌患者群體中的比例分別高于對(duì)應(yīng)的基因型在惡性程度低的肝癌患者群體中的比例；tt基因型的個(gè)體在惡性程度高的肝癌患者群體中的比例低于對(duì)應(yīng)的基因型在惡性程度低的肝癌患者群體中的比例。與攜帶tt和ct基因型的肝癌患者相比，攜帶cc基因型的肝癌患者肝癌為中分化肝細(xì)胞性肝癌的風(fēng)險(xiǎn)增加，or值為3.910(95％ci＝1.231-12.413；p＝0.011)。與攜帶tt和ct基因型的肝癌患者相比，攜帶cc基因型的肝癌患者肝癌為低分化肝細(xì)胞性肝癌的風(fēng)險(xiǎn)增加，or值為5.542,[(95％ci＝1.697-18.095；p＝0.002]。說(shuō)明rs12252多態(tài)性位點(diǎn)與肝癌的惡性程度顯著關(guān)聯(lián)。

在實(shí)際應(yīng)用中，可將檢測(cè)rs12252的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)與其它物質(zhì)(如檢測(cè)其它的與不同惡性程度肝癌相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性或基因型的物質(zhì))聯(lián)合在一起制備篩查或輔助篩查不同惡性程度肝癌患者的產(chǎn)品。

其中，檢測(cè)人基因組中rs12252的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)可為通過(guò)下述至少一種方法確定rs12252的多態(tài)性或基因型所需的試劑和/或儀器：dna測(cè)序、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、變性高效液相色譜、snp芯片、taqman探針技術(shù)和sequenommassarray技術(shù)。其中，利用sequenommassarray技術(shù)確定rs12252的多態(tài)性或基因型所需的試劑和/或儀器包括pcr引物對(duì)、基于單堿基延伸反應(yīng)的延伸引物、磷酸酶(如蝦堿性磷酸酶(shrimpalkalinephosphatase，sap))、樹(shù)脂、芯片、maldi-tof(matrix-assistedlaserdesorption/ionization–timeoffligh，基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜)以及sequenommassarray技術(shù)所需要的其他試劑和儀器；利用限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性確定rs12252的多態(tài)性或基因型所需的試劑和/或儀器包括pcr引物對(duì)和限制性內(nèi)切酶；snp芯片包括基于核酸雜交反應(yīng)的芯片、基于單堿基延伸反應(yīng)的芯片、基于等位基因特異性引物延伸反應(yīng)的芯片、基于“一步法”反應(yīng)的芯片、基于引物連接反應(yīng)的芯片、基于限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的芯片、基于蛋白dna結(jié)合反應(yīng)的芯片，及基于熒光分子dna結(jié)合反應(yīng)的芯片。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，采用限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性確定rs12252的多態(tài)性和基因型。所述pcr引物對(duì)在序列上沒(méi)有特殊要求，只要能擴(kuò)增出包括rs12252在內(nèi)的基因組dna片段即可，具體可為序列表中seqidno.1和seqidno.2所示的單鏈dna。所述限制性內(nèi)切酶具體可為msci。

本發(fā)明在不同惡性程度肝癌患者群體中發(fā)現(xiàn)rs12252是與不同惡性程度肝癌相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性?？蓪z測(cè)rs12252的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)與其它物質(zhì)(如檢測(cè)其它的與不同惡性程度肝癌相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性或基因型的物質(zhì))聯(lián)合在一起制備篩查不同惡性程度肝癌患者的產(chǎn)品。

附圖說(shuō)明

圖1為使用msci限制性內(nèi)切酶對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切的電泳圖譜；其中，m:為dna分子量標(biāo)準(zhǔn)(50bpladder)；樣品1-1、1-2和1-3為ct基因型酶切產(chǎn)物；樣品2-1、2-2和2-3為cc基因型酶切產(chǎn)物；樣品3-1、3-2和3-3為tt基因型酶切產(chǎn)物。

圖2為不同惡性程度肝癌患者群體中cc、ct和tt基因型個(gè)體的比例。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、ifitm3rs12252是與肝癌惡性程度、復(fù)發(fā)可能性以及肝癌腫瘤生長(zhǎng)速度相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)

rs12252是人染色體11p5.5上的一個(gè)二等位多態(tài)性的snp位點(diǎn)，該變異是轉(zhuǎn)換(t/c，在其互補(bǔ)鏈上則為a/g)，該位點(diǎn)位于ifitm3基因中。rs12252基因型是cc、ct或tt。其中，cc是rs12252位點(diǎn)為c的純合型，tt是rs12252位點(diǎn)為t的純合型，ct是rs12252位點(diǎn)為t和c的雜合型。

一、肝癌患者的入選標(biāo)準(zhǔn)

156例肝癌患者，其中男性患者為137例，女性患者為19例，所有患者的平均年齡為50.89±9.13，所有患者均來(lái)自中國(guó)大陸，且無(wú)血緣關(guān)系。所有患者均符合衛(wèi)生部組織專(zhuān)家指定的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版)》標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)影像學(xué)b超、ct、mri、肝穿及手術(shù)病理檢查證實(shí)確診為肝癌患者。

二、rs12252位點(diǎn)的基因分型

(1)擴(kuò)增含snp位點(diǎn)的核苷酸片段

根據(jù)rs12252的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，正向引物f：5’-gaaaaggaaactgttgagaaccgaa-3’(seqidno.1)，反向引物r：5’-gagcctcctcctaaacctgcac-3’(seqidno.2)，擴(kuò)增出待測(cè)snp所在的核苷酸片段，pcr產(chǎn)物為序列表中seqidno.3。rs12252位點(diǎn)位于seqidno.3的140bp處，該處核苷酸為c或t，當(dāng)該處核苷酸為t時(shí)，可被msci內(nèi)切酶(識(shí)別序列為tgg^cca)識(shí)別。

其中，pcr反應(yīng)體系以50μl計(jì)為：150-200ng/μl人基因組dna1μl，10μm引物f和r各2μl，premixtaqhs25μl，余量為ddh2o；其中，premixtaqhs為takara公司(貨號(hào)：dr028a)產(chǎn)品。使用premixtaqhotstartversion(takara公司)。

pcr反應(yīng)條件為：95℃10分鐘；95℃60秒，55℃30秒，72℃30秒，35個(gè)循環(huán)；72℃5分鐘。

(2)針對(duì)第142位核苷酸的不同選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶進(jìn)行pcr-rflp

該pcr產(chǎn)物用msci內(nèi)切酶酶切，反應(yīng)體系以20μl計(jì)為：pcr擴(kuò)增產(chǎn)物10μl，快速消化msci酶(fastdigestmsci，fermentas公司)1μl，10×fastdigestgreen緩沖液2μl，無(wú)核酸酶的ddh2o17μl。反應(yīng)條件為：37℃水浴，酶切30min。

然后，將得到的酶切產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

制膠：用蒸餾水將與膠接觸的器皿洗干凈，室溫自然晾干，將含有g(shù)oldenview的2％瓊脂糖凝膠倒入模板中，插入13個(gè)孔的梳子，待膠自然聚合后，拔出梳子，則制得含有13個(gè)孔的2％的瓊脂糖凝膠。

電泳：向15μl酶切產(chǎn)物中加入6×上樣緩沖液3μl，上樣檢測(cè)，100v恒壓，電泳2小時(shí)。

根據(jù)pcr-rflp的結(jié)果確定該位點(diǎn)在檢測(cè)群體中的基因型。當(dāng)pcr產(chǎn)物的140bp處核苷酸均為c時(shí)，msci內(nèi)切酶不可識(shí)別該位點(diǎn)，即pcr產(chǎn)物不能被切開(kāi)，凝膠中只有一條帶，長(zhǎng)度為562bp，該基因型記為cc型；當(dāng)140bp處的核苷酸均為t時(shí)，即可將pcr擴(kuò)增片段切成兩個(gè)片段，一個(gè)為420bp，另一個(gè)片段為142bp，該基因型記為tt型；當(dāng)140bp處既含有c又含有t時(shí)，即凝膠電泳中含有三條帶，長(zhǎng)度分別約為562bp、420bp和142bp，該基因型記為雜合型ct型。(圖1)

這156例肝癌患者中，cc基因型的患者為44例，ct基因型的患者為84例，tt基因型的患者為28例。

三、rs12252位點(diǎn)的基因型與肝癌惡性程度的關(guān)系

對(duì)這156例肝癌患者按照肝癌的不同惡性程度進(jìn)行分組，分為高分化肝細(xì)胞性肝癌組、中分化肝細(xì)胞性肝癌組和低分化肝細(xì)胞性肝癌組。肝癌患者歸為高分化肝細(xì)胞性肝癌組的標(biāo)準(zhǔn)為腫瘤直徑<2cm，與正常細(xì)胞相比核漿比例增大，但異型性不明顯。肝癌患者歸為中分化肝細(xì)胞性肝癌組的標(biāo)準(zhǔn)為腫瘤直徑大于3cm，癌細(xì)胞胞漿豐富、嗜酸性、核圓形，核仁清楚。肝癌患者歸為低分化肝細(xì)胞性肝癌組的標(biāo)準(zhǔn)為與正常肝組織相比血竇樣腔隙減少，癌細(xì)胞核漿比例明顯增大，異型性明顯。其中，異型性是指腫瘤組織在細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)上，與其發(fā)源的正常組織的不同程度的差異。各組中各基因型的患者數(shù)及百分比如表1與圖2所示。

表1、各組中各基因型的患者數(shù)及百分比

結(jié)果顯示，高分化肝細(xì)胞性肝癌組中c等位的頻率為41.03％，t等位的頻率為58.97％；中分化肝細(xì)胞性肝癌組中c等位的頻率為56.62％，t等位的頻率為43.38％；低分化肝細(xì)胞性肝癌組中c等位的頻率為64.29％，t等位的頻率為35.71％。c等位在中分化肝細(xì)胞性肝癌組中的頻率比在高分化肝細(xì)胞性肝癌組中的頻率高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＝0.028)，c等位在低分化肝細(xì)胞性肝癌組中的頻率比在高分化肝細(xì)胞性肝癌組中的頻率高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＝0.002)，c等位在低分化肝細(xì)胞性肝癌組中的頻率比在中分化肝細(xì)胞性肝癌組中的頻率高(p＝0.238)，表明rs12252位點(diǎn)的c等位為惡性程度高的肝癌的風(fēng)險(xiǎn)等位。

rs12252位點(diǎn)的三個(gè)基因型中，不同的組別中cc基因型的肝癌患者具有以下規(guī)律：在中分化肝細(xì)胞性肝癌組中的百分比高于在高分化肝細(xì)胞性肝癌組中的百分比，在低分化肝細(xì)胞性肝癌組中的百分比高于在高分化肝細(xì)胞性肝癌組中的百分比，在低分化肝細(xì)胞性肝癌組中的百分比高于在中分化肝細(xì)胞性肝癌組中的百分比。

不同的組別中ct基因型的肝癌患者具有以下規(guī)律：在中分化肝細(xì)胞性肝癌組中的百分比低于在高分化肝細(xì)胞性肝癌組中的百分比，在低分化肝細(xì)胞性肝癌組中的百分比低于在高分化肝細(xì)胞性肝癌組中的百分比。

不同的組別中tt基因型的肝癌患者具有以下規(guī)律：在低分化肝細(xì)胞性肝癌組中的百分比低于在高分化肝細(xì)胞性肝癌組中的百分比，在低分化肝細(xì)胞性肝癌組中的百分比低于在中分化肝細(xì)胞性肝癌組中的百分比，在中分化肝細(xì)胞性肝癌組中的百分比低于在高分化肝細(xì)胞性肝癌組中的百分比。

與攜帶tt和ct基因型的肝癌患者相比，攜帶cc基因型的肝癌患者肝癌為中分化肝細(xì)胞性肝癌的風(fēng)險(xiǎn)增加，or值為3.910(95％ci＝1.231-12.413；p＝0.011)。與攜帶tt和ct基因型的肝癌患者相比，攜帶cc基因型的肝癌患者肝癌為低分化肝細(xì)胞性肝癌的風(fēng)險(xiǎn)增加，or值為5.542,[(95％ci＝1.697-18.095；p＝0.002]。

結(jié)果表明，rs12252多態(tài)性位點(diǎn)與肝癌的惡性程度顯著關(guān)聯(lián)，可以利用rs12252位點(diǎn)篩查惡性程度高的肝癌患者。

四、rs12252位點(diǎn)的基因型與肝癌腫瘤生長(zhǎng)速度的關(guān)系

對(duì)這156例肝癌患者按照肝癌腫瘤生長(zhǎng)速度進(jìn)行分組，分為高生長(zhǎng)速度肝癌組和低生長(zhǎng)速度肝癌組，肝癌患者歸為高生長(zhǎng)速度肝癌組的標(biāo)準(zhǔn)為慢性乙型肝炎不經(jīng)過(guò)肝硬化直接發(fā)展為肝癌，在b超和ct確診為肝癌時(shí)腫瘤體積大于10cm³，伴有癌栓，肝癌患者歸為低生長(zhǎng)速度肝癌組的標(biāo)準(zhǔn)為慢性乙型肝炎經(jīng)過(guò)肝硬化發(fā)展為肝癌，在b超和ct確診為肝癌時(shí)腫瘤體積小于10cm³，不伴有癌栓。各組中各基因型的患者數(shù)及百分比如表2所示。

表2、各組中各基因型的患者數(shù)及百分比

結(jié)果顯示，高生長(zhǎng)速度肝癌組中c等位的頻率為63.53％，t等位的頻率為36.47％；低生長(zhǎng)速度肝癌組中c等位的頻率為45.07％，t等位的頻率為54.93％。c等位在高生長(zhǎng)速度肝癌組中的頻率比在低生長(zhǎng)速度肝癌組中的頻率高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.001)，表明rs12252位點(diǎn)的c等位為高肝癌腫瘤生長(zhǎng)速度的風(fēng)險(xiǎn)等位。

rs12252位點(diǎn)的三個(gè)基因型中，cc基因型的個(gè)體在高生長(zhǎng)速度肝癌組中的比例高于對(duì)應(yīng)基因型在低生長(zhǎng)速度肝癌組中的比例，tt和ct基因型的個(gè)體在高生長(zhǎng)速度肝癌組中的比例分別低于對(duì)應(yīng)基因型在低生長(zhǎng)速度肝癌組中的比例。與攜帶tt和ct基因型的個(gè)體相比，攜帶cc基因型的肝癌患者的腫瘤是高生長(zhǎng)速度腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加，or值為4.067[95％置信區(qū)間(95％ci)＝1.833-9.025；p<0.001]。

結(jié)果表明，rs12252多態(tài)性位點(diǎn)與肝癌腫瘤的生長(zhǎng)速度顯著關(guān)聯(lián)，可以利用rs12252位點(diǎn)篩查腫瘤的生長(zhǎng)速度快的肝癌患者。

五、rs12252位點(diǎn)的基因型與肝癌復(fù)發(fā)可能性的關(guān)系

在這156例肝癌患者中選出同處于病理低分化期(腫瘤直徑<2cm，核漿比例增大，但異型性不大)的肝癌患者，共54例，對(duì)選出的這54例肝癌患者均按照如下任一方法進(jìn)行治療：介入術(shù)、肝癌切除術(shù)和肝移植術(shù)。按照rs12252位點(diǎn)的基因型這54例肝癌患者進(jìn)行分組，分為高肝癌復(fù)發(fā)可能性組和低肝癌復(fù)發(fā)可能性組，肝癌患者歸為高肝癌復(fù)發(fā)可能性組的標(biāo)準(zhǔn)為治療12個(gè)月以內(nèi)復(fù)發(fā)，肝癌患者歸為低肝癌復(fù)發(fā)可能性組的標(biāo)準(zhǔn)為治療12個(gè)月以內(nèi)無(wú)復(fù)發(fā)。在以上肝癌患者進(jìn)行治療后，跟蹤其復(fù)發(fā)情況，復(fù)發(fā)的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：ct能觀察到新的病灶。各組中各基因型的患者數(shù)及百分比如表3所示。

表3、各組中各基因型的患者數(shù)及百分比

結(jié)果顯示，高肝癌復(fù)發(fā)可能性組中c等位的頻率為62.5％，t等位的頻率為37.5％；低肝癌復(fù)發(fā)可能性組中c等位的頻率為58.33％，t等位的頻率為41.67％。c等位在高肝癌復(fù)發(fā)可能性組中的頻率比在低肝癌復(fù)發(fā)可能性組中的頻率高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.001)，表明rs12252位點(diǎn)的c等位為高肝癌復(fù)發(fā)可能性的風(fēng)險(xiǎn)等位。

rs12252的三個(gè)基因型中，cc基因型的個(gè)體在肝癌復(fù)發(fā)性高的肝癌患者群體中的比例高于對(duì)應(yīng)的基因型在肝癌復(fù)發(fā)性低的肝癌患者群體中的比例；tt和ct基因型的個(gè)體在肝癌復(fù)發(fā)性高的肝癌患者群體中的比例分別低于對(duì)應(yīng)的基因型在肝癌復(fù)發(fā)性低的肝癌患者群體中的比例。

與攜帶tt和ct基因型的個(gè)體相比，攜帶cc基因型的肝癌患者的腫瘤使高肝癌復(fù)發(fā)可能性的風(fēng)險(xiǎn)增加，or值為4.067[95％置信區(qū)間(95％ci)＝1.833-9.025；p<0.001]。

結(jié)果表明，rs12252多態(tài)性位點(diǎn)與肝癌復(fù)發(fā)可能性顯著關(guān)聯(lián)，可以利用rs12252位點(diǎn)篩查肝癌復(fù)發(fā)可能性高的肝癌患者。

<110>首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院

<120>與不同惡性程度肝癌相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)及其應(yīng)用

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